DE60208787T2

DE60208787T2 - Verfahren zum messen der polymerisierung von dna und anwendungen des verfahrens

Info

Publication number: DE60208787T2
Application number: DE60208787T
Authority: DE
Inventors: Clas Källander; Ingvar Pettersson; Simon Gronowitz; Xingwu Shao
Original assignee: Cavidi Tech AB
Current assignee: Cavidi Tech AB
Priority date: 2001-06-14
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2022-06-15
Also published as: BRPI0210359B8; ATE316149T1; WO2002103039A1; US20040157230A1; CN100379879C; JP4188228B2; BRPI0210359B1; ES2257548T3; EP1395675B1; BR0210359A; AU2002303065B2; CN1541276A; US7488577B2; ZA200309552B; DE60208787D1; EP1395675A1; JP2004533255A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen der DNA-Polymerisierung und Anwendungen dieses Verfahrens. Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Messen einer DNA-abhängigen DNA-Polymerisierung.
Hintergrund
Die letzten Jahrzehnte haben eine schnelle Entwicklung neuer Verfahren zum Messen von reverser Transkription, RNA-abhängiger DNA-Polymerisierung, gesehen (siehe z.B. WO 01/01129). Das viel komplexere Thema, das Verfahren zum Quantifizieren von DNA-abhängiger DNA-Polymerisierung betrifft, hat bisher viel weniger Aufmerksamkeit auf sich gezogen.
Die klassischen DNA-Polymeraseaktivitätstests schließen die Verwendung von DNAse behandelter DNA ("aktivierte DNA") als Primer/Matrize und den Einbau radioaktiv markierter Nucleotide in die DNA ein (Aposhian und Kornberg, 1962). Eine Messung der Säure-präzipitierbaren Radioaktivität ermöglicht die Berechnung der Menge an Nucleotiden, die eingebaut wurden, und die Anzahl an Enzymeinheiten, die vorhanden sind. Die Verwendung von Radioaktivität ist jedoch gegenwärtig beschränkt und wird in vielen Laboratorien ungern verwendet, und daher gibt es aufgrund dieser Tatsachen einen allgemeinen Trend, der von auf Radioaktivität-basierenden Techniken, weg führt.
Für DNA-Polymerasen ist ein kommerzieller Test, der auf einem ELISA-Nachweis von Digoxigenin-markierten Nucleotiden basiert, die in neu hergestellte DNA eingebaut werden, erhältlich (Roche Molecular Biochemicals, Kat. Nr. 1468120, US 5,635,350 ). Dieser Test wird durch die Verwendung von zwei verschiedenen Nucleotidsubstraten gestört, die analog mit häufigen Gruppen sind, Digoxigenin als Markierung und Biotin zur Immobilisierung des Produktes. Im Ergebnis werden die Polymerisierungsreaktionsgeschwindigkeit und die anschließende Nachweisempfindlichkeit reduziert. Die Verwendung von Substratanaloga, die stark abweichende kinetische Eigenschaften haben, machen dieses System weniger relevant für Untersuchungen der Medikamentenempfindlichkeit verschiedener Polymerasen.
Ein weiteres attraktives alternatives Verfahren ist ein auf Fluoreszenz basierender Test für die DNA-Polymerase-Holoenzyme, welcher auf einer spezifischen Reaktion des Farbstoffs PicoGreen mit doppelsträngiger DNA basiert (Seville et al., 1996). Dieses letztgenannte Verfahren ist kürzlich modifiziert worden, um es auf einen breiteren Bereich verschiedener DNA-Polymerisierungsenzyme anwendbar zu machen (Tveit und Kristensen, 2001). Dieser Test ist technisch einfach und beruht auf der Verwendung von natürlichen Nucleotiden. Die Nachweisempfindlichkeit ist jedoch noch immer im gleichen Bereich wie beim klassiven radioaktiven DNA-Polymerasetest, und die Anwendungen, die beschrieben werden, zeigen einen Nachweisbereich von 0,05 bis 0,5 Einheiten DNA-Polymerase/Probe.
Die HIV-Therapie beruht heute auf einer Multimedikamententherapie. Die Dosierungen beruhen auf Kombinationen aller drei erhältlichen Medikamente: Nucleosid-Analoga, Nicht-Nucleosid-Analoga und Protease-Inhibitoren. Die Strategie liegt darin, die Wahrscheinlichkeit zu minimieren, dass ein mutiertes Virus überlebt.
Die Reverse-Transkriptase(RT)-Inhibitoren sind entweder Nucleosid-Analoga oder Nicht-Nucleosid-Analoga. Die Nicht-Nucleosid-Inhibitoren binden an eine hydrophobe Tasche des RT-Enzyms, das nahe, aber nicht an das aktive Zentrum anschließend, liegt. Die HIV-1-Replikation wird allosterisch durch das Ersetzen der katalytischen Aspartatreste gehemmt, bezogen auf die Polymerasebindungsstelle.
Die Nucleosidinhibitoren, die heute verwendet werden, beenden die Verlängerung der DNA-Kette, da ihnen die 3'-Hydroxylgruppe fehlt. Eine längere Therapie mit Nucleosidinhbitoren führt häufig zur Entwicklung eines resistenten Virus. Dieser Prozess wird mit dem graduierlichen Auftreten von Mutationen in dem Virus pol-Gen in Verbindung gebracht, welche jeweils zu bestimmten Aminosäurensubstitutionen führen (für einen Übersichtsartikel siehe Vandamme et al., 1998). Die Wirkungen dieser Substitution auf enzymatische Niveaus sind kompliziert und schließen die Verstärkung einer primitiven DNA-Editierfunktion ein. Diese Reaktion ist Nucleosid-abhängig und führt zu Dinucleosidpolyphosphaten und einem verlängerbaren DNA-3'-Ende (Arion et al., 1198, Meyer et al., 1999).
Die HIV-1-RT, wie auch andere Reverse Transkriptasen führen drei verschiedene enzymatische Reaktionen durch: die RNA-abhängige DNA-Polymerisierung, die DNA-abhängige DNA-Polymerisierung und den Abbau von RNA in dem DNA-RNA-Hybrid (RNase H). Die HIV-Reverse Transkriptase, die durch das pol-Gen codiert wird, ist ein Heterodimer, das aus einer p66- und einer p51-Untereinheit besteht. Beide RNA-abhängigen DNA-Polymerisierungen und DNA-abhängigen DNA-Polymerisierungen werden durch das gleiche aktive Zentrum ausgeführt, welches in der p66-Untereinheit lokalisiert ist (für einen Übersichtsartikel siehe Goff, 1990). Die Reaktionsmechanismen dieser Medikamente sind hauptsächlich gemäß ihrer Wirkung auf die RNA-abhängige DNA-Polymerisierungsreaktion definiert worden. Die Wirkung auf die DNA-abhängige DNA-Polymerisierungsreaktion ist vergleichsweise wenig studiert worden.
Unter der Voraussetzung, dass der Reaktionsmechanismus und das wirksame metabolisierte Medikament bekannt und erhältlich ist, kann die phänotypische virusbezogene Medikamentenempfindlichkeit auf enzymatischem Niveau bestimmt werden. In Abhängigkeit von der Fähigkeit der Enzymuntersuchungen und der Virusisolierungstechniken, die verwendet werden, kann das Testen der Medikamentenempfindlichkeit theoretisch entweder an Überständen von in Kulturen propagiertem Virus, an einem Primärvirusisolat oder an Viruspräparaten durchgeführt werden, die direkt von den Patienten gewonnen wurden. Der konventionelle RT-Aktivitätstest wird unter Verwendung eines künstlichen Matrizen-Primer-Konstrukts durchgeführt, und mit markierten Deoxynucleosidtriphosphaten als Nucleotidsubstrat. Das Matrizen/Primer-Paar poly/RA)/oligo(dT) ist das wirkungsvollste und die am meisten verwendete Kombination zur Bestimmung von HIV wie auch für andere retrovirale RTs. Ein Nachteil dieser Art von Untersuchung, wenn die Medikamentenempfindlichkeit, die getestet werden soll, betroffen ist, liegt darin, dass nur Nicht-Nucleosid-Analoga oder Analoga, die mit rA Basenpaare bilden können, getestet werden können. Analoga anderer Nucleotidbasen machen einen Test nötig, der auf einer variablen Polymermatrize beruht. RNA-Polymere, die Pyridinbasen enthalten, sind notorisch anfällig gegenüber RNasen und in der Praxis nicht mit biologischen Proben kompatibel. Es wäre daher vorteilhaft, einen Polymerasetest zu schaffen, der auf dem Testen der Medikamentenempfindlichkeit einer variablen DNA-Matrize basiert, vorausgesetzt, dass das Testsystem Ergebnisse ergibt, die mit denen korrelieren, die sich durch die Hemmung der reversen Transkription und den klassischen phänotypischen Medikamentenresistenztests ergeben.
Die heute verwendete HIV-Therapie ist nur ein Beispiel der Leistungsfähigkeit von DNA-Polymerase-Inhibitoren. Die derzeitige Situation, die die Resistenzentwicklung von Bakterien und anderen Mikroorganismen betrifft, motiviert die Suche nach neuen Klassen antimikrobieller Medikamente. DNA-Polymerasen sind eines der Hauptziele in diesem Ansatz. Als solches gibt es eine starke Nachfrage für technisch einfache Polymerase-Untersuchungen, die keine potentiellen Umweltschädigungen verursachen, und die beim Durchmustern nach Medikamenten über einen großen Bereich mikrobieller DNA-Polymerase-Isozyme angewandt werden können. Die Toxizität der Medikament-Kandidaten, die auf diese Weise gefunden werden, muss weiter im Hinblick auf die entsprechenden Säuger-DNA-Polymerasen untersucht werden.
Die Quantifizierung der Proliferation, die mit Polymerasen, wie beispielsweise Polymerase-α und -δ in Verbindung steht, kann verwendet werden, um die Zellproliferation zu überwachen. In diesem Zusammenhang kann erwähnt werden, dass die Serumwerte an Thymidinkinase, einem weiteren Zellproliferations-assoziierten Enzym gegenwärtig zur Prognose und Klassifizierung maligner Erkrankungen verwendet werden ( US 4,637,977 ). Die Phosphorylierung von Thymidin ist nur einer der zwei intrazellulären synthetischen Wege, welcher Thymidintriphosphat für die DNA-Synthese bereitstellt. Die Messung der DNA-Polymerase selbst hat das Potential, eine korrektere Abschätzung der gesamten DNA-Synthese im Vergleich mit der Thymidinkinaseaktivität oder dem Thymidineinbau zu liefern.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen nicht-radioaktiven DNA-Polymerasetest in Mikrotiterplattenformat bereit, der den kolorimetrischen oder fluorimetrischen Nachweis von Produkten ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet es als Nucleotidtriphosphatsubstrat 5-Bromdeoxyuridin-5'-triphosphat (BrdUTP). Der Unterschied des Van der Waals'-Radius zwischen der 5'-Position des Broms in BrdUTP und der 5'-Position der Methylgruppe im Thymidintriphosphat ist minimal (1,95 Å, verglichen mit 2,0 Å), und die Eigenschaften der Enzymkinetik dieser zwei Nucleotide sind ziemlich ähnlich. Das Verfahren kann aromatisiert werden und einen Detektionsnachweis von bis zu 3 Nanoeinheiten Polymeraseaktivität pro Probe erreichen.
Eine der Anwendungen der vorliegenden Erfindung ist das Testen der Medikamentenempfindlichkeit. Alle anti-retroviralen Medikamente, die bisher zugelassen wurden, interferieren entweder mit der enzymatischen Reaktion der viralen Protease oder der RT. Es gibt zusätzlich Medikamenten-Kandidaten in der Pipeline, die die Funktion der retroviralen Integrase betreffen.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen eines breiten Bereichs verschiedener DNA-abhängiger DNA-Polymerasen bereit. Es hat sich sogar für die Studien von hochprozessiven DNA- Polymerase-Systemen als geeignet erwiesen, trotz der vergleichsweise kurzen Matrizen, die verwendet wurden. Die Nützlichkeit zur Bestimmung der Aktivität bakterieller Polymerase I und III, der Säuger-DNA-Polymerase α, β und γ, der Proliferations-assoziierten Polymeraseaktivität in menschlichem Serum und DNA-abhängiger DNA-Polymerisierung durch HIV RT wird nachgewiesen, aber das Verfahren kann für Untersuchungen von nahezu allen viralen und zellulären DNA-Polymerasen verwendet werden. Eines der Merkmale, das den vorliegenden DNA-Polymerase-Test von dem Stand der Technik unterscheidet, ist seine herausragende Empfindlichkeit, welche einen Nachweis von bis zu drei Nanoeinheiten E. coli-DNA-Polymerase I-Aktivität möglich macht.
Das heißt, dass ein Aspekt der Erfindung auf ein Verfahren zum Messen der DNA-abhängigen DNA-Polymerisierung in einer biologischen Probe gerichtet ist, welches die Schritte umfasst:

