JPH047200B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ATP（アデノシントリホスフエー
ト）またはNMN（ニコチン酸アミドモノヌクレ
オチド）の高感度測定法に関する。更に詳しく
は、ATPおよびNMNのいずれか一成分を含有
する被検液に、主反応系においてNMNまたは
ATP、Mg2+（マグネシウムイオン）の存在下に
NMNアデニリルトランスフエラーゼを作用させ
てNADとピロリン酸に変換させ、主反応の後、
生じたNADを、NAD（Ｐ）を補酵素とする酸化
還元反応系、たとえば少なくともNADを消費し
て還元型NADを生成する反応を形成するデヒド
ロゲナーゼおよびその基質による反応系と、還元
型NAD（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系たと
えば還元型NADを消費してNADを生成するジア
ホラーゼおよびテトラゾリウム塩とによる反応系
との組合せによる補酵素サイクリング反応を行な
い、次いで反応において生成または消費される成
分を定量してなるATPおよびNMNのいずれか
一成分を含有する被検液中の成分の高感度測定法
に関する。
ト）またはNMN（ニコチン酸アミドモノヌクレ
オチド）の高感度測定法に関する。更に詳しく
は、ATPおよびNMNのいずれか一成分を含有
する被検液に、主反応系においてNMNまたは
ATP、Mg2+（マグネシウムイオン）の存在下に
NMNアデニリルトランスフエラーゼを作用させ
てNADとピロリン酸に変換させ、主反応の後、
生じたNADを、NAD（Ｐ）を補酵素とする酸化
還元反応系、たとえば少なくともNADを消費し
て還元型NADを生成する反応を形成するデヒド
ロゲナーゼおよびその基質による反応系と、還元
型NAD（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系たと
えば還元型NADを消費してNADを生成するジア
ホラーゼおよびテトラゾリウム塩とによる反応系
との組合せによる補酵素サイクリング反応を行な
い、次いで反応において生成または消費される成
分を定量してなるATPおよびNMNのいずれか
一成分を含有する被検液中の成分の高感度測定法
に関する。
NMNアデニリルトランスフエラーゼ
（EC.2.7.7.1）は下記の酵素作用を有し、ネズミの
肝臓、脳細胞、およびブタの肝臓の細胞核に存在
することが知られている（M.R.Atkinson、J.F.
Jackson、R.K.Morton、Biochem.J.、80318
（1961））。
（EC.2.7.7.1）は下記の酵素作用を有し、ネズミの
肝臓、脳細胞、およびブタの肝臓の細胞核に存在
することが知られている（M.R.Atkinson、J.F.
Jackson、R.K.Morton、Biochem.J.、80318
（1961））。
ATP＋NMNMg2
―――→
〓NAD＋ピロリン酸
本酵素の活性測定法としては、反応により生じ
たNADをアルコールデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.1）で還元して、生じた還元型NADを
340nｍによる吸光度測定する方法の報告がなさ
れている（A.Kornberg、“Methods in
Enzymology”、vol.、P.670（1955）、「酵素ハン
ドブツク」P.386（1982.12.1））。しかし、この活性
測定法に基いてATPまたはNMNの定量法とな
しても、その感度が低く、ATPまたはNMNの
定量法としては利用し難いものであつた。
たNADをアルコールデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.1）で還元して、生じた還元型NADを
340nｍによる吸光度測定する方法の報告がなさ
れている（A.Kornberg、“Methods in
Enzymology”、vol.、P.670（1955）、「酵素ハン
ドブツク」P.386（1982.12.1））。しかし、この活性
測定法に基いてATPまたはNMNの定量法とな
しても、その感度が低く、ATPまたはNMNの
定量法としては利用し難いものであつた。
本発明者は、上記反応により生じたNADを測
定することにより、さらにこのNADを、NAD
（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系と還元型
NAD（Ｐ）を補酵素とする反応系との組合せによ
る補酵素サイクリング反応により増幅反応させ、
生成または消費される成分を定量することにより
高感度に測定できることを見い出した。
定することにより、さらにこのNADを、NAD
（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系と還元型
NAD（Ｐ）を補酵素とする反応系との組合せによ
る補酵素サイクリング反応により増幅反応させ、
生成または消費される成分を定量することにより
高感度に測定できることを見い出した。
補酵素サイクリングは、従来よりよく知られた
方法であり（生化学実験講座５、酵素研究法、上
121〜135、日本生化学会編、東京化学同人）、基
質や酵素活性を増幅定量する方法であり、生体内
の微量成分の測定には適した方法である。
方法であり（生化学実験講座５、酵素研究法、上
121〜135、日本生化学会編、東京化学同人）、基
質や酵素活性を増幅定量する方法であり、生体内
の微量成分の測定には適した方法である。
しかしながら、従来おこなわれていたサイクリ
ング法では、主反応系にはNADおよび還元型
NADの両方が共存しており、このNADおよび還
元型NADのいずれか一方を定量する場合には、
まず反応系に共存する定量対象外のNADまたは
還元型NADのいずれかを消去するアルカリまた
は酸の添加、加熱処理の操作を必須とし、次いで
PHをサイクリング反応に適した値に調整後サイク
リング反応を行ない、さらに指示反応をおこなわ
なければならず、操作性に問題があり、その指示
反応自体が被測定物質以外の影響を受ける場合が
多かつた。しかも油井のような特殊な反応容器を
必要とし、非常に微量の反応液量でおこなわれて
きた。さらに、従来の方法では、共存する定量対
象外のNADまたは還元型NAD補酵素を消去する
場合、酸またはアルカリを添加、加熱処理後、中
和するもので、この中和のためのアルカリまたは
酸の量を非常に正確に用いて中和することを要
し、良好に中和できず、PHにばらつきが生じた場
合、これがサイクリング率に大きく影響し、測定
値の誤差の原因となつていた。また従来のATP
の測定法としては、３−ホスホグリセレイト・キ
ナーゼによる方法やヘキソキナーゼによる方法
（Methods of Enzymatic Analysis第４巻、第
2097〜2110頁（1974））が知られているが、これ
らの方法は、ATPと基質との作用によつて生成
するリン酸化物をデヒドロゲナーゼにて作用せし
めて、その際に必要とする補酵素、例えば還元型
NAD（Ｐ）の生成または減少量にて定量するもの
である。しかしこのデヒドロゲナーゼでの定量に
当り、その反応系内には、例えばNAD（Ｐ）と還
元型NAD（Ｐ）補酵素とが共存し、共存する定量
対象外の補酵素を酸またはアルカリにて破壊処理
し、さらに中和した後にサイクリングを行うこと
が必須となり、繁雑でかつ自動化し得ない方法で
ある。
ング法では、主反応系にはNADおよび還元型
NADの両方が共存しており、このNADおよび還
元型NADのいずれか一方を定量する場合には、
まず反応系に共存する定量対象外のNADまたは
還元型NADのいずれかを消去するアルカリまた
は酸の添加、加熱処理の操作を必須とし、次いで
PHをサイクリング反応に適した値に調整後サイク
リング反応を行ない、さらに指示反応をおこなわ
なければならず、操作性に問題があり、その指示
反応自体が被測定物質以外の影響を受ける場合が
