JPS59166099A - Ａｔｐまたはｎｍｎの高感度測定法 - Google Patents
Ａｔｐまたはｎｍｎの高感度測定法Info
- Publication number
- JPS59166099A JPS59166099A JP4120283A JP4120283A JPS59166099A JP S59166099 A JPS59166099 A JP S59166099A JP 4120283 A JP4120283 A JP 4120283A JP 4120283 A JP4120283 A JP 4120283A JP S59166099 A JPS59166099 A JP S59166099A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nad
- reaction system
- reaction
- dehydrogenase
- nmn
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＡＴＰ （アデノシントリホスフェ−１−）
またはＮＭＮ にコチン酸アミドモノヌクレオチド）の
高感度測定法に関する。更（・こ詳しくは１．ＡＴＰお
よびＮＭＮのいずれが一成分を含有する被検液に、主反
応系（こおいてＮＭＮまたはＡＴ２＋ Ｐ、Ｍｇ （マグネシウムイオン）の存在下ｅこＮ
ＭＮアデニリルトランスフエラーゼを作用させてＮＡＤ
とピロリン酸に変換させ、主反応の後、生したＮＡＤを
、Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系、
たとえば少なくともＮＡＤを消費して還元型ＮＡＤを生
成する反応を形成するデヒドロゲナーゼおよびその基質
ｔこよる反応系と、還元型Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ）を補酵素
とする酸化還元反応系たとえば還元型ＮＡＤを消費して
ＮＡＤを生成するジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩
とＱこよる反応系との組合せｔこよる補酵素サイクリン
グ反応を行ない、次いで反応において生成または消費さ
れる成分を定量してなるＡＴＰおよびＮＭＮのいずれか
一成分を含有する被検液中の成分の高感度測定法に関す
る。
またはＮＭＮ にコチン酸アミドモノヌクレオチド）の
高感度測定法に関する。更（・こ詳しくは１．ＡＴＰお
よびＮＭＮのいずれが一成分を含有する被検液に、主反
応系（こおいてＮＭＮまたはＡＴ２＋ Ｐ、Ｍｇ （マグネシウムイオン）の存在下ｅこＮ
ＭＮアデニリルトランスフエラーゼを作用させてＮＡＤ
とピロリン酸に変換させ、主反応の後、生したＮＡＤを
、Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系、
たとえば少なくともＮＡＤを消費して還元型ＮＡＤを生
成する反応を形成するデヒドロゲナーゼおよびその基質
ｔこよる反応系と、還元型Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ）を補酵素
とする酸化還元反応系たとえば還元型ＮＡＤを消費して
ＮＡＤを生成するジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩
とＱこよる反応系との組合せｔこよる補酵素サイクリン
グ反応を行ない、次いで反応において生成または消費さ
れる成分を定量してなるＡＴＰおよびＮＭＮのいずれか
一成分を含有する被検液中の成分の高感度測定法に関す
る。
ＮＭＮアデニリルトランスフエラーセ（ＥＣ。
２．７．７．／）は下記の酵素作用を有し、ネズミの肝
臓、脳細胞、およびブタの肝臓の細胞核ｅこ存在するこ
とが知られている（ Ｍ、 Ｒ，ＡＬｋｉｎｓｏｎ。
臓、脳細胞、およびブタの肝臓の細胞核ｅこ存在するこ
とが知られている（ Ｍ、 Ｒ，ＡＬｋｉｎｓｏｎ。
Ｊ、Ｆ、 Ｊａｅｌｃｓｏｎ、 Ｒ，に、 Ｍｏｒｔｏ
ｎ、 Ｂｉｏｃｂｃｍ、Ｊ、 。
ｎ、 Ｂｉｏｃｂｃｍ、Ｊ、 。
ＮＭＮアデニリルトランスフエラーゼ
本酵素の活性測定法としては、反応Ｑこより生じたＮＡ
Ｄをアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／。
Ｄをアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／。
／、／、／）で還元して、生じた還元型ＮＡＤを３１１
０ｎｍｌこよる吸光度測定する方法の報告がなされてい
る（ Ａ、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、 ” Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” 、 ｖｏｌ、ｕ 、
Ｐ、乙７０ （／９５３））。
０ｎｍｌこよる吸光度測定する方法の報告がなされてい
る（ Ａ、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、 ” Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” 、 ｖｏｌ、ｕ 、
Ｐ、乙７０ （／９５３））。
しかし、この活性測定法をこ基いてＡＴＰまたはＮＭＮ
の定量法となしても、その感度が低く、ＡＴＰまたはＮ
ＭＮの定量法としては利用し帰いものであった。
の定量法となしても、その感度が低く、ＡＴＰまたはＮ
ＭＮの定量法としては利用し帰いものであった。
本発明者は、上記反応ｅこより生じたＮＡＤを測定する
ことにより、さらＱここのＮＡｐを、ＮＡＤ（Ｐ）を補
酵素とする酸化還元反応系と貸元型ＮＡＤ （Ｐ）を補
酵素とする反応系との組合ぜｅこよる補酵素サイクリン
グ反応（こより増幅反応させ、生成または消費される成
分を定量することＱこより高感度に測定できることを見
い出した。
ことにより、さらＱここのＮＡｐを、ＮＡＤ（Ｐ）を補
酵素とする酸化還元反応系と貸元型ＮＡＤ （Ｐ）を補
酵素とする反応系との組合ぜｅこよる補酵素サイクリン
グ反応（こより増幅反応させ、生成または消費される成
分を定量することＱこより高感度に測定できることを見
い出した。
補酵素サイクリングは、従来よりよく知られた方法であ
り（生化学実験講座よ 酵素研究法、」二／２／〜／３
！；、８本生化学会編、東京化学同人）、基質や酵素活
性を増幅定量する方法てあり、生体内の微量成分の測定
Ｑこは適した方法である。
り（生化学実験講座よ 酵素研究法、」二／２／〜／３
！；、８本生化学会編、東京化学同人）、基質や酵素活
性を増幅定量する方法てあり、生体内の微量成分の測定
Ｑこは適した方法である。
しかしながら、従来おこなわれていたサイクリング法で
は、主反応系ＱこはＮＡＤおよび還元型ＮＡＤの側方が
共存しており、このＮＡＤおよび還元型ＮＡＤのいずれ
か一方を定量する場合？こは、まず反応系に共存する定
量対象外のＮＡＤまたは還元型ＮＡＤのいずれかを消去
するアルカリまたは酸の添加、加熱処理の操作を必須と
し、次いでｐ Ｈをサイクリング反応（こ適した値に調
整後サイクリング反応を行ない、さらに指示反応をおこ
なわなければならず、操作性に問題があり、その指示反
応自体が被測定物質以外の影響を受ける場合が多かった
。しかも油井のよりな粕殊な反応容器を必要とし、非常
に微量の反応液量でおこなわれてきた。さらｔこ、従来
の方法では、共存する定量対象外のＮＡＤまたは還元型
ＮＡＤ補酵素を消去する場合、酸またはアルカリを添加
、加熱処理後、中和するものて、この中和のためのアル
カリまたは酸の量を非常Ｑこ正確に用いて中和すること
を要し、良好ｔこ中和できず、ｐ Ｈ＆’−ばらつきが
生じた場合、これがサイクリング率ｔこ大きく影響し、
測定値の誤差の原因となっていた。
は、主反応系ＱこはＮＡＤおよび還元型ＮＡＤの側方が
共存しており、このＮＡＤおよび還元型ＮＡＤのいずれ
か一方を定量する場合？こは、まず反応系に共存する定
量対象外のＮＡＤまたは還元型ＮＡＤのいずれかを消去
するアルカリまたは酸の添加、加熱処理の操作を必須と
し、次いでｐ Ｈをサイクリング反応（こ適した値に調
整後サイクリング反応を行ない、さらに指示反応をおこ
なわなければならず、操作性に問題があり、その指示反
応自体が被測定物質以外の影響を受ける場合が多かった
。しかも油井のよりな粕殊な反応容器を必要とし、非常
に微量の反応液量でおこなわれてきた。さらｔこ、従来
の方法では、共存する定量対象外のＮＡＤまたは還元型
ＮＡＤ補酵素を消去する場合、酸またはアルカリを添加
、加熱処理後、中和するものて、この中和のためのアル
カリまたは酸の量を非常Ｑこ正確に用いて中和すること
を要し、良好ｔこ中和できず、ｐ Ｈ＆’−ばらつきが
生じた場合、これがサイクリング率ｔこ大きく影響し、
測定値の誤差の原因となっていた。
本発明者は上記の種々の欠点を解決するために補酵素サ
イクリング法Ｑこよる増幅高感度測定法を改良すべく種
