CN1541276A - 用于测量dna聚合作用的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

描述了一种用于测量生物样品中依赖DNA的DNA聚合作用的方法。所述方法包括下述步骤：提供一种与固相结合的引物，所述引物具有单链特异性短序列且不能进行内部碱基配对；使所述引物构建体与含有其序列的一部分与所述引物互补的单链脱氧核苷酸模板和四种脱氧核苷三磷酸的反应混合物接触，其中一种脱氧核苷三磷酸经修饰致使其为标记抗体所特异性识别；向所述混合物中加入包含所述DNA聚合酶例如逆转录病毒逆转录酶(RT)的生物样品；让所述聚合酶反应进行；将所述固定化反应产物与所述标记抗体一起温育；检测结合标记抗体的量；并且测量掺入的修饰脱氧核苷三磷酸的量，作为所述DNA聚合作用的测量结果，可将其用于药物敏感性测试。也公开了一种商业成套试剂。

Description

用于测量DNA聚合作用的方法及其应用
本发明涉及一种用于测量DNA聚合作用的方法及其应用。更准确地讲，本发明涉及一种用于测量依赖DNA的DNA聚合作用的方法。
背景
近几十年来用于测量逆转录即依赖RNA的DNA聚合作用的新方法已经历了快速演变。迄今为止，关于定量测定依赖DNA的DNA聚合作用的更复杂问题，受到的关注却少得多。
经典DNA聚合酶活性测定涉及用DNA酶处理的DNA(“活化DNA”)作为引物/模板并将放射性标记核苷酸掺入到DNA中(Aposhian和Kornberg，1962)。对酸可沉淀的放射性的测量使得可以计算出所掺入的核苷酸量和存在的酶单位数。然而，放射性的应用目前在许多实验室受到限制并感到悲观，这是由于摆脱基于放射性的技术的总倾向而造成的。
对于DNA聚合酶，一种基于ELISA来检测掺入到新制备的DNA的毛地黄毒苷标记核苷酸的商业测定是可利用的(Roche MolecularBiochemicals Cat.no 1468120，US5635350)。该测定由于要使用两种不同的具有大基团的核苷酸底物类似物-作为标记的毛地黄毒苷和用于产物固定化的生物素而受到阻碍。结果，聚合反应速度和后续检测灵敏度均降低。高度偏离动力学特性的底物类似物的应用使该系统与对不同聚合酶药物敏感性研究的相关性降低。
另一个更有吸引力的替代方法是DNA聚合酶全酶的基于荧光的测定，该测定基于染料PicoGreen与双链DNA的特异性反应(Seville等，1996)。后一方法最近已加以改进，使其适合于范围更宽的不同DNA聚合酶(Tveit和Kristensen，2001)。该测定技术上简单并且基于天然核苷酸的应用。然而，检测灵敏度仍在与经典放射性DNA聚合酶测定的灵敏度相同的范围内，并且已描述的应用证明，检测范围为0.05-0.5 U DNA聚合酶/样品。
当前的HIV疗法基于多药疗法。治疗方案基于所有三种可利用药物-核苷类似物、非核苷类似物和蛋白酶抑制剂的组合。该策略是将突变病毒存活的概率减至最小。
逆转录酶(RT)抑制剂或者是核苷类似物，或者是非核苷类似物。所述非核苷抑制剂与RT酶中活性部位附近但并不与其相邻的疏水性口袋结合。HIV-1复制由于取代了与聚合酶结合部位相关的催化性天冬氨酸残基而在变构水平上受到抑制。
当前所用的核苷抑制剂由于其缺乏3’-羟基而终止DNA链的延伸。用核苷抑制剂的长期疗法通常导致产生抗性病毒。该方法与病毒pol基因中不断出现的突变相关，每一突变都导致已确定氨基酸的取代(有关综述参见Vandamme等，1998)。这些取代在酶水平上的作用是复杂的并且包括增强原始DNA的编辑功能。该反应是核苷酸依赖性的并且产生多磷酸二核苷和可延伸的DNA 3’端(Arion等1998，Meyer等1999)。
所述HIV-1 RT以及其它逆转录酶进行三种不同的酶促反应：依赖RNA的DNA聚合作用、依赖DNA的DNA聚合作用和DNA-RNA杂合体中RNA的降解(RNA酶H)。由pol基因编码的HIV逆转录酶是一种由一个p66亚基和一个p51亚基组成的异二聚体。依赖RNA的DNA聚合作用和依赖DNA的DNA聚合作用均通过位于所述p66亚基的同一活性部位进行(有关综述参见Goff等，1990)。这些药物的反应机制主要根据其对依赖RNA的DNA聚合作用的作用来确定。对依赖DNA的DNA聚合作用的作用研究得比较少。
假如反应机制和有效代谢药物是已知和可利用的，则病毒药物的表型敏感性可以在酶水平上进行确定。依靠酶测定的能力和所用的病毒分离技术，药物敏感性测试在理论上可以用来自病毒培养繁殖的上清液、原代病毒分离物或者直接从患者中回收的病毒制备物来进行。常规RT活性测定是通过利用人工模板-引物的构建和标记脱氧核苷三磷酸作为核苷酸底物来进行的。所述模板/引物对poly(rA)/oligo(dT)是用于测定HIV以及其它逆转录病毒RT的最有效最常用的组合。当涉及药物敏感性测试时该测定类型的一个缺点是仅可测试非核苷类似物或可以与rA碱基配对的类似物。其它核苷酸碱基的类似物将需要基于可变聚合物模板的测定。含有嘧啶碱基的RNA聚合物对RNA酶敏感是众所周知的，因而实际上不适合于生物样品。因此，最好是以对可变DNA模板计划用于药物敏感性测试的聚合酶测定为根据，前提是所述测定系统得到的结果与抑制逆转录和药物经典表型抗性试验的那些结果有关。
当前所用的HIV疗法是DNA聚合酶抑制剂效力的唯一实例。目前的情况是，涉及细菌和其它微生物中的抗性产生推动对新类别的抗微生物药物的研究。DNA聚合酶是该项研究工作中的主要目标之一。因此，十分需要技术上简单的聚合酶测定，而不引起潜在环境危险并且可以适用于针对各种各样微生物DNA聚合酶同工酶的药物筛选。药物的毒性导致发现必须对相应的哺乳动物DNA聚合酶进行进一步评价。