多かつた。しかも油井のような特殊な反応容器を
必要とし、非常に微量の反応液量でおこなわれて
きた。さらに、従来の方法では、共存する定量対
象外のNADまたは還元型NAD補酵素を消去する
場合、酸またはアルカリを添加、加熱処理後、中
和するもので、この中和のためのアルカリまたは
酸の量を非常に正確に用いて中和することを要
し、良好に中和できず、PHにばらつきが生じた場
合、これがサイクリング率に大きく影響し、測定
値の誤差の原因となつていた。また従来のATP
の測定法としては、３−ホスホグリセレイト・キ
ナーゼによる方法やヘキソキナーゼによる方法
（Methods of Enzymatic Analysis第４巻、第
2097〜2110頁（1974））が知られているが、これ
らの方法は、ATPと基質との作用によつて生成
するリン酸化物をデヒドロゲナーゼにて作用せし
めて、その際に必要とする補酵素、例えば還元型
NAD（Ｐ）の生成または減少量にて定量するもの
である。しかしこのデヒドロゲナーゼでの定量に
当り、その反応系内には、例えばNAD（Ｐ）と還
元型NAD（Ｐ）補酵素とが共存し、共存する定量
対象外の補酵素を酸またはアルカリにて破壊処理
し、さらに中和した後にサイクリングを行うこと
が必須となり、繁雑でかつ自動化し得ない方法で
ある。
本発明者は上記の種々の欠点を解決するために
補酵素サイクリング法による増幅高感度測定法を
改良すべく種々研究した結果、サイクリング反応
自体を指示反応とすること、それにより指示反応
のための操作も試薬も必要とせず、エンド・ポイ
ント法だけでなく、レイト法も可能である特徴を
有し、しかも特殊な反応容器を必要とせず、一般
の恒温槽で反応が可能であるばかりでなくドライ
ケミカル法（フイルム法、固定化法）にも利用で
きる非常に簡便な方法であることを見い出した。
さらに本発明においては、主反応系において補酵
素を必要としないので、主反応に要した物質が残
存していても被測定物質の測定に影響を及ぼさな
いため、主反応の後補酵素の不活性化の操作を必
要とせず、正確な測定が可能であることを見い出
した。
補酵素サイクリング法による増幅高感度測定法を
改良すべく種々研究した結果、サイクリング反応
自体を指示反応とすること、それにより指示反応
のための操作も試薬も必要とせず、エンド・ポイ
ント法だけでなく、レイト法も可能である特徴を
有し、しかも特殊な反応容器を必要とせず、一般
の恒温槽で反応が可能であるばかりでなくドライ
ケミカル法（フイルム法、固定化法）にも利用で
きる非常に簡便な方法であることを見い出した。
さらに本発明においては、主反応系において補酵
素を必要としないので、主反応に要した物質が残
存していても被測定物質の測定に影響を及ぼさな
いため、主反応の後補酵素の不活性化の操作を必
要とせず、正確な測定が可能であることを見い出
した。
本発明は上記知見に基くもので、ATPおよび
NMNのいずれか一成分を含有する被検液に、主
反応系においてNMNまたはATP、Mg2+の存在
下にNMNアデニリルトランスフエラーゼを作用
させてNADとピロリン酸に変換させ、主反応の
後、生じたNADを、NAD（Ｐ）を補酵素とする
酸化還元反応系と、還元型NAD（Ｐ）を補酵素と
する反応系との組合せによる補酵素サイクリング
反応をおこない、次いでこのサイクリング反応に
おいて生成または消費される成分を定量すること
を特徴とする被検液中の成分の高感度測定法であ
る。
NMNのいずれか一成分を含有する被検液に、主
反応系においてNMNまたはATP、Mg2+の存在
下にNMNアデニリルトランスフエラーゼを作用
させてNADとピロリン酸に変換させ、主反応の
後、生じたNADを、NAD（Ｐ）を補酵素とする
酸化還元反応系と、還元型NAD（Ｐ）を補酵素と
する反応系との組合せによる補酵素サイクリング
反応をおこない、次いでこのサイクリング反応に
おいて生成または消費される成分を定量すること
を特徴とする被検液中の成分の高感度測定法であ
る。
本発明における反応系は以下のように説明され
る。
る。
主反応系
ATP＋NMN
Mg2
―――→
〓ピロリン酸＋NAD
NMNアデニリルトランスフエラーゼ
補酵素サイクリング反応系：
NAD（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応
系： NAD＋S1E1 ―――――――→ 〓還元型NAD＋P1 還元型NAD（Ｐ）を補酵素とする反応系： 還元型NAD＋S2E2 ――→ NAD＋P2 E1：NADおよびS1を基質として消費し、還
元型NADおよびP1を生成する反応を触媒
するデヒドロゲナーゼ。
系： NAD＋S1E1 ―――――――→ 〓還元型NAD＋P1 還元型NAD（Ｐ）を補酵素とする反応系： 還元型NAD＋S2E2 ――→ NAD＋P2 E1：NADおよびS1を基質として消費し、還
元型NADおよびP1を生成する反応を触媒
するデヒドロゲナーゼ。
E2：還元型NADおよびS2を消費して、NAD
およびP2を生成する反応を触媒する作用
物質。
およびP2を生成する反応を触媒する作用
物質。
S1：E1の基質。
S2：E2の基質。
P1：S1の酸化生成物。
P2：S2の還元生成物。
これを図示すると以下のようになる。
本発明の被検液としては、少なくともATPま
たはNMNのいずれか一成分を含有するものであ
ればよく、ATPまたはNMNを予め含有してな
る被検液や、ATPまたはNMNを遊離生成せし
めてなるATPまたはNMN含有被検液が挙げら
れる。ATPを遊離生成せしめてなるATP含有被
検液としては、通常キナーゼ、ADPおよびキナ
ーゼ基質用リン化合物による酸素反応にてその
ADPがリン酸化されてATPを遊離、生成せしめ
る酵素反応系のものが挙げられる。さらに詳しく
は、下記の酵素反応系が例示されるが、これらは
例示であつて何んら本発明の対象を限定するもの
ではない。
たはNMNのいずれか一成分を含有するものであ
ればよく、ATPまたはNMNを予め含有してな
る被検液や、ATPまたはNMNを遊離生成せし
めてなるATPまたはNMN含有被検液が挙げら
れる。ATPを遊離生成せしめてなるATP含有被
検液としては、通常キナーゼ、ADPおよびキナ
ーゼ基質用リン化合物による酸素反応にてその
ADPがリン酸化されてATPを遊離、生成せしめ
る酵素反応系のものが挙げられる。さらに詳しく
は、下記の酵素反応系が例示されるが、これらは
例示であつて何んら本発明の対象を限定するもの
ではない。
クレアチンキナーゼ（EC.2.7.3.2）、ADPお
よびクレアチンホスフエートの酵素反応系で、
クレアチンキナーゼ活性測定、ADPの定量、
クレアチンホスフエートの定量のいずれか一成
分の測定のために用いられる。
よびクレアチンホスフエートの酵素反応系で、
クレアチンキナーゼ活性測定、ADPの定量、
クレアチンホスフエートの定量のいずれか一成
分の測定のために用いられる。
クレアチンホスフエート＋ADP
還元済，Mg2+
――――――――――→
クレアチンキナーゼクレアチン＋ATP
（還元剤：β−メルカプトエタノール、還元型
グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシス
テイン、ジチオスレイートールなど） ピルベートキナーゼ（EC、2.7.1.40）、ADP
およびホスホエノールピルビン酸の酸素反応系
で、ピルベートキナーゼ活性測定、ADPの定
量、ホスホエノールピルビン酸のいずれか一成
分の測定に用いられる。
グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシス
テイン、ジチオスレイートールなど） ピルベートキナーゼ（EC、2.7.1.40）、ADP
およびホスホエノールピルビン酸の酸素反応系
で、ピルベートキナーゼ活性測定、ADPの定
量、ホスホエノールピルビン酸のいずれか一成
分の測定に用いられる。
ホスホエノールピルビン酸＋ADP