々研究した結果、サイクリング反応自体を指示反応とす
ること、それｔこより指示反応のための操作も試薬も必
要とぜず、エンド・ポイント法だけてなく、レイ１−法
も可能である特徴を有し、しかも特殊な反応容器を必要
とぜず、一般の恒温槽で反応が可能であるばかりでなく
ドライケミカル法（フィルム法、固定化法）にも利用で
きる非常（こ簡便な方法であることを見い出した。
イクリング法Ｑこよる増幅高感度測定法を改良すべく種
々研究した結果、サイクリング反応自体を指示反応とす
ること、それｔこより指示反応のための操作も試薬も必
要とぜず、エンド・ポイント法だけてなく、レイ１−法
も可能である特徴を有し、しかも特殊な反応容器を必要
とぜず、一般の恒温槽で反応が可能であるばかりでなく
ドライケミカル法（フィルム法、固定化法）にも利用で
きる非常（こ簡便な方法であることを見い出した。
さらに本発明Ｑこおいては、主反応系において補酵素を
必要としないので、主反応Ｑこ要した物質が残存してい
ても被測定物質の測定に影響を及ぼさないため、主反応
の後補酵素の不活性化の操作を必要とぜす、正確な測定
が可能であることを見い出した。
必要としないので、主反応Ｑこ要した物質が残存してい
ても被測定物質の測定に影響を及ぼさないため、主反応
の後補酵素の不活性化の操作を必要とぜす、正確な測定
が可能であることを見い出した。
本発明は上記知見ｅこ基くものて、ＡＴＰおよびＮＭＮ
のいずれか一成分を含有する被検液Ｑこ、主柱下にｋｂ
Ｎアデニリルトランスフエラーゼヲ作用させてＮＡＤと
ピロリン酸（こ変換させ、主反応の後、生したＮＡ、Ｄ
を、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系と、還
元型ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする反応系との組合せぐこ
よる補酵素サイクリング反応をおこない、次いてこのサ
イクリンク反応において生成または消費される成久を定
石することを特徴とす゛る被検液中の成分の高１・と度
測定法である。
のいずれか一成分を含有する被検液Ｑこ、主柱下にｋｂ
Ｎアデニリルトランスフエラーゼヲ作用させてＮＡＤと
ピロリン酸（こ変換させ、主反応の後、生したＮＡ、Ｄ
を、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系と、還
元型ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする反応系との組合せぐこ
よる補酵素サイクリング反応をおこない、次いてこのサ
イクリンク反応において生成または消費される成久を定
石することを特徴とす゛る被検液中の成分の高１・と度
測定法である。
本発明３こおける反応系は以下のように説明される。
ＮＭＮアデニリルｌ・ランヌフエフーゼ■ 補酵素サイ
クリング反応系： ■ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系：Ｅユ Ｎ Ａ、 Ｄ ＋ Ｓユーーーー−一一一→還元型ＮＡ
Ｄ＋−Ｐ１酸化還元反応 ■還元型ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする反応系：２ 還元型Ｎ Ａ 、Ｄ ＋Ｓ ２−一→ＮＡＤ十Ｐ２還元
型ＮＡＤおよびＰｌ を生成する反応を触媒するデヒ
ドロゲナーゼ。
クリング反応系： ■ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系：Ｅユ Ｎ Ａ、 Ｄ ＋ Ｓユーーーー−一一一→還元型ＮＡ
Ｄ＋−Ｐ１酸化還元反応 ■還元型ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする反応系：２ 還元型Ｎ Ａ 、Ｄ ＋Ｓ ２−一→ＮＡＤ十Ｐ２還元
型ＮＡＤおよびＰｌ を生成する反応を触媒するデヒ
ドロゲナーゼ。
Ｅ ２ ＋、還元型ＮＡＤおよびＳ２を消費して、Ｎ
ＡＤおよＪ’ Ｐ ２を生成する反応を触媒する作用物
質。
ＡＤおよＪ’ Ｐ ２を生成する反応を触媒する作用物
質。
Ｓ□ ：Ｅユの基質。
Ｓ２二Ｅ２の基質。
Ｐ□ ：Ｓ□の酸化生成物。
Ｐ２：８２の還元生成物。
これを図示すると以下のようになる。
本発明の被検液としては、少なくともＡＴＰまたはＮＭ
Ｎのいずれか一成分を含有するものであればよく、ＡＴ
ＰまたはＮＭＮを予め含有してなる被検液や、ＡＴＰま
たはＮＭＮを遊離生成せしめてなるＡＴＰまたはＮＭＮ
含有被検液か挙げられる。ＡＴＰを遊離生成せしめてな
るＡＴＰ含有被検液としては、通常キナーゼ、ＡＤＰお
よびキナーゼ基質用リン化合物による酵素反応（こでそ
のＡＤＦ’がリン酸化されてＡＴＰを遊離、生成せしめ
る酵素反応系のものが挙げられる。さらＱこ詳しくは、
下記の酵素反応系か例示さλする力・、こ’、ｌｔらは
例示であって何んら本発明のＡ象を限定１−るものでは
ない。
Ｎのいずれか一成分を含有するものであればよく、ＡＴ
ＰまたはＮＭＮを予め含有してなる被検液や、ＡＴＰま
たはＮＭＮを遊離生成せしめてなるＡＴＰまたはＮＭＮ
含有被検液か挙げられる。ＡＴＰを遊離生成せしめてな
るＡＴＰ含有被検液としては、通常キナーゼ、ＡＤＰお
よびキナーゼ基質用リン化合物による酵素反応（こでそ
のＡＤＦ’がリン酸化されてＡＴＰを遊離、生成せしめ
る酵素反応系のものが挙げられる。さらＱこ詳しくは、
下記の酵素反応系か例示さλする力・、こ’、ｌｔらは
例示であって何んら本発明のＡ象を限定１−るものでは
ない。
■クレアチンキナーゼ（ＥＣ，２，７，３，，２）、Ａ
ＤＰおよびクレアチン１貫ノ、フェートの酵素反応系で
、クレアチンキナーゼｇｉａ：ン１１１１、Ａ Ｄ Ｐ
ノＱ 量、クレアチンホノフエートの定ｍのυ＼ｉ’
ｈ 力Ａ−一成分測定のためＱこ用いられる。
ＤＰおよびクレアチン１貫ノ、フェートの酵素反応系で
、クレアチンキナーゼｇｉａ：ン１１１１、Ａ Ｄ Ｐ
ノＱ 量、クレアチンホノフエートの定ｍのυ＼ｉ’
ｈ 力Ａ−一成分測定のためＱこ用いられる。
クレアチンホヌフエート＋ＡＤＰ
クレアチンキナーゼ
（還元剤：β−メルカブトエクノール、還元型グルタチ
オン、シヌテイン、Ｎ−アセチルシヌテイン、ジチオヌ
レイー１゛−ｐなど） ■ピルベートキナーゼ（Ｅｃ、、２．７． ／、、
グＯ）、ＡＤＰおよびホスホエリ−ルビルピン酸の酵
素反応系で、ピルベートキナーゼ活性測定、ＡＤＰの定
量、ホヌホエノールビルビン酸のいずれか一成分の測定
に用いられる。
オン、シヌテイン、Ｎ−アセチルシヌテイン、ジチオヌ
レイー１゛−ｐなど） ■ピルベートキナーゼ（Ｅｃ、、２．７． ／、、
グＯ）、ＡＤＰおよびホスホエリ−ルビルピン酸の酵
素反応系で、ピルベートキナーゼ活性測定、ＡＤＰの定
量、ホヌホエノールビルビン酸のいずれか一成分の測定
に用いられる。
木ヌホエノ＝ｐピルビン酸−１−ＡＤＰピルビン酸＋Ａ
ＴＰ ■アセテートキナーゼ（ＥＣ，２，７，２，／）系て、
ｂ”ｔいずれか一成分の測定ｅこ用いられる。
ＴＰ ■アセテートキナーゼ（ＥＣ，２，７，２，／）系て、
ｂ”ｔいずれか一成分の測定ｅこ用いられる。
アセチルホヌフエート＋Ａ、 Ｄ Ｐ
アセテートキナーゼ
以下、各酵素反応系を簡略して挙げる。
■カルバモイルホヌフェート＋ＡＤＰ
Ｍｇ”
ＮＨ３＋ Ｃ’０２＋ Ａ Ｔ Ｐ
■グーホヌホーＸ−アヌパルティｌ−＋ Ａ Ｄ ＰＭ
ｇ”” アヌバルテイ１−キナーゼ（Ｅｃ、 、！、 ７．．２
．グＬ−アヌパルテイト＋ＡＴＰ ■乙３−ジホヌホーＤ−ダリセレイｌ−＋ Ａ Ｄ Ｐ
Ｍｇ２＋またはＭｎ”＋ ホスホグリセレイトキナーゼ（ＥＣ，２，７，１３）３
−ホヌホーＤ−クリセレイト＋ＡＴＰＯアルギニンホス
フェ−１−＋ＡＤＰ Ｍｇ２＋ ま ｌこ ば Ｍｎ ２” Ｌ−アルギニン＋ＡＴＰ ■ＡＤ Ｐ ＋ＡＤ Ｐ Ｍｇ”” ミオキナーゼ（ＥＣ，，２，７，＜１！、 ３）■ＸＤ
Ｐ十ＡＤＰ Ｍｇ２＋、 Ｍｎ ”＋４たハｃａ２＋ＸＭＰ十ＡＴＰ （ただしＸＤＰ−ヌクレオザイＩＳジホスフェ−１−ｘ
＝＝ｃｒ、：ｃ、Ｇ、ＣまたはＡを示ず）これらの酵素
反応系３こおけるキナーゼとしては、例エバ前記のクレ
アチンボスフェート、ボスポエノールヒルビン酸、アセ
チルポヌフェ−１・、カルベモイルホスフェート、クー
ホヌポーＬ−アスパルテイｌ−１／、３−シホスホーＤ
−グリセレイト、アルギニンホスフェート、ＡＤＰ、Ｘ
ＤＰなとのキナーゼ基質用リン化合物のリン酸基をＡＤ
Ｐ＆こ転位ぜしめてＡＴＰを生成遊離する作用を有する
酵素であればよく、例えばクレアチンボスフェートをキ
ナーゼ基質用リン化合物とするクレアチンキナーゼ、ホ
ヌホエノールヒルビン酸をキナーゼ基質用リン化合物と
するピルベートオキシダーゼ、アセチルホヌフェートを
キナーゼ基質用リン化合物とするアセテートキナーゼ、
その他のホスホグリセレイトキナーゼ、アルギニンキナ
ーゼ、ミオキナーゼ、ヌクレオサイドモノホスフェート
キナーゼなどが挙げられる。ＮＭＮを遊離生成せしめて
なるＮＭＮ含有被検液としては、下記の酵素反応系が例
示されるが、これは例示であって本発明の対象を何ら限