可以用增殖相关聚合酶例如聚合酶-α和聚合酶-δ的定量测定来监测细胞增殖。在正文中可列举目前用胸苷激酶-另一种细胞增殖相关酶的血清水平对恶性疾病进行预后和分类(US4637977)。胸苷的磷酸化正是为DNA合成提供胸苷三磷酸的两种胞内合成途径之一。与胸苷激酶活性或胸苷掺入相比，对DNA聚合酶本身的测量可能得到对总DNA合成给出更准确的估计。
发明的描述
本发明提供一种微量滴定板形式的非放射性DNA聚合酶测定，使得能够进行产物的比色或荧光检测。
在一个优选的实施方案中，本发明利用作为核苷三磷酸底物的5-溴脱氧尿苷5’-三磷酸(BrdUTP)。BrdUTP中5’位溴和胸苷三磷酸中5’位甲基之间的范德华半径的差异最小(1.95A和2.0A相近)，并且这两种核苷酸的酶动力学特性十分相似。所述方法可以芳构化并且其检测范围低至3nU聚合酶活性/样品。
本发明的应用之一是药物敏感性测试。迄今所批准的所有抗逆转录病毒药物都干扰病毒蛋白酶或RT的酶促反应。另外在计划中还有影响逆转录病毒整合酶功能的候选药物。
具体地说，本发明提供一种测定各种各样不同的依赖DNA的DNA聚合酶的方法。尽管所用的模板比较短，但是已证明甚至对于研究高度加工的DNA聚合酶系统也是适合的。证明了测定细菌聚合酶I和III的活性、哺乳动物DNA聚合酶α、β和γ的活性、人血清中增殖相关聚合酶活性和HIV RT的依赖DNA的DNA聚合作用反应的有效性，但所述方法可以用于研究基本上所有病毒和细胞的DNA聚合酶。其特征之一是本发明的DNA聚合酶测定与现有技术的区别在于其突出的灵敏度，使检测出低至3nU大肠杆菌DNA聚合酶I活性成为可能。
因此，本发明的一方面涉及一种用于测量生物样品中依赖DNA的DNA聚合作用的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供一种与固相结合的引物，所述引物具有单链特异性短序列且不能进行内部碱基配对，
b)使所述引物构建体与含有其序列的一部分与所述引物互补的单链脱氧核苷酸模板和四种脱氧核苷三磷酸的反应混合物接触，其中一种脱氧核苷三磷酸经修饰致使其为标记抗体所特异性识别，
c)向b)的混合物中加入包含所述DNA聚合酶的生物样品，
d)让所述聚合酶反应进行，
e)将由d)产生的固定化反应产物与所述标记抗体一起温育，
f)借助所用的标记检测结合的标记抗体的量，和
g)借助所述结合抗体的标记测量掺入的修饰脱氧核苷酸的量，作为所述DNA聚合作用的测量结果。
在一个实施方案中，通过逆转录病毒逆转录酶(RT)例如人免疫缺陷病毒(HIV)RT，进行所述DNA聚合反应。
在另一个实施方案中，所述经修饰的脱氧核苷三磷酸是5-溴脱氧尿苷5’-三磷酸(BrdUTP)，而所述标记抗体是碱性磷酸酶(Ap)缀合的抗BrdU单克隆抗体。
在依照本发明方法的一个优选实施方案中，将所测量的DNA聚合作用用于药物敏感性测试。
进行所述药物敏感性测试以评价某一药物在哺乳动物个体中是否有效，并且可以用测试结果来选择该个体的药物疗法。实际上，对所述个体在数个时间点进行测试，以监控所述个体中药物治疗的发展。
本发明也涉及一种商业成套试剂(package)，所述商业成套试剂包括按照本发明用于测量依赖DNA的DNA聚合作用的书面说明和/或数据载体说明。所述成套试剂至少包括下列成分：
a)一种与固相结合的引物，所述引物具有单链特异性短序列且不能进行内部碱基配对，
b)一种单链脱氧核苷酸模板，所述模板具有与a)中的引物互补的序列的一部分，
c)四种脱氧核苷三磷酸，其中一种脱氧核苷三磷酸经修饰致使其为标记抗体所特异性识别，和
d)标记抗体，所述标记抗体识别c)中的修饰脱氧核苷三磷酸。
现在，通过下面非限制性描述本发明的实施方案和附图，举例说明本发明。
所引用文献的公开内容通过引用结合到本文中。
附图简述
图1证明模板序列的变异对DNA聚合酶III被TMAU抑制的影响。
图2举例说明DNA聚合酶测定的检测灵敏度。HIV-1野生型RT(◆)，哺乳动物DNA聚合酶β(●)和大肠杆菌DNA聚合酶I(▲)。
图3证明所述DNA聚合酶测定测量所述双脱氧类似物抑制所有四种DNA碱基的能力。符号说明：ddATP(■)，ddGTP(◆)，ddCTP(●)和ddTTP(▲)。
图4显示作为对抗病毒药替诺福韦的抗性基础的生化机制基于增强依赖ATP的磷酸解反应。符号说明：标准反应溶液中的HIV-1野生型RT(○)。含有ATP的反应溶液中的HIV-1野生型RT(●)，标准反应溶液中的HIV-1突变型RT(◇)，含有ATP的反应溶液中的HIV-1突变型RT(◆)。
图5举例说明用从HIV感染个体血浆中分离的RT测定对抗病毒药奈韦拉平的敏感性。符号说明：(□)、(■)和(▲)来自感染个体的RT，(●)由重组HIV-1野生型RT组成的对照，(◆)具有中等奈韦拉平抗性的由突变型(L100I)重组HIV-1 RT组成的对照。
实施方案的描述
引物包被的微量滴定板的产生
将1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)羧二酰亚胺盐酸盐(终浓度10mg/ml)加入到100mM 1-甲基咪唑缓冲液(pH7.0)中，并用所述混合物稀释所述引物构建体至终浓度为1μg/ml。将100μl该引物缓冲液等分至由Nalge Nunc NucleoLink透明纸条(Cat no 248259)组成的微量滴定板的各孔中。将该板于37℃温育6-8小时，用含有2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的2M NaOH溶液充分洗涤，然后浸泡在三个装有水的5L管形瓶中。通过使板正面朝下放在吸水布或吸水纸上，除去各孔中的残留液体。让板在室温下干燥30分钟，最后于-20℃冷冻贮存。