a) Bereitstellen eines Primers mit einer einzelsträngigen kurzen spezifischen Sequenz, welche nicht in der Lage ist, intern Basenpaare zu bilden, gebunden an eine Festphase,
b) Kontaktieren des Primerkonstrukts mit einem Reaktionsgemisch, welches eine einzelsträngige Deoxynucleotidmatrizen-Konstruktion enthält, welche ein 5'-Ende, ein (A)n-Polymer, einen variablen Teil (GTCA)m und eine Sequenz, die komplementär zum Primer ist und die vier Deoxynucleotidtriphosphate enthält, von denen eines modifiziert ist, so dass es spezifisch durch einen markierten Antikörper erkannt werden kann,
c) Zugabe einer biologischen Probe, umfassend die DNA-Polymerase zum Gemisch aus b),
d) Ermöglichen, dass die Polymerasereaktion abläuft,
e) Inkubation des immobilisierten Reaktionsproduktes, das aus d) hervorgeht, mit dem markierten Antikörper,
e) Nachweisen der Menge des gebundenen markierten Antikörpers mit Hilfe der verwendeten Markierung, und
f) Messen der Menge an eingebautem modifizierten Deoxynucleotid, als Maß für die DNA-Polymerisierung mit Hilfe der Markierung des gebundenen Antikörpers.

In einer Ausführungsform wird die DNA-Polymerisierung durch eine Reverse-Transkriptase (RT) eines Retrovirus, wie beispielsweise die menschliche Immundefizienzvirus-(HIV)-RT durchgeführt.
In einer anderen Ausführungsform ist das modifizierte Deoxynucleotidtriphosphat 5-Bromdeoxyuridin-5'-triphosphat (BrdUTP) und der markierte Antikörper ist ein mit alkalischer Phosphatase (Ap) konjugierter Anti-BrdU-monoklonaler Antikörper.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird die gemessene DNA-Polymerisierung zum Testen der Medikamentenempfindlichkeit verwendet.
Die Untersuchung der Medikamentempfindlichkeit wird durchgeführt, um zu untersuchen, ob ein bestimmtes Medikament in einem Säugerindividuum wirksam ist, und das Ergebnis kann verwendet werden, um eine Medikamentenbehandlungstherapie für dieses Individuum auszuwählen. In der Praxis wird das Individuum zu verschiedenen Zeitpunkten Tests unterworfen, um die Entwicklung einer Medikamentenbehandlung in diesem Individuum zu überwachen.
Die Erfindung ist ebenfalls auf ein kommerzielles Paket zum Messen der DNA-abhängigen DNA-Polymerisierung gemäß der Erfindung gerichtet. Das Paket umfasst mindestens die folgenden Gegenstände:

a) einen Primer mit einer einzelsträngigen kurzen spezifischen Sequenz, die nicht in der Lage ist, intern Basenpaare zu bilden, welche an eine Festphase gebunden ist,
b) ein einzelsträngiges Deoxynucleotid-Matrizen-Konstrukt, bestehend aus vom 5'-Ende aus gesehen, einem (A)n-Polymer, einem variablen Teil (GTCA)m und einer Sequenz, die komplementär zum Primer in a) ist,
c) die vier Deoxynucleosidtriphosphate, von denen eines so modifiziert ist, dass es spezifisch durch einen markierten Antikörper erkannt wird, und
d) den markierten Antikörper, der das modifizierte Deoxynucleotidtriphosphat in c) erkennt.

