JP5570731B2 - ピロリン酸の測定方法 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は以下に関する。
[1]
下記(1)から(4)の各工程を含むピロリン酸の選択的な測定方法。
(1)試料中に含まれている可能性のあるピロリン酸を、少なくともAMPの存在下、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼに接触させ、ATPを生成する第一の反応を含む工程;
(2)上記第一の反応により生ずるATPをニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼに接触させ、ピロリン酸とNAD類を生成する第二の反応を含む工程;
(3)上記第二の反応により生ずるNAD類をNADH類に還元する第三の反応を含む工程;
(4)上記第三の反応により生ずるNADH類を検出する工程;
[1−1]
第三の反応により生ずるNADH類を検出する工程が、以下の工程を含む[1]に記載の測定方法。(5)ニトロブルーテトラゾリウム塩類の存在下、上記第三の工程により生ずるNADH類を還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩とNAD類とする第四の反応を含む工程;
(6)上記第四の反応により生ずる還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩類を検出する工程;
[1−2]
第四の反応により生ずるNAD類を、第三の反応に用い、第三の反応と第四の反応の間でサイクリング反応をさせる上記[1−1]に記載の測定方法。
[1−3]
第二の反応により生ずるピロリン酸を、第一の反応に用い、第一の反応と第二の反応の間でサイクリング反応をさせる上記[1]から[1−2]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−4]
第一の反応が、更に金属イオンを含む反応である上記[1]から[1−3]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−5]
金属イオンが、マグネシウムイオン、コバルトイオン、及びニッケルイオンからなる群から選ばれる1種、又は2種以上である上記[1−4]に記載の測定方法。
[1−6]
第一の反応が、更にホスホエノールピルビン酸(本明細書ではPEPと記載する場合がある)を含む反応である上記[1]から[1−5]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−7]
第二の反応が、更に金属イオンを含む反応である上記[1]から[1−6]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−8]
第二の反応に含まれる金属イオンが、マグネシウムイオン、コバルトイオン、及びニッケルイオンからなる群から選ばれる1種、又は2種以上である上記[1−7]に記載の測定方法。
[1−9]
第二の反応が、更にβ−ニコチンアミドモノヌクレオチド類(本明細書ではNMN類と記載する場合がある)を含む反応である上記[1]から[1−8]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−10]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、
〔1〕配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、第一の反応を触媒し得る酵素、
〔2〕配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号4のアミノ酸配列及び配列表配列番号5のアミノ酸配列を含む、第一の反応を触媒し得る酵素、又は、〔3〕下記の《1》から《5》の理化学的性質を有する第一の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である上記[1]から[1−9]のいずれか1つに記載の測定方法。
《1》至適pH
pH7から7.5の間に存在する;
《2》pH安定性
50℃、20分間でpH4.5から11の範囲で80%以上の活性を保持する;
《3》熱安定性
80℃、1時間の熱処理で90%以上の活性を保持し、且つ、4℃で少なくとも27日間保存後も70%以上の活性を保持する;
《4》補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、PEP及びピロリン酸を基質とした場合、アデノシン5’一リン酸(本明細書ではAMPと記載する場合がある)に対して特異的に補酵素として作用し、アデノシン5’二リン酸、イノシン5’一リン酸、シチジン5’一リン酸、グアノシン5’一リン酸、チミジン5’一リン酸又はウリジン5’一リン酸(本明細書では、順に、ADP、IMP、CMP、GMP、TMP、UMPと記載する場合がある)に作用しない;
《5》基質特異性
ピロリン酸を特異的に基質にする;
[1−11]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、第一の反応を触媒し得る酵素である上記[1]から[1−10]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−12]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号4のアミノ酸配列及び配列表配列番号5のアミノ酸配列を含む、第一の反応を触媒し得る酵素である上記[1]から[1−11]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−13]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、下記の《1》から《5》の理化学的性質を有する第一の反応を触媒し得る酵素である上記[1]から[1−12]のいずれか1つに記載の測定方法。
《1》至適pH
pH7から7.5の間に存在する;
《2》pH安定性
50℃、20分間でpH4.5から11の範囲で80%以上の活性を保持する;
《3》熱安定性
80℃、1時間の熱処理で90%以上の活性を保持し、且つ、4℃で少なくとも27日間保存後も70%以上の活性を保持する;
《4》補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、PEP及びピロリン酸を基質とした場合、AMPに対して特異的に補酵素として作用し、ADP、IMP、CMP、GMP、TMP、又はUMPに作用しない;
《5》基質特異性
ピロリン酸を特異的に基質にする;
[1−14]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、更に以下の《6》又は《7》のいずれかの理化学的性質を有する上記[1]から[1−13]のいずれか1つに記載の測定方法。
《6》冷凍安定性
−20℃で2週間保存後、90%以上の活性を保持する;
《7》冷蔵安定性
4℃で27日間保存後、80%以上の活性を保持する;
[1−15]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Thermotoga属由来である上記[1]から[1−14]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−16]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Thermotoga maritima由来である上記[1]から[1−15]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−17]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Thermotoga maritim a DSM 3109株由来である上記[1]から[1−16]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−18]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼをコードする塩基配列が、配列表配列番号2又は配列表配列番号3で表される塩基配列である上記[1]から[1−11]、又は[1−13]から[1−17]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−19]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、
〔1〕配列表配列番号6のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔2〕配列表配列番号6のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である上記[1]から[1−18]のいずれか1つに記載の測定方法。[1−20]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、配列表配列番号6のアミノ酸配列において、下記の<a>から<e>に記載のいずれか一つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素である上記[1]から[1−19]のいずれか1つに記載の測定方法。
<a>V132I(配列表配列番号6の132番目のVがIに置換したことを示す。以下同様。)
<b>D269V
<c>N64Y
<d>A65S
<e>A103S