DNA-聚合酶测定的方案
所述DNA-聚合酶测定基于一种具有与96孔微量滴定板各孔共价结合的特异性序列的短引物。所述反应混合物含有其序列的一部分与所述引物互补的单链脱氧核苷酸模板和四种脱氧核苷三磷酸。然而，胸苷三磷酸被5-溴脱氧尿苷5’-三磷酸(BrdUTP)取代。在所述聚合酶反应期间掺入到DNA中的溴脱氧尿苷一磷酸(BrdUMP)的量用碱性磷酸酶(Ap)缀合的抗BrdU单克隆抗体进行检测。用Ap底物4-甲基伞形基磷酸酯进行荧光产物检测。
向引物包被的微量滴定板的各孔中加入100μl DNA聚合酶反应混合物。样品用DNA聚合酶碱性缓冲液稀释，通过将50μl样品稀释液转移到板的各孔中，起始聚合酶反应。将微量滴定板于33℃温育规定时间后，通过用含有1.5％(v/v)辛基苯氧基聚乙氧乙醇(TritonX-100)的3mM硼酸盐缓冲液(pH8.9)洗涤该板，而终止反应。通常温育2次即4小时和过夜(16小时)，以检查聚合反应的线性化程度。该板用含有2mM EDTA的2M NaOH溶液充分洗涤，然后浸泡在三个装有水的5L管形瓶中。
接着，将该板与以下组分于33℃温育90分钟：100μl碱性磷酸酶(Ap)缀合的抗BrdU单克隆抗体(用含有50mM NaCl的25mM(双[2-羟乙基]亚氨基三[羟甲基]甲烷、2-双[2-羟乙基]氨基-2-[羟甲基]-1，3-丙二醇)(Bis Tris)缓冲液(pH7.2)稀释至4.8μg/ml)、37.5mM(NH4)2SO4、1mg/ml硫酸葡聚糖、1％Triton X-100和25mg/ml Sigma脱脂奶粉。
此后，该板再次用含有1.5％(v/v)Triton X-100的3mM硼酸盐缓冲液(pH8.9)洗涤，以除去未结合的标记抗体。用溶于Tris缓冲液(pH8.9)中的4-甲基伞形基磷酸酯底物测定所述碱性磷酸酶活性。用Wallac Victor 2读出仪，在规定间隔读出460nm的荧光(激发波长355nm)。
抑制可变DNA模板上第二链合成的测定方案
在改进的DNA聚合酶测定中进行所述抑制研究。所述药物分5个步骤进行连续稀释，且将25μl等份样品转移至微量滴定板的各孔中，与100μl DNA聚合酶反应混合物混合，通过加入25μl酶稀释液起始酶反应。在标准反应条件下对非核苷类似物进行研究，而在dNTP竞争性抑制剂的研究中，将所有四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)的浓度降至1μM。让所述聚合酶反应进行过夜(16-24小时，33℃)。此后，通过洗涤所述板终止反应。将IC50值定义为所研究的聚合酶活性达到50％抑制的药物浓度。
RT活性的测定方案
用改进的比色RT测定(CavidiLenti RT活性试剂盒)(可得自Cavidi Tech，Uppsala，瑞典)，测定在所研究的病毒制剂中的RT活性水平。所述方法已有描述(Ekstrand等，1996)。简而言之，用与96孔微量滴定板各孔共价结合的poly(rA)作为模板，从而在逆转录步骤中于33℃掺入5-溴脱氧尿苷5’-三磷酸(BrdUTP)。用碱性磷酸酶(Ap)缀合的抗BrdU单克隆抗体检测掺入到DNA中的溴脱氧尿苷一磷酸(BrdUMP)的量。最后，用Ap底物4-甲基伞形基磷酸酯进行荧光检测。
抑制逆转录的测定方案
在改进的Cavidi HS-kit Lenti RT测定中进行所述抑制研究。所述抑制剂分5个步骤进行连续稀释，然后将25μl等份样品转移至微量滴定板的各孔中，与100μl RT反应混合物混合，通过加入50μl酶稀释液起始酶反应。所述核苷三磷酸底物(BrdUTP)的终浓度为16μM，而引物(odT22)的含量为12ng/孔。让所述RT反应进行过夜(16-24小时，33℃)。此后，通过洗涤所述板而终止反应。将IC50值定义为所研究的RT活性达到50％抑制的药物浓度。基于可溶性细胞酶破坏后从微型柱中分离病毒RT而从含有RT封闭 性抗体的材料中分离病毒RT的方案
1)标记要使用的4.5ml塑料管。将其置于Nalgene盒中。向每支标记管中加入1ml样品(例如来自HIV感染个体的EDTA血浆)。加入100μl 66mM 5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)的缓冲水溶液，涡旋混合，将所述样品在室温下温育1小时。
游离的血浆酶活性在该步骤中遭到破坏，而病毒体内所含的酶则仍保持完整。然后可以通过几个分离步骤，从5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)、酶活性封闭性抗体和其它可能干扰病毒RT定量的物质中纯化所述病毒体。下述方案基于FractogelEMD TMAE Hicap凝胶的应用。
2)小心地悬浮分离胶，并转移1500μl凝胶浆至每支样品预处理管中。
3)将样品与凝胶浆在室温下温育90分钟，其中将所述管以水平方向放在定轨摇床上。
4)标记所需数目的10ml塑料微型柱，以识别要分析的样品。将该柱固定在柱洗涤装置即Supelco Visiprep固相抽真空歧管上。转移结合管中的内容物至其相应的柱中。转移前，将管涡旋一会儿，以使凝胶均匀分布。
5)当所有的柱都填满时，抽真空并将凝胶吸干。关掉真空，并通过将每个柱装入9ml缓冲液A开始洗涤。当所有的柱已装满时，抽真空并将凝胶吸干。
6)重复步骤5三次以上，总共洗涤4次。每次洗涤后都将凝胶吸干。在第4次洗涤后且将凝胶吸干后，关掉真空，进行步骤7。
所述洗涤步骤除去系统中未结合的RT封闭性抗体和5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)。
7)向所有干凝胶中加入9ml调节缓冲液(B)。1分钟后，抽真空并将凝胶吸干。