Das Paket wird gegebenenfalls auch schriftliche und/oder auf Datenträger befindliche Instruktionen zum Messen der DNA-abhängigen DNA-Polymerisierung gemäß der Erfindung enthalten.
Die Erfindung wird nun durch die folgende, nicht-beschränkende Beschreibung an Ausführungsformen und Zeichnungen der Erfindung dargestellt.
Die Lehre der zitierten Literatur werden hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die Wirkungen der Variation der Matrizensequenz auf die Inhibierung der DNA-Polymerase III mit TMAU dar.
2 stellt beispielhaft die Nachweisempfindlichkeit des DNA-Polymerasetests HIV-1-Wildtyp RT (⧫), der Säuger-DNA-Polymerase-ß (⦁) und der E. coli-Polymerase I
dar.
3 stellt die Fähigkeit des DNA-Polymerasetests dar, die Inhibierung aller vier DNA-Basen durch die DiDeoxyanaloga zu messen. Die Symbole sind: ddATP (∎), ddGT (⧫), ddCTP (⦁) und ddTP
.
4 zeigt den biochemischen Mechanismus, der einer Resistenzbildung gegenüber einem antiviralen Medikament Tenofovir zugrunde liegt, welcher auf einer Verstärkung einer ATP-abhängigen Phosphorolyse-Reaktion beruht. Symbole: HIV-1-Wildtyp-RT in einer Standardreaktionlösung
. HIV-1-Wildtyp-RT in der Reaktionslösung mit ATP (⦁), HIV-1-Mutanten RT in Standardreaktionslösung
, HIV-1-Mutanten-RT in einer Reaktionslösung mit ATP (⧫).
5 stellt beispielhaft die Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber dem antiviralen Medikament Nevirapin dar, unter Verwendung von RTs, die aus dem Plasma HIV-infizierter Individuen gewonnen wurden. Symbole:
, (∎) und
RTs von infizierten Individuen, (⦁) eine Kontrolle, die aus rekombinantem HIV-1-Wildtyp RT besteht, (⧫) eine Kontrolle, die aus einer mutierten (L100I) rekombinanten HIV-1 RT mit intermediärer Nevirapinresistenz besteht.
Beschreibung der Ausführungsformen
Herstellung von Primer-beschichteten Mikrotiterplatten
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (Endkonzentration 10 mg/ml) wurde zu 100 mM 1-Methylimidazol-Puffer (pH 7,0) gegeben, und das Gemisch wurde verwendet, um das Primerkonstrukt auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml zu bringen. 100 μl der Primerlösung wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte aliquotiert, die aus Nalge Nunc NucleoLink^® transparenten Strips (Kat. Nr. 248259) besteht. Die Platten wurden 6 bis 8 Stunden bei 37°C inkubiert, in 2 mol NaOH mit 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gewaschen und in drei 5 l-Gefäßen mit Wasser getränkt. Die Restflüssigkeit in den Vertiefungen wurde durch Klopfen der Platten, die über Kopf gehalten wurden, auf einen absorbierenden Stoff oder Papier entfernt. Den Platten wurde ermöglicht, für 30 Minuten bei Raumtemperatur zu trocknen, und sie wurden schließlich zur Lagerung bei –20°C eingefroren.
Protokoll für den DNA-Polymerasetest
Der DNA-Polymerasetest beruht auf einem kurzen Primer mit einer spezifischen Sequenz, die kovalent an die Vertiefungen einer 96-Well- Mikrotiterplatte gebunden ist. Das Reaktionsgemisch enthält eine einzelsträngige Deoxynucleotid-Matrize mit einem Teil der Sequenz, die komplementär zum Primer ist und in vier Deoxynucleosidtriphosphaten. Thymidintriphosphat ist jedoch durch 5-Bromdeoxyuridin-5'-triphosphat (BrdUTP) ersetzt worden. Die Menge an Bromdeoxyuridinmonophosphat (BrdUMP), die in die DNA während der Polymerasereaktion eingebaut wird, wird durch alkalische Phosphatase (Ap) konjugierten Anti-BrdU-monoklonalen Antikörper nachgewiesen. Das Ap-Substrat, 4-Methylumbelliferylphosphat, wird für den fluorimetrischen Produktnachweis verwendet.
100 μl DNA-Polymerasereaktionsgemisch wurde zu jeder Vertiefung der Primer-beschichteten Mikrotiterplatten hinzugegeben. Die Proben wurden in DNA-Polymerase-Basispuffer verdünnt und die Polymerasereaktion wurde durch Überführen von 50 μl Probenlösung in jede Vertiefung der Platte gestartet. Die Mikrotiterplatte wurde bei 33°C inkubiert, und die Reaktion wurde nach den angegebenen Zeitpunkten durch Waschen der Platte in 3 ml Boratpuffer (pH 8,9) mit 1,5 % (V/V) Octophenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100) beendet. Für gewöhnlich wurden zwei Inkubationszeitpunkte, 4 Stunden und über Nacht (16 Stunden), verwendet, um die Linearität der Polymerisierungsreaktion zu überprüfen. Die Platten wurden gut in 2 M NaOH mit 2 mM EDTA gewaschen und in drei 5 l-Gefäßen mit Wasser getränkt.
Als Nächstes wurden die Platten für 90 Minuten bei 33°C mit 100 μl alkalischer Phosphatase-(Ap)-konugiertem Anti-BrdU-monoklonalen Antikörper inkubiert, der auf 4,8 μg/ml in 25 mL (Bis[2-Hydroxyethyl]iminotris-[hydroxymethyl]methan; 2-Bis(2-hydroxyethyl]amino-2-[hydroxymethyl]-1,3-propandiol)-(Bis-Tris)Puffer (pH 7,2) mit 50 mM NaCl, 37,5 ml (NH₄)₂SO₄, 1 mg/ml Dextransulfat, 1 % Triton X-100 und 25 mg/ml Sigma-fettfreier Trockenmilch verdünnt ist.
Die Platten wurden danach wieder in 3 mM Boratpuffer (pH 8,9) mit 1,5 % (V/V) Triton X-100 gewaschen, um nicht-gebundenen markierten Antikörper zu entfernen. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde unter Verwendung von 4-Methylumbelliferylphosphat-Substrat, welches in Tris-Puffer (pH 8,9) gelöst war, bestimmt. Die Fluoreszenz wurde bei 460 nm mit einem Wallac-Victor-2-Reader in definierten Zeitabständen abgelesen (Anregung 355 nm).
Protokoll für die Bestimmung der Inhibierung der Synthese des zweiten Stranges an verschiedenen DNA-Matrizen
Die Inhibierungsstudien wurden in einem modifizierten DNA-Polymerasetest durchgeführt. Die Medikamente wurden seriell in fünf Schritten verdünnt und 25 μl Aliquots wurden in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte übertragen, gemischt mit 100 μl DNA-Polymerase-Reaktionsgemisch, und die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 25 μl Enzymverdünnung ausgelöst. Nicht-Nucleosidanaloga wurden als Standardreaktionsbedingungen untersucht, während die Konzentration aller vier Deoxynucleosidtriphosphate (dNTP) auf 1 μM in den Studien der dNTP-Kompetitionsinhibitoren reduziert wurde. Der Polymerasereaktion wurde ermöglicht über Nacht abzulaufen (16–24 Stunden bei 33°C). Danach wurde die Reaktion durch ein Waschen der Platte beendet. Der IC₅₀-Wert wurde als die Konzentration festgelegt, bei der ein Medikament eine 50%ige Inhibierung der untersuchten Polymeraseaktivität ergab.
Protokoll für die Bestimmung der RT-Aktivität
Eine Modifizierung des kolorimetrischen RT-Tests (Cavidi^® Lenti RT-Aktivitätskit), der von Cavidi Tech, Uppsala, Schweden erhältlich ist, wurde für die Bestimmung des Niveaus der RT-Aktivität in den untersuchten Viruspräparaten verwendet. Das Verfahren ist beschrieben worden (Ekstrand et al., 1996). Kurz gesagt, dient Poly(rA), welches kovalent an die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte gebunden ist, als Matrize für den Einbau von 5-Bromdeoxyuridin-5'-triphosphat (BrdUTP) während des reversen Transkriptionsschrittes bei 33°C. Die Menge an Bromdeoxyuridinmonophosphat (BrdUTP), welche in die DNA eingebaut wird, wird mit einem alkalische Phosphatase-(Ap)-konjugierten Anti-BrdU-monoklonalen Antikörper nachgewiesen. Als Ap-Substrat wird schließlich 4-Methylumbelliferylphosphat für den fluorimetrischen Nachweis verwendet.
Protokoll zur Bestimmung der Inhibierung der reversen Transkription
Die Inhibierungsstudien wurden in einem modifizierten Cavidi HS-Kit Lenti RT-Assay durchgeführt. Die Inhibitoren wurden seriell in fünf Schritten verdünnt und 25 μl-Aliquots wurden in jede Vertiefung in der Mikrotiterplatte überführt, welche mit 100 μl RT-Reaktionsgemisch gewaschen wurde, und die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 50 μl Enzymverdünnung ausgelöst. Die endgültige Nucleosidtriphosphatsubstrat(BrdUTP)-Konzentration betrug 16 μM und der Primer (odT₂₂) war in einer Menge von 12 ng pro Vertiefung vorhanden. Der RT-Reaktion wurde ermöglicht über Nacht (16–24 Stunden bei 33°C) voranzuschreiten. Anschließend wurde die Reaktion durch einmaliges Waschen der Platte beendet. Der IC₅₀-Wert wurde als die Konzentration des Medikaments definiert, welcher eine 50%ige Inhibierung der untersuchten RT-Aktivität ergab.
Protokoll für die Isolierung der viralen RT aus Material, welches RT-blockierende Antikörper enthält, basierend auf der Zerstörung löslicher zellulärer Enzyme, gefolgt von der Isolierung einer viralen RT aus Minisäulen