Mg2+またはMn2+とK+，NH4 +またはRb+
――――――――――――――――――――→
ピルペートキナーゼ
ピルビン酸＋ATP
アセテートキナーゼ（EC.2.7.2.1）、ADPお
よびアセチルホスフエートの酵素反応系で、そ
のいずれか一成分の測定に用いられる。
よびアセチルホスフエートの酵素反応系で、そ
のいずれか一成分の測定に用いられる。
アセチルホスフエート＋ADP
Mg2+またはMn2+
――――――――――→
アセテートキナーゼ酢酸＋ATP
以下、各酵素反応系を簡略して挙げる。
カルバモイルホスフエート＋ADP
Mg2+
―――――――――――――――――――――――→
カルバメイトキナーゼ（EC，２，７，２）
NH3＋CO2＋ATP
４−ホスホ−Ｌ−アスパルテイト＋ADP
Mg2+
Mg2+
―――――――――――――――――――――――――
―→ アスパルテイトキナーゼ（EC，２，７，２，４） Ｌ−アスパルテイト＋ATP １，３−ジホスホ−Ｄ−グリセレイト＋
ADP Mg2+またはMn2+ Mg2+またはMn2+ ―――――――――――――――――――――――――
――――→ ホスホグリセレイトキナーゼ（EC，２，７，２，３） ３−ホスホ−Ｄ−グリセレイト＋ATP アルギニンホスフエート＋ADP Mg2+またはMn2+ ―――――――――――――――――――――→ アルギニンキナーゼ（EC，２，７，３，３） Ｌ−アルギニン＋ATP ADP＋ADP Mg2+ ―――――――――――――――――――――→ ミオキナーゼ（EC，２，７，４，３） AMP＋ATP XDP＋ADP Mg2+，Mn2+またはCa2+ Mg2+，Mn2+またはCa2+ ―――――――――――――――――――――――――
――――――――――――――→ Mg2+，Mn2+またはCa2+ ―――――――――――――――――――――――――
――――――――――――――→ ヌクレオサイドモノホスフエートキナーゼ（EC，２，７
，４，４） XMP＋ATP （ただしXDP＝ヌクレオサイドジホスフエー
トＸ＝Ｕ、Ｉ、Ｇ、ＣまたはＡを示す） これらの酵素反応系におけるキナーゼとして
は、例えば前記のクレアチンホスフエート、ホス
ホエノールピルビン酸、アセチルホスフエート、
カルベモイルホスフエート、４−ホスホ−Ｌ−ア
スパルテイト、１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセレ
イト、アルギニンホスフエート、ADP、XDPな
どのキナーゼ基質用リン化合物のリン酸基を
ADPに転位せしめてATPを生成遊離する作用を
有する酵素であればよく、例えばクレアチンホス
フエートをキナーゼ基質用リン化合物とするクレ
アチンキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸をキ
ナーゼ基質用リン化合物とするピルベートオキシ
ダーゼ、アセチルホスフエートをキナーゼ基質用
リン化合物とするアセテートキナーゼ、その他の
ホスホグリセレイトキナーゼ、アルギニンキナー
ゼ、ミオキナーゼ、ヌクレオサイドモノホスフエ
ートキナーゼなどが挙げられる。NMNを遊離生
成せしめてなるNMN含有被検液としては、下記
の酵素反応系が例示されるが、これは例示であつ
て本発明の対象を何ら限定するものではない。
―→ アスパルテイトキナーゼ（EC，２，７，２，４） Ｌ−アスパルテイト＋ATP １，３−ジホスホ−Ｄ−グリセレイト＋
ADP Mg2+またはMn2+ Mg2+またはMn2+ ―――――――――――――――――――――――――
――――→ ホスホグリセレイトキナーゼ（EC，２，７，２，３） ３−ホスホ−Ｄ−グリセレイト＋ATP アルギニンホスフエート＋ADP Mg2+またはMn2+ ―――――――――――――――――――――→ アルギニンキナーゼ（EC，２，７，３，３） Ｌ−アルギニン＋ATP ADP＋ADP Mg2+ ―――――――――――――――――――――→ ミオキナーゼ（EC，２，７，４，３） AMP＋ATP XDP＋ADP Mg2+，Mn2+またはCa2+ Mg2+，Mn2+またはCa2+ ―――――――――――――――――――――――――
――――――――――――――→ Mg2+，Mn2+またはCa2+ ―――――――――――――――――――――――――
――――――――――――――→ ヌクレオサイドモノホスフエートキナーゼ（EC，２，７
，４，４） XMP＋ATP （ただしXDP＝ヌクレオサイドジホスフエー
トＸ＝Ｕ、Ｉ、Ｇ、ＣまたはＡを示す） これらの酵素反応系におけるキナーゼとして
は、例えば前記のクレアチンホスフエート、ホス
ホエノールピルビン酸、アセチルホスフエート、
カルベモイルホスフエート、４−ホスホ−Ｌ−ア
スパルテイト、１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセレ
イト、アルギニンホスフエート、ADP、XDPな
どのキナーゼ基質用リン化合物のリン酸基を
ADPに転位せしめてATPを生成遊離する作用を
有する酵素であればよく、例えばクレアチンホス
フエートをキナーゼ基質用リン化合物とするクレ
アチンキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸をキ
ナーゼ基質用リン化合物とするピルベートオキシ
ダーゼ、アセチルホスフエートをキナーゼ基質用
リン化合物とするアセテートキナーゼ、その他の
ホスホグリセレイトキナーゼ、アルギニンキナー
ゼ、ミオキナーゼ、ヌクレオサイドモノホスフエ
ートキナーゼなどが挙げられる。NMNを遊離生
成せしめてなるNMN含有被検液としては、下記
の酵素反応系が例示されるが、これは例示であつ
て本発明の対象を何ら限定するものではない。
ニコチンアミド＋５−ホスホ−α−Ｄ−リ
ボシ ルピロホスフエート ―――――――――――――――――――――――――
―――→ ―――――――――――――――――――――――――
―――→ NMNピロホスフオリラーゼ（EC，２，４，２，12）NMN＋
ピロリン酸 これらの酵素反応系におけるATPまたNMN
の定量目的は、酵素反応系における酵素の活性測
定や用いられる他の成分の定量のいずれか一成分
の測定のために行なわれるもので、また酵素反応
系の測定成分以外の成分は試薬として一定量用い
ればよい。この際用いられる被検液や試薬の量
は、測定すべき目的や選択する条件によつて適宜
設計変更すればよく、特に限定されるものではな
い。またこの酵素反応では通常37℃で一分間以上
行なえばよい。このように本発明の被検液として
はATP、NMNのいずれか一成分を含有するも
のが対象として挙げられるものである。
ボシ ルピロホスフエート ―――――――――――――――――――――――――
―――→ ―――――――――――――――――――――――――
―――→ NMNピロホスフオリラーゼ（EC，２，４，２，12）NMN＋
ピロリン酸 これらの酵素反応系におけるATPまたNMN
の定量目的は、酵素反応系における酵素の活性測
定や用いられる他の成分の定量のいずれか一成分
の測定のために行なわれるもので、また酵素反応
系の測定成分以外の成分は試薬として一定量用い
ればよい。この際用いられる被検液や試薬の量
は、測定すべき目的や選択する条件によつて適宜
設計変更すればよく、特に限定されるものではな
い。またこの酵素反応では通常37℃で一分間以上
行なえばよい。このように本発明の被検液として
はATP、NMNのいずれか一成分を含有するも
のが対象として挙げられるものである。
本発明に用いられるNMNアデニリルトランス
フエラーゼは、ATPおよびNMNを基質とし、
Mg2+イオンの存在下NADおよびピロリン酸を生
成する反応を触媒する酵素（EC.2.7.7.1）であり、
動物または微生物のいずれに由来するものでもよ
く、例えばブタ肝臓、酵母由来のものが挙げられ
る（M.R.Atkinson、J.F.Jackson、R.K.
