CN101035908A - 确定样本中模板核酸数量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种确定样本中模板核酸数量的方法，其包括以下步骤：1)向样本中加入核酸扩增反应所需的所有组分和核酸扩增反应的生物发光测定所需的所有组分；2)进行核酸扩增反应；3)监测生物发光测定所产生的光强度；以及4)确定样本中模板核酸的数量。
Description
技术领域
本发明涉及一种确定样本中模板核酸数量的方法，包括以下步骤：1)向样本中加入核酸扩增反应所需的所有组分和核酸扩增反应的生物发光测定所需的所有组分；2)进行核酸扩增反应；3)监测生物发光测定所产生的光强度；以及4)确定样本中模板核酸的数量。
背景技术
核酸扩增可用于确定样本中是否具有某一特定模板核酸，如果可产生扩增产物，则说明样本中存在这个模板核酸。反之，若不产生任何扩增产物，则说明模板核酸在样本中不存在。该技术在诊断应用方面十分重要，例如，可以确定样本中是否存在某一病原体。
核酸可以通过各种热循环技术和恒温技术得到扩增。热循环技术，如聚合酶链式反应(PCR)，是运用热循环来驱动周期性的DNA合成，从而产生与原始数量的模板DNA成比例的大量新的DNA。近年来，也出现了一些恒温技术，其不依赖热循环而驱动扩增反应。使用有链置换活性的DNA聚合酶的恒温技术，已经被用于扩增反应，其不需要RNA合成的步骤。类似的，对于需要RNA合成的扩增反应，恒温技术用到了逆转录酶、RNase H和DNA依赖性的RNA聚合酶。
核酸扩增反应的产物传统上是用凝胶电泳(基于琼脂糖或丙烯酰胺)进行分析，借助于荧光染料(比如溴化乙锭)给存在的DNA染色。这种方法可以用于检测出扩增产物的号数、数量和大小。但是，这种使用凝胶电泳扩增反应的准备、进行和分析需要大量的人工干预，不但要使用毒性制剂，而且很费时(一般总共要大约1小时)。此外，需要多重PCR(一般30次)才能产生可以探测到的产物。最近，出现了灵敏度更高的凝胶电泳方法，它采用荧光技术或混浊度测定来对核酸扩增反应的产物进行实时监测。
DNA聚合酶和RNA聚合酶的共同特点是每次将一个新的碱基插入扩增的DNA/RNA分子时，都会释放一个焦磷酸盐复合物(PPi)。因此在聚合酶作用下核酸加入到扩增的核酸链的同时，焦磷酸盐(PPi)作为一个副产物按照一定比例产生。因此PPi的浓度与合成的核酸数量是成比例的，因此也与扩增子的聚积成比例。用n表示聚合体长度，反应式可以表示为：
通常对PPi进行测定的一个灵敏的方法是用ELIDA(见Nyren，P.和Lundina，A.，Anal.Biochem.151：(2)504-509(1985))。这种测定方法包括两个步骤：(1)利用ATP硫酰酶将焦磷酸盐(PPi)转换为ATP，以及(2)在荧光素和氧气存在的情况下，在荧光素酶的催化作用下，用ATP产生光：
应用ELIDA测序法有其优越性，因为从小样本量中也可以快速得到生物发光读数，所用的仪器也很简单，很便宜，例如：胶片或CCD照相机。
美国专利US 5,534,424，US 5,498,523，以及国际专利中请WO 98/28440，WO 98/13523和WO 02/20836都描述了使用基于ELISA的方法给短片断DNA测序。在高温测序的单个聚合循环范围中，ELIDA测定法是用于通过聚合酶作用将单个核苷酸插入DNA分子之后。高温测序是一个重复性技术，每4个dNTP中只有一个存在于每次重复循环中，可以使序列上每一个位点的dNTP都被检测到。因此DNA合成所需的所有组分不可能同时存在。
使用H3PIM，即末端ELIDA测定，以检测热循环聚合酶链式反应(“PCR”)，也已有报道(见WO 92/16653和Tarbary等人，J.Immunological Methods，156(1992)55-60)。整个反应过程中在预先决定的时间间隔内和/或扩增反应末期将部分反应混合物取走。因此描述了加入多种试剂的长梯度测定。
WO 02/064830描述了使用ELIDA测定法对终末端进行测定以检测热循环PCR反应。在WO 02/064830中描述的ELIDA测定可以单一步骤完成，而在WO 92/16654中监测热循环PCR进行末端序列测定还需要加入多种试剂，并进行孵育。
上述有关末端序列测定存在很多问题：首先，这种方法要将生物发光测定的组分加入到反应混合物中，以进行扩增反应。但打开管口有可能导致样本污染，并可能污染实验室。如果样本本身污染了，可能导致产生假阳性或假阴性。此外，如果实验室被扩增的模板核酸所污染，则可能污染未来的样本，并且得到假阳性结果或假阴性结果(例如，见Victor，T等人，“避免实验室中产生假阳性聚合酶链式反应结果的经验和指导”，Eur.J.Clin.Chem.& Clin.Biochem.，31(8)：513-535(1993))。因此易污染就说明将这种终端测定法应用于诊断方法有严重的缺点。
上述末端测定方法的应用的另一个问题是dATP也是荧光素酶的一种底物。因此当dATP作为荧光酶底物时，代替了ATP与荧光素酶进行反应，会干扰光谱。WO 02/064830描述了当dATP作为扩增反应的底物时，ELIDA法产生的光信号是如何快速衰减的。这种衰减对使用终端测定法可能是个严重的障碍，因为监测到的光读数不仅是显示PPi浓度，也可以显示时间。因此如果不对终点测定进行严格的时间限制，这种末端测定方法也就不能定量。
一种替代末端序列测定的方法，是可以对扩增反应中的核酸合成进行“实时测定”，也就是在核酸合成进行时测定。目前的实时测定法包括：荧光技术测定和浊度测定。
荧光技术测定的工作原理是通过监测荧光的改变，从而观察与之相关的扩增产物的积聚情况。例如：US 5,994,056，WO 97/44486，WO 99/42611和US6,174,670中所描述的在PCR过程中用双链DNA结合染料(特别是包含供体和受体的荧光基团的杂交探针)来监测DNA扩增的方法。这种实时荧光技术不需要液体样本来进行PCR，因此避免了打开反应管，从而降低了污染的危险。
然而，荧光技术也有很明显的不足。尤其是荧光制剂、主要荧光标记的引物造价高，且样本的准备是烦琐的。此外，应用荧光系统也受到仪器本身性能和造价高的影响。一般来讲，需要计算机驱动的集成的热循环荧光计，因为需要实时跟踪PCR中而不是用于末端测定。结果，这个系统的可及性(造价)和轻便性就成为问题。由于检测需在PCR装置内进行，因此这种方法只能在有合适条件的实验室使用。
实时混浊度测定法是通过监测扩增反应混合物中是否有白色的焦磷酸镁沉淀来说明是否有PPi产生。这是一种测定是否有等温的环介导的扩增反应发生的方法(见Mori，Y.等人，“通过监测混合物中是否有白色的焦磷酸镁沉淀来探测扩增反应”，Biochem.And Biophys.Res.289，150-154(2001))。然而，这种方法的不是很灵敏，且要观察到明显的混浊需要PPi的浓度达到0.6mM左右。此外，混浊度测定法也需要用吸光度作为测定的方式，因此使进行测定所需要的装置复杂化。
WO 01/42496和Nygren等人已经描述了PCR产物的生物发光定量的方法(‘使用多倍量的聚合酶链式反应标准和生物发光检测来量化HIV-I’，AnalyticalBiochem.，288，28-38(2001))。固定作为PCR扩增结果所获得的产物，并通过标准延伸聚合反应来量化，其中聚合的一轮循环在室温下进行。在反应开始之后一分钟，用光度计和电位计记录仪来测定信号，通过包含ATP磺酰酶和腺苷5′-酰硫酸(APS)的ELIDA体系来测定由于核苷酸掺入所导致的PPi释放。
发明内容
从本申清的范围中明确放弃在共同待审批的专利申请PCT/GB2004/000127中披露的主题。
本发明为测定样本中的模板核酸的数量提供了一种方法，以下步骤：
1)向样本中加入核酸扩增反应所需的所有组分和核酸扩增反应生物发光测定所需的所有成分，包括：
a)核酸聚合酶，
b)核酸聚合酶的底物，
c)至少两个引物，
d)一种热稳定的荧光素酶，
e)荧光素，
f)将PPi转换成ATP的酶，其中该酶不是ATP硫酰酶，以及
g)步骤f)的酶的任何其它的必需底物或辅助因子，以及接着：
2)进行核酸扩增反应；
3)检测生物发光测定所产生的光的强度，并且
4)确定样本中的模板核酸的数量。
显然步骤g)的底物或辅助因子不是PPi。
PPi是扩增反应中核酸聚合反应的产物。本发明的方法可以将PPi的产生与生物发光测定的光强度相联系。优选地，先将PPi转换成ATP。ATP再由荧光素酶催化的生物发光测定法进行检测，这种酶将以ATP作为底物，当有荧光素和氧气存在时产生光。因此应用荧光素酶来跟踪ATP浓度的变化。优选地，使用将PPi转换成ATP的一种或多种酶。通过监测生物发光测试的光发射强度，就可以确定反应混合物中存在多少PPi，并进而确定样本中的模板核酸的量。因此，这种方法测定了扩增反应过程中核酸的体外酶合成，并给重新聚合反应过程中扩增的核酸定量。
将PPi转换成ATP和适合于在本发明中使用的酶的实例包括丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)(Eisaki，N.等人，‘来自嗜热的去草酮Microbispora rosea subsp.Aerata的丙酮酸磷酸二激酶：净化、特性和基因的分子克隆’，Biochimica et BiophysicaActa，(1999)1431：363-73，并参见描述了热稳定的PPDK的GB2317892)、烟酰胺-单核苷酸腺苷酰转移酶(NMNAT)(Sakubara，H.等人，‘来自hyperthermophilicarchaeon，Pyrococcus horikoshii OT-3的具有单一腺苷酰基团供体特异性的烟酰胺-单核苷酸腺苷酰转移酶’，J Mol Catalysis B：Enzymatic 23(2003)273-279，其描述了极端热稳定的NMNAT的分离)、ATP二磷酸酶(Heppel LA和Hilmoe RJ，‘激活腺苷三磷酸的酶水解的机理’，J.Biol.Chem.(1953)202：217-226)，和ATP磷酸核糖基转移酶(VoIl MJ等人，‘三磷酸核糖腺苷的纯化和组成研究：焦磷酸盐磷酸核糖基转移酶.组氨酸生物合成的第一个酶’，J.Biol.Chem.(1967)242：1760-1767)。这些酶催化下列反应：
