JP2008510455A - 試料中に存在するテンプレート核酸の量を決定するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
i)試料を、
a)核酸ポリメラーゼ、
b)核酸ポリメラーゼの基質、
c)少なくとも二つのプライマー、
d)耐熱性ルシフェラーゼ、
e)ルシフェリン、
f)PPiをATPに変換する酵素であって、ATPスルフリラーゼではないもの、および
g)項目f)の酵素の、他の任意の必要な基質または補因子
を含む、核酸増幅に必要な成分の全ておよび核酸増幅の生物発光アッセイに必要な成分の全てと接触させるステップ、そして次に、
ii)核酸増幅反応を実行するステップ、
iii)生物発光アッセイからの光出力の強さをモニターするステップ、および
iv)試料中に存在するテンプレート核酸の量を決定するステップ
を含む方法を提供する。
ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ:
PPi+ホスホエノールピルビン酸+AMP→ATP+ピルビン酸+Pi
ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ:
PPi+NAD+→ATP+ニコチンアミドリボヌクレオチド
ATPジホスファターゼ:
PPi+AMP→ATP+H2O
ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ:
PPi+1-(5-ホスホ-D-リボシル)-ATP→ATP+5-ホスホ-α-D-リボース1-二リン酸
(a)ATPから生じる光の波長を、増幅反応緩衝液中に存在するヌクレオチドに対する酵素作用によって生じる光と区別するための光学的方法、
(b)増幅反応に、PPiをATPに変換する酵素の有効な基質ではないヌクレオチドを利用すること、
(c)dATPを基質として利用する能力が減少している酵素変種を利用すること、
という選択肢が含まれる。
i)等温核酸増幅反応をリアルタイムで連続的にモニターすることができる;
ii)等温核酸増幅反応を、さらなる試薬添加を必要とせずに、完全に閉じた系でモニターすることができる;
iii)アッセイ温度が比較的低いため、非常に小さな試料体積の分析が可能になり(従来のPCRでは温度が高いため、非常に小さな試料体積は技術的障害になる)、試薬コストが削減されるだろう;
iv)簡単なCCDカメラを使って、何千もの等温PCR反応を同時にモニターすることができる。
a)核酸ポリメラーゼ、Mg源およびdNTP類の緩衝混合物、ならびに
b)ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびPPiをATPに変換する酵素であってATPスルフリラーゼではないもの
をそれぞれ含有する容器を含むことができる。
実施例1〜5および7〜14では、PPiをATPに変換する酵素の一例としてATPスルフリラーゼを利用する。ATPスルフリラーゼを使用する実施例1〜5および7は、本発明を実際に例示するものである。さらに、実施例8〜14は(エンドポイント分析法に基づいてはいるが)dATPからの干渉の軽減をどのように達成することができるかを例示している。ただし、先に述べたように、PPiをATPに変換する酵素としてのATPスルフリラーゼの使用は、特許請求の範囲からは特に除外されるので、実施例1〜5および7〜14は特許請求の範囲には包含されない。しかし、ATPスルフリラーゼを使用する代わりに特許請求の範囲に包含される酵素を使用するように実施例1〜5および7を適合させることは、当業者であれば容易にできるだろう。また、当業者であれば、実施例8〜14に例示する方法を適合させて、それらを本願の方法に応用することも、容易にできるだろう。特許請求の範囲に包含される方法の使用は、実施例6に例示する。
簡単な生物発光アッセイを使って核酸増幅をリアルタイムで追跡することの潜在的可能性を例証するために、ループ媒介増幅(LAMP)として知られる等温核酸増幅反応を選択した。
1)反応混合物(Bst DNAポリメラーゼまたは標的DNAを除く)
2)DNAポリメラーゼ
catgaattcgtcaagtctacgataacttagcgcttaggatgtcagatacttatgatgataagctgatagactatcttgcctggaagcttacttcataatggatgacgtatgccatgatagataccattgtctagacataagactttcaatctgcatagtcatgatcgatccatgctcgagtccaagctagtcatagcttatcatcaactgaatctagtaagtcattgaattctag
プライマー配列:
Lamp B1cB2:tat cat ggc ata cgt cat cca ttt tta taa gct gat aga cta tct tgc
Lamp F1F2c:tca atc tgc ata gtc atg atc gtt ttt tga tga taa gct atg act agc
LampループB:tat gaa gta agc ttc cag
LampループF:atc cat gct cga gtc caa
Lamp B3プライマー:atg tca gat act tat gat g
Lamp F3cプライマー:aat gac tta cta gat tca g
200μl PCRチューブに、反応混合物18.6μlを加え、次に0.4ng/μlのテンプレートDNA 1μlおよびBst DNAポリメラーゼ0.4μlを加えた。対照として、さらにもう一つの200μl PCRチューブに、反応混合物18.6μlおよび0.4ng/μlのテンプレートDNAを加えたが、Bst DNAポリメラーゼは加えなかった。