Morton、Biochem.J.、80、318（1981））。この
NMNアデニリルトランスフエラーゼの作用によ
り、被検液中のATPは、用いるNMNとともに
NADおよびピロリン酸を生成し、また被検液中
のNMNは用いるATPとともにNADおよびピロ
リン酸を生成する主反応を行わせしめる。
フエラーゼは、ATPおよびNMNを基質とし、
Mg2+イオンの存在下NADおよびピロリン酸を生
成する反応を触媒する酵素（EC.2.7.7.1）であり、
動物または微生物のいずれに由来するものでもよ
く、例えばブタ肝臓、酵母由来のものが挙げられ
る（M.R.Atkinson、J.F.Jackson、R.K.
Morton、Biochem.J.、80、318（1981））。この
NMNアデニリルトランスフエラーゼの作用によ
り、被検液中のATPは、用いるNMNとともに
NADおよびピロリン酸を生成し、また被検液中
のNMNは用いるATPとともにNADおよびピロ
リン酸を生成する主反応を行わせしめる。
この主反応について、その反応液量は、通常１
テスト当り10μから３mlの範囲の容量で反応し
得る。NMNアデニリルトランスフエラーゼは、
反応時間または待時間により異なるが、通常１テ
スト当り0.5〜100単位、好ましくは10単位以上で
作用し得る。また用いられるNMNまたはATP
は、少なくとも被検液中のATPまたはNMNの
量以上に用いればよく、またこの主反応において
被検液中のATPまたはNMNの量に相応した
NADが生成される。
テスト当り10μから３mlの範囲の容量で反応し
得る。NMNアデニリルトランスフエラーゼは、
反応時間または待時間により異なるが、通常１テ
スト当り0.5〜100単位、好ましくは10単位以上で
作用し得る。また用いられるNMNまたはATP
は、少なくとも被検液中のATPまたはNMNの
量以上に用いればよく、またこの主反応において
被検液中のATPまたはNMNの量に相応した
NADが生成される。
次に補酵素サイクリングにより増幅反応させる
のであるが、本発明においては、主反応系におい
て試料中のATPまたはNMN量に相応して変換
され生じたNADを、NAD（Ｐ）を補酵素とする
酸化還元反応系と、還元型NAD（Ｐ）を補酵素と
する反応系との組合せによる補酵素サイクリング
反応をおこない、次いでこのサイクリング反応に
おいて生成または消費される成分を定量する。
のであるが、本発明においては、主反応系におい
て試料中のATPまたはNMN量に相応して変換
され生じたNADを、NAD（Ｐ）を補酵素とする
酸化還元反応系と、還元型NAD（Ｐ）を補酵素と
する反応系との組合せによる補酵素サイクリング
反応をおこない、次いでこのサイクリング反応に
おいて生成または消費される成分を定量する。
NAD（Ｐ）とは、NADのみ、またはNADと
NADPの両方とのいずれかの意味を示するもの
で、NAD（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系と
としては例えば、NADを消費して還元型NADを
生成する反応を形成するデヒドロゲナーゼ（E1）
およびその基質（S1）による反応系や、NADと
NADPの両方を補酵素とするデヒドロゲナーゼ
（E1）およびその基質（S1）による反応系を用い
ることができる。上記のデヒドロゲナーゼは、特
に限定されることなく、少なくともNADを補酵
素として消費するものであればよく、かつ過剰量
用いる特定の基質に作用して還元型NADを生成
するデヒドロゲナーゼであればいかなる起源の酵
素であつてもよい。これらの酵素およびその基質
の例としては「酵素ハンドブツク」に記載されて
いるが、例として、ラクテートデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.27）およびＬ−ラクテート、アルコー
ルデヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.1.）およびエタノ
ール、グリセロールデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.6）およびグリセロール、グリセロール
−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.8）およびグリセロール−３−ホスフエ
ート、グルコースデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.47）およびグルコース、マレートデヒ
ドロゲナーゼ（EC.1.1.1.37）およびＬ−マレー
ト、グルタメイトデヒドロゲナーゼ（EC.1.4.1.2）
およびＬ−グルタメイト、３−α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.50）および
３−α−ヒドロキシステロイドなどが挙げられ
る。これらの酵素を用いる酸化還元反応系におけ
る酵素（E1）、基質（S1）、酵素反応、生成物
（P1）は以下に示す通りである。
NADPの両方とのいずれかの意味を示するもの
で、NAD（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系と
としては例えば、NADを消費して還元型NADを
生成する反応を形成するデヒドロゲナーゼ（E1）
およびその基質（S1）による反応系や、NADと
NADPの両方を補酵素とするデヒドロゲナーゼ
（E1）およびその基質（S1）による反応系を用い
ることができる。上記のデヒドロゲナーゼは、特
に限定されることなく、少なくともNADを補酵
素として消費するものであればよく、かつ過剰量
用いる特定の基質に作用して還元型NADを生成
するデヒドロゲナーゼであればいかなる起源の酵
素であつてもよい。これらの酵素およびその基質
の例としては「酵素ハンドブツク」に記載されて
いるが、例として、ラクテートデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.27）およびＬ−ラクテート、アルコー
ルデヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.1.）およびエタノ
ール、グリセロールデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.6）およびグリセロール、グリセロール
−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.8）およびグリセロール−３−ホスフエ
ート、グルコースデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.47）およびグルコース、マレートデヒ
ドロゲナーゼ（EC.1.1.1.37）およびＬ−マレー
ト、グルタメイトデヒドロゲナーゼ（EC.1.4.1.2）
およびＬ−グルタメイト、３−α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.50）および
３−α−ヒドロキシステロイドなどが挙げられ
る。これらの酵素を用いる酸化還元反応系におけ
る酵素（E1）、基質（S1）、酵素反応、生成物
（P1）は以下に示す通りである。
Ｌ−ラクテート（S1）＋NAD
（E1）
――――――――――――――→
ラクテートデヒドロゲナーゼ
ピルビン酸（P1）＋還元型NAD
エタノール（S1）＋NAD
（E1）
――――――――――――――→
アルコールデヒドロゲナーゼ
アセトアルデヒド（P1）＋還元型NAD
グリセロール（S1）＋NAD
（E1）
―――――――――――――――→
グリセロールデヒドロゲナーゼ
ジヒドロキシアセトン（P1）＋還元型NAD
グリセロール−３−ホスフエート
（S1）＋NAD
（E1）
―――――――――→
グリセロール−３−ホスフエート
デヒドロゲナーゼ
ジヒドロキシアセトンホスフエート（P1）
＋還元型NAD
グルコース（S1）＋NAD（Ｐ）
（E1）
――――――――――――――→
グルコースデヒドロゲナーゼ