[1−21]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼをコードする塩基配列が、配列表配列番号7で表される塩基配列である上記[1]から[1−20]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−22]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、真核生物由来である上記[1]から[1−21]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−23]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、酵母由来である上記[1]から[1−22]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−24]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、Saccharomyces属由来である上記[1]から[1−23]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−25]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、Saccharomyces cerevisiae由来である上記[1]から[1−24]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−26]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、dNTPsとATPに対する基質特異性の比率(dNTPsに対する基質特異性/ATPに対する基質特異性)が5%以下である上記[1]から[1−25]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−27]
第三の反応が、NAD類をNADH類に還元し得る酵素により触媒される反応である上記[1]から[1−26]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−28]
第三の反応が、12α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼにより触媒される反応である上記[1]から[1−27]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−29]
第四の反応におけるNADH還元物質が、ジアホラーゼ(diaphorase、本明細書では、DIと記載する場合がある)である上記[1]から[1−28]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−30]
試料が、dNTPsを含有する試料である、上記[1]から[1−29]のいずれか1つに記載の測定方法。
[1−31]
上記第一から第四の反応を含む工程から選ばれる一つ又は二つ以上の工程が、dNTPsを含有する工程である、上記[1]から[1−29]のいずれか1つに記載の測定方法。[1−32]
dNTPsが、dATP、dGTP、dCTP、及びdTTPからなる群から選ばれる1種又は2種以上である、上記[1−30]または[1−31]に記載の測定方法。
[1−33]
dNTPsが、少なくともdATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合物である、上記[1−30]または[1−31]に記載の測定方法。
[1−34]
dNTPsが、それぞれ0.4mM以下である上記[1−30]から[1−33]のいずれか1つに記載の測定方法。
[2]
上記[1]から[1−34]のいずれかに記載の方法を用いて、核酸増幅された試料又は該試料から調製された試料中に存在するピロリン酸を測定する核酸の検出又は定量方法。[2−1]
上記[1]から[1−34]のいずれかに記載の方法を用いて、核酸増幅された試料又は該試料から調製された試料中に存在するピロリン酸を測定し、核酸増幅前の試料におけるピロリン酸の値をブランク値として引くことを特徴とする核酸の検出又は定量方法。
[2−2]
上記[1]から[2−1]のいずれかに記載の方法を用いて、核酸増幅法による生成物であるピロリン酸を測定するピロリン酸の生成量を指標とする核酸の検出又は定量方法。
[2−3]
上記[1]から[2−2]のいずれかに記載の方法を用いて、核酸増幅法による生成物であるピロリン酸を測定し、核酸増幅前の試料におけるピロリン酸の値をブランク値として引くことを特徴とするピロリン酸の生成量を指標とする核酸の検出又は定量方法。
[3]
少なくとも以下の(1)から(7)を含む組成物。
(1)金属イオン
(2)AMP
(3)PEP
(4)ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
(5)NMN類
(6)ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
(7)NAD還元物質
[3−1]
更に以下の(8)と(9)を含む上記[3]に記載の組成物。
(8)NADH酸化物質
(9)ニトロブルーテトラゾリウム塩類(本明細書ではNTB類と記載する場合がある)
[3−2]
下記の(A)と(B)の2種の試薬を含む組成物。
(A)少なくとも以下の(1)から(4)を含む第1の試薬。
(1)金属イオン
(2)AMP
(3)PEP
(4)ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
(B)少なくとも以下の(5)から(7)を含む第2の試薬。
(5)NMN類
(6)ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
(7)NAD還元物質
[3−3]
更に、第2の試薬に、以下の(8)と(9)を含む上記[3−2]に記載の組成物。
(8)NADH酸化物質
(9)NTB類
[3−4]
金属イオンがマグネシウムイオン、コバルトイオン、及びニッケルイオンのうち、いずれか1つ以上である上記[3]から[3−3]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−5]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、
〔1〕配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、第一の反応を触媒し得る酵素、
〔2〕配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号4のアミノ酸配列及び配列表配列番号5のアミノ酸配列を含む、第一の反応を触媒し得る酵素、又は、〔3〕下記の《1》から《5》の理化学的性質を有する第一の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である上記[3]から[3−4]のいずれかに1つ記載の組成物。
《1》至適pH
pH7から7.5の間に存在する;
《2》pH安定性
50℃、20分間でpH4.5から11の範囲で80%以上の活性を保持する;
《3》熱安定性
80℃、1時間の熱処理で90%以上の活性を保持し、且つ、4℃で少なくとも27日間保存後も70%以上の活性を保持する;
《4》補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、PEP及びピロリン酸を基質とした場合、AMPに対して特異的に補酵素として作用し、ADP、IMP、CMP、GMP、TMP又はUMPに作用しない;
《5》基質特異性
ピロリン酸を特異的に基質にする;
[3−6]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、配列表配列番号1のアミノ酸配列からなり、第一の反応を触媒し得る酵素である上記[3]から[3−5]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−7]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、配列表配列番号1のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列は配列表配列番号4のアミノ酸配列及び配列表配列番号5のアミノ酸配列を含む、第一の反応を触媒し得る酵素である上記[3]から[3−6]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−8]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、下記の《1》から《5》の理化学的性質を有する第一の反応を触媒し得る酵素、のいずれかの酵素である上記[3]から[3−7]のいずれか1つに記載の組成物。
《1》至適pH
pH7から7.5の間に存在する;
《2》pH安定性
50℃、20分間でpH4.5から11の範囲で80%以上の活性を保持する;
《3》熱安定性
80℃、1時間の熱処理で90%以上の活性を保持し、且つ、4℃で少なくとも27日間保存後も70%以上の活性を保持する;
《4》補酵素特異性
マグネシウムイオン存在下で、PEP及びピロリン酸を基質とした場合、AMPに対して特異的に補酵素として作用し、ADP、IMP、CMP、GMP、TMP又はUMPに作用しない;
《5》基質特異性
ピロリン酸を特異的に基質にする;
[3−9]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、更に以下の《6》又は《7》のいずれかの理化学的性質を有する上記[3]から[3−8]のいずれか1つに記載の組成物。
《6》冷凍安定性
−20℃で2週間保存後、90%以上の活性を保持する;
《7》冷蔵安定性
4℃で27日間保存後、80%以上の活性を保持する;
[3−10]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Thermotoga属由来である上記[3]から[3−9]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−11]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Thermotoga maritima由来である上記[3]から[3−10]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−12]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが、Thermotoga maritimaDSM 3109株由来である上記[3]から[3−6]、又は[3−8]から[3−11]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−13]