1) Markiere die 4,5 ml-Kunststoffröhrchen, die verwendet werden sollen. Stelle sie in eine Nalgene-Box. Gebe 1 ml-Probe (z.B. EDTA-Plasma aus HIV-infizierten Individuen) zu jeder markierten Probe hinzu. Gebe 100 μl einer 66 mM Lösung aus 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) in gepuffertem Wasser hinzu, vortexe dies und inkubiere die Proben für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Aktivität der freien Plasmaenzyme wird während dieses Verfahrens zerstört, während die Enzyme, die in den Virionen enthalten sind, intakt bleiben. Die Virionen können dann durch verschiedene Trennungsverfahren aus der 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure), Enzymaktivität-blockierende Antikörper und anderen Substraten gereinigt werden, die mit der Quantifizierung der viralen RT interferieren können. Das unten angegebene Protokoll beruht auf der Verwendung von Fractogel^® EMD TMAE Hicap-Gel.
2) Suspendiere das Trenngel vorsichtig und übertrage 150 μl Gel-Aufschlämmung in jedes Probenvorbereitungsröhrchen.
3) Inkubiere die Proben mit der Gel-Aufschlämmung für 90 Minuten bei Raumtemperatur, wobei die Röhrchen horizontal auf einen Orbitalschüttler gelegt wreden.
4) Markiere die gewünschte Menge der 10 ml-Kunststoffminisäulchen, um die Proben, die analysiert werden sollen, zu identifizieren. Stelle die Säulen in eine Säulenwaschvorrichtung, d.h. eine Supelco Visiprep-Fastenphasenextraktion-Vakuummanifold. Übertrage die Inhalte in den Bindungsröhrchen in ihre entsprechenden Säulen, vortexe vor dem Transfer das Röhrchen kurz, um das Gel gleichmäßig zu verteilen.
5) Wenn alle Säulen gefüllt sind, lege ein Vakuum an und sauge die Gele trocken. Schalte das Vakuum ab und beginne das Waschen durch Einfüllen von 9 ml Puffer in jede Säule. Wenn alle Säulen gefüllt worden sind, lege ein Vakuum an und sauge die Gele trocken.
6) Wiederhole Schritt 5) dreimal mehr, was insgesamt vier Waschschritte ergibt. Sauge die Gele nach jedem Waschen trocken. Nach dem Trockensaugen der Gele nach dem vierten Waschen schalte das Vakuum ab und mache mit Schritt 7 weiter. Der Waschschritt entfernt ungebundene RT-blockierende Antikörper und 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) aus dem System.
7) Füge zu allen trockenen Gelen 9 ml des Konditionierungspuffers (B) hinzu. Lege nach 1 Minute ein Vakuum an und sauge die Gele trocken.
8) Wiederhole Schritt 7. Vor dem Ausschalten des Vakuums, prüfe, ob der gesamte Konditionierungspuffer (B) aus allen Gelen entfernt worden ist.
9) Hebe den oberen Teil der Säulenwaschvorrichtung an. Stelle den Röhrchenhalter mit den markierten Röhrchen in einen sauberen Behälter. Passe den oberen Teil der Vorrichtung wieder an. Kontrolliere, dass die kleinen Röhrchen jeder Säule in ihre entsprechenden Röhrchen hinein ragen.
10) Füge 600 μl Lysepuffer (C) zu jeder Säule hin. Lasse den Puffer in der Säule für 5 Minuten stehen. Lege dann langsam ein Vakuum an und sauge die Gele trocken. Dies wird in jedem Röhrchen ungefähr 600 μl Viruslysat aus dem damit verbundenen Gel ergeben.