グルコノ−δ−ラクトン（P1）＋還元型NAD
Ｌ−マレート（S1）＋NAD
（E1）
―――――――――――――→
マレートデヒドロゲナーゼ
オギザロ酢酸（P1）＋還元型NAD
Ｌ−グルタメイト（S1）＋H2O＋NAD
（E1）
―――――――――――――――→
グルタメイトデヒドロゲナーゼ
２−オキソグルタレイト（P1）＋還元型NAD
３−α−ヒドロキシステロイド（S1）＋NAD
（E1）
――――――――――――――→
３−α−ヒドロキシスラロイド
デヒドロゲナーゼ
３−ケトステロイド（P1）＋還元型NAD
これらの酸化還元反応に使用する酵素量は、酵
素力価、基質の種類および補酵素サイクリング率
によつて異なる。基質量は、１サイクル毎に１モ
ル比の基質を消費してなるもので、サイクリング
する補酵素より比較にならない程はるかに多いモ
ル量が使用されるもので、通常単位時間当りのサ
イクル数および反応時間に基いて決定すればよ
く、またその酸化還元酵素の反応速度が最大を示
すような濃度以上であればよい。通常0.1ｍＭな
いし100ｍＭの濃度範囲で存在し得る。
素力価、基質の種類および補酵素サイクリング率
によつて異なる。基質量は、１サイクル毎に１モ
ル比の基質を消費してなるもので、サイクリング
する補酵素より比較にならない程はるかに多いモ
ル量が使用されるもので、通常単位時間当りのサ
イクル数および反応時間に基いて決定すればよ
く、またその酸化還元酵素の反応速度が最大を示
すような濃度以上であればよい。通常0.1ｍＭな
いし100ｍＭの濃度範囲で存在し得る。
還元型NAD（Ｐ）を補酵素とする反応系として
は、少なくとも還元型NADを消費してNADを生
成する作用物質（E2）およびその基質（S2）の
反応系が挙げられ、その作用物質とその基質の反
応系としては、少なくとも還元型NADを消費し
てNADを生成する酸化還元酵素およびその基質
の反応系や、電子伝達物質およびテトラゾリウム
塩の反応系などが挙げられる。
は、少なくとも還元型NADを消費してNADを生
成する作用物質（E2）およびその基質（S2）の
反応系が挙げられ、その作用物質とその基質の反
応系としては、少なくとも還元型NADを消費し
てNADを生成する酸化還元酵素およびその基質
の反応系や、電子伝達物質およびテトラゾリウム
塩の反応系などが挙げられる。
還元型NADを消費してNADを生成する酸化還
元酵素としては、少なくとも還元型NADを補酵
素とし、過剰量用いる特定の基質（S2）に作用し
てNADおよびS2の還元型生成物（P2）を生成す
るデヒドロゲナーゼ、または少なくとも還元型
NADを補酵素とし、チトクローム、ジスルフイ
ド化合物、キノンおよびその類縁体等を受容体と
する還元型NAD（Ｐ）：受容体酸化還元酵素であ
ればそのいずれでも良く、その起源も限定される
ことはない。これらの酵素およびその基質または
受容体の例としては、「酵素ハンドブツク」に記
載されているが、デヒドロゲナーゼおよびその基
質の例としては、ラクテートデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.27）およびピルビン酸、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.1）およびアセトアル
デヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.6）およびジヒドロキシアセトン、グリ
セロール−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.8）およびジヒドロキシアセトンホスフ
エート）、マレートデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.37）およびオギザロ酢酸、３−α−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.50）および３−ケト−ステロイドなど
の例が挙げられる。また還元型NAD（Ｐ）：受容
体酸化還元酵素としては、チトクロームb5レダク
ターゼ（EC.1.6.2.2）、ジアホラーゼ
（EC.1.6.4.3）、ナイトレートレダクターゼ
（EC.1.6.6.1）、還元型NADPデヒドロゲナーゼ
（EC.1.6.99.1）、還元型NAD（Ｐ）デヒドロゲナー
ゼ（EC.1.6.99.2）、還元型NADデヒドロゲナーゼ
（EC.1.6.99.3）、還元型NADデヒドロゲナーゼ
（キノン）（EC.1.6.99.5）などが挙げられる。受容
体としては、メチレン・ブルー、フラビン類、キ
ノン類、２，６−ジクロロフエノールインドフエ
ノール、フエリシアン化塩、テトラゾリウム塩、
チトクローム、などが用いられ得るが、更に具体
的には、フラビン類としてはリボフラビン、フラ
ビンモノヌクレオチド（FMN）、フラビンアデ
ニンジヌクレオチド（FAD）、キノン類としては
ナフトキノン類として、１，４−ナフトキノン、
２−メチル−１，４−ナフトキノン、ベンゾキノ
ン類としては２，３−ジメトキシ−５−メチル−
１，４−ベンゾキノン、テトラメチル−Ｐ−ベン
ゾキノン、Ｐ−ベンゾキノン、ユビキノン、テト
ラゾリウム塩としては３，3′−（３，3′−ジメト
キシ−４，4′−ジフエニレン）ビス〔２−（Ｐ−
ニトロフエニル）−５−７−フエニル−テトラゾ
リウムクロライド〕（ニトロテトラゾリウムブル
ー）（NTB）、２−（Ｐ−ニトロフエニル）−３−
（Ｐ−ヨードフエニル）−５−フエニルテトラゾリ
ウムクロライド（INT）、２−（4′，5′−ジメチル
−2′−チアゾリル）−３，５−ジフエニルテトラ
ゾリウムブロマイド（４，５−MTT）、チトク
ロームとしてはフエリチトクロームb5、チトクロ
ームＣなどが挙げられる。
元酵素としては、少なくとも還元型NADを補酵
素とし、過剰量用いる特定の基質（S2）に作用し
てNADおよびS2の還元型生成物（P2）を生成す
るデヒドロゲナーゼ、または少なくとも還元型
NADを補酵素とし、チトクローム、ジスルフイ
ド化合物、キノンおよびその類縁体等を受容体と
する還元型NAD（Ｐ）：受容体酸化還元酵素であ
ればそのいずれでも良く、その起源も限定される
ことはない。これらの酵素およびその基質または
受容体の例としては、「酵素ハンドブツク」に記
載されているが、デヒドロゲナーゼおよびその基
質の例としては、ラクテートデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.27）およびピルビン酸、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.1）およびアセトアル
デヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.6）およびジヒドロキシアセトン、グリ
セロール−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.8）およびジヒドロキシアセトンホスフ
エート）、マレートデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.37）およびオギザロ酢酸、３−α−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.50）および３−ケト−ステロイドなど
の例が挙げられる。また還元型NAD（Ｐ）：受容
体酸化還元酵素としては、チトクロームb5レダク
ターゼ（EC.1.6.2.2）、ジアホラーゼ
（EC.1.6.4.3）、ナイトレートレダクターゼ
（EC.1.6.6.1）、還元型NADPデヒドロゲナーゼ
（EC.1.6.99.1）、還元型NAD（Ｐ）デヒドロゲナー
ゼ（EC.1.6.99.2）、還元型NADデヒドロゲナーゼ
（EC.1.6.99.3）、還元型NADデヒドロゲナーゼ
（キノン）（EC.1.6.99.5）などが挙げられる。受容
体としては、メチレン・ブルー、フラビン類、キ
ノン類、２，６−ジクロロフエノールインドフエ
ノール、フエリシアン化塩、テトラゾリウム塩、