ピルベートオルトホスフェートジキナーゼをコードする塩基配列が、配列表配列番号2又は配列表配列番号3で表される塩基配列である上記[3]から[3−12]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−14]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、〔1〕配列表配列番号6のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、〔2〕配列表配列番号6のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、のいずれかの酵素である上記[3]から[3−13]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−15]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、配列表配列番号6のアミノ酸配列において、下記の<a>から<e>に記載のいずれか一つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素である上記[3]から[3−12]、又は[3−14]のいずれか1つに記載の組成物。
<a>V132I
<b>D269V
<c>N64Y
<d>A65S
<e>A103S
[3−16]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼをコードする塩基配列が、配列表配列番号7で表される塩基配列である上記[3]から[3−15]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−17]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、真核生物由来である上記[3]から[3−16]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−18]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、酵母由来である上記[3]から[3−17]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−19]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、Saccharomyces属由来である上記[3]から[3−18]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−20]
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、Saccharomyces cerevisiae由来である上記[3]から[3−19]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−21]
第三の反応が、NAD類をNADH類に還元し得る酵素により触媒される反応である上記[3]から[3−20]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−22]
第三の反応が、12α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼにより触媒される反応である上記[3]から[3−21]のいずれか1つに記載の組成物。
[3−23]
第四の反応におけるNADH酸化物質が、DIである上記[3]から[3−22]のいずれかに記載の組成物。
[3−24]
更に下記の(C)を含む上記[3]から[3−23]のいずれか1つに記載の組成物。
(C)少なくとも既知量のピロリン酸を含むキャリブレーション試薬。
[4]
核酸を検出又は定量するための組成物である、上記[3]から[3−24]のいずれか1つに記載の組成物。
[5]
上記[4]に記載の組成物を用いて上記[2]又は[2−1]に記載の方法を行うことを特徴とする、核酸の検出又は定量方法。
[6]
dNTPsとATPに対する基質特異性の比率(dNTPsに対する基質特異性/ATPに対する基質特異性)が5%以下であるニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ。
本発明は更に、(5)ニトロブルーテトラゾリウム塩類の存在下、上記第三の工程により生ずるNADH類を還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩とNAD類とする第四の反応を含む工程、を含み、第四の反応により生ずる還元型NTB類(本明細書では、NTBH2と記載する場合がある)を検出する選択的ピロリン酸を測定する方法も挙げられる。
本発明の第一の反応に使用する酵素は、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ(P
yruvate orthophosphate dikinase (本明細書ではPPDKと記載する場合がある))でも良く、該PPDKは、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ(Pyruvate phosphate dikinase)や、EC 2.7.9.1等と表現される場合がある。本発明のPPDKの酵素作用は、例えばマグネシウムイオン等の金属イオンの存在下で、[式1]に示す通りである。例えば、ATP、ピルビン酸、及びリン酸を基質として用いたときの反応式は[式1]の左方向である。又、例えば、AMP、PEP、及びピロリン酸を基質として用いたときの反応式は[式1]の右方向である。本発明の第一の反応式は、AMPを基質としてATPを生じさせる反応であることから右方向の反応式である。
[式1]
AMP + PEP + ピロリン酸<=>ATP + ピルビン酸 + リン酸
Bacteriology 104,211−218 (1970))、Microbispora属由来(特開平08−168375号公報)等の公知のPPDKやそれらのアイソザイムがある。
U/ml以下である。
pHや安定性等の性質を利用しやすいように変化させることも可能である。上記の場合、PPDKの分子量は変化する場合があり、例えば、後述のpETベクターを利用してN末端にHisタグを付加すると分子量が約1,000大きくなる。本発明のPPDKのアミノ酸配列の二次構造や三次構造は、特に限定されない。
2.7.7.1等と表現される場合がある。本発明のNMNATaseの酵素作用は、例えばマグネシウムイオン等の金属イオンの存在下で、[式2]に示す通りである。例えば、ATP、及びNMNを基質として用いたときの反応式は[式2]の右方向である。又、例えば、NAD及びピロリン酸を基質として用いたときの反応式は[式2]の左方向である。本発明の第二の反応式は、右方向の反応式である。
[式2]
ATP + NMN <=> NAD + ピロリン酸
solfataricus由来(J.Bacteriol、179巻、7718頁、1997年)、古細菌であるMethanococcus jannaschii由来(J.Bacteriol、179巻、7718頁、1997年)、ヒト由来等の公知のNMNATase(Biochem.J、377巻、317頁、2004年)がある。尚、ヒト等を含む哺乳類や酵母等のMNATaseに、公知のアイソザイムがあればそれらを採用することもできる。
配列表配列番号6のアミノ酸配列であるSaccharomyces cerevisiae 6−2株由来のNMNATaseのアミノ酸配列は、Emanuelliら、Protein Expression and Purification 2003年、27巻、357頁により公知となったyNMNAT−2と同一であった。本発明のSaccharomyces cerevisiae 1−2株由来のNMNATaseのアミノ酸配列は、配列表配列番号6のアミノ酸配列の132番目のVがIに置換され(本明細書ではこのような置換を、置換前のアミノ酸、置換される位置、置換後のアミノ酸の順序からなる表記「V132I」等と記載する場合がある)、且つD269Vであった。又、本発明のSaccharomyces cerevisiae 3−2株由来のNMNATaseのアミノ酸配列は、N64Y、A65S、且つ、A103Sであった。従って、配列表配列番号6のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換の例としては、V132I、D269V、N64Y、A65S、A103S等が挙げられる。
本発明のNMNATaseの塩基配列については、上記PPDKの場合と同様である。
本発明の第二の反応において使用するNMNATaseの量については、上記PPDKの場合と同様である。本発明の第二の反応において、更に、NMN類、又は金属イオンを使用する場合、その種類と量についても同様である。
限は特に設けないが、20U/ml以下、好ましくは10U/ml以下、更に好ましくは5U/ml以下である。
本発明の第三の反応におけるNAD類は、NADまたはデアミドNAD(NAAD)等が挙げられ、そのうちいずれか一つ以上であっても良いがNADが特に好ましい
[式3]
基質 + NAD類 <=> 酸化された基質 + NADH類
本発明の第三の反応において、例えば12α−HSDを使用する場合、使用する12α−HSDの量は、例えば、下限が0.1U/ml以上、好ましくは0.5U/ml以上、更に好ましくは1U/ml以上、上限は特に設けないが、50U/ml以下、好ましくは20U/ml以下、更に好ましくは10U/ml以下である。
12α−HSDを使用する場合の一例として、コール酸(3α、7α、12α−Trihydroxy−5β−cholanic acid)を基質にした場合、生成物は3α、7α−Dihydroxy−12−oxo−5−β−cholanateである。
本発明の第四の反応におけるNTB類は、1,3,5−Triphenylformazan、1,5−Bis(4−methoxypheyl)−3−phenylformazan、1,5−Diphenyl−3−(2−thienyl)formazan等のホルマザン類や2,3,5−Triphenyltetrazolium、2,3,5−Tris(p−tolyl)tetrazolium、2,3−Bis(3−chlorophenyl)−5−phenyltetrazolium等のテトラゾリウム塩等、各種酵素の検出試薬、酸化還元系発色試薬として広く一般に用いられている複素環式有機化合物を含む。該NTB類や還元型NTB類は、水に不溶性、難溶性、又は可溶性のいずれでも良い。
