JPH0316119B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は内因性あるいは外因性干渉物質の影響
を受けることなく生体液中の成分を容易かつ正確
に測定する方法に関する。さらに詳しくは、生体
液中の成分を測定する反応過程に脱水素酵素によ
るレドツクス反応を適用し、生成する還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（いずれか一方を意味するときNAD（Ｐ）Ｈとい
う）を最終的に電子伝達体であるジアホラーゼと
発色性電子受容体であるテトラゾリウム化合物と
の反応に導き、ホルマザンの発色を比色定量し、
その結果から成分の量を測定する方法において、
検体中に当該反応の発色に関与する干渉物質があ
る場合は、予めこれを後述の方法で除去した後生
体液中の成分の測定を行なう方法に関する。 血清あるいは血漿中の成分の測定に上述のよう
なホルマザンの発色を比色定量する方法は従来か
ら数多く診断試薬に応用されている。例えば次の
反応式で示す方法は、その１例で各反応が定量的
に進行するので、最終のホルマザンの発色を比色
定量すれば成分の測定ができる。 (1) 測定すべき成分→誘導物質 (2) 誘導物質＋NAD（Ｐ）⁺脱水素酵素 ――――――→ 酸化型誘導物質＋NAD（Ｐ）Ｈ＋H⁺ (3) NAD（Ｐ）Ｈ＋H⁺＋NTBジアホラーゼ ―――――――→ NAD（Ｐ）⁺＋ホルマザン（発色） ただし、NTB：テトラゾリウム化合物の一つ、
ニトロテトラゾリウムブルーを表わす。 しかしこの反応系は検体中に存在する干渉物質
の影響を受け易く予めこれを除かないと正確な測
定ができない。もし上記反応(1)の誘導物質と同じ
ものが検体中に干渉物質として存在するときは、
測定すべき成分からの誘導物質と共に反応(2)以下
が進行し、反応(3)のホルマザンの比色定量に正の
誤差を与える。このような干渉物質には、α−ア
ミラーゼ測定における内因性のグルコース、外因
性のマルトース、GOT、GPT測定におけるＬ−
グルタメート、トリグリセライド測定におけるグ
リセリン等がある。 従来は、このような場合測定すべき成分と干渉
物質を一緒に測定した吸光度から干渉物質のみを
測定した吸光度を差し引くことにより誤差を修正
した。しかしこの方法は操作を二度繰り返さなけ
ればならず煩雑でありしかも試薬の無駄も大き
い。 本発明者等はNAD（Ｐ）Ｈの酸化反応における
ジアホラーゼ活性に関し、鋭意研究した結果、内
因性および外因性干渉物質の影響を全く受けな
い、しかも操作が簡単な生体液中の成分の測定方
法を開発し、本発明を完成した。 本発明の方法は測定反応の過程で干渉作用を示
す内因性、外因性物質あるいはその誘導物質を脱
水素酵素の存在下に酸化してその干渉能力を失わ
せる。この時生成するNAD（Ｐ）Ｈはジアホラー
ゼの存在下に、反応液中に溶存酸素により直ちに
酸化される結果、NAD（Ｐ）⁺に戻ると同時に過酸
化水素を生成するが、この過酸化水素はカタラー
ゼの存在下の場合は分解されて消失し、またはペ
ルオキシダーゼ（POD）の存在下の場合は溶存
酸素により酸化されNAD（Ｐ）ＨがNAD（Ｐ）⁺に
戻ると同時に水を生成する（以下これらの工程を
前処理ともいう）。 このようにして検体中の干渉物質を後に影響を
残すことなく消去した後前述の通り成分の測定を
行なうので、最終段階のホルマザン発色は成分の
量に比例するものとなり正確な引色定量ができ
る。なおこの場合には発色性電子受容体であるテ
トラゾリウム化合物が存在するのでジアホラーゼ
は溶存酸素との反応に優先して定量的にホルマザ
ンの発色を発現させる。 本発明の方法は上述のように、脱水素酵素によ
るレドツクス反応を適用して、測定すべき成分よ
り順次定量的に生成する誘導体を最終的に電子伝
達体−発色性電子受容体反応系を用いて測定す
る、体液中のα−アミラーゼの測定、トランスア
ミナーゼの測定、およびグリセリン脱水素酵素、
またはグリセロキナーゼ−グリセロホスフエート
脱水素酵素によるトリグリセライドの測定等に適
用でき、その効果は顕著である。 次に本発明の
方法およびその効果について実施例、試験例によ
りさらに詳細に説明する。 実施例 １ α−アミラーゼの測定 体液中のα−アミラーゼは次の反応系により測
定できる： (1) 修飾デンプンα−アミラーゼ ――――――――→ 分解デンプン (2) 分解デンプンα−グルコアミラーゼ ――――――――――――→ グルコース (3) グルコース＋ATPヘキソキナーゼ ――――――――→ グルコース−６−リン酸＋ADP (4) グルコース−６−リン酸＋NAD（Ｐ）⁺グルコース