8)重复步骤7，在关掉真空之前，检查是否已从所有凝胶中除去所有调节缓冲液(B)。
9)卸下柱洗涤装置的上层部分。将装有标记管的管固定器固定在清洁的容器中。重新装上该装置的上层部分。控制各柱的小管落入其相应管中。
10)向每个柱中加入600μl裂解缓冲液(C)。让所述缓冲液在所述柱中停留5分钟。然后缓慢抽真空并将凝胶吸干。这将在每支管中得到来自相关凝胶的约600μl病毒裂解液。
从步骤10的裂解液中回收的RT活性基本上无RT封闭性抗体、药物和细胞聚合酶活性，并且可以用灵敏的RT活性测定，即基于Ekstrand等人描述的方法的Cavidi HS-kit Lenti RT[7]进行定量。按照所述方法获得的25μl裂解液足以测定所述样品中的RT活性。余下的575μl样品应于-70℃或-70℃以下冷冻贮存，以供以后用于药物敏感性试验。
请注意：对半胱氨酸修饰剂不敏感的RT酶例如野生型HIV 1 RT可以任选地在存在高达5mM 5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)的情况下进行测定。另一方面，敏感酶例如MULV RT和来自某些疗法的HIV1抗性株(含有例如突变Y181C)的RT要求向所述裂解缓冲液中加入巯基还原剂即半胱氨酸或半胱胺。
材料
用于DNA聚合酶测定的引物/模板
引物序列是18个碱基的5’-GTC-CCT-GTT-CCG-GCG-CCA-3’(SEQ ID NO：12)且在5’端通过C6间隔臂与伯胺连接。
模板构建体含有三个不同的功能部分。从5’端起：一种(A)n聚合物，用于扩增BrdU信号；一个可变部分(GTCA)m，以获得依赖于四种脱氧核苷三磷酸的聚合酶反应；和一个与所述引物互补的序列。
在本实验中，实施例中包括n＝12且m＝5，除非另有说明。
核苷、酶抑制剂和抗病毒药物
ddATP，2’3’双脱氧腺苷三磷酸；ddGTP，2’3’双脱氧鸟苷三磷酸；ddCTP，2’3’双脱氧胞苷三磷酸；ddTTP，2’3’双脱氧胸苷三磷酸。TMAU，6-([3，4-亚丙基]苯胺基)尿嘧啶。
替诺福韦，(R)-9-(2-膦酰甲氧基-丙基)腺嘌呤；奈韦拉平，(11-环丙基-5，11-二氢-4-甲基-6H-二吡啶并[3，2-b：2’，3’-f]二氮杂-6-酮)(NVP)；和依法韦仑，(-)6-氯-4-环丙基乙炔基-4-三氟甲基-1，4-二氢-2H-3，1-苯并噁嗪-2-酮)(EFV)。
酶
DNA聚合酶I(大肠杆菌)购自Amersham Bioscience。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococus aureus)的重组DNA聚合酶III如已描述的方法(Brown等，1998)生产。哺乳动物DNA聚合酶α(小牛胸腺)和β(人)购自CHIMERx(Milwaukee)。DNA聚合酶γ如已描述的方法(Pileur等，2000)从牛心中纯化。
产生NNRTI抗性突变形式的HIV-1 RT(L100I，K103N，L100I/K103N，Y181C)。用从BH10分离株构建的pETRT表达载体作为突变模板。用市售定点诱变试剂盒QuikChange(Stratagene)产生各种突变。所述突变通过DNA序列分析加以证实。突变形式和天然形式的RT如先前描述的方法(Lindberg等，2000)进行分离。
产生重组HIV-1 RT的方法与AZT特定突变的方法是相似的，只是将突变引入HXB2-D分离株的RT编码区中。
来自HIV感染个体的血浆样品
追溯既往地选出来自治疗原初患者的血浆样品或用常规联合疗法治疗的患者的血浆样品。通过标准HIV 1 RNA PCR(Cobas，RocheDiagnostica)，测量各样品中的HIV-1 RNA含量。 罹患淋巴组织增生 性疾病的患者血清样品得自the Department of Internal Medicine，Uppsala University，Akademiska sjukhuset，Uppsala。
分离胶：例如FractogelEMD TMAE或FractogelEMD TMAEHicap，在314mM(2-(N-吗啉代)乙磺酸)(MES)pH5.1、413mM碘化钾和0.5mg/ml肝素溶液中。
微型柱，例如Biorad Poly-Prep(7311553)
微型柱洗涤装置，即Supelco Visiprep固相抽真空歧管。
塑料管，例如Nunc 4.5ml低温管。
具有固定化prA的微量滴定板，即Nalge Nunc NucleoLinck。
半胱氨酸修饰剂，例如用0.87M三羟甲基氨基甲烷(pH8.3)缓冲的66mM 5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)水溶液。
温和巯基还原剂，例如33mM半胱胺水溶液。
所用的缓冲液：
A)洗涤缓冲液：20mM MES pH5.4，500mM醋酸钾(KAc)
B)调节缓冲液：适合于RT测定的缓冲液，例如50mM(N-(2-羟乙基哌嗪-N’-(2-乙磺酸))(Hepes)pH7.6，25mM KAc，20mM氯化镁(MgCl2)，0.2mM乙二醇-双(β-氨基乙醚)N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)，2mM精胺和0.5mg/ml热灭活牛血清白蛋白(BSA)。
C)裂解缓冲液：适合于RT测定的缓冲液，包含去污剂如1.25％聚氧乙烯4十二烷基醚(Brij 30)，13ng/ml odT22和与调节缓冲液(B)中组分相同的组分。巯基还原剂，即当用对SH氧化/修饰敏感的RT加工病毒时任选加入0.2mM半胱胺。