チトクローム、などが用いられ得るが、更に具体
的には、フラビン類としてはリボフラビン、フラ
ビンモノヌクレオチド（FMN）、フラビンアデ
ニンジヌクレオチド（FAD）、キノン類としては
ナフトキノン類として、１，４−ナフトキノン、
２−メチル−１，４−ナフトキノン、ベンゾキノ
ン類としては２，３−ジメトキシ−５−メチル−
１，４−ベンゾキノン、テトラメチル−Ｐ−ベン
ゾキノン、Ｐ−ベンゾキノン、ユビキノン、テト
ラゾリウム塩としては３，3′−（３，3′−ジメト
キシ−４，4′−ジフエニレン）ビス〔２−（Ｐ−
ニトロフエニル）−５−７−フエニル−テトラゾ
リウムクロライド〕（ニトロテトラゾリウムブル
ー）（NTB）、２−（Ｐ−ニトロフエニル）−３−
（Ｐ−ヨードフエニル）−５−フエニルテトラゾリ
ウムクロライド（INT）、２−（4′，5′−ジメチル
−2′−チアゾリル）−３，５−ジフエニルテトラ
ゾリウムブロマイド（４，５−MTT）、チトク
ロームとしてはフエリチトクロームb5、チトクロ
ームＣなどが挙げられる。
還元型NAD（Ｐ）：受容体酸化還元酵素および
受容体の組合せは少なくとも還元型NADを補酵
素としてなる酵素および電子受容体となり得るも
のであれば特に制限されないが好ましい組み合せ
としては、ジアホラーゼ（EC.1.6.4.3）およびテ
トラゾリウム塩、還元型NADPデヒドロゲナー
ゼ（EC.1.6.99.1）およびメチレン・ブルー、還元
型NADデヒドロゲナーゼ（EC.1.6.99.3）および
チトクロームＣなどが挙げられる。還元型NAD
（Ｐ）：受容体酸化酵素は還元型NADに特異性の
高いものが好ましく、使用濃度は通常0.05〜
100U／mlの範囲で存在し得る。テトラゾリウム
塩の使用濃度は、テトラゾリウム塩および究極的
に形成されるホルマザンの双方の水溶性がむしろ
限定されるが、通常は試薬１ml当り1μｇから
100μｇの濃度範囲で存在し得る。
受容体の組合せは少なくとも還元型NADを補酵
素としてなる酵素および電子受容体となり得るも
のであれば特に制限されないが好ましい組み合せ
としては、ジアホラーゼ（EC.1.6.4.3）およびテ
トラゾリウム塩、還元型NADPデヒドロゲナー
ゼ（EC.1.6.99.1）およびメチレン・ブルー、還元
型NADデヒドロゲナーゼ（EC.1.6.99.3）および
チトクロームＣなどが挙げられる。還元型NAD
（Ｐ）：受容体酸化酵素は還元型NADに特異性の
高いものが好ましく、使用濃度は通常0.05〜
100U／mlの範囲で存在し得る。テトラゾリウム
塩の使用濃度は、テトラゾリウム塩および究極的
に形成されるホルマザンの双方の水溶性がむしろ
限定されるが、通常は試薬１ml当り1μｇから
100μｇの濃度範囲で存在し得る。
電子伝達物質としては、還元型NADをNADに
酸化する能力を有し、しかも補酵素サイクリング
反応に悪影響を及ぼさないような物質であり、例
えばフエナシンメタルサルフエート、メルドー
ラ・ブルー、ピロシアニンなどが挙げられる。使
用濃度は、サイクリング率に応じて設定すればよ
いが、通常反応液１ml当り5μｇ〜0.5mgの濃度範
囲で存在し得る。
酸化する能力を有し、しかも補酵素サイクリング
反応に悪影響を及ぼさないような物質であり、例
えばフエナシンメタルサルフエート、メルドー
ラ・ブルー、ピロシアニンなどが挙げられる。使
用濃度は、サイクリング率に応じて設定すればよ
いが、通常反応液１ml当り5μｇ〜0.5mgの濃度範
囲で存在し得る。
上記のサイクリング反応は、通常室温ないし37
℃付近の温度、好ましくは30〜37℃の温度で行わ
れる。反応時間は、特に限定されるものでなく、
通常１分以上、好ましくは５分以上行なえばよ
い。予定された時間の終りで反応を迅速に停止す
るには、酸、例えば塩酸、リン酸などを添加する
ことにより行なわれる。
℃付近の温度、好ましくは30〜37℃の温度で行わ
れる。反応時間は、特に限定されるものでなく、
通常１分以上、好ましくは５分以上行なえばよ
い。予定された時間の終りで反応を迅速に停止す
るには、酸、例えば塩酸、リン酸などを添加する
ことにより行なわれる。
このようにしてサイクリング反応を行なつた
後、このサイクリング反応において生成または消
費される部分を定量するのであるが、生成する成
分としてはE1の基質（S1）の酸化生成物（P1）
またはE2の基質（S2）の還元生成物（P2）を対
象とすればよく、消費される成分としてはE1の
基質（S1）またはE2の基質（S2）を対象とすれ
ばよく、これらのP1、P2、S1、S2のいずれか一
成分の量を定量すればよい。簡便には、基質の状
態では無色であり、生成物の状態にて呈色または
螢光を呈する吸光波長を変化する場合の生成物の
定量手段を用いることである。例えばテトラゾリ
ウム塩を基質（S2）として、生成するホルマザン
を還元生成物（P2）とせしめて、このホルマザ
ンを比色定量してなるものである。さらにフラビ
ン類やキノン類を基質（S2）として用いた場合に
は、それらの基質（Ｓ）の消費量をその特有の吸
光波長に基いて吸光度測定して定量すればよい。
後、このサイクリング反応において生成または消
費される部分を定量するのであるが、生成する成
分としてはE1の基質（S1）の酸化生成物（P1）
またはE2の基質（S2）の還元生成物（P2）を対
象とすればよく、消費される成分としてはE1の
基質（S1）またはE2の基質（S2）を対象とすれ
ばよく、これらのP1、P2、S1、S2のいずれか一
成分の量を定量すればよい。簡便には、基質の状
態では無色であり、生成物の状態にて呈色または
螢光を呈する吸光波長を変化する場合の生成物の
定量手段を用いることである。例えばテトラゾリ
ウム塩を基質（S2）として、生成するホルマザン
を還元生成物（P2）とせしめて、このホルマザ
ンを比色定量してなるものである。さらにフラビ
ン類やキノン類を基質（S2）として用いた場合に
は、それらの基質（Ｓ）の消費量をその特有の吸
光波長に基いて吸光度測定して定量すればよい。
さらに上記反応において、テトラゾリウム塩か
ら形成されるホルマザンの沈澱の防止をたすける
ために界面活性剤を添加することが好ましい。界
面活性剤としてはトライトンＸ−100、アデカト
ールSO−145などの非イオン界面活性剤が挙げら
れる。使用濃度は試薬に対し、0.01〜３％の濃度
範囲で存在し得る。この界面活性剤の添加によ
り、測定値の感度の上昇とホルマザン色素の安定
化を計ることができる。
ら形成されるホルマザンの沈澱の防止をたすける
ために界面活性剤を添加することが好ましい。界
面活性剤としてはトライトンＸ−100、アデカト
ールSO−145などの非イオン界面活性剤が挙げら
れる。使用濃度は試薬に対し、0.01〜３％の濃度
範囲で存在し得る。この界面活性剤の添加によ
り、測定値の感度の上昇とホルマザン色素の安定
化を計ることができる。
生じたホルマザン色素の比色定量はホルマザン
の特異的吸光波長にて吸光度（OD）を測定すれ
ばよく、例えば、500〜550nｍの波長により吸光
度を測定して、被測定物質の定量を行うことがで
きる。
の特異的吸光波長にて吸光度（OD）を測定すれ
ばよく、例えば、500〜550nｍの波長により吸光
度を測定して、被測定物質の定量を行うことがで
きる。
本発明によれば、エンド・ポイント法だけでな
く、レイト法、ドライケミカル法（フイルム法、
固定化法）も可能である。
く、レイト法、ドライケミカル法（フイルム法、
固定化法）も可能である。
本発明はATPの高感度測定法として有用であ
り、試料中に遊離しているATPの定量や、キナ
ーゼ、ADPおよびキナーゼ基質用リン化合物に
よる酵素反応にてADPがリン酸化されて生成、
遊離されるATPの定量、NMNの定量、NMNピ
ロホスホリラーゼ、ニコチンアミドおよび５−ホ
スホ−α−Ｄ−リボシルピロホスフエートによる
酵素反応にて生成、遊離されるNMNの定量に有
用である。さらに酵素反応系におけるキナーゼ活
性測定、ADP、キナーゼ基質用リン化合物、ニ
コチンアミド、５−ホスホ−α−Ｄ−リボシルピ
ロホスフエートのいずれか一成分の定量に利用す