Die RT-Aktivität, die in den Lysaten aus Schritt 10 gewonnen worden ist, ist im wesentlichen frei von RT-blockierenden Antikörpern, Medikamenten und zellulärer Polymeraseaktivität, und kann mit einem empfindlichen RT-Aktivitätstest quantifiziert werden, d.h. mit dem Cavidi HS-Kit Lenti RT, welcher auf dem von Ekstrand et al. [7] beschriebenen Verfahren beruht. 25 μl Lysat, welches gemäß dem vorliegenden Protokoll gewonnen worden ist, reicht aus zur Bestimmung der RT-Aktivität in der Probe. Die verbleibenden 575 μl Probe sollten bei –170°C oder darunter für spätere Verwendung in dem Medikamentenempfindlichkeitstest eingefroren werden.
Anmerkung: Die RT-Enzyme, die nicht gegenüber Cystein-modifizierenden Mitteln empfindlich sind, z.B. Wild-Typ HIV-1 RT, können gegebenenfalls in Gegenwart von bis zu 5 mM 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) untersucht werden. Empfindliche Enzyme, wie beispielsweise MULV RT und die RT einiger Therapie-resistenter HIV-1-Stämme (die beispielsweise die Mutation Y181C enthalten), benötigen andererseits die Zugabe eines Sulfhydrylreduzierenden Mittels, d.h. Cystein oder Cysteamin zum Lysepuffer.
Materialien
Primer/Matrize für den DNA-Polymerasetest
Die Primersequenz hat 18 Basen 5'-GTC-CCT-GTT-CCG-GCG-CCA-3' (SEQ ID NO: 12) und ist am 5'-Ende mit Hilfe eines C6-Spacer-Arms an ein primäres Amin gebunden.
Das Matrizenkonstrukt enthält drei Teile mit verschiedenen Funktionen. Vom 5'-Ende: A(A)n Polymer verwendet zum Amplifizieren des BrdU-Signals, ein variabler Teil (GTCA)m, um die Polymerasereaktion zu erreichen, die abhängig ist von den vier Deoxynucleosidtriphosphaten und eine Sequenz, die komplementär zum Primer ist.
In den Experimenten, die in den Beispielen eingeschlossen sind, ist n = 12 und m = 5, sofern es nicht anders angegeben ist.
Nucleoside, Enzyminhibitoren und antivirale Medikamente
ddATP, 2',3'-Dideoxyadenosintriphosphat; ddGTP, 2',3'-Dideoxyguanosintriphosphat; ddCTP, 2',3'-Dideoxycytidintriphosphat; ddTTP, 2',3'-Dideoxythymidintriphosphat.
TMAU, 6-([3,4-Trimethylen]anilino)uracil
Tenofovir, (R)-9-(2-Phosphonylmethoxypropyl)adenin; Nevirapin, (11-Cyclopropyl,5,11-dihydro-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2'3'-f][1,4]diazepin-6-on) (NVP); und Efavirenz, (-)6-Chlor-4-cyclopropylethinyl-4-trifluormethyl-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin-2-on) (EFV).
Enzyme
DNA-Polymerase I (E.coli) wurde von Amersham Bioscience bezogen. Rekombinante DNA-Polymerase III aus Staphylococcus aureus wurde wie beschrieben hergestellt (Brown et al., 1998). Säuger-DNA-Polymerase α (Kälberthymus) und β (Mensch) wurden von CHIMERx (Milwaukee) bezogen. DNA-Polymerase γ wurde, wie beschrieben (Pileur et al., 2000), aus Rinderherz gereinigt.
Die NNRTI-resistenten mutanten Formen von HIV-1 RT wurden hergestellt (L100I, K103N, L1001/K103N, Y181C). Als Matrize für die Mutationen wurde der pETRT-Expessionsvektor verwendet, welcher aus dem BH10-Isolat hergestellt wurde. Mutationen wurden unter Verwendung eines kommerziellen ortsspezifischen Mutagenesekits, QuickChange (Stratagene) erzeugt. Die Mutationen wurden durch DNA-Sequenzanalyse überprüft. Die mutierten und nativen Formen der RT wurden wie zuvor beschrieben, isoliert (Lindberg et al., 2002).
Anmerkung: NT-Enzyme, die nicht gegenüber Cystein modifizierenden Mitteln empfindlich sind, z.B. Wildtyp HIV-1 RT, können gegebenenfalls in Gegenwart von bis zu 5 mM 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) untersucht werden. Empfindliche Enzyme, wie beispielsweise MULV RT und die RT von einigen Therapie-resistenten HIV-1-Stäummen (enthaltend z.B. die Mutation Y181C), benötigen andererseits die Zugabe eines Sulfhydryl-reduzierenden Mittels, d.h. Cystein oder Cysteamin zum Lysepuffer.
Materialien
Primar/Matrize für den DNA-Polymerase-Test
Die Primarsequenz hat 18 Basen 5'-GTC-CCT-GTT-CCG-GCG-CCA-3' (SEQ ID NO: 12) und ist am 5'-Ende mit Hilfe eines C6-Spacer-Arms an ein primäres Amin gebunden.
Das Matrizenkonstrukt enthält drei Teile mit verschiedenen Funktionen. Vom 5'-Ende: A(A)n Polymer verwendet zum Amplifizieren des BrdU-Signals, ein variabler Teil (GTCA)m, um die Polymerasereaktion zu erreichen, die abhängig ist von den vier Deoxynucleosidtriphosphaten und eine Sequenz, die komplementär zum Primer ist.
In den Experimenten, die in den Beispielen eingeschlossen sind, ist n = 12 und m = 5, sofern es nicht anders angegeben ist.
Nucleoside, Enzyminhibitoren und antivirale Medikamente
ddATP, 2',3'-Dideoxyadenosintriphosphat; ddGTP, 2',3'-Dideoxyguanosintriphosphat; ddCTP, 2',3'-Dideoxycytidintriphosphat; ddTTP, 2',3'-Dideoxythymidintriphosphat.
TMAU, 6-([3,4-Trimethylen]anilino)uracil
Tenofovir, (R)-9-(2-Phosphonylmethoxypropyl)adenin; Nevirapin, (11-Cyclopropyl,5,11-dihydro-4-methyl-6H-dipyrido[3,2-b:2'3'-f][1,4]diazepin-6-on) (NVP); und Efavirenz, (-)6-Chlor-4-cyclopropylethinyl-4-trifluormethyl-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin-2-on) (EFV).
Enzyme
DNA-Polymerase I (E.coli) wurde von Amersham Bioscience bezogen. Rekombinante DNA-Polymerase III aus Staphylococcus aureus wurde wie beschrieben hergestellt (Brown et al., 1998). Säuger-DNA-POlymerase α (Kälberthymus) und β (Mensch) wurden von CHIMERx (Milwaukee) bezogen. DNA-Polymerase γ wurde, wie beschrieben (Pileur et al., 2000), aus Rinderherz gereinigt.
Die NNRTI-resistenten mutanten Formen von HIV-1 RT wurden hergestellt (L100I, K103N, L1001/K103N, Y181C): Als Matrize für die Mutationen wurde der pETRT-Expessionsvektor verwendet, welcher aus dem BH10-Isolat hergestellt wurde. Mutationen wurden unter Verwendung eines kommerziellen ortsspezifischen Mutagenesekits, QuickChange (Stratagene) erzeugt. Die Mutationen wurden durch DNA-Sequenzanalyse überprüft. Die mutierten und nativen Formen der RT wurden wie zuvor beschrieben, isoliert (Lindberg et al., 2002).
Das Verfahren zum Herstellen von rekombinanten HIV-1 RTs mit AZT-spezifischen Mutationen war ähnlich, aber die Mutationen wurden in die RT-codierende Region des HXB2-D-Isolats eingefügt.
Plasmaproben HIV-infizierter Individuen
Plasmaproben aus der Behandlung von naiven Patienten oder von Patienten, die mit einer gewöhnlichen Kombinationstherapie behandelt werden, wurden retrospektiv selektiert. Die Menge der HIV-1-RNA in jeder Probe wurde durch eine Standard-HIV-1-RNA-PCR (Cobas Roche Diagnostica) gemessen. Serumproben von Patienten mit lymphoproliferativen Störungen wurden vom Department of Internal Medicine, Uppsala University, Akademiska sjukhuset, Uppsala, Separationgel bezogen: z.B. Fractogel^® EMD TMAE Hicap in 314 mM (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) (MES), pH 5,1, 413 mM Kaliumiodid und Heparin 0,5 mg/ml.
Minisäulen, z.B. Biorad-Poly-Prep^® (7311553)
Minisäulen-Waschvorrichtung, d.h. Supelco Visiprep-Festphasenextraktionsvakuum-Manifold. Kunststoffröhrchen, z.B. Nunc 4,5 ml Cryogen-Röhrchen.
Mikrotiterplatten mit immobilisiertem prA, d.h. Nalge Nunc NucleoLinck^® Cystein-modifizierendes Mittel, z.B. 66 mM 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) in Wasser gepuffert mit 0,87 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan (pH 8,3).
Mildes Sulfhydryl-reduzierendes Mittel, z.B. 33 mM Cysteamin in Wasser.
Verwendete Puffer:

A) Waschpuffer: 20 mM MES, pH 5,4, 500 mM Kaliumacetat (KAc)
B) Konditionierungspuffer. Ein RT-Test-kompatibler Puffer, z.B. 50 mM (N-(2-Hydroxyethylpiperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (Hepes), pH 7,6, KAc 25 mM, Magnesiumchlorid (MgCl₂) 20 mM, Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether) N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA) 0,2 mM, Spermin 2 mM und Hitzeinaktiviertes Rinderserumalbumin (BSA) 0,5 mg/ml.
C) Lysepuffer: Ein RT-Test-kompatibler Puffer schließt ein Detergens, z.B. 1,25 % Polyoxyethylen-4-laurylether (Brij 30), 13 ng/ml odT₂₂ und die gleichen Bestandteile wie der Konditionierungspuffer (B) ein. Ein Sulfhydryl-reduzierendes Mittel, d.h. 0,2 mM Cysteamin, wird optional hinzugegeben, wenn Viren mit einer RT verarbeitet werden, die gegenüber einer SH-Oxidation/Modifizierung empfindlich ist.

RT-Reaktionsmischung: (N-(2-Hydroxyethylpiperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (Hepes) 11,7 mM, pH 7,6, BrdUTP 28,3 μM, odT₂₂ 120 ng/ml, MgCl₂ 4 mM, Dextransulfat 0,05 g/l, Spermin 2 mM, Triton-X 100 0,5 % (V/V), Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether), N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA) 0,2 mM und Rinderserumalbumin (BSA) 0,5 mg/ml.
DNA-Polymerase-γ und Retro-DNA-Polymerase-Basispuffer. Hepes 50 mM, pH 8,0, MgCl₂ 8 mM, Dextransulfat 1,5 μg/l, Spermin 1 mM, Triton-X 100 0,5 % (V/V), EGTA 0,2 mM, Dithiothreitol (DTT) 1,5 mM und Rinderserumalbumin (BSA) 0,5 mg/ml.
DNA-Polymerase III-Basispuffer. (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) (MES) 40 mM, pH 6,8, Kaliumacetat (KAc) 40 mM, MgCl₂ 10 mM, Spermin 2 mM, Polyoxyethylensorbitanmonolaureat (Tween 20) 0,5 % (V/V), EDTA 0,1 mM, Dithiothreitol 1,5 mM und Rinderserumalbumin (BSA) 50 μg/ml.
DNA-Polymerase-β-Basispuffer. 3-[(1,1-Dimethyl-2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxy-1-propansulfonsäure (AMPSO) 20 mM, pH 8,3, MgCl₂ 1 mM, Spermidin 3 mM, BSA1 μg/ml, EDTA 10 μM, DTT 0,1 μM, Tween 20 0,01 %. DNA-Polymerase-Reaktionsgemisch. DNA-Polymerasebasispuffer, verstärkt durch 24 μM BrdUTP, 49,5 μM dGTP, 49,5 μM dATP, 49,5 μM dCTP und 500 ng Matrize/ml.
Retro-DNA-Polymerasereaktionsgemisch mit ATP. Die DNA-Polymerase γ und Retro-DNA-Polymerasereaktionsmischung wurde mit 3,2 mM ATP verstärkt, und der pH auf 7,1 eingestellt.
Beispiele
Beispiel 1. Verwendung von verschiedenen Matrizen für die Zweitstrangsynthese durch HIV RT.
Zweischritt-Verdünnungsreihen der angegebenen Matrizenkonstrukte, ausgehend von 200 ng/ml wurden in jede Vertiefung von Mikrotiterplatten mit immobilisiertem Primer gemäß "Herstellung von Primer-beschichteten Mikrotiterplatten" eingeschlossen. 100 fg rekombinanter HIV-1 RT wurde in jede Vertiefung gegeben, und die Dauer der RT-Reaktion betrug 18 Stunden. Die Dauer der Polymeraseaktivität an jeder Matrize wurde gemäß "Protokoll für den DNA-Polymerasetest" unter Verwendung von DNA-Polymerase-γ und Retro-DNA-Polymerase-Basispuffer. 50 mM NaCl oder alternativ 100 mM wurden während der Bindung des Anti-BrdU-monoklonalen Antikörpers verwendet. Die Aktivitäten, die festgestellt wurden, wurden gegenüber der Konzentration der Matrize aufgetragen und das maximale erhaltene Signal für jede Art von Matrize wurde aus dem Plateau-Wert des entsprechenden Graphen berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Eine klare Korrelation wurde zwischen der Länge des A-Schwanzes und dem maximalen Signal, das in dem Polymerasetest erreichbar ist, gefunden. Die Länge des A-Schwanzes betraf ebenfalls die Fähigkeit des Antikörpers, der verwendet wurde, um das Produkt nachzuweisen, um bei erhöhter ionischer Stärke zu binden.
Beispiel 2. Wirkung der Matrizensequenz auf die Inhibierung der DNA-Polymerase III mit TMAU.
6-Anilinuracile sind selektive Inhibitoren der DNA-Polymerase III in Gram-positiven Bakterien. Das Anilinuracil-Molekül inhibierte sein Polymerase III-Ziel durch Sequestrieren desselben in einen inaktiven DNA-Medikamenten-Proteinkomplex (Tarantino et al., 1990). Das Medikament TMAU kann als Analogon von GTP angesehen werden. Die inhibitorische Fähigkeit der angegebenen Konzentration an TMAU gegenüber 1,25 ng/Vertiefung rekombinanter DNA-Polymerase III wurden gemäß "Protokoll für die Bestimmung der Inhibierung der Synthese des zweiten Stranges an verschiedenen DNA-Matrizen" unter Verwendung von entweder (CTGA)6-A12 (SEQ ID NO: 10) (∎) oder (CTG)6-A3 (SQ ID NO: 11)
als Matrize bestimmt. Die Reaktionsdauer der Polymerase betrug 1 Stunde, und die GTP-Konzentration in dem DNA-Polymerase III-Reaktionsgemisch wurde auf 2,5 μM reduziert. Die Polymeraseaktivitäten, die an der angegebenen Matrize erreicht wurden, wurden in % Aktivitäten umgerechnet, welche mit der gleichen Polymerase gefunden wurde, welche in Abwesenheit eines Inhibitors inkubiert wurde.
Die Ergebnisse werden in 1 dargestellt. Der hoch spezifische Inhibitor wies eine variierende inhibitorische Fähigkeit, abhängig von der Sequenz der verwendeten Matrize auf. Die vorliegende Erfindung stellt ein System bereit, in dem die verwendete DNA-Matrize leicht geändert werden kann, um die spezifischen Bedingungen, die durch das Enzym oder den untersuchten Inhibitor benötigt werden, zu berücksichtigen.
Beispiel 3. Nachweisempfindlichkeit des DNA-Polymerasetests.
Die Aktivität serieller Verdünnungen von HIV-1-Wildtyp-RT (⧫), Säuger-DNA-Polymerase-β (⦁) und E. coli-DNA-Polymerase I
wurden gemäß "Protokoll für den DNA-Polymerasetest" gemessen, indem Basispuffer verwendet wurden, die für jedes angegebene Enzym optimiert wurden. Die Polymerasereaktionsdauer, die verwendet wurde, betrug über Nacht (18 Stunden). Die Ergebnisse werden in 2 wiedergegeben. Jede der drei Enzympräparate spiegelt eine lineare Beziehung zwischen der Enzymmenge, die verwendet wurde, und der Menge des gewonnenen Produkts wider. Der Testhintergrund betrug 3800 rfu/Stunde. Indem ein doppelter Hintergrund als cut-off-Wert für den signifikanten Signalnachweis benutzt wurde, war es möglich, bis zu 10 nE HIV-1-Wildtyp RT, 6 nE Säuger-DNA-Polymerase-β und 3 nE E. coli-DNA-Polymerase I nachzuweisen.
Beispiel 4. Die Aktivität von fünf DNA-Polymerasen in verschiedenen Testsystemen.
Die Aktivität serieller Verdünnungen von DNA-Polymerase-α, DNA-Polymerase-β, DNA-Polymerase-γ, Serum eines Patienten, der an einem non-Hodgkin-Lymphom leidet und HIV-1 RT wurden gemäß "Protokoll für den DNA-Polymerasetest" und "Protokoll für die Bestimmung der RT-Aktivität" unter Verwendung von Reaktionslösungen, die auf den angegebenen Polymerase-Basispuffern beruhen, gemessen. Die Reaktionsdauer der Polymerase, die verwendet wurde, betrug 2 Stunden. Die festgestellten Aktivitäten wurden in % Aktivität auf eine variable DNA-Matrize bei den optimalen Reaktionsbedingungen für jedes Enzym zurückgerechnet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Jedes der fünf Enzympräparate, das untersucht wurde, hat seine eigenen Vorzüge, was die optimalen Reaktionsbedingungen betrifft. Die DNA-Polymerase-α und die humane Serumpolymerase wiesen jedoch ein ähnliches Muster auf. Nur die HIV-1 RT und die DNA-Polymerase-γ ergaben eine signifikante Aktivität im Umkehrtranskriptasetest.