RT反应混合物：11.7mM(N-(2-羟乙基哌嗪-N’-(2-乙磺酸))(Hepes)pH7.6，28.3μM BrdUTP，120ng/ml odT22，4mM MgCl2，0.05g/l硫酸葡聚糖，2mM精胺，0.5％(v/v)Triton-X 100，0.2mM乙二醇-双(β-氨基乙醚)N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)。
DNA聚合酶γ和逆转录DNA聚合酶碱性缓冲液：50mM Hepes pH8.0，8mM MgCl2，，1.5μg/l硫酸葡聚糖，1mM精胺，0.5％(v/v)Triton-X 100，0.2mM EGTA，1.5mM二硫苏糖醇(DTT)和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)。
DNA聚合酶III碱性缓冲液：40mM (2-(N-吗啉代)乙磺酸)(MES)pH6.8、40mM醋酸钾(KAc)，10mM MgCl2，2mM精胺，0.5％(v/v)聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween 20)，0.1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇和50μg/ml牛血清白蛋白(BSA)。
DNA聚合酶β碱性缓冲液：20mM 3-[(1，1-二甲基-2-羟乙基)氨基]-2-羟基-1-丙磺酸(AMPSO)pH8.3，1mM MgCl2，3mM亚精胺，1μg/ml BSA，10μM EDTA，0.1mM DTT，0.01％Tween 20。
DNA聚合酶反应混合物。补充的24μM BrdUTP，49.5μMdGTP、49.5μM dATP、49.5μM dCTP和500ng模板/ml的DNA聚合酶碱性缓冲液。
含有ATP的逆转录DNA聚合酶反应混合物。所述DNA聚合酶γ和逆转录DNA聚合酶的反应混合物补充3.2mM ATP且将pH调至7.1。
实施例
实施例1.利用不同的模板通过HIVRT进行第二链合成
按照“ 引物包被的微量滴定板的产生”，具有固定化引物的微量滴定板各孔中包含始于200ng/ml的指定模板构建体的两步稀释系列。向各孔中加入100fg重组HIV 1 RT，且所述RT反应的持续时间为18小时。按照“DNA-聚合酶测定的方案”，使用 DNA聚合酶 γ和逆转录DNA聚合酶碱性缓冲液，测定各模板的聚合酶活性。在抗BrdU单克隆抗体结合期间使用50mM NaCl或者使用100mMNaCl。将所获得的活性对模板浓度作图，根据各图平稳段的值，计算出各模板类型所达到的最大信号。
结果概述于表1中。发现A-尾的长度和所述聚合酶测定中可获得的最大信号之间存在明确的相关性。A-尾的长度在离子强度增加的情况下的确影响产物检测所用的抗体结合的能力。
实施例2.模板序列对用TMAU抑制DNA聚合酶III的影响
6-苯胺基尿嘧啶是来自革兰氏阳性菌的DNA聚合酶III选择性抑制剂。所述苯胺基尿嘧啶分子通过将其螯合成无活性DNA-药物-蛋白复合物而抑制其聚合酶III靶(Tarantino等，1990)。所述药物TMAU可以被认为是GTP的类似物。按照“ 抑制可变DNA模板上 第二链合成的测定方案”，用或者(CTGA)6-A12(SEQ ID NO：10)(■)或者(CTG)6-A3(SEQ ID NO：11)(▲)作为模板，测定指定浓度的TMAU对1.25ng/孔重组DNA聚合酶III的抑制能力。该聚合酶反应时间为1小时，并将所述DNA聚合酶III反应混合物中的GTP浓度降至2.5M。将指定模板上所获得的聚合酶活性换算成在没有抑制剂的情况下与同一聚合酶一起温育所获得活性的百分比(％)。
结果示于图1。这种高特异性抑制剂根据所用的模板序列而表现出不同的抑制能力。本发明提供的一个容易改变所用DNA模板的系统，以计算出所研究的酶或抑制剂所需的特异性条件。
实施例3.DNA聚合酶测定的检测灵敏度
按照“ DNA-聚合酶测定的方案”，利用最适于指定酶的碱性缓冲液，测量连续稀释的HIV 1野生型RT(◆)、哺乳动物DNA聚合酶β(●)和大肠杆菌DNA聚合酶I(▲)的活性。所用的聚合酶反应时间为过夜(18小时)。结果示于图2。这三种酶制剂中的每种在所用的酶量和所回收的产物量之间都表现出线性关系。所述测定的本底为3800rfu/小时。用双本底作为明显信号检测的截止值，有可能检测出低至10nU HIV 1野生型RT、6nU哺乳动物DNA聚合酶β和3nU大肠杆菌DNA聚合酶I。
实施例4. 5种DNA聚合酶在不同的测定系统中的活性
按照“ DNA-聚合酶测定的方案”和“ RT活性的测定方案”，使用基于指定聚合酶碱性缓冲液的反应溶液，测量连续稀释的DNA聚合酶α、DNA聚合酶β、DNA聚合酶γ、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)患者血清和HIV-1 RT的活性。所用的聚合酶反应时间为2小时。将所获得的活性换算成每种酶在最适反应条件下于可变DNA模板上的活性的百分比(％)。结果示于表2。所研究的五种酶制剂中的每种对与最适反应条件有其独特的偏爱。然而，DNA聚合酶α和人血清聚合酶均表现出相似的模式。仅HIV-1 RT和DNA聚合酶γ在所述逆转录酶测定中得到显著性活性。
实施例5.证明DNA聚合酶测定测量双脱氧类似物抑制所有四种DNA碱基的能力
按照“ 抑制可变DNA模板上第二链合成的测定方案”，测定指定浓度的ddATP(■)、ddGTP(◆)、ddCTP(●)和ddTTP(▲)对80fg重组野生型HIV 1 RT活性的抑制能力。将在不同抑制剂浓度下的聚合酶活性换算成在没有抑制剂的情况下对照活性的百分比(％)。结果示于图3。