丙酮酸磷酸二激酶：PPi+磷酸烯醇丙酮酸盐+AMP→ATP+丙酮酸盐+Pi
烟酰胺-单核苷酸腺苷酰转移酶：PPi+NAD+→ATP+烟酰胺核苷酸
ATP二磷酸酶：PPi+AMP→ATP+H2O
ATP磷酸核糖基转移酶：PPi+1-(5-磷酸-D-核糖基)-ATP→ATP+5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸
以上提到的酶仅仅是举例说明的，可以应用将PPi转换成ATP和适合于依照本发明的方法的任何其它酶或酶的组合物。但是，如共同待审批的专利中请PCT/GB2004/000127中描述的，将ATP硫酰酶作为将PPi转换成ATP的酶来应用，从本申请的范围中特别地排除。进一步地，将荧光素酶本身作为将PPi转换成ATP的酶的单独使用，从本申请的范围中特别地排除。
当将PPi转换成ATP的酶是丙酮酸磷酸二激酶时，底物是磷酸烯醇式丙酮酸和AMP。当将PPi转换成ATP的酶是烟酰胺-单核苷酸腺苷酰转移酶时，辅助因子是NAD+。当将PPi转换成ATP的酶是ATP二磷酸酶时，底物是AMP。当将PPi转换成ATP的酶是ATP磷酸核糖基转移酶时，底物是1-(5-磷酸-D-核糖基)-ATP。
步骤2)的核酸扩增反应可以等同于“进行性”的核酸聚合酶反应，因为有多于一个核苷酸附加循环在无需另加缓冲液组分或处理的情况下进行。因此步骤2)中核酸扩增反应是产生一个特定核酸序列的许多拷贝的体外技术，其中产生的拷贝进一步导致被复制的特定核酸序列的拷贝数的扩增。
步骤2)中扩增反应中用到的荧光素酶和生物发光测定中的其它组分极大地简化了对样本的分析，因为一旦扩增反应开始了就无需对反应混合物进一步处理。例如，没有必要取出部分样本来测定产生了多少PPi。相反地，核酸扩增所需要的全部组分备齐后，就可以对用于酶的核酸扩增反应的反应混合物，即步骤1)形成的反应混合物直接进行生物发光测定。没有必要在扩增反应之中或之后向反应混合物中加入生物发光测定的组分。
生物发光测定(亦称‘焦磷酸盐测定’或‘PPi测定’)以及扩增反应中所需的组分都必须要能经受步骤2)的核酸扩增反应的反应条件。例如，要用到将PPi转换成ATP的热稳定的酶和/或热稳定的荧光素酶和/或热稳定的核酸聚合酶。此处对于酶所使用的术语“热稳定的”，指在步骤2)的核酸扩增反应中在一定的时间范围内性质稳定的酶。
步骤1)中的组分，优选用冷冻干燥或其它稳定剂来进行稳定。因此优选将稳定剂与样本在步骤1)中同时加入。例如：可在步骤1)中将BSA、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和二硫苏糖醇(DDT)的一种或多种与样本同时加入。优选地，在步骤1)中将全部这些稳定剂与样本一起加入。
核酸扩增反应所需的温度和时间与核酸聚合反应所需的温度和时间明显不同。核酸扩增反应需要高温或较长的持续时间(例如：15分钟到24小时)或者两者都需要。与此相反，核酸聚合反应可以在低温(例如：37℃)下快速进行。已知荧光素酶是不稳定的。例如，在37℃时野生型萤火虫荧光酶会很快失活。也已知荧光素酶易被抑制，例如被其自身发光反应的产物氧化荧光素所抑制。然而，我们意外地发现在步骤2)的核酸扩增反应中荧光素酶能保持稳定。其是意外的，是由于在某些核酸扩增反应中要求较长的持续时间。
在步骤1)中与样本一起加入的热稳定的荧光素酶在步骤2)的核酸扩增反应的温度范围内是稳定的。使用的这种特定的荧光素酶取决于步骤2)的核酸扩增反应的条件。在此处使用的术语“荧光素酶”指可以催化生物发光反应的酶。在本发明方法中适用的荧光素酶包括：野生型荧光素酶和突变体或变异体荧光素酶，只要其可以在步骤2)的核酸扩增反应中一定的温度范围内保持稳定即可。优选地，在37℃下荧光素酶有至少10分钟的半衰期。更优选地，在40℃下荧光素酶有至少10分钟的半衰期。更优选地，在50℃下荧光素酶有至少10分钟的半衰期。更优选地，在60℃下荧光素酶有至少10分钟的半衰期。在本发明的方法中适用的热稳定的荧光素酶的实例是来自Promega的超光热稳定的荧光素酶，其在60℃下有至少10分钟的半衰期，同时该荧光素酶也由Tisi，L.等人所描述(Tisi，L.C.等人，(2002)热稳定的荧光素酶的发展，Analytica Chimica Acta，Vol.457，115-123)，其在40℃下有至少10分钟的半衰期。
步骤2)中的核酸扩增反应中可以有RNA的合成步骤，也可以没有。在步骤2)的核酸扩增反应的方法中不包括RNA合成步骤，聚合酶的底物包括以下四种dNTP之一：dATP，dTTP，dCTP和dGTP。一个或多个的dNTP可以用其合适的模拟物所代替。使用的荧光素酶是采用ATP作为底物来产生光的荧光素酶。使用ATP作为底物来产生光的荧光素酶的实例是萤火虫荧光素酶(来自Photinuspyralis)及其突变体。优选地，采用ATP作为底物产生光的荧光素酶是来自Promega的超光热稳定的荧光素酶。荧光素酶根据ATP浓度的改变而改变，因此反应混合物中含有将PPi转换成ATP的酶。
当存在将PPi转换为ATP的酶时，在步骤1)中需要向反应混合物中加入将PPi转换为ATP的酶的所有底物或辅助因子。
对于包括RNA合成步骤的扩增反应，聚合酶的底物包括四种dNTP之一(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)和四种NTP之一(“NTPs”)(ATP，UTP，CTP和GTP)。一个或多个dNTP和/或NTP可以用其合适的类似物所代替。因此当扩增反应包含RNA合成步骤时，内源性的ATP作为聚合酶的底物之一存在于反应混合物中，除非使用了可用于与RNA聚合酶作用但与荧光素酶不反应的ATP类似物。反应混合物中的大多数内源性ATP会严重影响本方法的应用，其中在步骤1)中反应混合物中的大多数内源性ATP会严重影响本方法的应用，其中在步骤1)中与样本一起加入的荧光素酶需要对ATP浓度的微量变化很灵敏。为了克服这个问题，优选在步骤1)中与样本一起加入合适的ATP类似物，即RNA聚合酶的底物，而非荧光素酶的底物(或至少是荧光素酶的非常差的底物)，而不是ATP自身。
本发明方法的另一个优点是：在步骤3)中可监测到光发射量。优选地，可以在视觉上监测到步骤3)中光发射量的强度。用于监测光发射强度的合适方法包括：应用胶片、电荷耦合器件(CCD)照相机或光电倍增器(例如：见W.R.Leo，用于核和粒子物理学试验的技术，Springer，1994)。换句话说，光发射强度可以用肉眼监测。优选地，步骤3)包括使用CCD照相机来监测来自生物发光测定的光发射强度。如果需要，光发射强度可以被扩大到可视的程度。因此，仅仅使用胶片、CCD摄像机或光电倍增器来监测光发射的能力比因没有需要的多功能硬件或光学系统而被迫应用荧光分析或凝胶分析的技术要优越的多。而且，我们可以不必用任何方式(就像在荧光和吸光度测定中应用的那样)去照射样本来监测光发射强度，也不必应用电化学样本(例如：作为半导体的方式：Wilding，P.等人，(1994)，‘在硅微结构中的PCR’，Clinical Chemistry，40(9)：1815-1818)或间接照射(例如：作为表面等离子体共振的方式：Bianchi，N.等人，(1997)，‘用于实时探测聚合酶链式反应扩增的HIV-I基因组序列的生物传感器技术和表面等离子体共振’，Clinical and Diagnostic Virology，8(3)：199-208)。
进一步地，例如通过单个CCD照相机可能同时监测一个或多个(例如数千个)样本。因此，本发明方法可用简单简单、廉价的硬件，其具有轻便性、小型化和易于整合成高生产力系统的可能性。
本发明方法中步骤1)中也优选包含将合适的缓冲液加入到样品中。适合用于本发明方法的缓冲液包括能使扩增反应进行，也能使生物发光测定进行的缓冲液。优选地，缓冲液包含一定量的镁离子。优选以氯化镁或硫酸镁的形式存在。例如，合适的缓冲液可能包含三醋酸盐、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁和TritonX-100(在25℃下pH8.8)。
本发明方法的一个优势是：依照本发明的方法的至少步骤2)和3)是在密封容器里进行的。这就减少甚至防止了在做扩增反应和生物发光测定时对样本污染的可能性，这是非常有用的。而且，这减少甚至防止了对实验室的污染。这是特别重要的，因为即使模板核酸的一个拷贝逸入实验室，都有可能污染其它待测的样本使之产生假阳性的结果。因此，本发明的方法在诊断应用中防止污染的能力是特别重要的。
为了进一步防止污染，优选在步骤4)后对容器进行了适当的处理，以便破坏容器中的核酸，特别是破坏模板核酸。优选容器自身在步骤4)后也被破坏，或伴随容器中核酸的破坏而被破坏。这就在最大程度地减少了对实验室和/或进一步对样本污染的可能性。
优选地，在本发明方法的步骤3)中，在核酸扩增反应期间监测光发射强度。这只有在步骤2)的核酸扩增反应期间生物发光测定的组分存在的前提下才有可能实现。优选地，在整个核酸扩增反应期间，即在核酸扩增反应的从始至终，都可监测到光发射强度。换句话说，在扩增反应的至少一部分中监测光发射强度。换句话说和/或另外地，在步骤2)的扩增反应结束之后或开始之前都可以监测到光发射强度，例如为了做对照研究。在步骤2)的扩增反应中监测光发射强度的能力简化了反应容器的搬运，并实现了快速确定存在于样本中的模板核酸的量。
dATP也可作为荧光素酶的底物。在扩增反应期间监测光发射强度的另一优点是：任何由dATP和荧光素酶反应产生的背景信号不会干扰本发明的方法。这只有在终点分析时才会成为问题。