Syngeneソフトウェアを使って、各試料からの光出力を時間の関数として定量した。得られた結果を図2に示す。
i)試料と対照の光減少率は最初は類似していた;
ii)ある期間後に、試料からの光強度は増加し始めたのに対して、対照は徐々に減少し続けた;
iii)試料からの光放射の増加率は増加し、最大に達した後、LAMP反応中で最大の光放射が記録される点に達するまで減少した;
iv)試料からの光放射がこの最大に達した後、光放射の減少が観察された;
v)最大光放射後は光放射の減少率が増加し、光放射の大きさが対照よりも小さくなった;
vi)光放射の減少率が減少し、最終的には対照の減少率と同じぐらいになった;
vii)この場合は、出発光強度は試料の方がわずかに高かったのに(これは、カメラに対する試料の相対的位置を考慮に入れるための処理を、試料からの光放射に対して何も行なわなかったという事実に関係している)、40分間の終了時点では、試料からの光放射の大きさは、対照よりもかなり小さかった。
LAMP反応で得られる結果の再現性を評価するために複数の試料を使用したこと以外は、実施例1と同じ手順を行なった。
試料および対照を二重または三重に実行したことおよび反応温度を55℃に上げたこと以外は、実施例1と同じにした。
結果を図3に示す。この場合は、実施例1と同じ試料曲線の進行が見られる。
出発材料および方法
実施例1に概説した手順と同じ手順を繰り返した。ただし試料には異なる量の標的DNAを使用した。含有するテンプレート核酸が合計で0.4ng、40pg、4pgまたは0.4pgのいずれかである二重試料を準備した。LAMP反応の温度は55℃とした。
結果として得た光放射プロファイルを各試料について図5に示す。図5で得た結果は本発明方法の重要な性質を実証している。テンプレート核酸の量と絶対的光放射との間に説得力のある相関関係はないが、ピーク光放射までの時間または光放射の変化率の変化までの時間との間には、明確な関係がある。
実施例1の場合と同じ手順を再び行なった。ただし、LAMP反応で得られる結果の再現性を、ある簡単なデータ操作を生データに施してから評価するために、複数の試料を使用した。具体的には、出力の一次導関数をプロットした。
これらは、試料および対照を三重に実行したこと、温度を50℃にしたこと、および各試料に合計1ngのテンプレートを使用したことを除いて、実施例1と同じにした。
LAMP法は約45℃〜65の温度範囲で機能させることができる。しかし、LAMP反応を行なう温度が高いほど、本発明の方法から得られる総合的光強度は(増幅が起こっても起こらなくても)低くなる。これは、使用する特定の耐熱性ルシフェラーゼ(PromegaのUltra-Glowルシフェラーゼ)が見かけ上、温度が高いほど低い速度で光反応を触媒するからである。したがってUltra-Glowルシフェラーゼの場合、55℃で観察される光放射の速度は、50℃で観察される速度よりかなり低い。しかし、例えば55℃から50℃に冷却すると、Ultra-Glowルシフェラーゼによって触媒される光放射の速度に増加が観察されるので、この効果は明らかに可逆的である。この可逆性は、高温で観察される光放射の減少が、単にルシフェラーゼ変性の結果だけではないことを暗示している。
実施例3と同様に(0.02pg/μl〜20pg/μlの範囲、すなわち試料全体で0.4pg〜試料全体で0.4ngの範囲にわたる)異なる量の標的テンプレートを含むさまざまな試料を試験したこと以外は、実施例1と同じにした。LAMP反応を55℃で開始させた後、10分後に温度を50℃に下げた。
この温度変化データから得られた生データを図10に示す。図10に示すデータは、この温度変化法が、温度を低下させたときに実際に光放射強度の増加をもたらすことを示している。さらに、ピーク光放射までの時間が依然として出発テンプレートDNA量の関数であるという点で、LAMPはその定量性を保っている。図10を、等価な量の標的テンプレートをLAMPで、ただし55℃の単一温度で試験する図5と比較すると、テンプレート量が最も多い試料(合計0.4ng/20pg/μl)とテンプレート量が最も少ない試料(合計0.4pg/0.02pg/μl)の間の時間差が約8分であるのに対して、図10に示す温度変化法では、時間差が約14分であることがわかる。
核酸増幅反応がLAMP反応である場合に、PPiをATPに変換する酵素として、PPDKの使用を試した。アッセイの成分は以下のとおりとした。
図12および図13は、LAMPの場合とちょうど同様に、ローリングサークル型増幅も、出発テンプレートの量に比例した時刻に光ピークを与えることを示している。
実施例9と同様に三つのPCR反応を準備した。試料の一つはサーモサイクリングにかけず、残りはサーモサイクリングにかけたが、一方にはTaqを加えなかった。予想される結果は、Taqと共にサーモサイクリングにかけた試料だけがPCR産物を生成するというものだった。これをゲル電気泳動によって確認した。各PCR反応液5μlを96穴プレート中のELIDA緩衝液25μlに加えた。CCDカメラを使って試料からの光放射を測定したところ、試料からの光放射は、ピロリン酸をアッセイした場合に、ゲルの結果と明確に対応することが実証された。
d-α-SATPの代わりにdATPを使用したこと以外は、実施例9と同様にPCR反応を準備した。すなわち標準的なPCR産物反応条件を使用した。二つの試料、すなわち(使用するプライマーに関して)正しいDNAテンプレートを含むものと、正しいDNAテンプレートが存在しないものを調製した。予想される結果は、正しいテンプレートを含む試料だけがPCR産物を生成するというものだった。PCR反応を行なった後、試料をゲル電気泳動によって分析した。次に、各PCR反応液5μlをELIDA緩衝液アッセイ試薬25μlに加え、実施例8と同様に緑色フィルターを装着したCCDカメラを使って、放射された光を検出した。検出された光放射はゲル電気泳動の結果と一致するので、このELIDAアッセイはどの試料がPCR産物をうまく生成したかを示すことができる。