Beispiel 5. Nachweis der Fähigkeit des DNA-Polymerasetests, die Inhibierung durch die Dedeoxyanaloga aller vier DNA-Basen zu messen.
Die inhibitorische Fähigkeit der angegebenen Konzentrationen an ddATP (∎), ddGTT (⧫), ddCTP (⦁) und ddTTP
gegenüber der Aktivität von 80 fg rekombinanter Wildtyp-HIV-1 RT wurde gemäß "Protokoll für die Bestimmung der Inhibierung der Synthese des zweiten Stranges an verschiedenen DNA-Matrizen" bestimmt. Die Polymeraseaktivität bei jeder Inhibitorkonzentration wurde in % der Aktivität einer Kontrolle in Abwesenheit eines Inhibitors rückgerechnet. Die Ergebnisse werden in 3 wiedergegeben.
Die Polymerasereaktion, bei der die Matrize (CTGA)₆-A₁₂ (SEQ ID NO: 10) benutzt wurde, wurde als empfindlich gegenüber einer Inhibierung durch die Dideoxyanaloga aller vier DNA-Basen befunden. Die IC₅₀-Werte, die festgestellt wurden, variierten von 20 nM for ddCTP bis 80 nM für ddATP.
Beispiel 6. Vergleich der Wirkung von Nicht-Nucleosid-Inhibitoren auf die Erst- und Zweitstrang-DNA-Synthese durch HIV-1 RT.
Die Wirkungen der drei Nicht-Nucleosid-Inhibitoren auf die angegebene rekombinante HIV-1 RT wurden gemäß "Protokoll für die Bestimmung der Inhibierung der Synthese des zweiten Stranges an verschiedenen DNA-Matrizen" unter Verwendung der DNA-Polymerase-γ und Retro-DNA-Polymerase-Basispuffer bzw. "Protokoll zur Bestimmung der Inhibierung der reversen Transkription" bestimmt. Die Dauer der Polymerisierungsreaktionen betrug 19 Stunden für die Zweitstrangsynthese an (CTGA)₆-A₁₂ (SEQ ID NO: 10) und 2 Stunden für die Erststrangsynthese an prA. Die RT-Aktivitäten, die erreicht wurden, wurden in % der Aktivitäten, die festgestellt wurden, wenn die gleiche RT in Abwesenheit eines Inhibitors inkubiert wurde, zurückgerechnet.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 zusammengefasst. Beide Testsysteme haben die Fähigkeit zwischen resistenten (Y181C, V179D) und empfindlichen RT-Enzymen zu unterscheiden. Die IC₅₀-Werte der Inhibitoren wurden nicht signifikant über einen 5-fachen Unterschied der verwendeten Enzymmenge in irgendeinem der zwei Testsysteme betroffen. Des weiteren gab es keine signifikante Unterschiede zwischen den erreichten IC₅₀-Werten durch die Messung der Inhibierung der Erst- oder Zweitstrang-DNA-Synthese.
Beispiel 7. Nachweis des biochemischen Mechanismus, der einer Resistenz gegen das antivirale Medikament Tenofovir zugrundeliegt.
Die fortgesetzte Therapie HIV-infizierter Individuen mit Nucleosid-Analoga führt zur Entwicklung resistenter Viren. Dieser Prozess ist assoziiert mit dem graduellen Auftreten von Mutationen in dem viralen Polgen. Die Wirkungen dieser Substitutionen auf enzymatischen Niveaus sind kompliziert und schließen die Verstärkung einer primitiven DNA-Editierfunktion ein. Diese Reaktion ist nucleotidabhängig und führt zu Dinucleosidpolyphosphat und einem verlängerbaren DNA-3'-Ende.
Die Wirkungen serieller Verdünnungen von Tenofovirtriphosphat auf 4 pg/Vertiefung der angegebenen rekombinanten HIV-1 RT wurden bestimmt gemäß "Protokoll für die Bestimmung der Inhibierung der Synthese des zweiten Stranges an verschiedenen DNA-Matrizen", indem eine Standardreaktionslösung, die auf dem DNA-Polymerase-γ-und -Retro-DNA-Polymerasebasispuffer beruhte, benutzt wurde, und auf der gleichen Reaktionslösung, die mit ATP ergänzt wurde. Die Dauer der Polymerisierungsreaktionen betrug 19 Stunden. Die RT-Aktivitäten, die erreicht wurden, wurden in % der Aktivität der gleichen RT, die in Abwesenheit eines Inhibitors inkubiert wurde, zurückgerechnet. 4 zeigt die Ergebnisse.
Symbole: HIV-1-Wildtyp-RT in der Standard-DNA-Polymerasereaktion
. HIV-1-Wildtyp-RT in DNA-Polymerasereaktionslösung mit ATP (⦁), T69S→SS/L210W/T215Y HIV-1 mutierte RT in Standard-DNA-Polymerasereaktionslösung
, T69S→SS/L210W/T215Y HIV-1 mutierte RT in DNA-Polymerasereaktionslösung mit ATP (⧫).
Die in 4 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, dass der Unterschied der Medikamentenempfindlichkeit zwischen der Wildtyp- und mutierten RT ungefähr 10-fach anstieg, wenn eine Reaktionslösung mit der Fähigkeit, eine ATP-abhängige Phosphorolysereaktion zu unterstützen, verwendet wurde.
Beispiel 8. Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber Nevirapin unter Verwendung von aus Plasma stammender RT.
1 ml-Proben des Plasmas von 3 HIV-infizierten Individuen aus Stockholm, Schweden, wurden gemäß dem "Protokoll für die Isolierung der viralen RT aus Material, welches RT-blockierende Antikörper enthält, basierend auf der Zerstörung löslicher zellulärer Enzyme, gefolgt von der Isolierung einer viralen RT aus Minisäulen" verarbeitet. Jede Plasma RT und die zwei Kontrollenzyme wurden in einen Satz serieller Verdünnungen von Nevirapin gemäß dem "Protokoll für die Bestimmung der Inhibierung der Synthese des zweiten Stranges an verschiedenen DNA-Matrizen" unter Verwendung von "DNA-Polymerase-γ and Retro-DNA-Polymerase-Basispuffer" titriert. Siehe 5.
Symbole:
RT eines Patienten 1 mit 140.000 Genomkopien/ml, (∎) RT des Patienten 2 mit 180.000 Genomkopien/ml,
RT des Patienten 3 mit 390.000 Genomkopien/ml, (⦁) eine Kontrolle, die aus der rekombinanten HIV-1-Wildtyp RT besteht, (⧫) und eine Kontrolle, die aus der rekombinanten HIV-1 mutierten RT (L100I) besteht, mit mittlerer Nevirapinresistenz.
Die IC₅₀-Werte gegenüber Nevirapin, die für die RTs der Patienten festgestellt wurden, variierten von 0,7 bis 1,2 μM. Um mit 0,5 μM der Kontrolle Wildtyp RT und > 10 μM der mutierten RT mit mittlerer Nevirapinresistenz (L100I) verglichen zu werden.
Beispiel 9. Nachweis der DNA-Polymeraseaktivität im Serum von Patienten mit lymphoproliferativen Störungen.
Serum von vier Patienten, die an Non-Hodgkin's-Lymphomen leiden und von sechs gesunden Blutspendern wurden seriell in DNA-Polymerase III-Basispuffer verdünnt. Die Polymeraseaktivität bei jeder Verdünnungsstufe wurde gemäß "Protokoll für den DNA-Polymerasetest" unter Verwendung von zwei und sechs Stunden Reaktionsdauer der Polymerase gemessen.
Die DNA-Polymeraseaktivität/μl Serumprobe und Stunde Polymerasetest wurden in einem Verdünnungsbereich berechnet, indem es einen linearen Zusammenhang zwischen der gebildeten Produktmenge und der zum Test hinzugegebenen Plasmamenge berechnet (siehe Tabelle 4).
Jede Serumprobe der Patienten mit Non-Hodgkin's Lymphom enthielt individuelle Mengen an DNA-Polymeraseaktivität, mit ähnlichen Eigenschaften wie die DNA-Polymerase α (siehe Tabelle 3). Die Menge der Aktivität reichte von ungefähr 2 bis 190 mal des Durchschnittswertes, der bei gesunden Blutspendern gefunden wurde.
Tabelle 1. Verwendung verschiedener Matrizen für die Zweitstrangsynthese durch HIV RT.