定するものではない。
ｇ”” アヌバルテイ１−キナーゼ（Ｅｃ、 、！、 ７．．２
．グＬ−アヌパルテイト＋ＡＴＰ ■乙３−ジホヌホーＤ−ダリセレイｌ−＋ Ａ Ｄ Ｐ
Ｍｇ２＋またはＭｎ”＋ ホスホグリセレイトキナーゼ（ＥＣ，２，７，１３）３
−ホヌホーＤ−クリセレイト＋ＡＴＰＯアルギニンホス
フェ−１−＋ＡＤＰ Ｍｇ２＋ ま ｌこ ば Ｍｎ ２” Ｌ−アルギニン＋ＡＴＰ ■ＡＤ Ｐ ＋ＡＤ Ｐ Ｍｇ”” ミオキナーゼ（ＥＣ，，２，７，＜１！、 ３）■ＸＤ
Ｐ十ＡＤＰ Ｍｇ２＋、 Ｍｎ ”＋４たハｃａ２＋ＸＭＰ十ＡＴＰ （ただしＸＤＰ−ヌクレオザイＩＳジホスフェ−１−ｘ
＝＝ｃｒ、：ｃ、Ｇ、ＣまたはＡを示ず）これらの酵素
反応系３こおけるキナーゼとしては、例エバ前記のクレ
アチンボスフェート、ボスポエノールヒルビン酸、アセ
チルポヌフェ−１・、カルベモイルホスフェート、クー
ホヌポーＬ−アスパルテイｌ−１／、３−シホスホーＤ
−グリセレイト、アルギニンホスフェート、ＡＤＰ、Ｘ
ＤＰなとのキナーゼ基質用リン化合物のリン酸基をＡＤ
Ｐ＆こ転位ぜしめてＡＴＰを生成遊離する作用を有する
酵素であればよく、例えばクレアチンボスフェートをキ
ナーゼ基質用リン化合物とするクレアチンキナーゼ、ホ
ヌホエノールヒルビン酸をキナーゼ基質用リン化合物と
するピルベートオキシダーゼ、アセチルホヌフェートを
キナーゼ基質用リン化合物とするアセテートキナーゼ、
その他のホスホグリセレイトキナーゼ、アルギニンキナ
ーゼ、ミオキナーゼ、ヌクレオサイドモノホスフェート
キナーゼなどが挙げられる。ＮＭＮを遊離生成せしめて
なるＮＭＮ含有被検液としては、下記の酵素反応系が例
示されるが、これは例示であって本発明の対象を何ら限
定するものではない。
ルビロホスフェート
ＮＭＮ＋ピロリン酸
これらの酵素反応系におけるＡＴＰまたＮＭＮの定量目
的は、酵素反応系における酵素の活性測定や用いられる
他の成分の定量のいずれが一成分の測定のため（こ行な
われるもので、また酵素反応系の測定成分以外の成分は
試薬として一定介用いればよい。この際用いられる被検
液や試薬の量は、測定すべき目的や選択する条件（こよ
って適宜設計変更すればよ（、特Ｑこ限定されるもので
はない。またこの酵素反応では通常３７℃で一分間以上
行なえばよい。このように本発明の被検液としてはＡＴ
Ｐ、ＮＭＮのいずれか一成分を含有するものが対象とし
て挙げられるものである。
的は、酵素反応系における酵素の活性測定や用いられる
他の成分の定量のいずれが一成分の測定のため（こ行な
われるもので、また酵素反応系の測定成分以外の成分は
試薬として一定介用いればよい。この際用いられる被検
液や試薬の量は、測定すべき目的や選択する条件（こよ
って適宜設計変更すればよ（、特Ｑこ限定されるもので
はない。またこの酵素反応では通常３７℃で一分間以上
行なえばよい。このように本発明の被検液としてはＡＴ
Ｐ、ＮＭＮのいずれか一成分を含有するものが対象とし
て挙げられるものである。
本発明Ｑこ用いられるＮ Ｍ Ｎアデニリル１−ランヌ
フエラーセは、ＡＴＰおよびＮＭＮを基質とし、Ｍｇ
イオンの存在下ＮＡＤおよびピロリン酸を生成する
反応を触媒する酵素（ＥＣ，，２，７，７，７）であり
、動物または微生物のいずれＱこ由来するものでもよく
、例えばブタ肝臓、酵母由来のものか挙げられる（ Ｍ
、 Ｒ、Ａｔｋｉｎｓｏｎ、 Ｊ、 Ｆ。
フエラーセは、ＡＴＰおよびＮＭＮを基質とし、Ｍｇ
イオンの存在下ＮＡＤおよびピロリン酸を生成する
反応を触媒する酵素（ＥＣ，，２，７，７，７）であり
、動物または微生物のいずれＱこ由来するものでもよく
、例えばブタ肝臓、酵母由来のものか挙げられる（ Ｍ
、 Ｒ、Ａｔｋｉｎｓｏｎ、 Ｊ、 Ｆ。
Ｊａｃｌｃｓｏｎ、Ｒ，Ｋ、 Ｍｏｒｔｏｎ、Ｂｉｏ
ｃｌ＋ａｍ、Ｊ、、 ｇＱ。
ｃｌ＋ａｍ、Ｊ、、 ｇＱ。
３／ｇＣ／９ｇ／））。このＮＭＮアデニリルトランス
フエラーゼの作用３こより、被検液中のＡＴＰば、用い
るＮＭＮとともＱこＮＡＤおよびピロリン酸を生成し、
また被検液中のＮＭＮは用いるＡＴＰとともにＮＡＤお
よびピロリン酸を生成する主反応を行わせしめる。
フエラーゼの作用３こより、被検液中のＡＴＰば、用い
るＮＭＮとともＱこＮＡＤおよびピロリン酸を生成し、
また被検液中のＮＭＮは用いるＡＴＰとともにＮＡＤお
よびピロリン酸を生成する主反応を行わせしめる。
この主反応Ｑこついて、その反応液量は、通常／テスト
当り１０μｔから３ｍｌの範囲の容量で反応Ｌ ’４
ル、 Ｎ Ｍ Ｎアデニリルトランスフエラーゼは、反
応時間または待時間により異なるが、通常／テスト当り
０５〜７００単位、好ましくは７０承位以上で作用し得
る。また用いられるＮＭＮまたはＡＴＰは、少なくとも
被検液中のＡＴＰまたはＮＭＮの量販上（こ用いればよ
く、またこの主反応Ｑこおいて被検液中のＡＴＰまたは
ＮＭＮの量に相応したＮＡＤが生成される。
当り１０μｔから３ｍｌの範囲の容量で反応Ｌ ’４
ル、 Ｎ Ｍ Ｎアデニリルトランスフエラーゼは、反
応時間または待時間により異なるが、通常／テスト当り
０５〜７００単位、好ましくは７０承位以上で作用し得
る。また用いられるＮＭＮまたはＡＴＰは、少なくとも
被検液中のＡＴＰまたはＮＭＮの量販上（こ用いればよ
く、またこの主反応Ｑこおいて被検液中のＡＴＰまたは
ＮＭＮの量に相応したＮＡＤが生成される。
次Ｑこ補酵素サイクリングにより増幅反応させるのであ
るが、本発明においては、主反応系（こおいて試料中の
ＡＴＰまたはＮＭＮ量に相応して変換され生じたＮＡＤ
を、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系と、還
元型ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする反応系との組合せｅこ
よる補酵素サイクリング反応をおこない、次いてこのサ
イクリング反応において生成または消費される成分を定
帝する。
るが、本発明においては、主反応系（こおいて試料中の
ＡＴＰまたはＮＭＮ量に相応して変換され生じたＮＡＤ
を、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系と、還
元型ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする反応系との組合せｅこ
よる補酵素サイクリング反応をおこない、次いてこのサ
イクリング反応において生成または消費される成分を定
帝する。
ＮｉバＤ （Ｐ）とは、ＮＡＤのみ、またはＮＡＤとＮ
ＡＤＰの両方とのいずれかの意味を示するもめで、ＮＡ
’Ｄ（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系ととしては例
えば、ＮＡＤを消費して還元型ＮＡＤを生成する反応を
形成するデヒドロゲナーゼ（Ｅｌ）およびその基質（Ｓ
ｌ） ＆こよる反応系や、ＮＡＤとＮＡＤＰの両方を補
酵素とするデヒドロゲナーゼ（Ｅｌ）およびその基質（
Ｓ□）による反応系を用いることができる。上記のデヒ
ドロゲナーゼは、特に限定されることなく、少なくとも
ＮＡＤを補酵素として消費するものであればよく、かつ
過剰量用いる特定の基質シこ作用して還元型ＮＡＤを生
成するデヒドロゲナーゼであればいかなる起源の酵素て
あってもよい。これらの酵素およびその基質の例として
は［酵素ハンドブックＪ ’＋こ記載されているが、例
として、ラクデートデヒドロゲナー／、’／、６）およ
びグリセロール、グリセロール−３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ，／、 ／、’ ／、 ｇ ）オ、
、ｌ：ヒグリセロール−３−ホヌフエート、グルコース
デヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／、、／、／’、 グア）
およびグルコース、マレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，
／、ｙ、 ７．３７）およびＬ−マレート、グルタメイ
トデヒドロゲナーゼ（ＥＣ’、 ／、 ｌｌ−、／、
、２ ）およびＬ−グルタメイト、３−α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／、／、／、３０
）および３−α−ヒト゛ロキシヌテロイドなどが挙げら
れる。これらの酵素を用いる酸化還元反応系における酵
素（Ｅｌ）、基質（Ｓｌ）、酵素反応、生成物（Ｐｌ）
は以下に示す通りである。
ＡＤＰの両方とのいずれかの意味を示するもめで、ＮＡ
’Ｄ（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系ととしては例
えば、ＮＡＤを消費して還元型ＮＡＤを生成する反応を
形成するデヒドロゲナーゼ（Ｅｌ）およびその基質（Ｓ
ｌ） ＆こよる反応系や、ＮＡＤとＮＡＤＰの両方を補
酵素とするデヒドロゲナーゼ（Ｅｌ）およびその基質（
Ｓ□）による反応系を用いることができる。上記のデヒ