虽然应用本发明的方法从本质上减小了由dATP引起的问题，但是本发明包括了这样的方法，其使荧光素酶与由将PPi转换为ATP的酶产生的ATP反应所产生的光不同于荧光素酶与作为聚合酶底物的核苷酸反应所产生的光。这些方法能减少背景信号，因此增加了对于由将PPi转换为ATP的酶产生的ATP所产生的光进行探测的灵敏性。这些方法由以下供选择性步骤组成：
(a)区分由ATP所产生的光波长与酶作用于扩增反应缓冲液中的核苷酸所产生的光的光学方法；
(b)利用作为在扩增反应中对于将PPi转换为ATP的酶无效的底物的核苷酸；
(c)利用减少dATP作为底物的应用的酶变体。
例如，可以使用波长特异性的光探测方法来区分从ATP产生(由此来源于焦磷酸盐)的光和来自dATP的光。荧光素酶与ATP反应产生黄绿光，而其与dATP反应产生红光。因此，当样本包含ATP和dATP时，在荧光素酶存在时从ATP产生的光的范围能通过使用合适的过滤器或测定在与ATP相比dATP不产生显示信号的波长处的发光量。因此来源于dATP直接与荧光素酶反应的光能够足够小，以便增加对将PPi转换为ATP的酶所产生的ATP探测的灵敏性，即使在较低的PPi浓度下。
进一步地，dATP可以替换为d-α-SATP。d-α-SATP是一种对于荧光素酶比dATP近似低100倍的底物，因此d-α-SATP与荧光素酶直接反应仅产生极少的光。然而，d-α-SATP是包含DNA合成的扩增反应的合适底物。已知能用DNA聚合酶将d-α-SATP插入DNA链。现在发现d-α-SATP(现在包含硫原子)插入的DNA能够作为模板来直接进行进一步的DNA合成；这是扩增的先决条件。使用d-α-SATP的扩增反应是有效的，d-α-SATP是一种对于荧光素酶比dATP差得多的底物，大大减少了干扰。因此，在依照本发明的方法中使用d-α-SATP时，如果已经产生了焦磷酸盐，例如如果模板核酸已经被扩增了，产生的样本将仅发射有效的光。对于本领域技术人员来说，显然在这里也可以使用除了d-α-SATP以外的核苷酸，该核苷酸是用于扩增反应的聚合酶的底物，而其与荧光素酶的反应显示了比与dATP反应更低的比活性。
例如可以使用与ATP相比用dATP的生物发光的色彩具有更大差异的或对于dATP或ATP具有不同亲合力的突变体荧光素酶(例如突变体或变体萤火虫或甲虫荧光素酶)。与dATP和ATP反应的最大荧光波长的差异大于野性型酶的突变体荧光素酶能被用于改进由ATP和dATP反应产生的光的差异。进一步地，可以类似地使用相对于ATP来说dATP是对于发光体较差底物的突变体。在该实施例中，可使用相对于与ATP反应与其它核苷酸相比区别更大的任何突变体荧光素酶，来测定通过活性和/或产生的光波长。在现有技术中已知的获得或鉴定这样的荧光素酶的方法(例如：WO 96/22376和WO 99/14336)。
优选地，本发明方法的步骤3)进一步包括产生一个时间函数光发射强度数据组。这个数据组用来确定样本中存在的模板核酸的量。优选地，这个数据组可以用软件分析和/或以图表或表格的形式来表示。例如，这个数据组可以绘制成光强度与时间的图表或光强度变化率与时间的图表(即：第一个导数)。
光发射强度可以在一个或更多，例如至少2、3、4、5、10、15、20或更多预定时间内监测。优选这些预定时间都是从步骤2)的扩增反应所需条件准备好(此时时间为(t)＝0分钟)之后的时间里确定的。这些条件为步骤1)中起始的反应混合物已经形成，处于扩增反应的合适温度，该温度也是扩增反应和生物发光测定的组分都处于稳定状态的温度数值。例如，至少在部分扩增反应中，在预定的时间间隔里可监测光发射量的强度。优选地，在整个扩增反应中，在预定的时间间隔里可监测光发射量的强度。例如，该时间间隔可以是每隔30秒，每隔1分钟，每隔1分30秒等。另外，预定的时间间隔是可以调整的。优选地，在一分钟内记录一个、两个或更多个光读数。每分钟计数越多，结果就越可靠，因此优选尽可能增加每分钟的读数次数。优选地，第一次监测光发射量应该定为0分钟。在某些实施方式中，也可以在扩增反应完成后监测光发射量。
使用的光探测系统越灵敏，每分钟可能得到的时间点就越多，因为与灵敏性较差的CCD照相机相比，应用较高灵敏性的照相机可以通过更短的时间来整合光发射量获得每次的数据。因此，尽可能使用灵敏的照相机是有利的。
本发明方法的优点是：在本发明方法的步骤3)中，我们可以连续地监测光发射量的强度。用“连续地”意味着使用的检测系统的全部生产量。优选地，在至少部分步骤2)的扩增反应中连续地监测光发射量。更优选地，在整个步骤2)的扩增反应中连续地监测光发射量。步骤3)也包括在步骤2)的扩增反应完成后替代地或附加地连续监测光发射量的强度。
依据此发明的方法可被用于以定量和/或定性的形式确定样本中的模板核酸的量。
使用定性的形式包括利用本发明的方法，在步骤2)的核酸扩增反应发生之前来确定样本中模板的量。其也包括利用本发明的方法来确定步骤2)的核酸扩增反应产生的样本中模板核酸的量，其可以在步骤2)的核酸扩增反应中测定，也可以在步骤2)的核酸扩增反应后测定，即：已经产生了多少核酸扩增产物(“扩增子”)的量化。这使得对核酸扩增反应程度的量化成为可能。当用于定性的形式时，术语“确定”包括对存在于样本中的模板核酸量的精确测定和对存在于样本中的模板核酸量的估计。
我们惊奇地发现：为了以定量的形式确定存在于样本中的模板核酸的量，除了每秒产生的光发射量的强度外，光发射量强度变化的时间选择也是成比例的因素。例如，在特定的反应条件下(如：特定的模板核酸、特定的扩增反应和生物发光测定的组分的浓度以及扩增反应的特定温度)，如果在核酸扩增反应开始时存在于样品中的模板核酸浓度较高，则与存在于样品中的模板核酸浓度较低的反应相比，光发射量强度将在扩增反应开始后的短时期内发生变化。因此，对于特定组的反应条件，可以通过检测作为时间函数的光发射强度的改变来测定样本中模板核酸的量。优选地，在特定组的反应条件下，使用不同已知浓度的特定模板核酸来进行一系列对照反应，将由本发明的方法分析样本所获得的结果与由该系列对照反应所获得的结果相比较。对照反应还可以这样进行：在扩增反应中的预定时间点所产生的模板核酸的量可使用凝胶电泳或其它合适的计量方式来测定。这将能够计算在预定时间点的对照样本中的模板核酸的量，也能够把数据组中各自的点联系起来。
本发明方法用于定性分析时，可以评估核酸扩增反应是否已产生扩增产物，从而判断样本中是否有模板核酸。在许多应用中，当扩增条件足够优选(例如病原体相关核苷酸(优选DNA)的快速监测)时，需要建立靶DNA序列的唯一信息存在于发生扩增反应的样品中。当模板核酸存在于样品中时，将导致扩增子的产生，作为步骤2)的核酸扩增反应的产物。因此，这将导致当与没有扩增发生的对照反应相比时，作为时间函数的光发射强度模式的改变。当样本中无核酸产物时，步骤2)中没有扩增反应发生，因此也就没有扩增子产生。因此，作为时间函数的光发射强度改变模式即使不是相同于无扩增反应的对照反应，也是与其相似的。熟练的技术人员能够确定作为时间函数的光发射强度改变模式是否与由对照所给出的模型明显不同。因此，用于步骤2)中的短语“进行核酸扩增反应”包含两层意思“进行核酸扩增反应”和“创造合适的条件使得扩增反应发生”，因为在实施例中如果样品中没有模板核酸，就不会有扩增反应发生。优选地，在反应的起始之后预定时间段内，监测期望的光强度变化的有无。
已经发现PPi本身对高浓度荧光素酶有直接效应。通过做一系列使用在特定反应条件下不同浓度的特定起始模板核酸的对照实验，熟练的技术人员能够从得到的数据组中确定PPi本身对荧光素酶具有可估计的和可觉察的直接效应的时间。然后可以利用这些对照实验的结果来确定样品中模板核酸的量。
例如，已经发现PPi自身可以在高浓度下抑制荧光素酶。光发射强度的开始迅速下降与荧光素酶被特定浓度的PPi抑制是互相关联的。这可能与光发射量的最大值，即光发射量升降的拐点是相对应的。也可以说，它代表光发射量下降速率迅速上升，即由缓慢下降到快速下降的那一点。通过做一系列的使用不同浓度模板核酸的对照实验，我们可以计算出特定组的反应条件和模板核酸的不同浓度下，光发射量开始迅速下降的时间点。然后可以利用这些对照实验的结果来外推样品中模板核酸的量。
另外，PPi可以引起光发射量的上升，该光发射来自于非PPi的底物所抑制的荧光素酶。
因此，PPi是否激活或抑制荧光素酶催化的生物发光测定取决于一系列因素，包括所使用的荧光素酶的精确类型、反应的温度、PPi的浓度以及影响荧光素酶活性的其它化合物的存在。通过在特定组的反应条件下做使用不同浓度的特定起始模板核酸的一系列对照实验，熟练的技术人员可以从所得数据组中确定PPi对荧光素酶的直接效应的作用时间以及效应的本质。这些对照实验的结果也可以用来外推样品中模板核酸的量。
可以用一系列不同的方法来分析作为时间函数的光发射强度的数据组，以此来确定样本中模板核酸的量。在数据组中的特定数据点代表存在特定PPi浓度的时间点。然后将这些点与样本中模板核酸的量联系起来。例如，优选监测下列的一个或多个数据点：1)光发射强度开始上升的时间点；2)光发射强度增加率升高或降低的时间点；3)光发射强度变化率从升高到降低(优选光发射的最大强度点或光发射强度的峰值)或从降低到升高过渡的时间点；4)光发射强度下降变化率升高或降低的时间点；和/或5)光发射强度到达或超过预定水平的时间点。
为了以定量的形式确定样本中模板核酸的量，所要监测的数据点优选是光发射量的变化率发生明显改变的点。当分析数据组时，光发射量的变化率发生明显改变的点对于熟练的技术人员来说是显而易见的。
最优选地，光发射量改变率明显变化的点，都将是代表在光发射强度增高和降低之间进行转换的点。代表在光发射强度增高和降低之间进行转换的点，也是光发射量改变率明显变化的点。当以光发射强度单位时间变化图表来显示结果时，代表在光发射强度增高和降低或降低和增高之间进行转换的点优选作为拐点来表示。那些代表光发射强度从一个恒定值开始上升或下降的点，或者那些代表光发射强度从上升或下降变化到恒定值的点也是代表光发射强度变化率明显变化的点。