发现用模板(CTGA)6-A12(SEQ ID NO：10)的聚合酶反应对双脱氧类似物抑制所有四种DNA碱基敏感。所获得的IC50值在对于ddCTP为20nM至对于ddATP为80nM的范围内变动。
实施例6.非核苷抑制剂对第一链和第二链DNA合成受HIV 1 RT的影响的比较
分别按照“ 抑制可变DNA模板上第二链合成的测定方案”和“ 抑 制逆转录的测定方案”，使用 DNA聚合酶γ和逆转录DNA聚合酶碱 性缓冲液，测定3种非核苷抑制剂对指定重组HIV 1 RT的影响。聚合反应的持续时间分别是：对于在(CTGA)6-A12(SEQ ID NO：10)上的第二链合成为19小时，而对于在prA上的第一链合成为2小时。将所获得的RT活性换算成在没有抑制剂的情况下与同一RT一起温育所获得的活性的百分比(％)。
结果概述于表3。两个测定系统均具有鉴别抗性RT(Y181C，V179D)和敏感RT的能力。任何抑制剂的IC50值在这两个测定系统的任一个中不因为所用酶量的5倍差异而被显著影响。此外，通过测量对第一链或第二链DNA合成的抑制，所获得的IC50值之间没有显著性差异。
实施例7.证明作为对抗病毒药替诺福韦的抗性基础的生化机制
用核苷类似物长期治疗HIV感染个体导致产生抗性病毒。该过程与不断出现的病毒pol基因突变相关。这些取代在酶水平上的影响是复杂的并且包括增强原始DNA的编辑功能。该反应是核苷酸依赖性的并且产生二核苷多磷酸和可延伸的DNA 3’端。
按照“ 抑制可变DNA模板上第二链合成的测定方案”，使用基于 DNA聚合酶γ和逆转录DNA聚合酶碱性缓冲液的标准反应溶液和补充ATP的相同反应溶液，测定连续稀释的三磷酸替诺福韦对4pg/孔指定重组HIV 1 RT的影响。聚合反应的持续时间为19小时。将所获得的RT活性换算成在没有抑制剂的情况下温育的同一RT活性的百分比(％)。图4显示所得结果。
符号说明：标准DNA聚合酶反应溶液中的HIV-1野生型RT(○)。含有ATP的DNA聚合酶反应溶液中的HIV-1野生型RT(●)，标准DNA聚合酶反应溶液中的T69S→SS/L210W/T215Y HIV-1突变型RT(◇)，含有ATP的DNA聚合酶反应溶液中的T69S→SS/L210W/T215Y HIV-1突变型RT(◆)。
图4所示的结果证明，当使用能够支持ATP依赖性磷酸解反应的反应溶液时，野生型RT和突变型RT之间的药物敏感性差异大约增加10倍。
实施例8.用血浆源性RT测定对奈韦拉平的敏感性
按照“ 基于可溶性细胞酶破坏后从微型柱中分离病毒RT而从含 有RT封闭性抗体的材料中分离病毒RT的方案”，处理来自瑞典斯德哥尔摩(Stockholm，Sweden)的3位HIV感染个体的血浆样品各1ml。按照“ 抑制可变DNA模板上第二链合成的测定方案”，使用“ DNA 聚合酶γ和逆转录DNA聚合酶碱性缓冲液”，让每种血浆RT和两种对照酶对一组连续稀释的奈韦拉平溶液进行滴定。参见图5。
符号说明：(□)患者1的RT，140000基因组拷贝/ml；(■)患者2的RT，180000基因组拷贝/ml；(▲)患者3的RT，390000基因组拷贝/ml；(●)由重组HIV-1野生型RT组成的对照；和(◆)具有中等奈韦拉平抗性的重组HIV-1突变型RT(L100I)组成的对照。
发现患者RT对奈韦拉平的IC50值的变动范围为0.7-1.2μM。将对照野生型RT的0.5μM和具有中等奈韦拉平抗性的突变型RT(L100I)的＞10μM进行比较。
实施例9.淋巴组织增生性疾病患者血清中DNA聚合酶活性的检测
4位非霍奇金淋巴瘤患者血清和6位健康供血者血清用DNA聚合酶III碱性缓冲液连续稀释。按照“ DNA-聚合酶测定的方案”，使用2小时和6小时的聚合酶反应时间，测量各稀释步骤的聚合酶活性。
计算出所述稀释范围的DNA聚合酶活性/μl血清样品和小时聚合酶测定，在该范围内，在所形成的产物量和加入到所述测定中的血浆量之间存在线性关系(参见表4)。
非霍奇金淋巴瘤患者的每个血清样品都含有不同量的DNA聚合酶活性，其特性与DNA聚合酶α相似(参见表3)。活性量的范围为健康供血者中所获得的平均值的约2-190倍。
表1.用不同的模板通过HIV RT进行第二链合成
                                    100mM NaCla
          最大信号*      本底
              (rfu/小时)  (rfu/小时)  的信号(最大
所用的模板                             信号的％)    SEQ ID NO：
(CTGA)5         89444        1629        20        SEQ ID NO：1
(CTGA)5-A       63694        1958        25        SEQ ID NO：2
(CTGA)5-AA      184421       613         33        SEQ ID NO：3
(CTGA)5-AAAA    239688       2565        44        SEQ ID NO：4
(CTGA)5-A8      198894       1544        58        SEQ ID NO：5
(CTGA)6         60627        1285        22        SEQ ID NO：6
(CTGA)6-AAA     83555        1009        ND        SEQ ID NO：7
(CTGA)6-A5      119326       914         ND        SEQ ID NO：8