−６−リン酸脱水素酵素 ――――――――――――――――――→ ６−ホスホグルコン酸−NAD（Ｐ）Ｈ (5) NAD（Ｐ）Ｈ＋NTBジアホラーゼ ――――――――→ NAD（Ｐ）⁺＋ホルマザン ただし、ATP：アデノシン三リン酸 ADP：アデノシン二リン酸 NTB：ニトロテトラゾリウムブルー （テトラゾリウム化合物） を表わす。 反応(5)で生成するホルマザンの吸光度を測定
し、その結果から、α−アミラーゼの活性値を計
算する。もし生体液中に内因性グルコース、また
は、最近盛んに輸液として用いられているマルト
ースが干渉物質として存在するときは反応(3)また
は、反応(2)、(3)により、次いで反応(4)、(5)により
ホルマザンが生成するため、α−アミラーゼの測
定値に正の誤差を与える。 本発明において、始めに反応(1)の修飾デンプン
を加えることなく反応(2)以下を行なわせ内因性グ
ルコース、およびマルトースは反応(2)、(3)、(4)に
より６−ホスホグルコン酸とし、これを除去す
る。次いで反応(5)はNTBが存在しないので起ら
ず次の別反応が進行する。 (6) NAD（Ｐ）Ｈ＋H⁺＋O₂カタラーゼ ――――――――→ ジアホラーゼNAD（Ｐ）⁺＋1/2O₂＋H₂O (7) NAD（Ｐ）Ｈ＋H⁺＋1/2O₂POD ――――――――→ ジアホラーゼNAD（Ｐ）⁺＋H₂O ただし、O₂：溶存酸素 を表わす。 反応(6)、(7)により干渉物質から生ずるNAD
（Ｐ）ＨはNAD（Ｐ）⁺に戻り、カタラーゼを使用
する場合は最終的には水と酸素を生ずるのみであ
り、またPODを使用する場合は水を生ずる。し
たがつて、続く成分の測定の際には干渉物質の影
響は全く除かれている。すなわち前処理をした
後、反応(1)より反応(5)までを実施すればα−アミ
ラーゼの正確な測定ができる。 １ 試薬 (1) ATP ５ｍ mol／ NADP⁺ 0.4ｍ mol／ ジアホラーゼ 2000U／ MgCl₂ 20ｍ mol／ ヘキソキナーゼ 600U／ グルコース−６−リン酸 500U／ 脱水素酵素 グルコアミラーゼ 4800U／ POD 10000U／ 牛アルブミン 0.1％ を含む100ｍ mol／ PH8.2 コハク酸緩衝液 (2) NTB ３ｍ mol／ トリトンＸ−100 １％ ソジウム・スターチ・グリコレート
7.2mg／ml を含む40ｍ mol／ PH6.4 コハク酸緩衝液 (3) トリトンＸ−100 0.33％ を含む0.6 Ｎ−HCl溶液 ２ 操作法 試薬(1)２mlに血清検体209μを加え37℃、
５分間保温後、試薬(2)１mlを加え、さらに37
℃、５分間保温後に試薬(3)１mlを加えて、反応
を停止した後、波長600nｍで吸光度を測定す
る。別にα−アミラーゼ活性既知の検体を上記
と同様に操作し、検量線を造り、この検量線よ
り血清検体のα−アミラーゼ活性を求める。 試験例 １ (1) α−アミラーゼ測定におけるグルコースの影
響 血清検体にグルコースを200、400、600、
800、1000mg／dlの濃度で添加した検体につい
て実施例１により吸光度を測定した。別に同じ
検体について本発明の前処理を行なわない方
法、すなわち、試薬(1)２mlと試薬(2)１mlの混合
試薬に検体20μを加えて、37℃、５分間保温
後に試薬(3)１mlを加えて反応を停止した後、吸
光度を測定した。 その結果は、次の表に示す。

【表】 上の表が示すように、内因性グルコースに対
する前処理を行なわない場合は、グルコースに
より、かなりの影響を受け、結果として、α−
アミラーゼ活性を測定しているとはいえない。
本発明によれば、1000mg／dlの高濃度のグルコ
ースによつても影響を受けずにα−アミラーゼ
活性を正確に測定できる。 (2) 本発明方法のα−アミラーゼ活性濃度と吸光
度との関係 実施例１の方法により、α−アミラーゼ活性
の濃度系列について吸光度を測定した結果を第
１図に示す。 この図が示すようにα−アミラーゼ活性の濃
度と吸光度とは、直接関係を示し、正しく、α
−アミラーゼ活性を測定できることが分る。 実施例 ２ グルタメートオキザルアセテート転移酵素
（GOT）およびグルタメートピルベート転移酵素
（GPT）の測定 体液中のGOT、GPTはグルタメート脱水素酵
素（GLDH）を用い次の反応系により測定でき
る。 １ α−ケトグルタレート＋Ｌ−アスパラギン酸GOT ――――→ Ｌ−グルタメート＋オキザル酢酸 ２ α−ケトグルタレート＋Ｌ−アラニンGPT ――――→ Ｌ−グルタメート＋ピルビン酸 ３ Ｌ−グルタメート＋NAD(P)⁺＋H₂OGLDH ―――――→ NAD(P)Ｈ＋α−ケトグルタレート＋NH₃ ４ NAD（Ｐ）Ｈ＋NTBジアホラーゼ ―――――――→ NTD（Ｐ）⁺＋ホルマザン 上述の反応で生成するホルマザンの吸光度を測