另外，代表光发射强度明显改变的点可能是代表光发射强度上升率或下降率明显上升或下降的点。因此，短语“光发射强度改变率明显变化的点”优选是指这样一个点，这个点在相同的预定时间间隔内，该点前后光发射强度改变至少30％。更优选地，″光发射强度改变率明显变化的点″指在相同的预定时间间隔里，该点前后光发射强度改变至少50％。更优选地，″光发射强度改变率明显变化的点″指在相同的预定时间间隔里，该点前后光发射强度改变至少70％。换句话说，“光发射强度改变率明显变化的点”指在相同的预定时间间隔里，该点前后光发射强度改变至少10％，20％，40％，60％或80％。这个预定时间间隔最好是30秒，但也可以是1分钟、1分30秒或更多。另外，预定的时间间隔可以小于30秒。预定时间间隔的选择将取决于监测光发射强度的时间间隔，也取决于所研究的特定扩增反应的动力学特性。
因此对于定量分析，优选监测数据组中的下列一点或几点：1)光发射强度开始上升的点；2)光发射强度上升变化率明显上升或下降的点；3)光强度变化率由上升转为下降的点(优选光发射强度最大值)或由下降转为上升的点和/或4)光发射强度下降变化率明显上升或下降的点。也可以监测光发射强度达到或超过预定水平的时间。
优选通过监测以下一点或多点对样本中核酸量进行定量分析：1)达到光发射强度开始上升点的时间；2)达到光发射强度从上升转为下降的点的时间；3)达到光发射强度下降率明显上升的点的时间；4)达到光发射强度下降率明显下降的点的时间；以及5)光强度接近或超过预定水平的时间。
如上所述，特定模板核酸达到特定的监测点所需的时间取决于扩增反应开始时样本中模板核酸的浓度。因此，本发明方法的步骤4)优选进一步包括光发射强度与来自标准曲线的光发射强度的比较，所述标准曲线由在对照样本中的一系列对照物反应所形成，所述对照样本中的模板核酸量是已知的，以此来确定反应样本中的模板核酸量。
在定性分析中，为确定样本中模板核酸的量，即：样本中是否含有模板核酸，数据组中所监测到的点优选是光发射浓度达到或超过预定水平的点。
光发射强度的增加表明样本中模板核酸的存在。优选地，光发射强度的增加与无扩增反应发生的对照反应是相关的。例如，这样的对照反应优选无样本核酸存在或未应用聚合酶。因此，在这些具体实施方式中，可以通过检测光发射强度是否超过无扩增反应发生的对照反应来定性测定样本中核酸的量。更优选地，在这些具体情况下，可以通过监测光发射强度是否达到或超过预定水平来定性测定样本中核酸的量。例如，预定水平可以设定在扩增反应开始时光强度下降率在最小值的那个点的光发射强度的125％、150％、175％或200％。如果光发射强度达到或超过了这个预定水平，则表明样本中存在模板核酸。但是如果光发射强度未达到这个预定水平，则表明样本中不存在模板核酸。
预定水平的改变可能取决于以下一种或多种因素，包括：所使用的模板核酸、核酸扩增反应中组分的浓度及反应温度。通过进行对照试验(有或无模板核酸)，熟练的技术人员可以容易地确定一个合适的预定水平。
优选地，在步骤2)的扩增反应开始之后预定的时间内，光发射强度的升高表明样本中存在模板核酸，反之亦然。例如，当本发明的方法用于基因型时，一定量的试验材料通常包含一定量的靶模板，然后如果靶模板核酸不存在，则可以肯定：如果在预定时间内光发射强度没有增加，则不存在靶模板。
优选地，预定的持续时间来自于步骤2)的扩增反应。在反应开始时模板核酸量越少，步骤2)的扩增反应时间就越长。通过改变模板核酸的浓度及模板核酸的有无来做一系列的对照试验，熟练的技术人员可以容易地通过特定反应条件下模板核酸有无增长来确定合适的预定时间。例如，预定时间可以是自扩增反应开始后20、25、30、35、40、45、50分钟或更长时间。
换句话说或另外，在依照本发明的方法中，与预定水平相关的光发射强度的降低表明样本中模板核酸的存在。有假说认为，当荧光素酶被PPi抑制时，光发射强度降低。例如，预定水平可以设定在扩增反应开始时光强度下降率在最小值时的光发射强度的25％、20％、15％、10％或5％。如果光发射强度下降到预定水平或其以下，则表明样本中的模板核酸的存在。然而，如果光发射强度没有达到预定水平，这就表明样本中模板核酸的缺失。
预定水平的改变可能取决于以下一种或多种因素，包括：所使用的模板核酸、核酸扩增反应中组分的浓度及反应温度。通过进行对照试验(有或无模板核酸)，熟练的技术人员可以容易地确定一个合适的预定水平。
优选本发明方法的步骤4)进一步包含了与无扩增反应发生的对照试验的光发射强度的比较。例如，这样的对照可能与本发明方法中步骤相同，除了模板核酸和/或扩增反应所需的其它组分之一(例如聚合酶)被忽略之外。这需要考虑到生物发光衰减的时间延长。
在依照本发明的方法中，虽然优选对照试验与样本试验是同时进行的，但并非必须如此。例如，对照试验也可以提前进行以便将所得到的数据与许多其它的样本进行比较。
在依照本发明的方法中，相对于没有扩增反应发生的对照试验的光发射强度的降低表明样本中模板核酸的存在。该相对于对照试验的降低发生在上面所提到的光发射强度的其它变化之后。已经发现，光发射强度最终会降低到低于没有扩增反应发生的对照试验的水平，这个发现是令人惊讶的，因为熟练的技术人员预期当产生更多PPi时，光发射强度能继续上升。有假说认为光发射强度下降到低于对照组的水平，是因为荧光素酶受到PPi抑制的缘故。虽然优选在步骤2)的扩增反应中通过对光发射强度的监测来确定其是否低于对照反应，但是这也可以在步骤2)的核酸扩增反应之后进行监测。优选地，光发射强度下降到对照反应水平的30％或更低。更优选地，可以下降到对照反应水平的20％或更低。更优选地，可以下降到10％或更低。选择性地，可以下降到对照反应的光发射强度的90％或更低、80％或更低、70％或更低、60％或更低、50％或更低、40％或更低、25％或更低、15％或更低、5％或更低。
优选地，与预定水平相关或与对照反应核酸扩增反应开始后预定时间内相关的光发射强度降低表明样本中模板核酸的存在，反之表明不存在。预定时间间隔优选是扩增反应开始后20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟或更长时间。通过做一系列模板核酸的不同浓度或不存在模板核酸的对照实验，熟练的技术人员就可以容易地根据光发射强度是否下降来确定合适的预定时间。
步骤2)的核酸扩增反应优选是在一定温度范围内进行的，在此范围内荧光素酶具有足够的活性和稳定性，以便在扩增反应期间提供足够和稳定的光发射量。进一步地，步骤2)的核酸扩增反应是在足够低的温度下进行的而且非常快速足以使荧光素酶在反应期间保持稳定。本发明方法的步骤2)的核酸扩增反应可以在恒定温度下进行，也可在多个温度下进行，也可用热循环方法进行。优选在恒定温度下进行。在恒温下进行的核酸扩增反应是不需要热循环的。
那些不包括RNA合成步骤的核酸扩增反应和适合用依照本发明方法监测的实施例包括恒温法和热循环法(例如PCR)。
不包括RNA合成步骤的恒温方法通常是通过链置换法来进行的。这样的方法包括：循环扩增(见Fire，A.和Xu，S.-Q.(1995)‘Rolling replication of short DNAcircles′，Proc.Natl Acad.Sci.USA，92，4641-4645)，循环扩增反应技术(见
http：// www.molecularstaging.com/Pages/RCATdetails.html；Amersham′s Phi29-basedamplification Kit，product codes：25-6400-10和25-6400-50)，恒温支流扩增(Zhang，W.等，‘Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplificationmethod：a feasibility study′，J.Clin.Microbiol.，Jan 2002，128-132)，依赖限制性核酸内切酶的链置换扩增(见Walker，G.T.，‘Isothermal in vitro amplification of DNAby a restriction enzyme/DNA polymerase system′，PNAS，(1992)，89，392-396)，环介导的恒温扩增(LAMP)(见Notomi，T.，‘Loop-mediated isothermal amplification ofDNA′，Nucl.Acids.Res.，2000，28(12)，e63，i-vii)以及由这些方法衍生出来的方法。不包括RNA合成步骤的恒温核酸扩增技术和通过线性置换机理进行的扩增方法也称为“恒温PCR”技术。在背景反应是在低温扩增下进行的前提下，有一发现令人很惊讶，该发现认为，基于ELIDA分析的生物发光测定可以用于监测通过链置换进行的扩增反应。
选择性地，不包括RNA合成步骤的热循环方法或许可以应用在本发明的方法中，前提是：扩增反应和生物发光测定的所有组分在反应循环温度下是稳定的。优选地，该热循环反应是一个低温热循环方法，其中引物延伸在不超过75℃的循环温度范围内进行，更优选不超过70℃，而且所用的是适度热稳定的的DNA聚合酶。这个方法的例子是LoTemp_PCR，其所用的是HiFi_DNA聚合酶，在网址www.hifidna.com/FQAall.htm上对此方法作了描述。另外，这种热循环反应是一种低温热循环方法，该方法应用的是有脯氨酸存在下的DNA聚合酶I的Klenow片段(见Nucleic Acid Research，(1999)，27(6)，1566-1568)。
包括RNA合成步骤和可以被本发明方法监测的恒温扩增反应的实例包括：转录介导扩增(TMA)或基于扩增的核酸序列(NASBA)(Guatelli，J.C.等，‘Isothermal，in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reactionmodelled after retroviral replication’，PNAS，(1990)，87，1874-1878)和由这些方法衍生出来的方法。