* Zweischrittverdünnungsserien der angegebenen Matrize, ausgehend von 200 ng/ml wurden in jede Vertiefung von Mikrotiterplatten mit immobilisiertem Primer eingeschlossen. 100 fg rekombinanter HIV-1 RT wurde in jede Vertiefung gegeben, und die Dauer der RT-Reaktion betrug 18 Stunden. 50 mM wurden während der Bindung eines Anti-BrdU-monoklonalen Antikörpers verwendet. Die herausgefundenen Aktivitäten wurden gegen die Konzentration der Matrize aufgetragen, und das maximale Signal, das für jede Matrize erreicht wurde, wurde berechnet.
^a RT-Reaktionsbedingungen und Berechnungen waren identisch wie im "maximalen Signal", aber während der Antikörperbindung wurden 100 nM NaCl verwendet.

Tabelle 2. Scheinbare Aktivität von vier Säuger-DNA-Polymerasen und HIV-RT in verschiedenen Testsystemen

* % der Aktivität an einer variablen DNA-Matrize bei optimalem Basispuffer des angegebenen Isozyms
^{a DNA-Polymerase γ und Retro-DNA-Polymerasepuffer}
^b Aktivität im RT-Test mit prA/odT als Primermatrize.

Tabelle 3. Vergleich der Wirkung von Nicht-Nucleosidinhibitoren auf Erst- und Zweitstrang-DNA-Synthese durch HIV-1 RT

* Die Wirkungen von drei Nicht-Nucleosidinhibitoren auf die angegebenen rekombinanten HIV-1 RT wurden gemäß "Protokoll für die Bestimmung der Inhibierung der Synthese des zweiten Stranges an verschiedenen DNA- Matrizen" und "Protokoll zur Bestimmung der Inhibierung der reversen Transkription" bestimmt. Die Dauer der Polymerisierungsreaktionen betrug 19 Stunden für die Zweitstrangsynthese an (CTGA)6-A12 (SEQ ID NO: 10) und 2 Stunden für die Erststrangsynthese an prA. Die RT-Aktivitäten, die erhalten wurden, wurden in Prozent der Aktivitäten zurück gerechnet, die herausgefunden wurden, wenn die gleiche RT in Abwesenheit eines Inhibitors inkubiert wurde.

Tabelle 4. Nachweis der DNA-Polymeraseaktivität im Serum von Patienten mit lymphoproliferativen Störungen

^a Patient, der an Non-Hodgkin-Lymphom leidet
* NS, nicht signifikant.

Serum von vier Patienten, die an Non-Hodgkin-Lymphom leiden und von sechs gesunden Blutspendern wurden seriell in DNA-Polymerase III-Basispuffer verdünnt. Die Polymeraseaktivität bei jeder Verdünnungsstufe wurde gemäß "Protokoll für den DNA-Polymerasetest" gemessen. Die DNA-Polymerase-Aktivitäten, die in der Tabelle aufgeführt wurden, wurden aus dem Verdünnungsbereich berechnet, wo es einen linearen Zusammenhang zwischen der Menge des gebildeten Produktes und der Menge des hinzugegebenen Plasmas gab. Der Testhintergrund 854 flu/h ist von allen Werten abgezogen worden.
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SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Messung der DNA-abhängigen DNA-Polymerisation in einer biologischen Probe mit folgenden Schritten: a) Herstellung eines Primers mit einer kurzen einsträngigen spezifischen Sequenz, die keine interne Basenpaarung eingehen kann, gebunden an eine feste Phase, b) Kontaktieren des Primerkonstrukts mit einem Reaktionsgemisch, welches ein einsträngiges Deoxynukleotid-Templatekonstrukt, bestehend, vom 5'-Ende ausgehend, aus einem (A)n-Polymer, einem variablen Teil (CTGA)m und einer zum Primer komplementären Sequenz, und die vier Deoxynukleosid-Triphosphate enthält, wovon eines derart modifiziert ist, dass es von einem markierten Antikörper spezifisch erkannt wird, c) Hinzufügen einer die DNA-Polymerase enthaltenden biologischen Probe zum Gemisch von b), d) Ablaufenlassen der Polymerasereaktion, e) Inkubieren des immobilisierten Reaktionsprodukts aus d) mit dem markierten Antikörper, f) Ermittlung der Menge gebundener markierter Antikörper mit Hilfe der verwendeten Markierung, und g) Messung der Menge an eingebautem modifiziertem Deoxynukleosidtriphosphat als Mass für die DNAPolymerisation mit Hilfe der Markierung des gebundenen Antikörpers.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Polymerase eine Retrovirus-Reverse-Transkriptase (RT) ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die Retrovirus-RT Humanimmunodefizienzvirus- (HIV-) RT ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, worin das modifizierte Deoxynukleosid-Triphosphat 5-Bromodeoxyuridin-5'-Triphosphat (BrdUTP) und der markierte Antikörper ein mit alkalischer Phosphatase (Ap) monokloner konjugierter anti-BrU-Antikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, worin die gemessene DNA-Polymerisation für Arzneimittelempfindlichkeitstests verwendet wird:
Handelspackung zur Messung der DNA-abhängigen DNA-Polymerisation nach einem der Ansprüche 1–4, enthaltend a) einen Primer mit einer kurzen einsträngigen spezifischen Sequenz, die keine interne Basenpaarung eingehen kann, gebunden an eine feste Phase, b) ein einsträngiges Deoxynukleotid-Templatekonstrukt bestehend, vom 5'-Ende ausgehend, aus einem (A)n-Polymer, einem variablen Teil (CTGA)m und einer zum Primer in a) komplementären Sequenz, c) die vier Deoxynukleosid-Triphosphate, wovon eines derart modifiziert ist, dass es von einem markierten Antikörper spezifisch erkannt wird, und d) den markierten Antikörper, der das modifizierte Deoxynukleosid-Triphosphat in c) erkennt.