実施例9と同様に(すなわちd-α-SATPを使って)七つのPCR試料を調製した。サーモサイクリング中、PCR反応が5サイクルするごとに、35サイクルまで、チューブの一つを取り出して、氷上に置いた。PCR産物の生成をゲル電気泳動を使って分析した。各試料5μlをELIDA緩衝液25μlに加え、放射された光をCCDカメラで記録した。図14(PCRサイクル数に対する光のグラフ)は、ELIDAアッセイから放射された光がサイクル数と共に増加することだけでなく、PCR産物をゲル上で検出できるようになる前に光放出が増加することを示している。
実施例12と同様にPCR反応を準備し、実行した。PCR反応液1μlをELIDAアッセイ緩衝液20μlと混合することによって、各PCR試料の分析を開始した。次に、試料から放射された光を、Labsystems Luminoscan Ascentルミノメーターで、1分間にわたる一連の4連続光測定値として測定した。各光測定値は(装置のデフォルトPMT電圧を使って)10秒間にわたって積分された試料からの光放射を表した。
試験プラスミドpPw601aを0.5pgしか使用しなかったこと以外は実施例9と同様にPCR反応を準備した。さらに、PCR反応は、d-α-SATPまたはdATPのどちらかを含有した。d-α-SATPまたはdATPのどちらかを含有する未反応PCR混合物のELIDAアッセイからの光放射を実施例13と同様に測定した。同じ試料で、それらが30サイクルのPCR反応を完了した後(そしてアガロースゲル分析で判断して同じ量のアンプリコンを生成した後)に、さらなるELIDAアッセイを行なった。未反応PCR混合物からの光放射と反応済みPCR混合物からの光放射との比を図16に示す(シグナル:バックグラウンド比を示す)。d-α-SATPを使用するとシグナル:バックグラウンド比はかなり改善されることがわかる。これは、d-α-SATPがdATPと同程度にはルシフェラーゼと反応しないという事実によるものである。
Claims (38)
- 試料中に存在するテンプレート核酸の量を決定するための方法であって、
i)試料を、
a)核酸ポリメラーゼ、
b)核酸ポリメラーゼの基質、
c)少なくとも二つのプライマー、
d)耐熱性ルシフェラーゼ、
e)ルシフェリン、
f)PPiをATPに変換する酵素であって、ATPスルフリラーゼではないもの、および
g)項目f)の酵素の、他の任意の必要な基質または補因子
を含む、核酸増幅に必要な成分の全ておよび核酸増幅の生物発光アッセイに必要な成分の全てと接触させるステップ、そして次に、
ii)核酸増幅反応を実行するステップ、
iii)生物発光反応からの光出力の強さをモニターするステップ、および
iv)試料中に存在するテンプレート核酸の量を決定するステップ
を含む方法。 - 少なくともステップii)およびステップiii)が密封された容器内で行なわれる、請求項1に記載の方法。
- ステップiii)において、光出力の強さが核酸増幅反応中にモニターされる、請求項1または請求項2に記載の方法。
- ステップiii)が、時間の関数としての光出力の強さのデータセットを生成させることをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 存在するテンプレート核酸の量が、光出力の強さの変化率が有意に変化する点に到達するのに要する時間をデータセットから測定することによって決定される、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップii)の核酸増幅反応の開始時に試料中に存在するテンプレート核酸の量を決定するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップii)の核酸増幅反応の結果として試料中に存在するテンプレート核酸の量を決定するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 存在するテンプレート核酸の量が、光出力の強さが増加し始める点に到達するのに要する時間をデータセットから測定することによって決定される、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 存在するテンプレート核酸の量が、光出力の強さが最大である点に到達するのに要する時間をデータセットから測定することによって決定される、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 存在するテンプレート核酸の量が、光出力の強さの減少率が増加する点に到達するのに要する時間をデータセットから測定することによって決定される、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 存在するテンプレート核酸の量が、光出力の強さの減少率が減少する点に到達するのに要する時間をデータセットから測定することによって決定される、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 存在するテンプレート核酸の量が、光出力の強さが所定のレベルに到達する点または所定のレベルを横切る点に到達するのに要する時間をデータセットから測定することによって決定される、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- ステップiv)が、光出力の強さを、試料が既知量のテンプレート核酸を含む対照からの光出力の強さと比較することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- テンプレート核酸が試料中に存在するかどうかを決定するための、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- テンプレート核酸が試料中に存在するかどうかが、光出力の強さが所定のレベルに到達するかどうかまたは所定のレベルを横切るかどうかをデータセットから測定することによって決定される、請求項14に記載の方法。