ドロゲナーゼは、特に限定されることなく、少なくとも
ＮＡＤを補酵素として消費するものであればよく、かつ
過剰量用いる特定の基質シこ作用して還元型ＮＡＤを生
成するデヒドロゲナーゼであればいかなる起源の酵素て
あってもよい。これらの酵素およびその基質の例として
は［酵素ハンドブックＪ ’＋こ記載されているが、例
として、ラクデートデヒドロゲナー／、’／、６）およ
びグリセロール、グリセロール−３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ，／、 ／、’ ／、 ｇ ）オ、
、ｌ：ヒグリセロール−３−ホヌフエート、グルコース
デヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／、、／、／’、 グア）
およびグルコース、マレートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，
／、ｙ、 ７．３７）およびＬ−マレート、グルタメイ
トデヒドロゲナーゼ（ＥＣ’、 ／、 ｌｌ−、／、
、２ ）およびＬ−グルタメイト、３−α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／、／、／、３０
）および３−α−ヒト゛ロキシヌテロイドなどが挙げら
れる。これらの酵素を用いる酸化還元反応系における酵
素（Ｅｌ）、基質（Ｓｌ）、酵素反応、生成物（Ｐｌ）
は以下に示す通りである。
■Ｌ−ラクテート（Ｓｌ） ＋ ＮＡＤ（Ｅｌ）
ピルビン酸（Ｐｌ）十還元型ＮＡＤ
■エ タ ノ −ル （Ｓよ）＋ＮＡＤ（Ｅｌ）
アセトアルデヒド（Ｐｌ）十還元型ＮＡＤ■グリセロー
ル（Ｓｌ）＋ＮＡ Ｄ （Ｅｌ） ジヒドロキシアセトン（ＰＩ ）十還元型ＮＡＤ■グリ
セロール−３−ホスフェ−１〜（Ｓｌ）＋ＮＡＤ（Ｅｌ
） デヒドロゲナーゼ ジヒドロキシアセトンホヌフエート（ＰＩ ）＋還元型
ＮＡＤ ■グルコース（Ｓ□）＋ＮＡＤ（Ｐ） （Ｅｌ） ノ グルコＮ−δ−ラクトン（Ｐｌ）十還元型ＮＡＤ■Ｌ−
マレ−）（Ｓよ）＋ＮＡＤ （Ｅｌ） マレートデヒドロゲナーゼ オギザロ酢酸（Ｐよ）十還元型ＮＡＤ ■Ｌ−グルタメイト（Ｓ□）＋Ｈ２０＋ＮＡＤ（Ｅｌ） ２−オギソグルタレイト（Ｐ□）十還元型ＮＡＤ■３−
α−ヒドロキシヌテロイ）’（Ｓｌ）＋ＮＡＤ（Ｅｌ） デヒドロゲナーゼ ３−ケトヌテロイド（Ｐｌ）十還元型Ｎ、、ＡＤこれら
の酸化還元反応に使用する酵素量は、酵素力価、基質の
種類および補酵素サイクリング率によって異なる。基質
量は、／サイクル毎に／モル比の基質を消費してなるも
ので、サイクリングする補酵素より比較にならない程は
るかに多いモル量が使用されるもので、通常単位時間当
りのザイク／Ｉ／数および反応時間に基いて決定すれば
よ（、またその酸化還元酵素の反応速度が最大を示すよ
うな濃度以上であればよい。通常０． ／ ｍ Ｍない
し１００ｍＭの濃度範囲で存在し得る。
ル（Ｓｌ）＋ＮＡ Ｄ （Ｅｌ） ジヒドロキシアセトン（ＰＩ ）十還元型ＮＡＤ■グリ
セロール−３−ホスフェ−１〜（Ｓｌ）＋ＮＡＤ（Ｅｌ
） デヒドロゲナーゼ ジヒドロキシアセトンホヌフエート（ＰＩ ）＋還元型
ＮＡＤ ■グルコース（Ｓ□）＋ＮＡＤ（Ｐ） （Ｅｌ） ノ グルコＮ−δ−ラクトン（Ｐｌ）十還元型ＮＡＤ■Ｌ−
マレ−）（Ｓよ）＋ＮＡＤ （Ｅｌ） マレートデヒドロゲナーゼ オギザロ酢酸（Ｐよ）十還元型ＮＡＤ ■Ｌ−グルタメイト（Ｓ□）＋Ｈ２０＋ＮＡＤ（Ｅｌ） ２−オギソグルタレイト（Ｐ□）十還元型ＮＡＤ■３−
α−ヒドロキシヌテロイ）’（Ｓｌ）＋ＮＡＤ（Ｅｌ） デヒドロゲナーゼ ３−ケトヌテロイド（Ｐｌ）十還元型Ｎ、、ＡＤこれら
の酸化還元反応に使用する酵素量は、酵素力価、基質の
種類および補酵素サイクリング率によって異なる。基質
量は、／サイクル毎に／モル比の基質を消費してなるも
ので、サイクリングする補酵素より比較にならない程は
るかに多いモル量が使用されるもので、通常単位時間当
りのザイク／Ｉ／数および反応時間に基いて決定すれば
よ（、またその酸化還元酵素の反応速度が最大を示すよ
うな濃度以上であればよい。通常０． ／ ｍ Ｍない
し１００ｍＭの濃度範囲で存在し得る。
還元型ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする反応系としては、少
なくとも還元型Ｎ’Ａ Ｄを消費してＮＡＤを生成する
作用物質（Ｅ２）およびその基ｆｆ（Ｓ２）の反応系が
挙げられ、その作用物ｒとその基質の反応系としては、
少な（とも還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成する酸
化還元酵素およびその基質の反応系や、電子伝達物質お
よびテトラゾリウム塩の反応系などが挙げられる。
なくとも還元型Ｎ’Ａ Ｄを消費してＮＡＤを生成する
作用物質（Ｅ２）およびその基ｆｆ（Ｓ２）の反応系が
挙げられ、その作用物ｒとその基質の反応系としては、
少な（とも還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成する酸
化還元酵素およびその基質の反応系や、電子伝達物質お
よびテトラゾリウム塩の反応系などが挙げられる。
還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成する酸化還元酵素
としては、少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素とし、過剰
量用いる特定の基質（Ｓ２） ｋこ作用してＮ、ＡＤお
よびＳ２の還元型生成物（Ｐ２）を生成するデヒドロゲ
ナーゼ、または少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素とし、
チトクローム、ジフルフィド化合物、キノンおよびその
類縁体等を受容体とする還元型ＮＡＤ（Ｐ）：受容体酸
化還元酵素であればそのいずれでも良く、その起源も限
定されることはない。これらの酵素およびその基質また
は受容体の例としては、「酵素ハンドブック」ｔこ記載
されているが、デヒドロゲナーゼおよびその基質の例と
しては、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／、／、
／、２７ ）およびピルビン酸、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣ，／、／、／。
としては、少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素とし、過剰
量用いる特定の基質（Ｓ２） ｋこ作用してＮ、ＡＤお
よびＳ２の還元型生成物（Ｐ２）を生成するデヒドロゲ
ナーゼ、または少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素とし、
チトクローム、ジフルフィド化合物、キノンおよびその
類縁体等を受容体とする還元型ＮＡＤ（Ｐ）：受容体酸
化還元酵素であればそのいずれでも良く、その起源も限
定されることはない。これらの酵素およびその基質また
は受容体の例としては、「酵素ハンドブック」ｔこ記載
されているが、デヒドロゲナーゼおよびその基質の例と
しては、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／、／、
／、２７ ）およびピルビン酸、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣ，／、／、／。
／）およびアセトアルテ゛ヒト、グリセロールデヒドロ
ゲナーゼ（ＥＣ，／、／、／、乙）およびジヒドロキシ
アセトン、グリセロール−３−ホヌフエートデヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣ，／、／、／、ｇ）およびジヒドロキシア
セトン°ホスフェート）、マレートデヒドロゲナーゼ（
ＥＣ，／、／、／。
ゲナーゼ（ＥＣ，／、／、／、乙）およびジヒドロキシ
アセトン、グリセロール−３−ホヌフエートデヒドロゲ
ナーゼ（ＥＣ，／、／、／、ｇ）およびジヒドロキシア
セトン°ホスフェート）、マレートデヒドロゲナーゼ（
ＥＣ，／、／、／。
３７）およびオギザロ耐酸、３−α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／、／、／、５０）およ
び３−ケトーヌテロイドなどの例が挙げられる。また還
元型ＮＡＤ（Ｐ）：受容体酸化還元酵素としては、チト
クロームｂ５レダククーゼ（ＥＣ，’／、乙、、２．．
２）、ジアホラーゼ（ＥＣ０／、乙、４．３）、ナイト
レートレダクターゼ（ＥＣ，／、乙、乙、／）、還元型
ＮＡＤＰデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／、 乙、７り、／
）、還元型Ｎ Ａ Ｄ、（Ｐ）デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
，／、 乙。
イドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／、／、／、５０）およ
び３−ケトーヌテロイドなどの例が挙げられる。また還
元型ＮＡＤ（Ｐ）：受容体酸化還元酵素としては、チト
クロームｂ５レダククーゼ（ＥＣ，’／、乙、、２．．
２）、ジアホラーゼ（ＥＣ０／、乙、４．３）、ナイト
レートレダクターゼ（ＥＣ，／、乙、乙、／）、還元型
ＮＡＤＰデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／、 乙、７り、／
）、還元型Ｎ Ａ Ｄ、（Ｐ）デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
，／、 乙。
タデ、２）、還元型ＮＡＤデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１／
、乙、ワタ、３）、還元型ＮＡＤデヒドロゲナーゼ（キ
ノン）（ＥＣ，／、乙、タデ、３−）などが挙げられる
。受容体としては、メチレン・ブル−、フラビン類、キ
ノン類、２．乙−シクロロフェノールインドフェノール 塩，テトラゾリウム塩，チトクローム、なとが用いられ
得るが、更に具体的には、フラビン類としてはりボフラ
ビン，フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ ）、フラビ
ンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、キノン類として
はナフトキノン類として、／，ｌｌ−ナフトキノン、２
−メチル−／，グーナフトキノン、ベンゾキノン類とし
ては！，３ −ジメトキシ−Ｓ−メチル−／．４−ベン
ゾキノン、テｌ゛ラメチルー戸ーペンゾキノン，戸−ペ
ンゾギ／ン，ユビキノン、テトラゾリウム塩としては３
、 ３’−（ ３． ３’−ジメトキシーグ＋ ＜ｚ’
−ジフェニレン）ビ；ｘＣ２−（Ｐ−二トロフエニル）
−５−７−フエニルーチトラゾリウムクロライド〕にト
ロテトラゾリウムブルー （ｆ−二トロフェニル）−３７（ｆ’−ヨードフエニ／
Ｌ／ ） − ３−フエ二〜テトラゾリウムクロライド
（ ＩＮＴ ）ｌ’ ２−（ｊ′，Ｓ′−ジメチル−２
′−チアゾリル）−３．３−ジフェニルテトラゾリウム
ブロマイド（ ＋，）−ＭＴＴ ）、チトクロームとし
てはフェリチトクロームｂ５， チトクロームＣなど
が挙げられる。
、乙、ワタ、３）、還元型ＮＡＤデヒドロゲナーゼ（キ
ノン）（ＥＣ，／、乙、タデ、３−）などが挙げられる
。受容体としては、メチレン・ブル−、フラビン類、キ
ノン類、２．乙−シクロロフェノールインドフェノール 塩，テトラゾリウム塩，チトクローム、なとが用いられ
得るが、更に具体的には、フラビン類としてはりボフラ
ビン，フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ ）、フラビ
ンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、キノン類として
はナフトキノン類として、／，ｌｌ−ナフトキノン、２
−メチル−／，グーナフトキノン、ベンゾキノン類とし
ては！，３ −ジメトキシ−Ｓ−メチル−／．４−ベン
ゾキノン、テｌ゛ラメチルー戸ーペンゾキノン，戸−ペ
ンゾギ／ン，ユビキノン、テトラゾリウム塩としては３
、 ３’−（ ３． ３’−ジメトキシーグ＋ ＜ｚ’
−ジフェニレン）ビ；ｘＣ２−（Ｐ−二トロフエニル）
−５−７−フエニルーチトラゾリウムクロライド〕にト
ロテトラゾリウムブルー （ｆ−二トロフェニル）−３７（ｆ’−ヨードフエニ／
Ｌ／ ） − ３−フエ二〜テトラゾリウムクロライド
（ ＩＮＴ ）ｌ’ ２−（ｊ′，Ｓ′−ジメチル−２
′−チアゾリル）−３．３−ジフェニルテトラゾリウム
ブロマイド（ ＋，）−ＭＴＴ ）、チトクロームとし
てはフェリチトクロームｂ５， チトクロームＣなど
が挙げられる。
還元型ＮＡＤ（Ｐ）：受容体酸化還元酵素および受容体
の組合せは少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素としてなる
酵素および電子受容体となり得るものであれば特（・こ
制限されないが好ましい組み合せとしては、ジアホラー
ゼ（ＥＣ，／、乙、１１．３）およびテトラゾリウム塩
、還元５ＮＡＤＰデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／、 乙、
り７．／）およびメチレン・ブルー、還元型Ｎ、ＩＭＤ
デヒドロゲナーゼ（’ＥＣ，／、乙。９９．３）および
チトクロームＣなどが挙げられる。還元型ＮＡＤ（Ｐ）
：受容体酸化酵素は還元型ＮＡＤ？こ特異性の高いもの
か好ましく、使用濃度は通常０．０３〜／ ００ Ｕ
／ ｍｌの範囲で存在し得る。テトラゾリウム塩の使用
濃度は、テトラゾリウム塩および究極的ｔこ形成される
ホルマザンの双方の水溶性がむしろ限定されるが、通常
は試薬／ ｍｌ当り／μグから１００μグの濃度範囲で
存在し得る。
の組合せは少なくとも還元型ＮＡＤを補酵素としてなる
酵素および電子受容体となり得るものであれば特（・こ
制限されないが好ましい組み合せとしては、ジアホラー
ゼ（ＥＣ，／、乙、１１．３）およびテトラゾリウム塩
、還元５ＮＡＤＰデヒドロゲナーゼ（ＥＣ，／、 乙、
り７．／）およびメチレン・ブルー、還元型Ｎ、ＩＭＤ
デヒドロゲナーゼ（’ＥＣ，／、乙。９９．３）および
チトクロームＣなどが挙げられる。還元型ＮＡＤ（Ｐ）
：受容体酸化酵素は還元型ＮＡＤ？こ特異性の高いもの
か好ましく、使用濃度は通常０．０３〜／ ００ Ｕ
／ ｍｌの範囲で存在し得る。テトラゾリウム塩の使用
濃度は、テトラゾリウム塩および究極的ｔこ形成される
ホルマザンの双方の水溶性がむしろ限定されるが、通常
は試薬／ ｍｌ当り／μグから１００μグの濃度範囲で
存在し得る。
電子伝達物質としては、還元型ＮＡＤをＮＡＤに酸化す
る能力を有し、しかも補酵素サイクリング反応に悪影警
を及ぼさないような物質であり、例えばフェナジンメタ
ルザルフェート、メルドーラ・ブルー、ピロシアニンな
どが挙げられる。使用濃度は、サイクリング率に応じて
設定すればよいが、通常反応液／ｍｌ当り、！；ｐｆ〜
０．３ ｍＶの濃度範囲で存在し得る。
る能力を有し、しかも補酵素サイクリング反応に悪影警
を及ぼさないような物質であり、例えばフェナジンメタ
ルザルフェート、メルドーラ・ブルー、ピロシアニンな
どが挙げられる。使用濃度は、サイクリング率に応じて
設定すればよいが、通常反応液／ｍｌ当り、！；ｐｆ〜
０．３ ｍＶの濃度範囲で存在し得る。
上記のサイクリング反応は、通常室温ないし３７℃付近
の温度、好ましくは３０〜３７℃の温度で行われる。反
応時間は、特に限定されるものでなく、通常７分以上、
好ましくはＳ分以上行なえばよい。予定された時間の終
りで反応を迅速ｅこ停止するには、酸、例えば塩酸、リ
ン酸などを添加すること（こより行なわれる。
の温度、好ましくは３０〜３７℃の温度で行われる。反
応時間は、特に限定されるものでなく、通常７分以上、
好ましくはＳ分以上行なえばよい。予定された時間の終
りで反応を迅速ｅこ停止するには、酸、例えば塩酸、リ
ン酸などを添加すること（こより行なわれる。
このようにしてサイクリング反応を行なった後、このサ
イクリング反応ｔこおいて生成または消費される部分を
定量するのであるが、生成する成分としてはＥユの基質
（Ｓ□）の酸化生成物（Ｐｌ）またはＥ２の基質（Ｓ２
）の還元生成物（Ｐ２）を対象とすればよく、消費され
る成分としてはＥ□の基質（Ｓｌ）またはＥ２の基質（
Ｓ２）を対象とすればよく、これらのＰｌ、’Ｐ２．Ｓ
１．Ｓ２のいずれか一成分の量を定量すればよい。簡便
には、基質の状態では無色であり、生成物の状態にて呈
色または螢光を呈する吸光波長を変化する場合の生成物
の定量手段を用いることである。例えばテトラゾリウム
塩を基質（Ｓ２）として、生成するホルマザンを還元生
成物（Ｐ２）とせしめて、このホルマザンを比色定量し
てなるものである。さら？こフラビン類やキノン類を基
質（Ｓ２）として、用いた場合には、それらの基質（Ｓ
）の消費量をその特有の吸光波長に基いて吸光度測定し
て定量すればよい。
イクリング反応ｔこおいて生成または消費される部分を
定量するのであるが、生成する成分としてはＥユの基質
（Ｓ□）の酸化生成物（Ｐｌ）またはＥ２の基質（Ｓ２
）の還元生成物（Ｐ２）を対象とすればよく、消費され
る成分としてはＥ□の基質（Ｓｌ）またはＥ２の基質（
Ｓ２）を対象とすればよく、これらのＰｌ、’Ｐ２．Ｓ
１．Ｓ２のいずれか一成分の量を定量すればよい。簡便
には、基質の状態では無色であり、生成物の状態にて呈
色または螢光を呈する吸光波長を変化する場合の生成物
の定量手段を用いることである。例えばテトラゾリウム
塩を基質（Ｓ２）として、生成するホルマザンを還元生
成物（Ｐ２）とせしめて、このホルマザンを比色定量し
てなるものである。さら？こフラビン類やキノン類を基