步骤2)的核酸扩增反应是在一个温度范围内进行的，在此范围内扩增反应及生物发光分析的组分保持稳定。优选地，步骤2)的核酸扩增反应在不超过75℃的温度范围内进行。更优选地，步骤2)的核酸扩增反应在不超过70℃的温度范围内进行。更优选地，步骤2)的核酸扩增反应在不超过65℃的温度范围内进行。最优选地，步骤2)的核酸扩增反应在不超过60℃的温度范围内进行，即：在这个温度范围内，来自Promega的超光热稳定的荧光素酶具有足够的活性和稳定性，在整个扩增反应期间提供足够和稳定的光发射量。选择性地，步骤2)的核酸扩增反应可以在不超过55℃、50℃、45℃或40℃的温度范围内进行。
优选地，步骤2)的核酸扩增反应是在不低于20℃的温度范围内进行的。更优选地，步骤2)的核酸扩增反应是在不低于30℃的温度范围内进行的。更优选地，步骤2)的核酸扩增反应是在不低于40℃的温度范围内进行的。选择性地，步骤2)的核酸扩增反应可以在不低于25℃、35℃、45℃、50℃、55℃或者60℃的温度范围内进行。
优选地，步骤2)的核酸扩增反应在30℃到75℃的温度范围内进行。更优选地，步骤2)的核酸扩增反应在30℃到65℃的温度范围内进行。例如，步骤2)的核酸扩增反应可以在45℃到65℃、50℃到55℃或者35℃到40℃的温度范围内进行。
已经发现当将Bst DNA聚合酶(Stenesh，J.和Roe，B.A.，Biochim.et Biophys.Acta 272，156(1972))用于扩增反应时，优选50℃到55℃的温度范围，例如在利用Bst DNA聚合酶的LAMP和循环反应中(虽然循环扩增反应也可以使用其它的聚合酶)。Bst DNA聚合酶在50℃以下活性低，而在65℃时活性最佳。但是，来自超光荧光素酶的光发射量在55℃以上较低，因此在50℃到55℃的温度范围内使用Bst DNA聚合酶是有利的。排除或代替50℃到55℃的范围，在更高或更低的温度下使用Bst DNA聚合酶也包括在本发明的范围内，虽然这可能需要使用非常灵敏的探测仪器或降低本方法的应用性。
步骤2)的核酸扩增反应可以在一个恒定的温度下进行，此恒定温度在上述的温度范围内。在一个优选实施方式中，核酸扩增反应在37℃进行。例如利用在37℃时稳定的突变荧火虫荧光素酶(在这个温度时，野生型酶很快会失活)，可以在恒温核酸扩增反应中利用标准ELIDA反应来监测PPi的生成。Tisi，L等人描述了在37℃时保持稳定的一种突变荧火虫荧光素酶的实例，该荧光素酶适用于本发明的方法(Tisi，L.C.等人，(2002)，‘热稳定的荧火虫荧光素酶的发展’，AnalytiCChimica Acta，Vol.457，115-123)。
选择性地，步骤2)的核酸扩增反应可以在优选温度范围内的多个温度下进行。
已经发现，当核酸扩增反应进行的温度上升时，由生物发光测定所产生的光发射的整体强度较低(不论扩增发生与否)，步骤2)的核酸扩增反应在较低温度下进行是有利的。较低的反应温度有双重优点：既增加了光发射强度，又使扩增反应进行更慢。较慢的扩增反应对于定量分析尤其有利，因为此时数据点出现的时间较之在更高温度下监测扩增反应时其出现的时间更长，因此也更易于监测；对含有不同量的模板核酸的样本而言，这些数据点对应于不同的点，这些点显示随着时间的变化，光强度改变的速率变化的变量。
但是，在较低温度下进行核酸扩增反应可能会潜在地影响扩增反应的特异性。例如，当扩增反应的温度降低时很有可能出现假阳性结果，因为在扩增反应的温度降低时，出现引物退火序列而不是需要的靶序列的机会增加了。因此，本发明也提供了一种方法，其中步骤2)的核酸扩增反应以较高温度起始，随后降至较低的温度。优选地，这种较高和较低的温度应在上述的优选反应温度范围之内。这种方法的好处是核酸扩增反应以较高温度起始，这样特异性就较高；然后，在扩增进入可检测的指数增长阶段之前，降低反应温度以增加光强度，并且减缓反应的进行。例如，核酸扩增反应的温度可以起始于55℃，并随后降低到50℃，其在核酸扩增反应使用Bst DNA聚合酶的具体实施方式中是特别有利的。
相对低温的恒温方法和低温热循环方法与将温度升至95℃的传统热循环PCR方法相比，前者可对更小的样本量进行分析。尤其是在温度范围不超过55℃的具体实施方式中，可用本发明的方法分析极小的样本量。例如，低于10μl的样本量甚至低于1μl的样本量都可用本发明的方法分析。极小的样本量是传统PCR的一个技术难点，因为传统PCR需要高温。能够分析极小的样本量也可以减少试剂的消耗。
因此，在优选的实施例中，本发明的方法要求在步骤2)的核酸扩增反应中，聚合酶反应在恒温下进行，并且在这个温度下所用的荧光素酶是稳定的。这提供了以下优点：
1)可以实时连续监测恒温核酸扩增反应；
2)可在一个完全封闭的系统内监测恒温核酸扩增反应，不需要另加试剂；
3)相对低温测定可对极小的样本量进行分析(极小的样本量是传统PCR的一个技术难点，因为传统PCR需要高温，因此减少了试剂的消耗)；以及
4)一个普通的CCD照相机可同时监测上千个恒温PCR反应。
本发明的一个特征是当合成了核酸时，用凝胶电泳可检测到核酸扩增中核酸合成所产生的PPi，这增加了检测的敏感性，并减少了扩增的时间。进一步地，Mori等人(Mori，Y.等人，Biochem.B iophys.Res.Comm.，(2001)289，150-154)的比混浊法要求，在观察到明显混浊之前，PPi的浓度约为0.6mM，这个要求通过使用焦磷酸盐测定试验来实现，其中使用酶将PPi转化为ATP，低于0.5uM的PPi浓度导致PPi浓度与生物发光之间呈现线性关系(Nyren和Lundin，AnalyticalBiochemistfy，151(2)，405-409(1985))。这显示本发明方法的灵敏性得到提高，在一次混浊度的测定中检测PPi至少1200次。本发明方法较之基于荧光的方法灵敏性也更高。
依照本发明的方法可用于医学诊断。目前，大多数诊断试验中心需将其试验结果送出去进行分析，因为分析核酸扩增反应的传统方法，例如PCR，需要复杂的硬件和光学仪器。运用上述方法将能在关心的点上分析测试结果。例如，它可用于性健康门诊，如弄清楚样本中是否含有诸如特定细菌或病毒等病原体。它也可用于确定样本中细菌(例如：衣原体，尤其是沙眼衣原体或大肠杆菌)或病毒的量，例如，用来确定感染的程度。
依照本发明的方法还可以进一步用于确定在一个有机体的遗传密码中是否存在一个特定的核酸序列。例如，其可被用于确定来源于模板核酸链的核酸是否被遗传修饰，或被用来检测与一特定的无遗传修饰的品种或经过遗传修饰的品种相关的DNA，或被用来检测血缘相近的动物的DNA，或被用于医学或兽医学诊断，比如基因诊断或法庭证据。
依照本发明的方法可用于检测样本中有机体的存在。如上所述，该有机体可以是一种病原体。然而，本方法也可以用于检测非病原性有机体。
本发明的方法也可用于免疫-核酸扩增技术(例如，见Sano，T.等人，(1992)Science，vol.258，120-122)(例如，用于鉴定与抗体相连结的特定模板核酸)。本方法也适用于在难以使用如荧光反应或吸光反应之类技术的原位。例如，本发明的方法可以被用于金属表面。因此本发明的方法可以被用于，例如，检出手术刀片上的朊病毒。
进一步地，提供了用于依照本发明的方法的一种试剂盒。特别地将依照本发明的试剂盒中所使用的作为将PPi转化为ATP的酶的ATP磺酰酶(如共同待审批的申请PCT/GB2004/000127中所描述的)，从本发明的范围中排除出去。
用于依照本发明的方法的试剂盒优选含有核酸聚合酶及其底物、至少两个引物、一种热稳定的荧光素酶，荧虫光素和将PPi转化为ATP的酶，其中所述的酶不是ATP磺酰酶，而是任何其它需要底物或辅助因子的将PPi转化为ATP的酶。更优选地，该试剂盒进一步含有缓冲液，例如镁离子溶液。选择性地，用于依照本发明的方法的试剂盒可仅包括以上成分的一些和/或附加的组分。样本和试剂盒中排除的任何其它组分都可在使用过程中加入。
例如，用于本发明方法的试剂盒可由一些容器组成，这些容器各自包含：
a)核酸聚合酶、镁离子和dNTPs的混合缓冲剂；以及
b)荧光素酶、荧虫光素和将PPi转化为ATP的酶，其中所述的酶不是ATP磺酰酶。
试剂盒中的一个或多个dNTPs或NTPs可被合适的dNTP或NTP类似物所替代。例如，当试剂盒用于其步骤2)的扩增反应包含RNA合成阶段的方法时，ATP可替换为ATP的类似物，所述的ATP类似物可被RNA聚合酶所作用，而不被荧光素酶作用。
优选地，试剂盒中至少有一种成分是冻干的或以另一种适合储存的形式存在于试剂盒中。更优选地，试剂盒中所有组分都为冻干的，或都以一种或多种其它适合储存的形式存在。所述其它形式包括加入了稳定剂的和/或包含试剂盒组分的冷冻或冰冻的混合体。
优选的试剂盒形式是一个小型“液态”循环。优选地，用于本发明的试剂盒与一枚信用卡的大小差不多，以便易于操作。
用于依照本发明方法的试剂盒可用于同时分析一个或多个样本。例如，用于依照本发明方法的试剂盒可于同时分析2，3，...，50，...，100，...，200甚至1000份样本。
在本发明方法的具体实施方式中，本发明被用于同时监测多个样本，本方法可用于检测每一份样本中具有相同序列的模板核酸的存在，也可用于检测不同样本中具有不同序列的模板核酸的存在。
用一张试验卡可以显示来自于一份或几份样本的结果。优选地，试验卡与一张信用卡差不多，以易于操作。
本发明进一步提供了实施本发明方法的装置，其包括依照本发明的试剂盒中的组分。例如，优选地，依照本发明的装置包括核酸聚合酶及其底物、至少两个引物、一种热稳定的荧光素酶、荧虫光素和任何其它需要底物或辅助因子的将PPi转化为ATP的酶。
附图说明
下面将通过仅以下列图为参考的例子进一步描述本发明：
图1显示跟踪LAMP反应的装置。