- 所定のレベルと比較した光出力の強さの増加が、試料中にテンプレート核酸が存在することを示す、請求項15に記載の方法。
- 所定のレベルと比較した光出力の強さの減少が、試料中にテンプレート核酸が存在することを示す、請求項15に記載の方法。
- テンプレート核酸が試料中に存在するかどうかが、光出力の強さが、ステップii)の増幅反応の開始後、所定の時間内に、所定のレベルに到達するかどうかまたは所定のレベルを横切るかどうかを、データセットから測定することによって決定される、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。
- ステップiv)が、光出力の強さを、増幅が起こっていない対照からの光出力の強さと比較することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅が起こっていない対照反応と比較した光出力の強さの減少が、試料中にテンプレート核酸が存在することを示す、請求項19に記載の方法。
- ステップii)の核酸増幅反応が、サイクリング温度範囲が75℃を超えない低温サーモサイクリング増幅法である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- ステップii)の核酸増幅反応が等温的に行なわれる、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- ステップii)の核酸増幅反応が、75℃を超えない温度範囲内で行なわれる、請求項22に記載の方法。
- ステップii)の核酸増幅反応が、増幅反応および生物発光アッセイの成分が安定であるような一定温度で行なわれる、請求項22または請求項23に記載の方法。
- ステップii)の核酸増幅反応が、増幅反応および生物発光アッセイの成分が安定であるような温度範囲内の二以上の温度で行なわれる、請求項22または請求項23に記載の方法。
- ステップii)の核酸増幅反応が高温で開始された後、低温に下げられる、請求項25に記載の方法。
- 医学的診断に使用するための、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 病原体が試料中に存在するかどうかの決定に使用するための、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ある特定核酸配列が、ある生物の遺伝暗号中に存在するかどうかを決定するための、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- テンプレート核酸に由来する核酸が遺伝子改変されているかどうかを決定するための、請求項29に記載の方法。
- ある生物が試料中に存在するかどうかを決定するための、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- イムノ核酸増幅技術で使用するための、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸ポリメラーゼ、核酸ポリメラーゼの基質、少なくとも二つのプライマー、耐熱性ルシフェラーゼ、ルシフェリン、PPiをATPに変換する酵素であってATPスルフリラーゼではないもの、項目f)の酵素の、他の任意の必要な基質または補因子、および適切な緩衝液を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法で使用するためのキット。
- a)核酸ポリメラーゼ、Mg2+源およびdNTP類の緩衝混合物、ならびに
b)ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびPPiをATPに変換する酵素であってATPスルフリラーゼではないもの
をそれぞれ含有する容器を含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法で使用するためのキット。 - キットの成分の少なくとも一つがキットでの貯蔵に適した形態をとっている、請求項33または請求項34に記載のキット。
- 請求項33〜35のいずれか一項に記載のキット中に存在する成分を組み込んだ、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法を実行するための装置。
- トラコーマクラミジアが試料中に存在するかどうかを決定するための、請求項31に記載の方法。
- PPiをATPに変換する酵素がピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ(PPDK)であり、酵素の基質がホスホエニルピルビン酸およびAMPである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
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