ることも可能である。
り、試料中に遊離しているATPの定量や、キナ
ーゼ、ADPおよびキナーゼ基質用リン化合物に
よる酵素反応にてADPがリン酸化されて生成、
遊離されるATPの定量、NMNの定量、NMNピ
ロホスホリラーゼ、ニコチンアミドおよび５−ホ
スホ−α−Ｄ−リボシルピロホスフエートによる
酵素反応にて生成、遊離されるNMNの定量に有
用である。さらに酵素反応系におけるキナーゼ活
性測定、ADP、キナーゼ基質用リン化合物、ニ
コチンアミド、５−ホスホ−α−Ｄ−リボシルピ
ロホスフエートのいずれか一成分の定量に利用す
ることも可能である。
これらの定量において、ATPまたはNMNの
１モル比に対して極めて高モル比の生成物質を形
成せしめるため、ATPまたはNMNの高感度測
定法として有用である。
１モル比に対して極めて高モル比の生成物質を形
成せしめるため、ATPまたはNMNの高感度測
定法として有用である。
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する
が、これにより本発明を限定するものではない。
が、これにより本発明を限定するものではない。
実施例 １
（試薬）
(1) 50ｍＭ Tris−HCl緩衝液PH7.5
(2) ５ｍＭ MgCl2
(3) １ｍＭ NMN
(4) NMNアデニリルトランスフエラーゼ（イ
ースト由来：18U／ml） (1) 100ｍＭ リン酸緩衝液PH8.0 (2) アルコールデヒドロゲナーゼ（イースト由
来：240U／ml） (3) 0.01％ NTB (4) ジアホラーゼ（バチルスメガテリウム由
来：240U／ml） (5) 0.8M エタノール (6) 0.1％ トリトンＸ−100 （操作） 試薬0.1mlに0.5〜2.5μMのATP10μを添加
し、37℃で15分間反応を行ない、反応後37℃に予
備加温した後、試薬を0.1ml添加し、正確に10
分間反応を行ない、2.8mlの0.1NHClを添加し、
反応を停止したのち、550nｍにて比色定量をし
た。（結果）第１図の通りであつて、ATPの濃度
と550nｍにおける吸光度の間にきわめて良好な
直線的関係が得られた。
ースト由来：18U／ml） (1) 100ｍＭ リン酸緩衝液PH8.0 (2) アルコールデヒドロゲナーゼ（イースト由
来：240U／ml） (3) 0.01％ NTB (4) ジアホラーゼ（バチルスメガテリウム由
来：240U／ml） (5) 0.8M エタノール (6) 0.1％ トリトンＸ−100 （操作） 試薬0.1mlに0.5〜2.5μMのATP10μを添加
し、37℃で15分間反応を行ない、反応後37℃に予
備加温した後、試薬を0.1ml添加し、正確に10
分間反応を行ない、2.8mlの0.1NHClを添加し、
反応を停止したのち、550nｍにて比色定量をし
た。（結果）第１図の通りであつて、ATPの濃度
と550nｍにおける吸光度の間にきわめて良好な
直線的関係が得られた。
実施例 ２
実施例１で用いた試薬のうち、アルコールデヒ
ドロゲナーゼおよび0.8Mエタノールの代わりに、
グリセロール−３−ホスフエートデヒドロゲナー
ゼ（ウサギ筋肉由来、EC.1.1.1.8）300U／mlおよ
び10ｍＭグリセロール−3′−ホスフエートを用い
て、以下実施例１と同様の反応を行なつた。結果
は第２図の通りであつて、実施例１と同様に、
ATPと550nｍにおける吸光度の間にきわめて良
好な直線関係が得られた。
ドロゲナーゼおよび0.8Mエタノールの代わりに、
グリセロール−３−ホスフエートデヒドロゲナー
ゼ（ウサギ筋肉由来、EC.1.1.1.8）300U／mlおよ
び10ｍＭグリセロール−3′−ホスフエートを用い
て、以下実施例１と同様の反応を行なつた。結果
は第２図の通りであつて、実施例１と同様に、
ATPと550nｍにおける吸光度の間にきわめて良
好な直線関係が得られた。
実施例 ３
実施例１における試薬のうち、アルコールデ
ヒドロゲナーゼおよび0.8Mエタノールをグリセ
ロールデヒドロゲナーゼ（バチルス・メガテリウ
ム由来、EC.1.1.1.6）260U／mlおよび1Mグリセ
ロールを用いて、以下実施例１と同様の反応を行
なつた。結果は第３図に示される通りである。
ヒドロゲナーゼおよび0.8Mエタノールをグリセ
ロールデヒドロゲナーゼ（バチルス・メガテリウ
ム由来、EC.1.1.1.6）260U／mlおよび1Mグリセ
ロールを用いて、以下実施例１と同様の反応を行
なつた。結果は第３図に示される通りである。
実施例 ４
（試薬）
(1) 50ｍＭ Tris−HCl緩衝液PH7.5
(2) ５ｍＭ MgCl2
(3) ５ｍＭ ATP
(4) NMNアデニリルトランスフエラーゼ（イ
ースト由来：18U／ml） (1) 100ｍＭ リン酸緩衝液 PH8.0 (2) アルコールデヒドロゲナーゼ（イースト由
来：240U／ml） (3) 0.01％ NTB (4) ジアホラーゼ（バチルスメガテリウム由
来：240U／ml） (5) 0.8M エタノール (6) 0.1％ トリトンＸ−100 （操作） 試薬0.1mlに0.5〜2.5μMのNMN10μを添加
し、37℃で15分間反応を行ない、反応後37℃に予
備加温した後、試薬を0.1ml添加し、正確に10
分間反応を行ない、2.8mlの0.1NHClを添加し、
反応を停止したのち、550nｍにて比色定量した。
ースト由来：18U／ml） (1) 100ｍＭ リン酸緩衝液 PH8.0 (2) アルコールデヒドロゲナーゼ（イースト由
来：240U／ml） (3) 0.01％ NTB (4) ジアホラーゼ（バチルスメガテリウム由
来：240U／ml） (5) 0.8M エタノール (6) 0.1％ トリトンＸ−100 （操作） 試薬0.1mlに0.5〜2.5μMのNMN10μを添加
し、37℃で15分間反応を行ない、反応後37℃に予
備加温した後、試薬を0.1ml添加し、正確に10
分間反応を行ない、2.8mlの0.1NHClを添加し、
反応を停止したのち、550nｍにて比色定量した。
（結果）
第４図に示される通りで、NMNの濃度と550n
ｍにおける吸光度の間にきわめて良好な直線的関
係が得られた。
ｍにおける吸光度の間にきわめて良好な直線的関
係が得られた。
実施例 ５
（反応液）
(1) 50ｍＭ Tris−HCl緩衝液PH7.5
(2) 20ｍＭ MgCl2
(3) アセテートキナーゼ（大腸菌由来、8U／ml）
(4) 10ｍＭ MgCl2
(5) １ｍＭ NMN
(6) NMNアデニルトラススフエラーゼ（18U／
ml） （操作） 反応液0.2mlを小試験管にとり、各濃度のア
セチルホスフエート溶液10μを添加し、37℃で
20分反応を行なつたのち、実施例１に示した試薬
を0.2ml加え、10分間反応したのち、1.8mlの
0.1NHCl溶液を加えて反応を停止したのち550n
ｍで比色定量した結果、第５図に示す如く良好な
直線が得られた。
ml） （操作） 反応液0.2mlを小試験管にとり、各濃度のア
セチルホスフエート溶液10μを添加し、37℃で
20分反応を行なつたのち、実施例１に示した試薬
を0.2ml加え、10分間反応したのち、1.8mlの
0.1NHCl溶液を加えて反応を停止したのち550n
ｍで比色定量した結果、第５図に示す如く良好な
直線が得られた。
第１図は指示反応系にアルコールデヒドロゲナ
ーゼ、エタノール、ジアホラーゼ、テトラゾリウ
ム塩を用いてなるATPの検量曲線を示し、第２
図は指示反応にグリセロール−３−ホスフエート
デヒドロゲナーゼ、グリセロール−3′−ホスフエ
ート、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩を用いて
なるATPの検量曲線を示し、第３図は指示反応
系にグリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロー
ル、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩を用いてな
るATPの検量曲線を示し、第４図は指示反応系