質（Ｓ２）として、用いた場合には、それらの基質（Ｓ
）の消費量をその特有の吸光波長に基いて吸光度測定し
て定量すればよい。
さらに上記反応（こおいて、テトラゾリウム塩から形成
されるホルマザンの沈澱の防止をたすけるために界面活
性剤を添加することが好ましい。界面活性剤としてはト
ライトンＸ−１００，アデカト一ルＳＯ−／ｌｌ−３な
どの非イオン界面活性剤が挙げられる。使用濃度は試薬
ｔこ対し、００／〜３％の濃度範囲で存在し得る。この
界面活性剤の添加Ｑこより、測定値の感度の上昇とホル
マザン色素の安定化を計ることができる。
されるホルマザンの沈澱の防止をたすけるために界面活
性剤を添加することが好ましい。界面活性剤としてはト
ライトンＸ−１００，アデカト一ルＳＯ−／ｌｌ−３な
どの非イオン界面活性剤が挙げられる。使用濃度は試薬
ｔこ対し、００／〜３％の濃度範囲で存在し得る。この
界面活性剤の添加Ｑこより、測定値の感度の上昇とホル
マザン色素の安定化を計ることができる。
生じたホルマザン色素の比色定量はホルマザンの特異的
吸光波長にて吸光度（ＯＤ）を測定すればよく、例えば
、３００”３３０ｎｍの波長により吸光度を測定して、
被測定物質の定量を行うことができる。
吸光波長にて吸光度（ＯＤ）を測定すればよく、例えば
、３００”３３０ｎｍの波長により吸光度を測定して、
被測定物質の定量を行うことができる。
本発明ｔこよれば、エンド・ポイント法だけでなく、レ
イト法、ドライケミカル法（フィルム法、固定化力も可
能である。
イト法、ドライケミカル法（フィルム法、固定化力も可
能である。
本発明はＡＴＰの高感度測定法として有用であり、試料
中ｔこ遊離しているＡＴＰの定量や、キナーゼ、ＡＤＰ
およびキナーゼ基質用リン化合物による酵素反応シこて
ＡＤＰがリン酸化されて生成、Ｍ離されるＡＴＰの定量
、ＮＭＮの定量、ＮＭＮピロホスホリラーゼ、ニコチン
アミドおよびｓ−ホヌホーα−１） −＋）ボシルピロ
ホヌフエートによる酵素反応にて生成、遊離されるＮＭ
Ｎの定量に有用である。さらｔこ酵素反応系におけるキ
ナーゼ活性測定、ＡＤＰ、キナーゼ基質用リン化合物、
ニコチンアミド、５−ホスホ−α−？−Ｄ−リボシルピ
ロホヌフエートのいずれか一成分の定量に利用すること
も可能である。
中ｔこ遊離しているＡＴＰの定量や、キナーゼ、ＡＤＰ
およびキナーゼ基質用リン化合物による酵素反応シこて
ＡＤＰがリン酸化されて生成、Ｍ離されるＡＴＰの定量
、ＮＭＮの定量、ＮＭＮピロホスホリラーゼ、ニコチン
アミドおよびｓ−ホヌホーα−１） −＋）ボシルピロ
ホヌフエートによる酵素反応にて生成、遊離されるＮＭ
Ｎの定量に有用である。さらｔこ酵素反応系におけるキ
ナーゼ活性測定、ＡＤＰ、キナーゼ基質用リン化合物、
ニコチンアミド、５−ホスホ−α−？−Ｄ−リボシルピ
ロホヌフエートのいずれか一成分の定量に利用すること
も可能である。
これらの定量において、ＡＴＰまたはＮＭＮの１モル比
に対して極めて高モル比の生成物質を形成せしめるため
、ＡＴＰまたはＮＭＮの高感度測定法として有用である
。
に対して極めて高モル比の生成物質を形成せしめるため
、ＡＴＰまたはＮＭＮの高感度測定法として有用である
。
次ｔこ実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、こ
れにより本発明を限定するものではない。
れにより本発明を限定するものではない。
実施例／
（試薬）
１ （１） ３０ ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
緩衝液ｐＨ７，ｆｆ（２１３ｍＭ ＭｇＣ１２ （３＋ ／ ｍＭ ＮＭＮ （４） ＮＭＮアデニリルトランスフェラーセ（イ
ースト由来： ／ ｇ Ｕ／ｍｌ！ ）１１（１）
１００ ｍＭ リン酸Ｍ衝液ＰＨｊｉｆ、Ｑ（２＋
アルコールデヒドロゲナーゼ（イースト由来＝−
グＯＵ ／ ｍｌ ）（３） ０．０ ／ ％
ＮＴ’Ｂ（４） ジアホラーゼ （バチルスメガテリウム由来： ２グＯＵ／ｍ１） （５） ｏ、ｇ Ｍ エタノール（６）
０４ ％ ト リ ト ンＸ−１０
０（操作） 試薬Ｉ Ｏ，／ ｍｌｔコＯ，−３〜’、２夕ｐ Ｍノ
ＡＴＰ ／ ＯｐＬを添加し、３７℃で７３分間反応を
行ない、反応後３７℃に予１絹加温した後、試薬■を。
緩衝液ｐＨ７，ｆｆ（２１３ｍＭ ＭｇＣ１２ （３＋ ／ ｍＭ ＮＭＮ （４） ＮＭＮアデニリルトランスフェラーセ（イ
ースト由来： ／ ｇ Ｕ／ｍｌ！ ）１１（１）
１００ ｍＭ リン酸Ｍ衝液ＰＨｊｉｆ、Ｑ（２＋
アルコールデヒドロゲナーゼ（イースト由来＝−
グＯＵ ／ ｍｌ ）（３） ０．０ ／ ％
ＮＴ’Ｂ（４） ジアホラーゼ （バチルスメガテリウム由来： ２グＯＵ／ｍ１） （５） ｏ、ｇ Ｍ エタノール（６）
０４ ％ ト リ ト ンＸ−１０
０（操作） 試薬Ｉ Ｏ，／ ｍｌｔコＯ，−３〜’、２夕ｐ Ｍノ
ＡＴＰ ／ ＯｐＬを添加し、３７℃で７３分間反応を
行ない、反応後３７℃に予１絹加温した後、試薬■を。
／ ｍｌ添加における吸光度の間にきわめて良好な直線
的関係が得られた。
的関係が得られた。
実施例２
実施例／て用いた試薬のうち、アルコールデヒドロゲナ
ーゼおよび０． ｇ Ｍエタノールの代わり。こ、グリ
セロール−３−ホヌフェートデヒドロゲナーゼ（ウサギ
筋肉由来、ＥＣ，／、／、／、ｇ）３００Ｕ７ｍｌおよ
び１０ｍＭグリセａ −１ｖ −３’−ホヌフエートを
用いて、以下実施例／と同様の反応を行なった。結果は
第２図の通りてあって、実施例／と同様に、ＡＴＰと３
夕Ｏｎ ｍ ｆこおける吸光度の間にきわめて良好な
直線関係が得られた。
ーゼおよび０． ｇ Ｍエタノールの代わり。こ、グリ
セロール−３−ホヌフェートデヒドロゲナーゼ（ウサギ
筋肉由来、ＥＣ，／、／、／、ｇ）３００Ｕ７ｍｌおよ
び１０ｍＭグリセａ −１ｖ −３’−ホヌフエートを
用いて、以下実施例／と同様の反応を行なった。結果は
第２図の通りてあって、実施例／と同様に、ＡＴＰと３
夕Ｏｎ ｍ ｆこおける吸光度の間にきわめて良好な
直線関係が得られた。
実施例３
実施例／ｐこおける試薬■のうち、アルコールデヒドロ
ゲナーゼおよび０． ｇ Ｍエフノールをグリセロール
デヒドロゲナーゼ（バチルス・メガテリウム由来、ＥＣ
，／、／、／、、４ ）、２乙ＯＵ ／ ｍｌおよび／
Ｍクリセロールを用いて、以下実施例／と同様の反応を
行なった。結果は第３図に示される通りである。
ゲナーゼおよび０． ｇ Ｍエフノールをグリセロール
デヒドロゲナーゼ（バチルス・メガテリウム由来、ＥＣ
，／、／、／、、４ ）、２乙ＯＵ ／ ｍｌおよび／
Ｍクリセロールを用いて、以下実施例／と同様の反応を
行なった。結果は第３図に示される通りである。
実施例グ
（試薬）
１ （１） ５０ ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ］
緩衝液ｐＨ７，３（２） ３ ｍＭ Ｍ
ｇＣ１２（３） ３ ｒｎＭ ＡＴＰ（４）
ＮＭＮアデニリルトランスフエラーゼ（イースト
由来： ／ ｇ Ｕ ／ ｍｌ ）１１（１）
１００ ｍＭ リ ン５．”ｆｉｊｊ’＄
７’ｅ ｐＨｇ、０（２） アルコールデヒ
ドロゲナーゼ（イースト由来：２グＯＵ／ｍ１） （３） ０．０ ／ ％ ＮＴＢ（４） ジア
ホラーゼ （バチルスメガテリウム由来： ２グＯＵ ／ ｍｌ、 ） （５） Ｏｇ Ｍ エ タ
ノ −ル（６） ０．７ ％
ト リ ト ンｘ−−／ ｏ。
緩衝液ｐＨ７，３（２） ３ ｍＭ Ｍ
ｇＣ１２（３） ３ ｒｎＭ ＡＴＰ（４）
ＮＭＮアデニリルトランスフエラーゼ（イースト
由来： ／ ｇ Ｕ ／ ｍｌ ）１１（１）
１００ ｍＭ リ ン５．”ｆｉｊｊ’＄
７’ｅ ｐＨｇ、０（２） アルコールデヒ
ドロゲナーゼ（イースト由来：２グＯＵ／ｍ１） （３） ０．０ ／ ％ ＮＴＢ（４） ジア
ホラーゼ （バチルスメガテリウム由来： ２グＯＵ ／ ｍｌ、 ） （５） Ｏｇ Ｍ エ タ
ノ −ル（６） ０．７ ％
ト リ ト ンｘ−−／ ｏ。
（操作）
試薬１０． ／ ｍｌ Ｅ Ｏ０３〜、２：３ｐＭ（ｆ
）ＮＭＮ ／。
）ＮＭＮ ／。
μｔを添加し、３７℃で７５分間反応を行ない、反応後
３７℃に予備加温した後、試薬■をＱ、 ／ ｍｌ添加
し、正確ｔこ１０分間反応を行ない１．：ｌ、 ｇ ｍ
ｅの０、／ＮＨＣｌを添加し、反応を停止したのち、３
３０１１Ｉｎにて比色定量した。
３７℃に予備加温した後、試薬■をＱ、 ／ ｍｌ添加
し、正確ｔこ１０分間反応を行ない１．：ｌ、 ｇ ｍ
ｅの０、／ＮＨＣｌを添加し、反応を停止したのち、３
３０１１Ｉｎにて比色定量した。
（結果）
第７図に示される通りで、ＮＭＮの濃度と３３０ｎｍに
おける吸光度の間（こきわめて良好な直線的関係が得ら
れた。
おける吸光度の間（こきわめて良好な直線的関係が得ら
れた。
実施例ｊ
（反応液Ｉ）
（１） ３０ ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ］緩衝液
ｐＨ７Ｊ（２） ２０ ｍＭ ＭｇＣ１２（３）