本発明の第四の反応において、NTB類の存在下NADH類をNAD類に酸化する方法は公知の方法であれば特に限定されず、本発明のNADH酸化物質を利用してNADH類をNAD類に酸化する(NTB類を還元型NTB類に還元する)。該方法は、酵素的であっても非酵素的であっても良い。本発明の第四の反応は、[式4]に示す通りである。
[式4]
NTB類 + NADH類 <=> 還元型NTB類 + NAD類
1.6.99.3と表現される場合がある。
また、本発明における測定方法では、第四の反応を含む工程により生ずるNAD類を、
再度第三の反応を含む工程で反応させ、第三の反応を含む工程と第四の反応を含む工程の間でサイクリング反応を採用する事ができる。このサイクリング反応では還元型NTB類が増幅される。該サイクリング反応を本発明における測定方法に採用すれば、本発明の測定方法の、測定感度の向上が期待できる。図17に第三の反応を含む工程と第四の反応を含む工程の間でサイクリング反応をさせる場合の一例を示した。このサイクリング反応では3α、7α−Dihydroxy−12−oxo−5−β−cholanate、還元型NTB(NTBH2)が増幅されることになる。従って、該サイクリング反応を本発明における測定方法に採用すれば、還元型NTBが増幅されるので、本発明の測定方法の測定感度の向上が期待できる。
さらに、本発明における測定方法では、第一の反応を含む工程と第二の反応を含む工程の間でのサイクリング反応と、第三の反応を含む工程と第四の反応を含む工程の間でのサイクリング反応を同時に採用するダブルサイクリング反応を採用する事ができる。すなわち、第二の反応を含む工程により生じるピロリン酸を第一の反応を含む工程で反応させ、第二の反応を含む工程によりNADを増幅し、かつ、第四の反応を含む工程により生じるNADを第三の反応を含む工程で反応させ、第四の反応を含む工程により還元型NTB類を増幅する該ダブルサイクリング反応を本発明における測定方法に採用すれば、本発明の測定方法の、測定感度の向上が期待できる。
分以上、更に好ましくは3分以上である。上限は特に設けないが、好ましくは30分以下、更に好ましくは15分以下、特に好ましくは10分以下である。第一の反応を含む工程から第三の反応を含む工程の各工程の反応時間は不均等であっても良い。本発明の測定方法が、第四の反応を含む工程を含む場合も同様である。
(1)金属イオン
(2)AMP
(3)PEP(ホスホエノールピルビン酸)
(4)PPDK(ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ)
(5)NMN類(β−ニコチンアミドモノヌクレオチド類)
(6)NMNATase(ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ)
(7)NAD還元物質(例えばデヒドロゲナーゼ)
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物は、更に以下の(8)と(9)を含んでも良い。
(8)NADH酸化物質
(9)NTB類
(A)少なくとも以下の(1)から(4)を含む第1の試薬。
(1)金属イオン
(2)AMP
(3)PEP
(4)PPDK
(B)少なくとも以下の(5)から(7)を含む第2の試薬。
(5)NMN類
(6)NMNATase
(7)NAD還元物質
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物(B)は、更に以下の(8)と(9)を含んでも良い。
(8)NADH酸化物質
(9)NTB類
本発明の選択的ピロリン酸測定用の組成物は、更に下記の(C)を含んでも良い。
(C)少なくとも既知量のピロリン酸を含むキャリブレーション試薬。
及び、NTB類の種類と量、すなわち、該組成物がピロリン酸測定用の組成物となり得る為に有効な上記物質の量、及びpH緩衝剤の条件等は、上記の本発明の測定方法と同様である。
該既知量は特に限定されないが、例えばピロリン酸の場合、下限は0μM以上、好ましくは0.1μM以上、更に好ましくは0.5μM以上、上限は特に設けないが、1mM以下、好ましくは100μM以下、更に好ましくは50μM以下である。
本発明の第一の反応に使用する酵素は、公知の方法により、自然界から該酵素を形成する天然の生物を探索(スクリーニング)し、該生物の細胞から取得すれば良い。該生物は[式1]を触媒し得る酵素を形成する生物であれば限定されず、例えば真正細菌、真核生物、又は古細菌を含む微生物が挙げられる。微生物を探索の対象とする場合には、微生物は公知の方法に従って自然界から分離すれば良く、高温、低温、高圧、酸、アルカリ環境等の極限環境を含む土壌や水中、落下菌や氷核等を含む空中、又は、生物の体内等から得ることができる。特に高温環境から分離した微生物からは安定性の高い第一の反応に使用する酵素を得ることが期待できる。又、微生物は後述するATCCやDSM等の菌株バンクから購入しても良い。分離した微生物は、限界希釈法やモノコロニーの形成等公知の方法に従って純粋分離し、最少培地、LB培地、ブイヨン培地等で純粋培養し、その培養物において[式1]の酵素活性の有無を確認する事により、第一の反応に使用する酵素を形成する生物を選別できる。又、集積培養による微生物の取得等、探索の効率を上げる工夫も可能である。[式1]の酵素活性の有無は、後述する酵素活性測定方法等により当業者なら容易に確認できる。
学・分子生物学的手法を中心に、シュプリンガー・フェアラーク東京)等に従うことにより同定することができ、又、市販の各種菌株同定キット(日本ビオメリュー社等)を使用することによっても可能であり、更には、財団法人日本食品分析センター(東京都渋谷区元代々木町52番1号)等に依頼して同定しても良い。
又、得られた該酵素をコードする塩基配列やその情報は、上記の該酵素や該酵素を形成する天然の微生物を用いた、プロテインシーケンス、DNAシーケンスや公知遺伝子工学手法で取得できる。
又、該酵素をコードする塩基配列を含む細胞を用いる工程を採用する場合には、上記の第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列をベクターに挿入して宿主微生物に導入させて形質転換体を作成し、その形質転換体を用いて該酵素を形成する例が示される。
としては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、Novagen社のpETベクター、又はpBR322、pBR325、pACYC184、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pIN I、BluescriptKS+、Bacillus subtilisを宿主とする場合にはpWH1520、pUB110、pKH300PLK、放線菌を宿主とする場合にはpIJ680、pIJ702、酵母、特にSaccharomyces cerevisiaeを宿主とする場合にはYRp7、pYC1、YEp13等が使用できる。本発明においては大腸菌を宿主とするプラスミドベクターが好ましい。プロモーターは宿主中で発現できるものであれば特に限定されない。
このようなベクターを、第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列の切断に使用した制限酵素により生成する塩基配列の末端と、同じ末端を生成する制限酵素により切断してベクター断片を作成し、第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列の断片とベクター断片とを、DNAリガーゼにより常法に従って結合させて第一の反応に使用する酵素をコードする塩基配列を目的のベクターに挿入して、組換体ファージ又は組換体プラスミドとする。
subtilis、Bacillus megaterium等、放線菌に属する微生物の場合、Streptmyces lividans TK24等、Saccharomyces cerevisiaeに属する微生物の場合、Saccharomyces
cerevisiae INVSC1等が使用できる。本発明においては大腸菌を宿主微生物とする事が好ましい。
し、第一の反応に使用する酵素を形成する範囲で適宜変更し得るが、大腸菌や放線菌の場合、好ましくは下限としてpH5.8以上、好ましくはpH6.2以上で、上限としてpH8.5以下、好ましくはpH7.5以下である。
かくして得られる第一の反応に使用する酵素は安定化剤又は賦型剤として、各種の塩類、糖類、酵素、脂質、界面活性化剤等を加え、あるいは加えることなく、限外濾過濃縮、凍結乾燥等の方法により、液状又は固形の第一の反応に使用する酵素を得ることができ、又、適宜凍結乾燥を行う場合、安定化剤又は賦型剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミン等を0.5から10%程度添加しても良い。
二の反応に使用する酵素のアミノ酸配列の典型的な例としては、配列表配列番号6のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列をコードする塩基配列の一例は配列表配列番号7の塩基配列である。該塩基配列は、Emanuelliら、Protein Expression and Purification 2003年、27巻、357頁によりyNMNAT−2として明らかにされ、該塩基配列がコードする酵素は、NMNATaseであるがdATPも基質にすると報告されていた。したがって、当業者は当該先行文献から該塩基配列がコードするNMNATaseを使用した場合、dATPやdNTPsの影響を受けない選択的なピロリン酸を測定する事は不可能であると、考えるのが自然と思われる。
上記と別異なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として、ピロリン酸にATPスルフリラーゼを作用させた後、ルシフェラーゼを利用して、生成するATPを発光で検出する方法(WO92/16654)、及びピルビン酸リン酸ジキナーゼとルシフェラーゼを使用する方法(特許文献1)が公知である。該方法は、ピロリン酸を選択的に測定する為には、試料中に存在するdATPの消去が必要である場合があるし、発光を測定する装置が必要である。
上記と別異なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びキサンチンデヒドロゲナーゼ/オキシダーゼを使用する方法が公知である(特許文献2)。該方法は、ピロリン酸を選択的に測定する為には、試料中に存在する可能性のあるヒポキサンチンの消去が必要である。