图2显示存在靶DNA的LAMP的输出和不存在Bst DNA聚合酶的对照物的LAMP输出。
图3显示双倍LAMP样本和双倍对照物的结果。
图4显示和图2和3一样配制的样本的结果，但显示绝对光强度有差别。
图5显示关于LAMP在55℃时用不同量的靶模板(双倍数)的光发射模式。
图6显示到达光发射峰值的时间。
图7显示三倍量LAMP反应的原始输出的图。
图8显示从图7的曲线第一次衍变而来的图。
图9显示对照物和样本的对比。
图10显示十分钟后，温度从55℃降至50℃时的LAMP反应。
图11：使用PPDK作为将PPi转换为ATP的酶的LAMP的光强度随着时间变化的图，并将其与使用ATP磺酰酶作为将PPi转换为ATP的酶的图、以及不存在BstDNA聚合酶的两个对照物的图相比较。
图12：使用不同浓度模板的循环扩增和ELIDA；以及
图13：循环扩增和ELIDA的信号峰值的时间。
实施例
实施例1-5和7-14利用ATP磺酰酶作为将PPi转换成ATP的酶的实例。使用ATP磺酰酶的实施例1-5和7举例说明了在实践中的本发明。进一步地，实施例8-14(虽然根据终点分析法)举例说明了如何达到减少来自dATP的干扰。但是，如前所述，特别地将利用ATP磺酰酶作为将PPi转换成ATP的酶从本权利要求的范围中除去，因此实施例1-5和7-14不属于本权利要求的范围。但是，熟练的技术人员能容易地使用属于本权利要求的范围的酶代替ATP磺酰酶来改变实施例1-5和7。熟练的技术人员也能容易地改变实施例8-14中所说明的方法，并将其应用于本申请的方法。在实施例6中说明了属于本权利要求的范围的方法的应用。
实施例1：本发明方法的示例
选择恒温核酸扩增反应，即称为环介导的扩增(LAMP)，来举例说明用一简单的生物发光分析来实时监测核酸扩增反应的可能性。
目前，大多数LAMP方法的快速显示使用6个引物。这种显示被示例为在仅仅15分钟内检测了105拷贝的靶DNA(Nagamine et al.2002 Molecular andCellular Probes，16，p223-229)。LAMP反应通常在60-65℃范围内进行，并且需要至少4mM的镁离子溶液。
为了特别地示例LAMP反应中实时生物发光的结果，需要找出能降低LAMP反应温度的方法。这是因为如下事实：温度高达65℃时，在LAMP扩增反应过程中，即使是目前已知的热稳定性最强的甲虫荧光素酶(来自Promega的超光热稳定的荧光素酶)也会缺乏活性和/或不能稳定地发出充足而稳定的光(大约需要45分钟或更长时间来确定一个样本中不含有任何一种特定的靶DNA分子)。
把镁离子的浓度从4mM降至2mM将使LAMP反应在低温下顺利进行。进一步地，高浓度的甜菜碱会降低LAMP反应在低温下成功的可重复进行的能力。最终，将选择不会干扰LAMP反应的合适的稳定剂，并将其包含于配方中。结果，可能确定使在整个扩增过程中，生物发光分析和LAMP反应同时的条件。
起始材料：
1)反应混合物(更少的Bst DNA聚合酶或靶DNA)
剂量 试剂名 公司
20mM 醋酸盐 Sigma
10mM KCl Sigma
10mM 硫酸铵 Sigma
2mM 硫酸镁 Sigma
0.10％V/V Triton X-100 Sigma
0.5％W/V BSA Sigma
5％W/V 海藻糖 Sigma
0.4mg/ml 聚维酮 Sigma
9mM 硫苏糖醇 Melford
100g/ml D-荧光素(钾盐) Europa
54ng/ml 超光荧光素酶 Promega
100M 腺苷5’磷酸硫酸盐 Sigma
0.5U/ml ATP磺酰酶 Sigma
250uM 四种dNTPs之一 Amersham Biosci.
0.8M LAMPBlcB2引物 PNAC Cambridge UK
0.8pM LAMPFlF2c引物 PNAC Cambridge UK
0.4M LAMP Loop B引物 PNAC Cambridge UK
0.4M LAMP Loop F引物 PNAC Cambridge UK
0.2M LAMP B3引物 PNAC Cambridge UK
0.2M LAMP F3c引物 PNAC Cambridge UK
PH8.8@25℃(引物序列见下面)
2)DNA聚合酶
8U/μl Bst DNA聚合酶 New England Biolabs
3)模板DNA
catgaattcgtcaagtctacgataacttagcgcttaggatgtcagatacttatgatgataagctgatagactatcttgcctgga
agcttacttcataatggatgacgtatgccatgatagataccattgtctagacataagactttcaatctgcatagtcatgatcgat
ccatgctcgagtccaagctagtcatagcttatcatcaactgaatctagtaagtcattgaattctag
引物序列：
LAMP BlcB2：tat cat ggc ata cgt cat cca ttt tta taa get gat aga eta tct tgc
LAMP FlF2c：tea ate tgc ata gtc atg ate gtt ttt tga tga taa get atg act age
LAMP Loop B：tat gaa gta age ttc cag
LAMP Loop F：ate cat get cga gtc caa
LAMP B3 引物 atg tea gat act tat gat g
LAMP F3c 引物 aat gac tta eta gat tea g
方法：
在一个200μl的PCR管中，加入1μl的0.4ng/μl模板DNA和0.4μl Bst DNA聚合酶后，加入18.6μl的反应混合物。在另一个200μl的PCR管的对照物中，加入18.6μl的反应混合物和0.4ng/μl的模板DNA，但不加Bst DNA聚合酶。
样本被置于Syngene GeneGeniuS光学厨柜(www.syngene.co.uk)里的50℃恒温器上。利用Syngene GeneSnap软件(www.syngene.co.uk)在Syngene光学厨柜里用一个CCD照相机拍一系列照片来记录样本发出的光(透过密封的PCR管)(图1)。每张照片代表1分钟内样本发出的全部的光。
一共记录40张画面，因此LAMP反应总共就被观察了40分钟。
结果：
利用Syngene软件，每一样本的光输出可被定量为一个时间函数。获得的结果见于图2。
利用琼脂糖凝胶电泳，可以确认(含有核酸模板的)“样本”的确扩增出大量DNA，而对照组则没有合成任何DNA。
以下是扩增中一些光输出的特征：
1)最初，样本与对照物的光输出降低的速率相似；
2)过了一段时间，样本的光强度开始上升，而对照物的光强度继续逐渐降低；
3)样本的光输出的增长速率一直上升，达到一个最大值，然后下降，直到达到在LAMP反应过程中的有记录的光输出峰值的那一点；
4)样本光输出达到峰值之后，观察到光输出下降；
5)光输出达到峰值后下降的速率逐渐增加，并且光输出的数量小于对照物的；
6)样本光输出下降的速率减慢，最终与对照物相似；
7)在40分钟的最后，样本光输出的量相对来说低于对照物。即使在这个例子中，样本的最初光强度要稍微高一些(这与样本的光输出根本没有考虑样本和照相机的相对位置有关)。
有一种假设认为光强度在达到峰值后即降低是由于因为荧光素被焦磷酸盐抑制了。这样的话，在依照本发明的方法中，光强度的峰值代表了在这一点时累积了特定量的焦磷酸盐。因此，光强度峰值也代表了在这一点时，已经合成了特定量的DNA。
实施例2：本发明的方法利用LAMP扩增反应的可重复性
程序与实施例1中相同，除了用了多个样本来评价LAMP反应所得结果的可重复性。
起始材料和方法：
除了样本和对照物是实施例1中的两倍或三倍来实施，以及反应温度升至55℃，其他与实施例1相同。
结果：
结果见图3。这个实施例中样本反应曲线与实施例1相同。
这个例子中的两个样本，无论光输出变化的速率还是到达最大光输出的时间均极其相似。此外，用琼脂糖凝胶电泳证实样本中扩增的DNA的产生。对于对照组，两个例子对照的光输出变化速率是相似的，但绝对值有一点小小的差别。人们认为是因为所用系统的光捕捉的不同效果而不是任何生化方面的原因。然而，即使没有数据处理，也可以得到清晰的结果。
在一些例子中，例如三倍数样本的绝对光强度可随光捕捉的效果变化而变化。然而，相互间光输出的速率和到达最大光输出的时间是相似的(图4)。
实施例3：以定量方式来利用本发明的方法
起始材料和方法：
重复实施例1中相同的过程，但是样本中的靶DNA数量不一样。设定复制样本，使其总共包含0.4ng，40pg，4pg或0.4pg的模板核酸。LAMP反应的温度是55℃。
结果：
图5显示了每个样本的光发射数据。图5所获得的数据表明了本发明方法的关键性质。如果靶模板量和绝对光发射量之间没有令人信服的相关性，那么达到发光量最高值的时间或发光量改变率变化的时间之间就有明确的关系。
发光量达峰值的时间和靶DNA量之间的不一致表明其关系是定量的(见图6a，其中发光量峰值时间和样本中DNA靶模板浓度的log10是线性关系)。在图6b中，显示了产生25％扩增子的时间和达发光量峰值的时间，可以看到两者的参数相关。因此，对比发光量达峰值的时间和琼脂糖凝胶电泳获得的结果，可以看到发光量的峰值时间反映的是扩增子的积累和样本中模板核酸的量。
实施例4：对根据本发明方法得到的数据进行处理，其中核酸扩增反应是LAMP反应
在对原始数据进行简单处理后，用多样本再次重复实施例1中的过程，以估计LAMP反应获得的数据的可重复性。尤其是，设计了第一个衍生物。
起始材料和方法
除了样本与控制器采用三份以外，与实施例1相同，温度50℃，总量1ng的模板用于每一个样本中。
图7显示了这些样品根据本发明的方法所获得的大量原始数据。通过描绘发光量对时间和光密度对时间的变化率(即第一个衍生物)，可以看到明显的拐点。特别地，图7所显示的曲线与y轴相交的最大和最小两点之间的面积，当描绘了曲线的第一个衍生物时。虽然强度等级显示了相当大的不同，曲线的拐点却是相似的。