アセテートキナーゼ （大腸菌由来、ｇＵ／ｍ１） （４） １０ ｍＭ ＭｇＣ１２（５） ／
ｍＭ ＮＭＮ （６） ＮＭＮアデニルドラススフェラーゼ（／ｇＵ
／ｍ１） （操作） 反応液ＩＯ，２ｍｌを小試験管（・ことり、各０度のア
セチルホヌフエート溶Ｗ１０μＬ ヲ’ｌ？Ａ加Ｌ、３
７℃で２０分反反応行なったのち、実施例／シこ示した
試薬■をＱ、 、；ｌ ｍｌ加え、１０分間反応したの
ち、／、 ｇ ｍｌの０． ／ Ｎ ＨＣｌ溶液を加え
て反応を停止したのち！；３０ｎｍで比色定量した結果
、第Ｓ図に示す如く良好な直線が得られた。
ｐＨ７Ｊ（２） ２０ ｍＭ ＭｇＣ１２（３）
アセテートキナーゼ （大腸菌由来、ｇＵ／ｍ１） （４） １０ ｍＭ ＭｇＣ１２（５） ／
ｍＭ ＮＭＮ （６） ＮＭＮアデニルドラススフェラーゼ（／ｇＵ
／ｍ１） （操作） 反応液ＩＯ，２ｍｌを小試験管（・ことり、各０度のア
セチルホヌフエート溶Ｗ１０μＬ ヲ’ｌ？Ａ加Ｌ、３
７℃で２０分反反応行なったのち、実施例／シこ示した
試薬■をＱ、 、；ｌ ｍｌ加え、１０分間反応したの
ち、／、 ｇ ｍｌの０． ／ Ｎ ＨＣｌ溶液を加え
て反応を停止したのち！；３０ｎｍで比色定量した結果
、第Ｓ図に示す如く良好な直線が得られた。
第１図は指示反応系ｅこアルコールデヒドロゲナーゼ、
エタノール、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩を用いて
なるＡＴＰの検量曲線を示し、第２図は指示反応シこグ
リセロ−／ｌ／ −’３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、グリセロ−１ｖ−３’−ホヌフエート、ジアホラー
ゼ、テトラゾリウム塩を用いてなるＡＴＰの検量曲線を
示し、第３図は指示反応系にグリセロールデヒドロゲナ
ーゼ、グリセロール、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩
を用いてなるＡＴＰの検量曲線を示し、第１図は指示反
応系にアルコールデヒドロゲナーゼ、エタノール、ジア
ホラーゼ、テトラゾリウム塩を用いてなるＮＭＮの検量
曲線を示し、第５図は本発明にょるアセチルホヌフエー
トの検量曲線を示す。 特許出願人 東洋而造株式会社 代表者 伊東富士馬 第 ｌ 図 、イ自ミ５４！中の７１１ＴＰ＾Ａ１番（、ｉＨン第２
図 ｏｏツ１．Ｑ １．シ２０２り 功軒へＡＴＰ＾紡（Ｑ） 第３図 ０ ２ ４ ６ ＆ ＩＱ□ＡＴＰ＾１
（ＰＭ、１ 第９図 ｏ ｏ、５ １．０ １．５ ２．ｏ ２５ホ付
い間口へ尉（かり 第５ ０ ０Ｓ１．０ ＋、５ ２．０ 矛デ２Ｐセ＾７℃ナレソン６５へ端隈 ５ 塗ｈ）
エタノール、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩を用いて
なるＡＴＰの検量曲線を示し、第２図は指示反応シこグ
リセロ−／ｌ／ −’３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、グリセロ−１ｖ−３’−ホヌフエート、ジアホラー
ゼ、テトラゾリウム塩を用いてなるＡＴＰの検量曲線を
示し、第３図は指示反応系にグリセロールデヒドロゲナ
ーゼ、グリセロール、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩
を用いてなるＡＴＰの検量曲線を示し、第１図は指示反
応系にアルコールデヒドロゲナーゼ、エタノール、ジア
ホラーゼ、テトラゾリウム塩を用いてなるＮＭＮの検量
曲線を示し、第５図は本発明にょるアセチルホヌフエー
トの検量曲線を示す。 特許出願人 東洋而造株式会社 代表者 伊東富士馬 第 ｌ 図 、イ自ミ５４！中の７１１ＴＰ＾Ａ１番（、ｉＨン第２
図 ｏｏツ１．Ｑ １．シ２０２り 功軒へＡＴＰ＾紡（Ｑ） 第３図 ０ ２ ４ ６ ＆ ＩＱ□ＡＴＰ＾１
（ＰＭ、１ 第９図 ｏ ｏ、５ １．０ １．５ ２．ｏ ２５ホ付
い間口へ尉（かり 第５ ０ ０Ｓ１．０ ＋、５ ２．０ 矛デ２Ｐセ＾７℃ナレソン６５へ端隈 ５ 塗ｈ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）ＡＴＰ（アデノシントリホヌフエート）およびＮ
ＭＮにコチン酸アミドモノヌクレオチド）のいずれか−
成分を含有する被検液に、主反応系ｅこおいてＮＭＮま
たはＡＴＰ、マグネシウムイオンの存在下ｔこＮ Ｍ
Ｎアデニリルトランスフエラーゼを作用させてＮＡＤと
ピロリン酸に変換させ、主反応の後、生したＮＡＤを、
Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系と、
還元型Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ）を補酵素とする反応系との組
合せ（こよる補酵素サイクリング反応をおこない、次い
てこのザイクリンク反応において生成または消費される
成分を定量することを特徴とするＡＴＰおよびＮＭＮの
いずれか一成分を含有する被検液中の成分の高感度測定
法（２） Ａ Ｔ Ｐか、キナーゼ、ＡＤＰ（アデノシ
ンジヌクレオチド）およびキナーゼ基質用リン化合物の
反応系によって生成されるＡＴＰである特許請求の範囲
第１項記載の高感度測定法。 （３）キナーゼ、ＡＤＰおよびキナーゼ基質用リン化合
物の反応系が、クレアチンキナーゼ、ＡＤＰおよびクレ
アチン繍スフエートの反応系、ピルベートキナーゼ、Ａ
ＤＰおよびホヌホエノールピルビン酸の反応系、アセテ
ートキナーゼ、ＡＤＰ。 アセチルホヌフエートの反応系、カルバメートキナーゼ の反応系，アメパルティトキナーゼ、ＡＤＰ，Ｚ−ホス
ホ−Ｌ−アメパルティトの反応系，ホスホクリセレイト
キナーゼ，ＡＤＰ，／．３−ジホスホーＤークリセレイ
トの友応系，アルギニンモナーセ，ＡＤＰ，アルギニン
ホヌフエートの反応系。 ミオキナーゼ、ＡＤＰ，ＡＤＰの反応系，またはヌクレ
オザイドモノホヌフエートキナーセ， ＡＤＰ，ヌクレ
オサイドジホヌフエ−１・の反応系である特許請求の範
囲第２項記載の高感度測定法。 （４ｉ Ｎ Ｍ Ｎが下記ｔこ示される酵素反応によっ
て生成されるＮＭＮである特許請求の範囲第１項記載の
高感度測定法。 ルピロホヌフエート ＮＭＮ＋ピロリン酸 （５）Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応
系が、少なくともＮＡＤを消費して還元型ＮＡＤを生成
する反応を形成するデヒドロゲナーゼおよびその基質ｔ
こよる反応系である特許請求の範囲第１項記載の高感度
測定法。 （６）デヒドロゲナーゼおよびその基質が、ラクテート
デヒドロゲナーゼおよびＬ−ラフチー１−．アルコール
デヒドロゲナーゼおよびエタノール、クリセロールデヒ
Ｆロゲナーゼおよびグリセロール、グリ、セロ−ルー３
−ホヌフェートデヒドロゲナーゼおよびグリセロール−
３１ホスフェ−１−、グルコーヌデヒドロゲナーゼおよ
びグルコース、マレートデヒドロゲナーゼおよびＬ−マ
レート、グルタメイトデヒドロゲナーゼおよびＬ−グル
クメナーゼおよび３−α−ヒドロキシヌテロイドのいず
れかの反応系である特許請求の範囲第Ｓ項記載の高Ｉざ
度測定法。 （７）還元型Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ）を補酵素とする反応系
が、少なくとも還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成す
る反応を形成する酸化還元酵素およびその基質よりなる
反応系である特許請求の範囲第１項記載の高感度測定法
。 （８）少なくとも還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成
する酸化還元酵素およびその基質が、ラクテートデヒド
ロゲナーゼおよびピルビン酸、アルコールデヒドロゲナ
ーゼおよびアセトアルデヒド。 クリセロールデヒドロゲナーゼおよびジヒドロキシアセ
トン、グリセロール−３−ホスフェ−１−デヒドロゲナ
ーゼおよびシヒドロキシアセトンポヌフエート、マレー
トデヒドロゲナーゼおよびオギザロ酢酸、３−α−ヒド
ロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび３−ケトヌテ
ロイドのいずれかの反応系である特許請求の範囲第７項
記載の高感度測定法。 （９）少なくとも還元型ＮＡＤを消費してＮＡＤを生成
する反応を形成する酸化還元酵素およびその基質が、還
元型Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ） ：受容体酸化還元酵素および
その受容体である特許請求の範囲第７項記載の高感度測
定法。 αＯ）還元型Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ） ：受容体酸化還元酵
素およびその受容体が、還元５ Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ）デ