上記と別異なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として、キナーゼ、ピロリン酸からATPを生成する酵素、及びNAD又はNADPを補酵素とする脱水素酵素を使用する方法が公知である(特許文献3)。該方法は、ピロリン酸を選択的に測定する為には、試料中に存在するdATPの消去が必要である。
従って本発明の測定方法は、例えば上記核酸増幅法による核酸増幅反応中又は反応後の被検液を測定することにより、簡便なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として好適である。
Spring Harbor Laboratory 1982年、1989年)や上記の蛋白質・酵素の基礎実験法、市販の各種酵素、又は、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。又、以下に示した測定値等は測定の条件や使用機器の精度等によりその値は変化し得る。
尚、本発明で使用する試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業株式会社製、シグマアルドリッチ社製、タカラバイオ株式会社製等であり、市販で容易に入手できるものを使用することができる。DSM菌株はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHで購入できる。ATCC菌株はAmerican Type Culture Collectionで購入できる。試薬のメーカーや純度等は特に限定されない。
[PPDK活性測定用反応試薬混合液1]
100mM HEPES/NaOH pH7.5
5mM PEP
2mM AMP
4mM MgCl2
4mM ピロリン酸
0.15mM NADH
1mlのPPDK活性測定用反応試薬混合液1を層長1cmの石英セル中で371分間予備加温した後、5,000U/mlの乳酸デヒドロゲナーゼ(Roche社製)を3μl添加し、更に37℃で1分間加温した。これに適当な濃度に希釈したPPDKを10μl添混和して酵素反応を開始し、反応開始後340nmにおける吸光度を測定して直線的に反応している1分間当たりの吸光変化をAs/minとした。PPDKの代わりに精製水を用いた場合の1分間当たりの吸光変化をAb/minとした。酵素活性(U/ml)は[式5]で算出した。本明細書では特に記載がない場合、PPDKの活性測定はPPDK活性測定方法1を使用した。
[式5]
酵素活性(U/ml)={(As/min−Ab/min)/6.22}×1.013/0.01×希釈倍数
上記PPDK活性測定方法1は、連続反応なので一度に多くの試料の活性測定が出来るが、乳酸デヒドロゲナーゼの熱安定性を考慮し37℃で測定するため、至適温度が50℃以上と予想される本発明のPPDK本の性質を正しく調べることは難しい。PPDK活性測定方法2は第一反応がThermotoga maritimaの生育至適温度(80℃)に近い温度(50℃)なので、本発明のPPDKの正しい性質を調べることが出来る可能性があるが、一方でトリクロロ酢酸を使用するので取扱上注意が必要であり、又、二段階で活性測定するため、一度に多くの試料の活性を測定するには操作が煩雑である。本実施例では、必要に応じてPPDK活性測定方法2を使用し、使用した場合は特に記載する。
[PPDK活性測定用反応試薬混合液2−1]
100mM HEPES/NaOH pH 7.5
5mM PEP
2mM AMP
5mM MgCl2
5mM ピロリン酸
酵素液と蒸留水を加えて400μlとする。
[PPDK活性測定用反応試薬混合液2−2]
1.15M Tris/HCl pH 8.0
0.135mM NADH
5U/ml 乳酸デヒドロゲナーゼ
遠心上精400μlを加えて1mlとする。
PPDK活性測定方法2は、酵素反応を2段階に分けて活性測定する方法である。適当な濃度に希釈したPPDKを用いてPPDK活性測定用反応試薬混合液2−1を調製した。このとき、酵素を加えずに調製したものを「ブランク」とし、酵素を加えたものを「テスト」とした。予め50℃に調製したPPDK活性測定用反応試薬混合液2−1にPPDK液と蒸留水を添加して400μlとして反応を開始し、10分間インキュベートして1段階目の反応を行った。続いてこの反応液を氷冷して50%トリクロロ酢酸を50μl加えて反応を停止した。反応液を4℃、15,000rpmで10分間遠心して得られた上清400μlを、新しいエッペンドルフチューブに予め準備しておいたPPDK活性測定用反応試薬混合液2−2に移した。これを37℃で10分間インキュベートすることにより2段階目の反応を行った後、「ブランク」と「テスト」の340nmの吸光度を測定してそれぞれAb、Atとした。酵素活性1単位(1ユニット)は、37℃で1分間に1マイクロモルのPEPをピルビン酸に変化させる酵素量として、Ab−Atより酵素活性を求めた(NADHのミリモル吸光係数は6.22)。
[NMNATase活性測定用反応試薬混合液]
100mM HEPES/NaOH pH7.5
2mM β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
2mM ATP
2mM MgCl2
1mM コール酸
5U/ml 12α−HSD(旭化成ファーマ株式会社製)
1mlのNMNATase活性測定用反応試薬混合液を層長1cmの石英セル中で37℃1分間予備加温した後、適当な濃度に希釈したNMNATaseを30μl混和して酵素反応を開始し、反応開始後340nmにおける吸光度を測定して直線的に反応している1分間当たりの吸光変化をAs/minとした。NMNATaseの代わりに精製水を用いた場合の1分間当たりの吸光変化をAb/minとした。酵素活性(U/ml)は[式6]で算出した。
[式6]
酵素活性(U/ml)={(As/min−Ab/min)/6.3}×1.03/0.03×希釈倍数
精製前の酵素、粗酵素液、および精製酵素等の蛋白質濃度はバイオラッド社のプロテインアッセイキット(ブラッドフォード法)を用いて使用説明書記載の方法に従って測定し、BSAをスタンダードとして算出した。
[実施例1]
<DNAの抽出>
Thermotoga maritima DSM 3109株の菌体を50mM Tris/HCl(pH8.0)、50mM EDTA、15%シュークロースを含む1mg/mlリゾチーム溶液で37℃、10分処理した後、SDSを最終濃度0.25%になるよう添加して菌体を溶解した。更に等量のフェノール/クロロホルムの1:1混合液を加え、30分攪拌した後、遠心分離(12,000rpm、15分間)して水層を回収し
た。回収した水層に10分の1量の3Mの酢酸ナトリウム(pH5.5)を混合後、2倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムDNAをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムDNAを、10mM Tris/HCl(pH8.0)、1mM EDTA水溶液(本明細書ではTEと記載する場合がある)に溶解し、適量のRNaseAを加え、37℃で1時間保温し、混在しているRNAを分解した。次いで、等量のフェノール/クロロホルムの1:1混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に10分の1量の3Mの酢酸ナトリウム(pH5.5)と2倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムDNAを分離した。この染色体をTEに溶解し、TE飽和のフェノールとクロロホルムの1:1混合液を加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層に3Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)とエタノールを加え、撹拌後、−70℃で5分間冷却した後、遠心分離(2,000G、4℃、15分)し、沈澱した染色体を75% エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりThermotoga maritima DSM 3109株のDNA標品を得た。
<PCR法による配列表配列番号1に示す遺伝子の増幅>
pET21a(+)又はpET28a(+)(Novagen)のマルチクローニングサイトNdeI及びHindIII部位に配列表配列番号2の遺伝子を挿入するように、配列表配列番号8と9のプライマーを設計した。pUC118を使用する場合は、マルチクローニングサイトXbaI及びHindIII部位に挿入するように配列表配列番号10と9のプライマーを設計した。PCRは、KOD DNAポリメラーゼを用いて常法に従って行った。得られた約2.7kbpのPCR産物は、例えばQIAGEN QIAquick PCR Purification Kitを用いる等、常法に従って精製した。
<発現ベクターとのライゲーション>
実施例2で精製した配列表配列番号8と9のプライマーを使用したPCR産物はNdeI及びHindIIIにより常法に従って制限酵素処理した(インサートA)。実施例2で精製した配列番号10と9のプライマーを使用したPCR産物はXbaI及びHindIIIにより常法に従って制限酵素処理した(インサートB)。これらインサートAとBは、例えばQIAGEN QIAquick PCR Purification Kitを用いる等、常法に従って精製した。インサートAはNdeI及びHindIIIにより制限酵素処理し精製したpET21a(+)又はpET28a(+)と常法に従ってライゲーションし、pET21a(+)/TM0272又はpET28a(+)/TM0272を作成した。インサートBはXbaI及びHindIIIにより制限酵素処理し精製したpUC118と常法に従ってライゲーションし、pUC118/TM0272を作成した。コロニーダイレクトPCR法によるポジティブクローンから精製した組換え体プラスミドは、DNAシーケンスしてインサート配列が正しい事を確認した。
<pET21a(+)/TM0272とpET28a(+)/TM0272の発現チェック>