图8中显示了样本LAMP扩增反应发生后的曲线与y轴有两个交点。第一个表示图7的第一个拐点，第二个表示最大光强度的点。图8中显示的最大和最小值说明了与光发射量变化最大速率有关的时间点。所有的四个数据点(两个y轴的交点、一个最大值和一个最小值)表示了三个样本的重叠。值得注意的是第一个Y轴的交点发生在第二个交点大约十分钟之前。
图9显示的是放大的曲线8，说明了描绘样本与对照的第一个衍生物上的区别。
因为来自于利用LAMP反应的本发明的方法的原始数据的内在信息容量，即使是每一个数据的操作，例如描绘第一个衍生物，不仅使结果曲线的点可以清楚识别(y轴的交点，最大值和最小值)，而且结果可以对光信号的量不敏感(例如：与图7中的曲线重叠相比，图8中的重叠更相似)。
实施例5：在扩增反应过程中改变扩增反应的温度
LAMP方法可以在大约45℃到65℃的温度范围内进行。然而LAMP反应进行的温度越高，本发明方法所获得的整个光强度就越低(无论反应是否发生)。这是由于使用的特定热稳定的荧光素酶(来自Promega的超光热稳定的荧光素酶)，可以在较高的温度下以较低的速率催化光反应。因此55℃下超光热稳定的荧光素酶所测得的光发射率明显比50℃下低得多。然而，在降低温度时，例如从55℃到50℃，有人观察到：超光热稳定的荧光素酶催化的光发射率是增加的，因此结果是明显可逆的。这个可逆性暗示：观察到的高温下光发射的降低并不仅仅是荧光素酶变性的结果。
因此低温下进行LAMP反应可以增加试验中的光发射量。而且，低温下进行LAMP反应也可以减慢反应本身。这在某些情况下是有利的。例如，当定量实施本发明方法时，减慢扩增反应可能是有利的，以便与在高温下进行LAMP反应相比，例如不同数量的目标模板达到发光峰值的时间可以分隔得更大。
但是，低温下进行LAMP反应可以潜在地影响反应的特异性，如果LAMP温度降低，假阳性的可能性就会增加。也就是说，随着反应温度的降低，与形成靶序列的机会相比形成引物序列的机会将增加。
要想既要利用低温反应又想保持最大的特异性，一个可行的办法就是在反应的过程中改变温度。特别地，LAMP反应在较高的温度起始，这时特异性较高，然后，在反应进入可测的指数增值阶段之前就降低反应的温度，来增加光的强度并减慢反应的进行。
起始材料和方法：
与实施例1相同，除了应用不同数量的实施例3中的靶模板(在0.02pg/μl至20pg/μl的范围内，即：0.4pg到0.4ng的整个样本)对各种样本进行测定。LAMP反应起始的温度是55℃，10分钟后降低到50℃。
结果：
图10显示了由温度改变的数据获得的原始数据。图10所显示的数据表明改变温度的方法确实导致在温度下降时光发射强度的增加。进一步说，LAMP反应是定量的，表现为达到最高值发射光的时间是模板DNA起始量的函数。将图10和图5相比，其中利用LAMP反应来测定相等量的靶模板，但在55℃的单独温度下，可以看出在模板含量最多的样本(总共0.4ng/20pg/μl)和最少的样本(总共0.4pg/0.02pg/μl)之间的反应时间相差接近8分钟，在图10显示的改变温度的方法中，时间相差接近14分钟。
事实上，高于55℃的温度也可以应用，因为，虽然超光荧光素酶在超过60℃后就开始变得不稳定了，但是也可以在高温条件下耐受短暂的时间。这个方法因此增加了可利用温度的范围。
而且，如果反应的时间不需要很长的话，可以在使荧光素酶产生不可逆失活的温度下利用不很稳定的荧光素酶来参加反应。
最后，使用改变温度的方法仍然可能产生明显的假阳性，但是由于在扩增反应的开始的关键阶段(即：仅仅在指数生长期之前)对高温的严格控制，可以使假阳性不普遍发生。
实施例6：利用PPDK作为将PPi转化为ATP的酶
利用PPDK作为将PPi转化为ATP的酶来进行测定，其中核酸扩增反应是LAMP反应。测定的组分是：
起始材料：
1)反应混合物(更少的Bst DNA聚合酶或靶DNA)
剂量 试剂名 公司
20mM 醋酸盐 Sigma
10mM KCl Sigma
10mM 硫酸铵 Sigma
2mM 硫酸镁 Sigma
0.10％V/V Triton X-100 Sigma
0.5％W/V BSA Sigma
5％W/V 海藻糖 Sigma
0.4mg/ml 聚维酮 Sigma
9mM 硫苏糖醇 Melford
100g/ml D-荧光素(钾盐) Europa
2.8mM 磷酸烯醇丙酮酸盐 Sigma
50μM AMP Sigma
54ng/ml 超光荧光素酶 Promega
1U/ml PPDK Kikkoman
250μM 四种dNTPs之一 Amersham Biosci.
0.8μM LAMP BlcB2引物 PNAC Cambridge UK
0.8μM LAMP FlF2c引物 PNAC Cambridge UK
0.4μM LAMP Loop B引物 PNAC Cambridge UK
0.4μM LAMP Loop F引物 PNAC Cambridge UK
0.2μM LAMP B3引物 PNAC Cambridge UK
0.2μM LAMP F3c引物 PNAC Cambridge UK
PH8.8@25℃(引物序列见下面)
图11所示的结果表明使用PPDK的作为时间函数的光发射强度的图形与使用ATP磺酰酶所获得的图形基本上相似。意外的是，在用PPDK进行的测试的起始阶段的背景光信号仅仅比用ATP磺酰酶进行的测试稍低：腺苷5’含磷硫酸盐(“APS”)(被用于ATP磺酰酶体系)是荧光素酶的底物，并被认为促进了背景光发射。但是，PPDK不使用APS，而具有与ATP磺酰酶体系同数量级大小的背景。进一步地，使用PPDK，在光强度快速上升之前，存在光强度的持续上升。在两种情况下，图形与没有BST DNA聚合酶存在的对照相比有很大不同。
实施例7：使用不同模板浓度的循环扩增和ELIDA
图12和13显示正如LAMP一样，循环扩增引起在与起始模板的量成比例的时间的光的峰值。
实施例8：使用过滤器来除去来自dATP激发的生物发光所产生的光
焦磷酸盐测试缓冲液(PAB)由如下成分组成：
0.1M 醋酸盐(pH7.75) Sigma
2mM EDTA Sigma
10mM 乙酸镁 Sigma
0.1％ 牛血清白蛋白 Sigma
5μM 腺苷5′含磷硫酸盐 Sigma
0.4mg/ml 聚乙烯吡咯烷酮(360,000) Sigma
0.3U/ml ATP磺酰酶 Sigma
100g/ml D-荧光素 Europa
2.8mM 磷酸烯醇丙酮酸盐 Sigma
5.5×108光单位 Photinus pyralis荧光素酶 Promega
1mM Dithiothreotol Melford
新近制成焦磷酸钠的溶液(Sigma)，并在冰上遮光保存。
50μl的PAB整分到96孔板的两个孔中。将1μl的0.1mM焦磷酸钠加入到一个样品中；将1μl的2mM dATP加入到其它样品中。使用具有黑白CCD照相机的同源光盒来5秒钟合计信号，观测产生的光发射量。当加入焦磷酸盐的样本很明亮时，从dATP样本中有明显的光发射。加入的dATP的量等于标准50μlPCR反应的消耗量的1/5。因此dATP对于生物发光的贡献是重要的。
将绿色的滤光镜置于CCD照相机的透镜的前面，再一次观测上面的样本。可明显地看出绿色滤光镜的存在明显减少了dATP样本相对于焦磷酸盐样本的信号。这是由于来自dATP样本的发光在620nm处有最大光发射量，而来自ATP样本的发光在550nm处有最大量(在pH 7.8)。因此绿色的滤光镜阻挡了更多来自dATP样本的发光。
实施例9：使用dATP模拟体d-α-SATP的PCR
50μl的PCR反应包括下列组分：
5μl Tris-HCl 100nM Sigma
4μl 氯化镁 50nM Gibco
5μl d-α-SATP 2mM Glen research
5μl dCTP 2mM Pharmacia
5μl dGTP 2mM Pharmacia
5μl dTTP 2mM Pharmacia
1μl 测试质粒pPw601a 0.5ng/μl
1.25μl 引物1 10μM
1.25μl 引物2 10μM
0.5μl Taq聚合酶 5U/μl Roche
19μl Milli-Q水
引物1和2的序列和测试质粒各自如SEQ ID No.1、2和3所示。期望的PCR产物的大小是158bp。将5μl的Eurogentec“smart-ladder”的分子量标识物(marker)用于凝胶电泳。将2μl的10mg/ml溴化乙锭加入到琼脂糖凝胶和凝胶泳动的缓冲液中。在加热到95℃30秒后，将Taq聚合酶加入到样本中。在Perkin-Elmer GeneAmpPCR体系2400上执行下列循环参数。
95℃30秒
(加入Taq聚合酶)
95℃30秒
95℃30秒
55℃30秒
72℃5秒
72℃20秒
(95℃下进行30秒的30个循环、55℃下进行30秒的30个循环、72℃下进行5秒的30个循环)
将10μl的PCR反应产物上样到包含溴化乙锭的10％琼脂糖凝胶上，该凝胶边上有分子量标识物(marker)。凝胶在60V下电泳50分钟，然后用瞬变显示来检测。可见使用d-α-SATP代替dATP产生了PCR产物。在相同的条件下，如果使用dATP来代替，但使用通常0.2mM浓度的1/10时，没有PCR产物被检测到。这表明使用d-α-SATP所获得的PCR产物不是简单的被dATP污染的结果，因为d-α-SATP是的纯度超过98％；因此由于污染dATP，PCR产物不能存在。
实施例10：使用d-α-SATP的PCR反应中焦磷酸盐的检测
如实施例9来设定三个PCR反应。样本之一不受热循环的影响，其余的样本是热循环的，除了一个没有Taq加入。预期结果是仅仅有Taq的热循环的样本将产生PCR产物。这被凝胶电泳所确认。将每个5μl的PCR反应物加入到96孔板的25μl ELIDA缓冲液中。使用CCD照相机来测定来自样本的发光，证明对于焦磷酸盐的试验，来自样本的发光明显与凝胶结果相对应。