定し、その結果からGOT、GPTの活性値を計算
する。 血清あるいは血漿中に干渉物質として存在する
Ｌ−グルタメートはGLDHと反応し、NAD（Ｐ）
Ｈを生成するため、GOTあるいはGPTの測定値
に正の誤差を与える。 本発明においては始めに内因性Ｌ−グルタメー
トをGLDHとNAD（Ｐ）⁺の反応により、α−ケ
トグルタレートに転化し、これを除去する。次い
で、生成したNAD（Ｐ）Ｈの除去については実施
例１で述べたのと全く同様に行なわれ干渉物質で
あるＬ−グルタメートは消去される。 次いで、Ｌ−アスパラギン酸またはＬ−アラニ
ン、α−ケトグルタレートおよびNTBを含む試
薬を添加し、トランスアミナーゼ（GOT、
GPT）活性を正確に測定することができる。 １ 試薬 (1) カタラーゼ 10000U／ グルタメート 40000U／ 脱水素酵素 NAD⁺ 46ｍ mol／ ジアホラーゼ 4000U／ を含む100ｍ mol／ PH7.8 リン酸緩衝液 (2) GPT測定用 DL−アラニン 800ｍ mol／ α−ケトグルタレート 11ｍ mol／ NTB 1.0ｍ mol／ を含む100ｍ mol／ PH7.8 リン酸緩衝液 GOT測定用 Ｌ−アスパラギン酸 400ｍ mol／ α−ケトグルタレート 1.6ｍ mol／ NTB 1.0ｍ mol／ を含む100ｍ mol／ PH7.8 リン酸緩衝液 (3) トリトンＸ−100
0.1％を含む0.1N−HCl溶液 ２ 操作法 試薬(1)250μに血清検体20μを加え、37℃、
10分間保温後に、試薬(2)250μを加え、さらに
37℃、30分間保温後に、試薬(3)３mlを加えて反応
を停止した後、波長560nｍで吸光度を測定する。 別に、GOT、GPT活性既知の検体を上記と同
様に操作し、検量線を造り、この検量線より、血
清検体のGOT、GPT活性を求める。 試験例 ２ (1) GOT、GPT測定におけるＬ−グルタメート
の影響 血清検体にＬ−グルタメートを20、40、80、
100mg／mlの濃度で添加して検体について、実
施例２により、吸光度を測定した。別に同じ検
体について、本発明の前処理を行なわない方
法、即ち、試薬(1)250μと試薬(2)250μの混
合試薬に検体20μを加えて、37℃、30分間保
温後に試薬(3)３mlを加えて反応停止した後、吸
光度を測定した。 その結果は、次の表に示す。

【表】 上の表が示すように、内因性Ｌ−グルタメー
トに対する前処理を行なわない場合は、Ｌ−グ
ルタメートにより、かなりの影響を受け、結果
として、GOT、GPT活性を測定しているとは
いえない。本発明によれば、100mg／dlの高濃
度のＬ−グルタメートによつても影響を受けず
に、GOT、GPT活性を正確に測定できる。(2)
本発明方法のGOT、GPT活性濃度と吸光度
との関係 実施例２の方法により、GOT、GPT活性の
濃度系列について吸光度を測定した結果を第２
図に示す。 この図が示すように、GOT、GPT活性の濃
度と吸光度とは、直線関係を示し、正しく
GOT、GPT活性を測定できることが分る。 以上述べた通り本発明方法は簡単な方法で検
体中の干渉性物質を除去し試薬の無駄な使用も
なく正確な測定を可能にした点で極めて有用な
ものである。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図の縦軸は吸光度を示し、横軸
は血清の希釈度を示す。また、第１図○印は、血
清中のα−アミラーゼ活性を、第２図の○印は
GOT活性を、△印はGPT活性を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 生体液中の成分を測定するに当り、脱水素酵
   素を用いるレドツクス反応を適用し生成する還元
   型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を
   電子伝達体−発色性電子受容体反応系を用いて比
   色定量し、生体液中の成分の含有量を測定する方
   法において、当該反応に干渉作用を有する生体液
   中の内因性、外因性物質あるいはその誘導物質を
   予め脱水素酵素存在下に酸化し、その際生成する
   還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドま
   たはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
   酸を発色性電子受容体の存在しない状態でジアホ
   ラーゼ及びカタラーゼまたはペルオキシダーゼと
   作用させて除去することを特徴とする生体液中の
   成分を測定する方法。