pET21a(+)/TM0272、pET28a(+)/TM0272を大腸菌 BL21(DE3)に常法に従って形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含むSB培地(トリプトン12g、酵母エキス24g、グリセロール5mlを蒸留水0.9Lに溶かして121℃20分間滅菌した。リン酸一水素カリウム12.5g、リン酸二水素カリウム3.8gを蒸留水0.1Lに溶かして121℃20分間滅菌した。それぞれを室温まで冷却後混合して1LのSB培地とした。)に植菌した。37℃で13時間培養後にIP
TGを終濃度1mMになるように加えて、更に5時間培養を行った。培養液を遠心分離して集菌し、菌体を生理的食塩水で洗い、菌体湿重量の4倍量の20mM HEPES/NaOH(pH7.5)に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
<pUC118/TM0272の発現チェック>
pUC118/TM0272を大腸菌 JM109に常法に従って形質転換し、50μg/mlのアンピシリンを含むSB培地に植菌した。37℃で18時間培養後に培養液を遠心分離して集菌し、菌体を生理的食塩水で洗い、菌体湿重量の4倍量の20mM HEPES/NaOH(pH7.5)に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
<粗酵素液の熱処理>
実施例5で得た粗酵素液は80℃で15分間熱処理し遠心分離して、上清を粗精製液とした。この粗精製液のSDS−PAGEを図1に示した。
<PPDKの精製1>
20mM HEPES/NaOH(pH7.5)で平衡化したバイオラッド社のUnoQ(登録商標)陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに、実施例6の粗精製液をアプライした。カラムをベッド体積の5倍以上の20mM HEPES/NaOH(pH7.5)で洗浄した後、20mM HEPES/NaOH(pH7.5)と0.5M NaClを含む20mM HEPES/NaOH(pH7.5)を用いたベッド体積の12倍量のリニアグラジエント溶出を行った。活性画分を回収し、100倍量の20mM HEPES/NaOH(pH7.5)で透析する事により脱塩した。
10mM リン酸カリウム(pH7.5)で平衡化したバイオラッド社のハイドロキシアパタイトを用いたカラムに上記の脱塩したPPDKをアプライした。カラムをベッド体積の5倍以上の10mM リン酸カリウム(pH7.5)で洗浄した後、300mM リン酸カリウム(pH7.5)を用いてベッド体積の12倍量のリニアグラジエント溶出を行った。活性画分を回収し、1mMのDTTを含む100倍量の20mM HEPES/NaOH(pH7.5)で透析、又は1mMのDTTを含む20mM HEPES/NaOHで平衡化したゲル濾過剤であるG−25(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を使用して脱塩し、精製酵素とした。
本実施例により、500mlの培養液から収率約15%で比活性約5U/mgの精製酵素を約5mg得た。PPDK活性測定方法2で測定した。
<PPDKの精製2>
0.2MのNaClを含む20mM HEPES/NaOH(pH7.5)で平衡化したシグマアルドリッチ社のニッケルアフィニティーゲルクロマトグラフィーカラムに、実施例4の粗酵素液をアプライした。0.2MのNaClを含む20mM HEPES/NaOH(pH7.5)でカラムをベッド体積の5倍以上洗浄した後、0.2MのNaClと0.2Mのイミダゾールを含む20mM HEPES/NaOH(pH7.5)で吸着画分の溶出を行った。
溶出した活性画分に20%の硫酸アンモニウムを添加し、20%の硫酸アンモニウムを含む20mM HEPES/NaOH(pH7.5)で平衡化したフェニルトヨパールクロマトグラフィーカラム(東ソー社製)にアプライした。20%の硫酸アンモニウムを含む20mM HEPES/NaOH(pH7.5)でカラムをベッド体積の5倍以上洗浄
した後、20mM HEPES/NaOH(pH7.5)を用いたベッド体積の12倍量のリニアグラジエント溶出を行った。溶出した活性画分は実施例7と同様の方法で脱塩した。収率は約50%だった。本実施例により得られたPPDKの比活性は、7U/mgだった。PPDK活性測定方法2で測定した。
<PPDK活性の確認>
100mM HEPES/NaOH(pH7.5)、1mM AMP、1mM MgCl2、1mM PEP、1mM ピロリン酸からなる反応液に実施例7で得たPPDK 10μlを添加し、50℃で20分間反応した。反応液をAsahipak GS−320(昭和電工株式会社製)を用いたHPLCで分析した。移動相は200mM リン酸ナトリウム(pH3)で、流速は0.5ml/分、カラム温度は室温で260nmの吸光を測定した。反応液の代わりにATP、ADP、AMP及びアデノシン混合液を用いて、同条件下、HPLCで分析し、分離した結果を図2に示す。図3は反応前の反応液を分離した結果である。図4は反応後の反応液を分離した結果である。本結果より、AMPを基質とした時にATPが反応によって生じており、PPDK活性が確認できた。
<PPDK凍結保存安定性>
実施例7の脱塩していないPPDK(1.2U/ml)を−20℃で凍結保存して2週間後に融解し、凍結保存前後の活性を比較した結果、凍結保存後も94%の残存活性があった。
<PPDK冷蔵保存安定性>
実施例7で得た脱塩していないPPDK(1.2U/ml)を4℃で保存して、0、5、8、12、19、27日後に活性測定した結果を図5に示した。PPDKは冷蔵保存下で、27日保存後も80%以上の残存活性があった。また、該PPDKを同条件で9ヶ月保存後も80%以上の残存活性があった。PPDK活性は、測定方法2で測定した。
<熱安定性1>
実施例7で得た脱塩したPPDK約0.2mg/mlを50℃から100℃の範囲で20分間熱処理した。未処理の酵素活性を100%として残存活性(%)を図6に示した。その結果、本発明のPPDKは90℃、20分間の熱処理で、90%以上の活性を保持した。PPDK活性を、測定方法2で測定した。
<熱安定性2>
実施例7で得た脱塩したPPDK 約0.2mg/mlを80℃又は90℃で、0から1時間の範囲で熱処理した。未処理の酵素活性を100%として残存活性(%)を図7に示した。その結果、本発明のPPDKは90℃、1時間の熱処理で、70%以上の活性を保持し、80℃、1時間の熱処理で90%以上の活性を保持した。PPDK活性を測定方法2で測定した。
<至適pH>
PPDK活性測定用反応試薬混合液2−1における緩衝液をpH6からpH7の範囲はBis−Tris/HCl緩衝液(図8中○印)、pH7からpH8の範囲はHEPES/NaOH緩衝液(図8中△印)、pH8からpH9の範囲はグリシルグリシン/NaO
H(図8中□印)に変更して活性測定を行い、本発明のPPDKの至適pHを測定した。図8に、最大活性を100%とした相対活性(%)としてその結果を示した。本発明のPPDKの至適pHはpH7からpH7.5であった。PPDK活性を、測定方法2で測定した。実施例7で得た脱塩したPPDKを使用した。
<pH安定性>
実施例7で得た脱塩したPPDKを約0.06mg/mlの濃度になるように、100mMのpH4からpH6.5はクエン酸/クエン酸ナトリウム緩衝液(図9中○印)、pH6.5からpH7はイミダゾール/HCl緩衝液(図9中△印)、pH7からpH8はHEPES/NaOH緩衝液(図9中□印)、pH8からpH9はグリシルグリシン/NaOH緩衝液(図9中●印)、pH9からpH11はグリシン/NaOH緩衝液に溶解し(図9中■印)、50℃20分間で保存し、最大活性が得られた場合を100%として残存活性(%)を図9に示した。その結果、本発明のPPDKは50℃、20分間でpH4.5から11の範囲で80%以上の活性を保持した。PPDK活性を測定方法2で測定した。
<補酵素特異性>
PPDK活性測定用反応試薬混合液2−1におけるAMPを、ADP、IMP、CMP、GMP、TMP、及びUMPに変更して活性測定を行った。その結果、本発明のPPDKはマグネシウムイオン存在下で、PEP及びピロリン酸を基質とした場合、AMPに対して特異的に補酵素として作用し、ADP、IMP、CMP、GMP、TMP、及びUMPに作用しなかった。実施例7で得た脱塩したPPDKを使用した。
<金属イオン>
PPDK活性測定用反応試薬混合液2−1におけるMgCl2を、CoCl2、NiCl2、CaCl2、及びZnCl2に変更して、予め1mM EDTA及び0.2Mの硫酸ナトリウムを含む100倍量の20mM HEPES/NaOH(pH7.5)で2回透析した本発明のPPDKの活性測定を行った。その結果、本発明のPPDKは、金属イオンの無い場合、CaCl2及びZnCl2の場合は活性を示さなかったが、CoCl2の場合、NiCl2の場合は、MgCl2の場合を100%として、それぞれ74%、29%の相対活性を示した。実施例7で得た脱塩したPPDKを使用した。
<分子量>
分子量の計算値及び測定値は以下のとおりである。
(1)アミノ酸の一次配列からの計算値:98,102
(2)実施例7で得た脱塩したPPDKのSDS−PAGEによる測定値(図1の矢印):83,000
<Km値>
実施例7で得た脱塩したPPDKのPEP、ピロリン酸及びAMPに対する見かけのKmを、ラインウェーバー・バーク逆数プロットにより算出した。PEP、ピロリン酸及びAMPに対する見かけのKmは、それぞれ0.32mM、1.12mM、0.065mMであった。PPDK活性を測定方法2で測定した。
<NMNATaseの調整>