(CTGA)6-A9      202668       963         ND        SEQ ID NO：9
(CTGA)6-A12     226062       726         ND        SEQ ID NO：10
(CTG)6-A3       124334       814         ND        SEQ ID NO：11
*具有固定化引物的微量滴定板各孔中包括从200ng/ml开始的两步稀释系列的指定模板。向各孔中加入100fg重组HIV 1 RT且RT反应的持续时间为18小时。在抗BrdU单克隆抗体结合期间使用50mM。将所获得的活性对模板浓度作图，并计算各模板所达到的最大信号。
aRT反应条件和计算与“最大信号”中的相同，但在抗体结合期间使用100mM NaCl。
表2. 4种哺乳动物DNA聚合酶和HIV RT在不同测定系统中的表观活性
        DNA聚合酶同工酶在指定测定中的活性(％ * )
碱性缓冲液   DNA polα    DNA polβ   DNA polγ      血清DNAp  HIV RT
Pol III      100       17        0         100        0
DNA polβ         40        100       5          30        33
DNA polγa 1         13        100        9         100
prA/Lentib 0         0         10         0         2175
*用指定同工酶的最适碱性缓冲液对可变DNA模板活性的百分比(％)
a DNA聚合酶γ和逆转录DNA聚合酶碱性缓冲液。
b在RT测定中用prA/odT作为引物模板的活性。
表3.非核苷抑制剂对第一链和第二链DNA合成受HIV 1 RT的影响的比较
                 RT酶            模板的IC50(μm) *
抑制剂      类型    含量(fg)    (CTGA)6-A12 prA
奈韦拉平    wt        100           2.0        2.2
            wt        20            2.0        2.5
            Y181C     100           ＞500      200
            Y181C     20            ＞500      180
            V179D     100           8          7
            V179D     20            12         8
依法韦仑    wt        100           0.04       0.02
            wt        20            0.03       0.02
            Y181C     100           0.12       0.15
            Y181C     20            0.14       0.13
            V179D     100           0.5        0.7
            V179D     20            0.4        0.6
膦甲酸      wt        100           0.5        0.7
            wt        20            0.5        0.6
*分别按照“ 抑制可变DNA模板上第二链合成的测定方案”和“ 抑 制逆转录的测定方案”，测定3种非核苷抑制剂对指定重组HIV 1 RT的影响。聚合反应的持续时间分别是对于在(CTGA)6-A12(SEQ ID NO：10)上进行第二链合成为19小时，而对于在prA上进行第一链合成为2小时。将所获得的RT活性换算成在没有抑制剂的情况下与同一RT一起温育所获得的活性的百分比(％)。
表4.淋巴组织增生性疾病患者血清中DNA聚合酶活性的检测
血清编号    血清来源    聚合酶活性(rfu/小时/μl血清
                        /小时聚合酶反应)
T1          NHL患者a   158521
T2          NHL患者     1305
T3          NHL患者     3405
T4          NHL患者     16619
B1-B6       供血者      841±180
a非霍奇金淋巴瘤患者。
*NS，无显著性。
4位非霍奇金淋巴瘤患者血清和6位健康供血者血清用DNA聚合酶III碱性缓冲液连续稀释。按照“ DNA-聚合酶测定的方案”，测量各稀释步骤的聚合酶活性。根据稀释范围计算出列入表的DNA聚合酶活性，在该范围内，在所形成的产物量和加入的血浆量之间存在线性关系。所有值都减去测定的本底854flu/h。
参考文献
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<120>用于测量DNA聚合作用的方法及其应用
<130>110063501
<140>
<141>
<150>US 60/297,773
<151>2001-06-14
<160>12
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：模板