ヒドロゲナーゼおよびフラビン類、キノン類９．２．乙
−ジクロロフェノールインドフェノール、フェリシアン
化塩。 テトラゾリウム塩、チトクロームＣまたは酸素である特
許請求の範囲第７項記載の高感度測定法。 （ｎ）還元型ＮＡＤ（Ｐ）：受容体酸化還元型酵素およ
びその基質が、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩で
ある特許請求の範囲第７項記載の高感度測定法。 （１２）還元型Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ）を補酵素とする反応
系が、電子伝達物質およびテトラゾリウム塩である特許
請求の範囲第１項記載の高感度測定法。 （１３） ％１ 子伝ａ 物５１が、フエナシンーメク
サルフエ一ト、メルドーラ・ブル−またはピロシアニン
である特許請求の範囲第７．２項記載の高感度測定法（
１４）サイクリング反応において、界面活性剤を添加す
ることからなる特許請求の範囲第１項記載の高感度測定
法。 （］５）界面活性剤が非イオン系界面活性剤である特許
請求の範囲第１４’項記載の高感度測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4120283A JPS59166099A (ja) | 1983-03-11 | 1983-03-11 | Ａｔｐまたはｎｍｎの高感度測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4120283A JPS59166099A (ja) | 1983-03-11 | 1983-03-11 | Ａｔｐまたはｎｍｎの高感度測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59166099A true JPS59166099A (ja) | 1984-09-19 |
| JPH047200B2 JPH047200B2 (ja) | 1992-02-10 |
Family
ID=12601828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4120283A Granted JPS59166099A (ja) | 1983-03-11 | 1983-03-11 | Ａｔｐまたはｎｍｎの高感度測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59166099A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7122333B2 (en) | 2001-11-21 | 2006-10-17 | Unitika Ltd. | Method and reagent for visually measuring ATP |
| JP2009225784A (ja) * | 2008-02-28 | 2009-10-08 | Asahi Kasei Pharma Kk | ピロリン酸の測定方法 |
| JP2019024468A (ja) * | 2017-08-03 | 2019-02-21 | 旭化成ファーマ株式会社 | タンパク質およびその製造方法、タンパク質組成物ならびにそれを用いたｎｍｎの測定方法および測定組成物 |
| WO2021241446A1 (ja) | 2020-05-25 | 2021-12-02 | 横河電機株式会社 | 検体中の標的分子の検出方法、及び標的分子検出キット |
-
1983
- 1983-03-11 JP JP4120283A patent/JPS59166099A/ja active Granted
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7122333B2 (en) | 2001-11-21 | 2006-10-17 | Unitika Ltd. | Method and reagent for visually measuring ATP |
| JP2009225784A (ja) * | 2008-02-28 | 2009-10-08 | Asahi Kasei Pharma Kk | ピロリン酸の測定方法 |
| US8105766B2 (en) | 2008-02-28 | 2012-01-31 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method of measuring pyrophosphate |
| JP2019024468A (ja) * | 2017-08-03 | 2019-02-21 | 旭化成ファーマ株式会社 | タンパク質およびその製造方法、タンパク質組成物ならびにそれを用いたｎｍｎの測定方法および測定組成物 |
| WO2021241446A1 (ja) | 2020-05-25 | 2021-12-02 | 横河電機株式会社 | 検体中の標的分子の検出方法、及び標的分子検出キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH047200B2 (ja) | 1992-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1051326A (en) | Method and reagent for reducing errors in enzymatic assays | |
| GB2055200A (en) | Enhancement of the sensitivity of bioluminescent and chemiluminescent assays with enzymatic cycling | |
| Kirstein et al. | Highly sensitive enzyme thermistor determination of ADP and ATP by multiple recycling enzyme systems | |
| JPS59166099A (ja) | Ａｔｐまたはｎｍｎの高感度測定法 | |
| JP4660750B2 (ja) | Ａｔｐ増幅−サイクリング法による微量ａｔｐの定量方法およびキット | |
| WO1995004831A1 (fr) | Procede de determination des ions chlorure | |
| US7122333B2 (en) | Method and reagent for visually measuring ATP | |
| EP2460888B1 (en) | Method and kit for measurement of dehydrogenase or substrate for the dehydrogenase | |
| JPH0220239B2 (ja) | ||
| CN107974485A (zh) | 氨定量方法、定量试剂盒、测试片和氨定量装置 | |
| WO2012050536A1 (en) | Method of the adenosine diphosphate quantitative determination | |
| JP2818696B2 (ja) | Ｎａｄｈキナーゼを用いる高感度定量法 | |
| JP5843072B2 (ja) | 特定物質の測定方法および特定物質測定用キット | |
| US3838010A (en) | Photometric method for determining lactic acid dehydrogenase or glucose-6-phosphate dehydrogenase | |
| JPH0675515B2 (ja) | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 | |
| JP5633669B2 (ja) | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット | |
| JP3470099B2 (ja) | デヒドロゲナーゼまたはその基質を測定するための安定化補酵素溶液およびその使用 | |
| JPH0412120B2 (ja) | ||
| JP3566976B2 (ja) | 生体成分中の測定対象の測定方法 | |
| JPS62151200A (ja) | マグネシウムイオン定量用試薬 | |
| JP3586737B2 (ja) | 生体物質の測定方法 | |
| JPH07108239B2 (ja) | ピルビン酸の定量方法及び該方法を利用する生体成分の定量方法 | |
| CN115992199A (zh) | 一种增强己糖激酶酶活性的方法 | |
| JPS63500631A (ja) | 酵素、基質または酵素阻害剤の生物発光投与方法、その投与に使用する支持体、その投与の利用およびその支持体の利用 | |
| JPH0316119B2 (ja) |