Saccharomyces cerevisiae 1−2株、3−2株、及び6−2株のDNAを、実施例1と同様の方法で得た。pUC118のマルチクローニングサイトXbaI及びHindIII部位に配列表配列番号7の遺伝子を挿入するように、配列表配列番号11と12のプライマーを設計した。実施例2と同様の方法でpUC118/Sc1−2、pUC118/Sc3−2、及びpUC118/Sc6−2を作成し、実施例5と同様の方法でNMNATaseの粗酵素液を調整した。該粗酵素液は10mMのTris/HCl緩衝液pH8.0で平衡化したQ sep.BB(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に吸着させた。10mMのTris/HCl緩衝液pH8.0で充分に洗浄した後、0及び0.5MのKClを含む10mMのTris/HCl緩衝液pH8.0を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度15%になるように硫酸アンモニウムを添加し、15%の硫酸アンモニウムを含む10mM リン酸カリウム緩衝液pH7.5で平衡化したPhenyl sep.FF(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に吸着して15及び0%の硫酸アンモニウムを含む10mM リン酸カリウム緩衝液pH7.5を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は10mM リン酸カリウム緩衝液pH7.5で平衡化したG−25で脱塩した後、10mM リン酸カリウム緩衝液pH7.5で平衡化したDEAE sep.FF(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に吸着させた。10mM リン酸カリウム緩衝液pH7.5で充分に洗浄した後、0及び0.5MのKClを含む10mM リン酸カリウム緩衝液pH7.5を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は10mM リン酸カリウム緩衝液pH7.0で平衡化したG−25で脱塩してNMNATase1−2、3−2、6−2を得た。100mlの培養液から本実施例により得られたNMNATase1−2、3−2、6−2は、約60U、700U、400Uであった。
<NMNATaseのdNTPs/ATPの比較>
下記の[組成物]を作成し、NMNATaseの、dNTPs/ATP(dNTPsとATPに対する基質特異性の比率)を測定した。測定には日立7080形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル20μl、R1として[組成物]を180μl、測定主波長は340nm、測定副波長は405nm、レートA、5分反応、測光ポイントは2−3とし、精製水によるブランクを差し引いた。試料として、1mMのdNTPsとATPを使用した。尚、レートA(Rate A)とは測定機器(日立7080形自動分析機)の測定方法の1つであり、日立7080形自動分析機の取扱説明書を参照すれば当業者なら理解出来る。その結果、NMNATase1−2、3−2、6−2のdNTPs/ATPは順に、1.7、1.3、0.8%であった。
[組成物]
100mM HEPES/NaOH pH7.5
1mM β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
2mM MgCl2
1mM コール酸
5U/ml 12α−HSD(旭化成ファーマ社製)
1U/ml 実施例20で調整したNMNATase1−2、3−2、6−2
<ピロリン酸の測定1>
下記の[組成物]を作成し、ピロリン酸の測定方法を実施した。測定には日立7080形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル20μl、R1として[組成物A]を150μl、R2として[組成物B]を150μl、測定主波長は340nm、測定副波長は405nm、2ポイントエンド、10分反応、測光ポイントは16−31とし、精製水によるブランクを差し引いた。試料としてピロリン酸を図10の横軸の範囲となるよう
に調整して、測定した結果を図10に示した。本発明の組成物を使用して本発明の測定方法によりピロリン酸の測定が実施できた。図中○、△、□は順にPPDKの[組成物A]中の濃度1、5、10U/mlを示す。尚、2ポイントエンド(2point end)とは測定機器(日立7080形自動分析機)の測定方法の1つであり、日立7080形自動分析機の取扱説明書を参照すれば当業者なら理解出来る。
[組成物A]
100mM HEPES/NaOH pH7.5
1mM PEP
1mM AMP
1mM MgCl2
1、5、10U/ml 実施例7で調整した脱塩後のPPDK
[組成物B]
100mM HEPES/NaOH pH7.5
1mM β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
2mM MgCl2
1mM コール酸
5U/ml 実施例20で調整したNMNATase3−2
5U/ml 12α−HSD(旭化成ファーマ社製)
<ピロリン酸の測定2>
下記の[組成物]を作成し、ピロリン酸の測定方法を実施した。測定には日立7080形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル20μl、R1として[組成物A]を150μl、R2として[組成物B]を150μl、測定主波長は546nm、測定副波長は660nm、レートA、10分反応、測光ポイントは27−30とし、精製水によるブランクを差し引いた。0から20μMのピロリン酸を試料とした場合の測定結果を図11の○で、0から40μMのピロリン酸を0.8mMのdNTPsと1:1で混合して試料とした場合の測定結果を図11の●で示した。0から20μMのピロリン酸を試料とした場合、Y=0.4X+5、R2=0.996、0から40μMのピロリン酸を0.8mMのdNTPsと1:1で混合して試料とした場合、Y=0.4X+14、R2=0.991、となり、dNTPsの共存下でも精度良くピロリン酸が測定できた。また、反応速度が等比級数的に時間とともに増大したので、本実施例の反応はサイクリング反応であることが確認された。
[組成物A]
100mM HEPES/NaOH pH7.5
1mM PEP
1mM AMP
1mM MgCl2
1U/ml 実施例7で調整したPPDK
[組成物B]
100mM HEPES/NaOH pH7.5
1mM β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
1mM MgCl2
1mM コール酸
0.025% ニトロテトラゾリウムブルー
0.5U/ml 実施例20で調整したNMNATase3−2
5U/ml 12α−HSD(旭化成ファーマ社製)
5U/ml DI(旭化成ファーマ社製)
<ピロリン酸の測定3>
PCRによる核酸増幅反応中の被検液のピロリン酸濃度を測定した。PCRは、TOYOBO社製Blend Taqを使用して以下の[PCR mixture]で実施した。PCR条件は94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分を25サイクル実施し、図12の横軸に示した各サイクル数の時に[PCR mixture]を一部抜き取り被検液とし、下記の[組成物]でピロリン酸濃度を検出した。Templateは実施例20のpUC118/Sc6−2とし、配列表配列番号7の遺伝子を増幅した。増幅遺伝子は約1.5kbpであった。定量は、20μMのピロリン酸水溶液をキャリブレーターとして測定して被検液中のピロリン酸濃度を算出した。測定には日立7080形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプルとして被検液を20μl、R1として[組成物A]を150μl、R2として[組成物B]を150μl、測定主波長は546nm、測定副波長は660nm、レートA、10分反応、測光ポイント27−30とし、0サイクル目の被検液の値をブランクとして差し引いた。
その結果を図12に示したように、本発明の組成物を使用してPCRによる核酸増幅反応中の被検液のピロリン酸濃度を、可視光で測定することができた。本発明の測定方法は、上記核酸増幅法による核酸増幅反応中の被検液を測定することにより、簡便なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として好適である事が確かめられた。また、反応速度が等比級数的に時間とともに増大したので、本実施例の反応はサイクリング反応であることが確認された。
[PCR mixture]
×10 Buffer for Blend Taq 10μl
2mM dNTPs 4μl
2.5U/μl Blend Taq polymerase 2μl
50μl プライマーM13Forward 2μl
50μl プライマーM13Reverse 2μl
200ng/μl TemplateDNA 1μl
蒸留水 79μl
[組成物A]
100mM HEPES/NaOH pH7.0
1mM PEP
1mM AMP
1mM MgCl2
1U/ml 実施例7で調整したPPDK
[組成物B]
100mM HEPES/NaOH pH7.0
1mM β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
1mM MgCl2
1mM コール酸
0.025% ニトロテトラゾリウムブルー
0.5U/ml 実施例20で調整したNMNATase3−2
5U/ml 12α−HSD(旭化成ファーマ社製)
5U/ml DI(旭化成ファーマ社製)
<ピロリン酸の測定4>
PCRによる核酸増幅反応中の被検液中のピロリン酸濃度を測定した。測定方法は実施例24と同様である。Templateは実施例5のpUC118/TM0272とし、配列表配列番号2の遺伝子を増幅した。
その結果を図13に示した様に、本発明の組成物を使用してPCRによる核酸増幅反応中の被検液のピロリン酸濃度が可視光で測定できた。本発明の測定方法は、上記核酸増幅
法による核酸増幅反応中の被検液を測定することにより、簡便なピロリン酸の生成量を指標とする核酸の測定方法として好適である事が確かめられた。また、反応速度が等比級数的に時間とともに増大したので、本実施例の反応はサイクリング反応であることが確認された。
<PPDK発現の改良>
配列表配列番号1に示す遺伝子の中で、大腸菌において使用頻度が低いと考えられるコドン(AGA、AGG、ATA、CGG、CCC、CUA)全てを大腸菌において使用頻度が高いコドンに変換して配列表配列番号3の遺伝子を作成した。コドン変換は、合成プライマーを使用したPCRによる常法で行った。実施例2、3、5、6と同様の方法で粗精製液を得て、図14に示すSDS−PAGEで、配列表配列番号2の遺伝子によるPPDKの発現量(図中(A))と配列表配列番号3(図中(B))の遺伝子によるPPDKの発現量を比較した。配列表配列番号3の遺伝子によるPPDKの発現量は、配列表配列番号2の遺伝子によるPPDKの発現量に比べて改善された。又、配列表配列番号3の遺伝子によるPPDKの培養力価は、配列表配列番号2の遺伝子によるPPDKの培養力価に比べて約3倍高くなった。
<リアルタイムPCRとの比較>