实施例11：使用dATP的PCR反应中焦磷酸盐的检测
如实施例9来设定三个PCR反应，除了使用dATP代替d-α-SATP，即使用标准的PCR反应条件。准备两个样本，其中一个有修正过的DNA模板存在(相对于使用的引物)，其中一个没有修正过的DNA模板存在。预期结果是仅仅有修正过的模板的样本将产生PCR产物。通过进行PCR反应，用凝胶电泳来分析样本。将每个5μl的PCR反应物加入到25μl ELIDA分析试剂中，使用装有绿色滤光镜的CCD照相机来测定发光，如实施例8所述。测得的发光与凝胶电泳相符，因此ELIDA测定能正确指示样本已成功地产生了PCR产物。
实施例12：PCR产物检测的定量化和灵敏性
如实施例9来准备七个PCR样本(即：使用d-α-SATP)。在热循环中，除去一个管，并在PCR反应的每5个循环到35个循环时将其放在冰上。用凝胶电泳来分析产生的PCR产物。将每个5μl的样本加入到25μl ELIDA缓冲液中，使用CCD照相机来记录发光。图14(发光与PCR循环数目的关系图)显示不仅来自ELIDA测定的发光随循环数而增加，而且在PCR产物能在凝胶上被检测出来之前发光也增加。
实施例13：与包含dATP的PCR反应相比，包含d-α-SATP的PCR反应的ELIDA测定的发光的稳定性
如实施例12来设定和进行PCR反应。每个PCR样本的分析起源于PCR反应物与20μl的ELIDA测定缓冲液的混合。然后用Labsystems Luminoscan Ascent光度计在1分钟的时间内连续测定四次光读数，来测定来自样本的发光。每个光读数代表在十秒的区间内来自样本的发光的总和(使用机械的默认PMT电压)。
图15(光单位与时间的关系图)证明不论是使用dATP还是使用d-α-SATP，来自PCR反应的ELIDA测定的连续四次光读数的光发射量都进行5和35个循环。使用dATP的PCR反应显示光发射随时间的明显衰减。这种效果随PCR循环数目而增大。结果，在5和35个循环的光发射之间的差异明显减少。相反地，使用d-α-SATP，对于5和35个循环的样本，发光与时间之比都接近常数。结果，对于四次读数所测定的5和35个循环，发光与时间之比都几乎是常数(仅仅5％的差异)。
实施例14：与包含dATP的PCR反应相比，包含d-α-SATP的PCR反应的ELIDA测定的信号比的本底
如实施例9来设定PCR反应，除了使用仅仅0.5pg的测试质粒pPw601a。进一步地，PCR反应包含d-α-SATP或dATP。如实施例13来测定包含d-α-SATP或dATP的未反应的PCR混合物的ELIDA测定的发光。在进行了PCR反应的完整30个循环(并根据琼脂糖凝胶分析判断产生了相同量的扩增子)之后，对于同一样本进行ELIDA测定。图16显示了来自未反应的PCR混合物与反应的PCR混合物的发光的比例(显示信号：本底的比率)。可见使用d-α-SATP明显改进了信号：本底的比率。这是由于如下事实：d-α-SATP没有与荧光素酶反应到dATP相同的程度。
上面仅仅通过一些实施例对本发明进行了说明，可以基于此作出进一步的修改和完善，但是这些仍在本发明权利要求所界定的范围内。
Claims (38)
1、一种确定样本中的模板核酸数量的方法，包含如下步骤：
1)向样本中加入核酸扩增反应所需的所有组分和核酸扩增反应生物发光测定所需的所有组分，包括：
a)核酸聚合酶，
b)核酸聚合酶的底物，
c)至少两个引物，
e)荧光素，
f)将PPi转换成ATP的酶，其中该酶不是ATP硫酰酶，以及
g)步骤f)的酶的任何其它必需的底物或辅助因子，以及接着：
2)进行核酸扩增反应；
3)检测生物发光所产生的光的强度，并且
4)确定样本中的模板核酸的数量。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：至少步骤2)和步骤3)在密闭容器内进行。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在步骤3)的核酸扩增反应中测定发射光的强度。
4、根据权利要求1至3的任一权利要求所述的方法，其特征在于：步骤3)还包括产生一个时间函数发射光强度数据。
5、根据权利要求4至6的任一权利要求所述的方法，其特征在于：通过测量达到发射光强度变化率明显变化时间点所需时间的数据来确定核酸存在的数量。
6、一种根据权利要求1至4的任一权利要求所述的确定步骤2)的核酸扩增反应开始时样本中模板核酸数量的方法。
7、一种根据权利要求1至4中任一权利要求所述的确定步骤2)的核酸扩增反应产生的样本中核酸数量的方法。
8、根据权利要求5至7中任一权利要求所述的方法，其特征在于：通过测量达到光强度开始增加的时间点所需时间的数据来确定核酸存在的数量。
9、根据权利要求5至7中任一权利要求所述的方法，其特征在于：通过测量达到光强度达到最大值的时间点所需时间的数据来确定核酸存在的数量。
10、根据权利要求5至7中任一权利要求所述的方法，其特征在于：通过测量达到光强度增长的开始降低时间点所需时间的数据来确定核酸存在的数量。
11、根据权利要求5至7中任一权利要求所述的方法，其特征在于：通过测量达到光强度降低的开始降低时间点所需时间的数据来确定核酸存在的数量。
12、根据权利要求5至7中任一权利要求所述的方法，其特征在于：通过测量达到光强度到达或者超过一个预定水平的时间点所需时间的数据来确定核酸存在的数量。
13、根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于：步骤4)还包括将发射光强度与包含已知模板核酸数量的对照物的发射光强度的比较。
14、一种根据权利要求1至13中任一权利要求所述的确定样本中是否存在模板核酸的方法。
15、根据权利要求14所述的方法，其特征在于：样本中模板核酸是否存在，是通过测量光强度到达或者超过一个预定水平的时间点所需时间的数据组来确定。
16、根据权利要求15所述的方法，其特征在于：相对于预定水平的光强度增加表示样本中存在模板核酸。
17、根据权利要求15所述的方法，其特征在于：相对于预定水平的光强度降低表示样本中存在模板核酸。
18、根据权利要求15至17中任一权利要求所述的方法，其特征在于：样本中是否存在模板核酸，通过测定自步骤2)扩增反应开始后的一个预定的时间长度内发射光强度是否达到或者超过预定的水平来确定。
19、根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于：步骤4)还包括将光强度与没有扩增反应的控制器内的发射光强度进行比较。
20、根据权利要求19所述的方法，其特征在于：如果与没有扩增反应的控制器内的发射光强度进行比较，光强度降低，则表明样本中存在模板核酸。
21、根据权利要求1至21中任一权利要求所述的方法，其特征在于：步骤2)的核酸扩增反应为低温热循环扩增方法，循环温度范围不超过75℃。
22、根据权利要求1至21所述的任一权利要求所述的方法，其特征在于：步骤2)的核酸扩增反应是恒温进行的。
23、根据权利要求22所述的方法，其特征在于：步骤2)的核酸扩增反应为低温热循环方法，循环温度范围不超过75℃。
24、根据权利要求22或23所述的方法，其特征在于：步骤2)的扩增反应在恒温下进行，在此温度下，扩增反应的组分以及发光测定保持稳定。
25、根据权利要求22或23所述的方法，其特征在于：步骤2)的核酸扩增是在扩增反应的组分以及发光测定能保持稳定的温度范围内的多于一个温度数值下进行的。
26、根据权利要求25所述的方法，其特征在于：步骤2)的核酸扩增反应在较高的温度下开始然后降到一个较低的温度。
27、根据前述任一权利要求的方法用于临床诊断。
28、根据前述任一权利要求的方法用于确定样本中是否存在病原体。
29、一种根据前述任一权利要求确定生物体遗传密码中是否存在某一特定核酸序列的方法。
30、一种根据权利要求29所述的确定模板核酸起源的核酸是否被遗传修饰的方法。
31、一种根据权利要求1至26的任一权利要求所述的确定在样本中是否存在有机体的方法。
32、一种根据权利要求1至26中任一权利要求所述的方法，应用免疫-核酸扩增技术。
33、根据前述任一权利要求所述方法中应用的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：核酸聚合酶及其底物，至少两个引物，一种热稳定的荧光素酶，荧光素和将PPi转换成ATP的酶，其中该酶不是ATP硫酰酶，步骤f)的酶的任何其它的必需的底物或辅助因子，以及合适的缓冲液。
34、根据权利要求1至33任一权利要求所述的方法中应用的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有容器，这些容器分别包括：
a)核酸聚合酶、镁离子和dNTPs的混合缓冲剂；和b)荧光素酶，荧光素和将PPi转换成ATP的酶，其中该酶不是ATP硫酰酶。
35、根据权利要求33或34所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的至少一个组成部分形式上适于存放在试剂盒里。
36、一种实施权利要求1至32任一权利要求所述方法的设备，其特征在于：所述的设备合并了根据权利要求33至35任一权利要求所述的试剂盒中的组成部分。
37、一种根据权利要求31所述的方法，用于确定样品中是否存在沙眼衣原体。
38、一种根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于：将PPi转换成ATP的酶是丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)，并且该酶的底物是磷酸烯醇式丙酮酸和AMP。
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