<400>1
ctgactgact gactgactga                                       20
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：模板
<400>2
ctgactgact gactgactga a                                     21
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：模板
<400>3
ctgactgact gactgactga aa                                    22
<210>4
<211>24
<212>DNA
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<220>
<223>人工序列的描述：模板
<400>4
ctgactgact gactgactga aaaa                                  24
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：模板
<400>5
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<210>6
<211>24
<212>DNA
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<223>人工序列的描述：模板
<400>6
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<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：模板
<400>7
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：模板
<400>8
ctgactgact gactgactga ctgaaaaaa                             29
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：模板
<400>9
ctgactgact gactgactga ctgaaaaaaa aaa                        33
<210>10
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：模板
<400>10
ctgactgact gactgactga ctgaaaaaaa aaaaaa                     36
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：模板
<400>11
ctgctgctgc tgctgctgaa a                                     21
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>12
gtccctgttc cggcgcca                                       18

Claims (6)

1.一种用于测量生物样品中依赖DNA的DNA聚合作用的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供一种与固相结合的引物，所述引物具有单链特异性短序列且不能进行内部碱基配对，
b)使所述引物构建体与含有其序列的一部分与所述引物互补的单链脱氧核苷酸模板和四种脱氧核苷三磷酸的反应混合物接触，其中一种脱氧核苷三磷酸经修饰致使其为标记抗体所特异性识别，
c)向b)的混合物中加入包含所述DNA聚合酶的生物样品，
d)让所述聚合酶反应进行，
e)将由d)产生的固定化反应产物与所述标记抗体一起温育，
f)借助所用的标记检测结合的标记抗体的量，和
g)借助所述结合抗体的标记测量掺入的修饰脱氧核苷三磷酸的量，作为所述DNA聚合作用的测量结果。
2.权利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶是逆转录病毒逆转录酶(RT)。
3.权利要求2的方法，其中所述逆转录病毒RT是人免疫缺陷病毒(HIV)RT。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述经修饰的脱氧核苷三磷酸是5-溴脱氧尿苷5’-三磷酸(BrdUTP)，而所述标记抗体是碱性磷酸酶(Ap)缀合的抗BrU单克隆抗体。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中将所测量的DNA聚合作用用于药物敏感性测试。
6.一种商业成套试剂，所述商业成套试剂包括依照权利要求1-4中任一项用于测量依赖DNA的DNA聚合作用的书面说明和/或数据载体说明，所述商业成套试剂包括下列组分：
a)一种与固相结合的引物，所述引物具有单链特异性短序列且不能进行内部碱基配对，
b)一种单链脱氧核苷酸模板，所述模板具有与a)中的引物互补的序列的一部分，
c)四种脱氧核苷三磷酸，其中一种脱氧核苷三磷酸经修饰致使其为标记抗体所特异性识别，和
d)标记抗体，所述标记抗体识别c)中的修饰脱氧核苷三磷酸。
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