PCRによる核酸増幅を、SYBR(登録商標)GreenIを用いた蛍光と、本発明のピロリン酸濃度測定方法を用いた可視光で検出して比較した。PCRはタカラバイオ株式会社のSYBR(登録商標)Premix Ex Taq(登録商標)を用いて、下記の[PCR mixture]を調整して行った。Templateは約220bpのフラグメントを挿入したpUC119を使用した。SYBR(登録商標)GreenIを用いたPCRは、タカラバイオ株式会社のSmart cycler(登録商標)II Systemを使用したリアルタイムPCRで蛍光を検出した。通常のPCRは、Applied Biosystems 9800 Fast サーマルサイクラーを使用した。各サイクル数の時に[PCR mixture]を一部抜き取り被検液とし、下記の[組成物]で日立7080形自動分析機を使用して、本発明のピロリン酸濃度測定方法を用いて、可視光で検出した。PCR条件は、SYBR(登録商標)Premix Ex Taq(登録商標)の取扱説明書に記載のSmart cycler(登録商標)II Systemの標準プロトコール、すなわち95℃10秒の後、95℃5秒と60℃20秒を40サイクル実施するシャトルPCRとした。Applied Biosystems 9800 Fast サーマルサイクラーを用いたPCR条件も同様であった。日立7080形自動分析機のパラメーターはサンプルとして被検液を20μl、R1として[組成物A]を100μl、R2として[組成物B]を50μl、測定主波長は546nm、測定副波長は660nm、レートA、10分反応、測光ポイント23−21とし、0サイクル目の被検液の値をブランクとして差し引いた。
その結果を図15に示した。図15中●がタカラバイオ株式会社のSmart cycler(登録商標)II Systemを使用したリアルタイムPCRによる核酸増幅を検出した結果で、○は本発明のピロリン酸濃度測定組成物とピロリン酸濃度測定方法を用いて核酸増幅を検出した結果である。リアルタイムPCRでは約15サイクル目から、本発明の測定方法は、約17サイクル目から核酸増幅を検出できた。このように、本発明の測定方法は、従来から汎用されているリアルタイムPCRとほぼ同時期に核酸増幅を検出することができ、しかも、本発明は可視光によるピロリン酸の生成量を指標とすることから、リアルタイムPCRよりも簡便に核酸を測定することができ、好適な測定方法であることが確かめられた。また、反応速度が等比級数的に時間とともに増大したので、本実施例の反応はサイクリング反応であることが確認された。
[PCR mixture]
×1 SYBR(登録商標)Premix Ex Taq(登録商標)
0.2μM M13Forward Primer
0.2μM M13Reverce Primer
約50ng Template
[組成物A]
150mM HEPES/NaOH pH7.0
1.5mM PEP
1.5mM AMP
1.5mM MgCl2
1.5U/ml 実施例7で調整したPPDK
[組成物B]
50mM HEPES/NaOH pH7.0
2mM β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
2mM MgCl2
2mM コール酸
0.05% ニトロテトラゾリウムブルー
1U/ml 実施例20で調整したNMNATase3−2
10U/ml 12α−HSD(旭化成ファーマ社製)
10U/ml DI(旭化成ファーマ社製)
<ピロリン酸の測定3>
下記の[組成物]を作成し、ピロリン酸の測定方法を実施した。測定には日立7080形自動分析機を使用した。パラメーターはサンプル20μl、R1として[組成物A]を150μl、R2として[組成物B]を150μl、測定主波長は546nm、測定副波長は660nm、レートA、10分反応、測光ポイントは27−30とし、精製水によるブランクを差し引いた。0から1μMのピロリン酸を試料とした場合の測定結果を図18の○で、0から2μMのピロリン酸を0.8mMのdNTPsと1:1で混合して試料とした場合の測定結果を図18の●で示した。0から1μMのピロリン酸を試料とした場合、Y=11.0X+0.8、R2=0.998、0から2μMのピロリン酸を0.8mMのdNTPsと1:1で混合して試料とした場合、Y=9.84X+8.0、R2=0.999、となり、dNTPsの共存下でも精度良くピロリン酸が測定できた。Myokinase(シグマ社製)、ADP−HKTII(ADP依存型のヘキソキナーゼ(旭化成ファーマ社製))は試料中のATPやdATPを消去するために添加した。P1,P5,−diadenosine−5’−pentaphosphate(Ap5A)はMyokinaseの阻害剤である。
[組成物A]
100mM HEPES/NaOH pH7.5
0.2% TX−100
1mM PEP
1mM AMP
1mM MgCl2
10mM Glucose
2U/ml ADP−HKTII
3U/ml Myokinase
[組成物B]
100mM HEPES/NaOH pH7.5
1mM β−ニコチンアミドモノヌクレオチド
1mM MgCl2
5U/ml 12α−HSD
1mM コール酸
0.025% ニトロテトラゾリウムブルー
0.5U/ml 実施例20で調整したNMNATase3−2
5U/ml DI
0.2% TX−100
1U/ml 実施例7で調整したPPDK
40μM Ap5A
Claims (11)
- 下記(1)から(4)の各工程を含む試料中のピロリン酸の選択的な測定方法であって、
(1)試料中に含まれている可能性のあるピロリン酸を、少なくともAMP及びホスホエノールピルビン酸の存在下、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼに接触させ、ATPを生成する第一の反応を含む
工程;
(2)上記第一の反応により生ずるATPを、少なくともニコチンアミドモノヌクレオチドの存在下、ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼに接触させ、ピロリン酸とNAD類を生成する第二の反応を含む工程;
(3)上記第二の反応により生ずるNAD類をNADH類に還元する第三の反応を含む工程;
(4)上記第三の反応により生ずるNADH類を検出する工程;
前記ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、
〔1〕配列表配列番号6のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔2〕配列表配列番号6のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である、前記測定方法。 - 第三の反応により生ずるNADH類を検出する工程が、以下の工程を含む請求項1に記載の測定方法。
(5)ニトロブルーテトラゾリウム塩類の存在下、上記第三の工程により生ずるNADH類を還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩とNAD類とする第四の反応を含む工程;
(6)上記第四の反応により生ずる還元型ニトロブルーテトラゾリウム塩類を検出する工程; - 第四の反応により生ずるNAD類を、第三の反応に用い、第三の反応と第四の反応の間でサイクリング反応をさせる請求項2に記載の測定方法。
- 第二の反応により生ずるピロリン酸を、第一の反応に用い、第一の反応と第二の反応の間でサイクリング反応をさせる請求項1から3のいずれか1項に記載の測定方法。
- 試料が、トリ燐酸化デオキシリボ核酸類(dNTPs)を含有する試料である、請求項1から4のいずれか1項に記載の測定方法。
- ピルベートオルトホスフェートジキナーゼが配列表配列番号1のアミノ酸配列からなるピルベートオルトホスフェートジキナーゼである、請求項1〜5のいずれかに記載の測定方法。
- 請求項1から6のいずれか1項に記載の方法を用いて、核酸増幅された試料又は該試料から調製された試料中に存在するピロリン酸を測定することを特徴とする、核酸の検出又は定量方法。
- 少なくとも以下の(1)から(7)を含む組成物であって、
(1)マグネシウムイオン
(2)AMP
(3)ホスホエノールピルビン酸
(4)ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
(5)β−ニコチンアミドモノヌクレオチド類
(6)ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
(7)NAD還元物質
前記(6)のニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、
〔1〕配列表配列番号6のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔2〕配列表配列番号6のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である、前記組成物。 - 下記の(A)と(B)の2種の試薬を含む組成物であって、
(A)少なくとも以下の(1)から(4)を含む第1の試薬。
(1)マグネシウムイオン
(2)AMP
(3)ホスホエノールピルビン酸
(4)ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
(B)少なくとも以下の(5)から(7)を含む第2の試薬。
(5)β−ニコチンアミドモノヌクレオチド類
(6)ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ
(7)NAD還元物質
前記(6)のニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼが、
〔1〕配列表配列番号6のアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
〔2〕配列表配列番号6のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、第二の反応を触媒し得る酵素、
のいずれかの酵素である、前記組成物。 - 核酸を検出又は定量するための組成物である、請求項8または9に記載の組成物。
- 請求項10に記載の組成物を用いて請求項6に記載の方法を行うことを特徴とする、核酸の検出又は定量方法。
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