にアルコールデヒドロゲナーゼ、エタノール、ジ
アホラーゼ、テトラゾリウム塩を用いてなる
NMNの検量曲線を示し、第５図は本発明による
アセチルホスフエートの検量曲線を示す。
ーゼ、エタノール、ジアホラーゼ、テトラゾリウ
ム塩を用いてなるATPの検量曲線を示し、第２
図は指示反応にグリセロール−３−ホスフエート
デヒドロゲナーゼ、グリセロール−3′−ホスフエ
ート、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩を用いて
なるATPの検量曲線を示し、第３図は指示反応
系にグリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロー
ル、ジアホラーゼ、テトラゾリウム塩を用いてな
るATPの検量曲線を示し、第４図は指示反応系
にアルコールデヒドロゲナーゼ、エタノール、ジ
アホラーゼ、テトラゾリウム塩を用いてなる
NMNの検量曲線を示し、第５図は本発明による
アセチルホスフエートの検量曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ATP（アデノシントリホスフエート）および
NMN（ニコチン酸アミドモノヌクレオチド）の
いずれか一成分を含有する被検液に、主反応系に
おいてNMNまたはATP、マグネシウムイオン
の存在下にNMNアデニリルトランスフエラーゼ
を作用させてNADとピロリン酸に変換させ、主
反応の後、生じたNADを、NAD（Ｐ）を補酵素
とする酸化還元反応系と、還元型NAD（Ｐ）を補
酵素とする反応系との組合せによる補酵素サイク
リング反応をおこない、次いでこのサイクリング
反応において生成または消費される成分を定量す
ることを特徴とするATPおよびNMNのいずれ
か一成分を含有する被検液中の成分の高感度測定
法。 ２ ATPが、キナーゼ、ADP（アデノシンジヌ
クレオチド）およびキナーゼ基質用リン化合物の
反応系によつて生成されるATPである特許請求
の範囲第１項記載の高感度測定法。 ３ キナーゼ、ADPおよびキナーゼ基質用リン
化合物の反応系が、クレアチンキナーゼ、ADP
およびクレアチンホスフエートの反応系、ピルベ
ートキナーゼ、ADPおよびホスホエノールピル
ビン酸の反応系、アセテートキナーゼ、ADP、
アセチルホスフエートの反応系、カルバメートキ
ナーゼ、ADPおよびカルバモイルホスフエート
の反応系、アスパルテイトキナーゼ、ADP、４
−ホスホ−Ｌ−アスパルテイトの反応系、ホスホ
グリセレイトキナーゼ、ADP、1.3−ジホスホ−
Ｄ−グリセレイトの反応系、アルギニンキナー
ゼ、ADP、アルギニンホスフエートの反応系、
ミオキナーゼ、ADP、ADPの反応系、またはヌ
クレオサイドモノホスフエートキナーゼ、ADP、
ヌクレオサイドジホスフエートの反応系である特
許請求の範囲第２項記載の高感度測定法。 ４ NMNが下記に示される酵素反応によつて生
成されるNMNである特許請求の範囲第１項記載
の高感度測定法。 ニコチンアミド＋５−ホスホ−α−Ｄ−リボシ ルピロホスフエート ――――――――――――――→ NMNピロホスフオリラーゼNMN＋ピロリン酸 ５ NAD（Ｐ）を補酵素とする酸化還元反応系
が、少なくともNADを消費して還元型NADを生
成する反応を形成するデヒドロゲナーゼおよびそ
の基質による反応系である特許請求の範囲第１項
記載の高感度測定法。 ６ デヒドロゲナーゼおよびその基質が、ラクテ
ートデヒドロゲナーゼおよびＬ−ラクテート、ア
ルコールデヒドロゲナーゼおよびエタノール、グ
リセロールデヒドロゲナーゼおよびグリセロー
ル、グリセロール−３−ホスフエートデヒドロゲ
ナーゼおよびグリセロール−３−ホスフエート、
グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコース、
マレートデヒドロゲナーゼおよびＬ−マレート、
グルタメイトデヒドロゲナーゼおよびＬ−グルタ
メイト、３−α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼおよび３−α−ヒドロキシステロイドの
いずれかの反応系である特許請求の範囲第５項記
載の高感度測定法。 ７ 還元型NAD（Ｐ）を補酵素とする反応系が、
少なくとも還元型NADを消費してNADを生成す
る反応を形成する酸化還元酵素およびその基質よ
りなる反応系である特許請求の範囲第１項記載の
高感度測定法。 ８ 少なくとも還元型NADを消費してNADを生
成する酸化還元酵素およびその基質が、ラクテー
トデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸、アルコー
ルデヒドロゲナーゼおよびアセトアルデヒド、グ
リセロールデヒドロゲナーゼおよびジヒドロキシ
アセトン、グリセロール−３−ホスフエートデヒ
ドロゲナーゼおよびシヒドロキシアセトンホスフ
エート、マレートデヒドロゲナーゼおよびオギザ
ロ酢酸、３−α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼおよび３−ケトステロイドのいずれかの
反応系である特許請求の範囲第７項記載の高感度
測定法。 ９ 少なくとも還元型NADを消費してNADを生
成する反応を形成する酸化還元酵素およびその基
質が、還元型NAD（Ｐ）：受容体酸化還元酵素お
よびその受容体である特許請求の範囲第７項記載
の高感度測定法。 １０ 還元型NAD（Ｐ）：受容体酸化還元酵素お
よびその受容体が、還元型NAD（Ｐ）デヒドロゲ
ナーゼおよびフラビン類、キノン類、２，６−ジ
クロロフエノールインドフエノール、フエリシア
ン化塩、テトラゾリウム塩、チトクロームＣまた
は酸素である特許請求の範囲第９項記載の高感度
測定法。 １１ 還元型NAD（Ｐ）：受容体酸化還元型酵素
およびその基質が、ジアホラーゼおよびテトラゾ
リウム塩である特許請求の範囲第９項記載の高感
度測定法。 １２ 還元型NAD（Ｐ）を補酵素とする反応系
が、電子伝達物質およびテトラゾリウム塩である
特許請求の範囲第１項記載の高感度測定法。 １３ 電子伝達物質が、フエナジン−メタサルフ
エート、メルドーラ・ブルーまたはピロシアニン
である特許請求の範囲第１２項記載の高感度測定
法。 １４ サイクリング反応において、界面活性剤を
添加することからなる特許請求の範囲第１項記載
の高感度測定法。 １５ 界面活性剤が非イオン系界面活性剤である
特許請求の範囲第１４項記載の高感度測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4120283A JPS59166099A (ja) | 1983-03-11 | 1983-03-11 | Ａｔｐまたはｎｍｎの高感度測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4120283A JPS59166099A (ja) | 1983-03-11 | 1983-03-11 | Ａｔｐまたはｎｍｎの高感度測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59166099A JPS59166099A (ja) | 1984-09-19 |
| JPH047200B2 true JPH047200B2 (ja) | 1992-02-10 |
Family
ID=12601828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4120283A Granted JPS59166099A (ja) | 1983-03-11 | 1983-03-11 | Ａｔｐまたはｎｍｎの高感度測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59166099A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE60209943D1 (de) | 2001-11-21 | 2006-05-11 | Unitika Ltd | Visuelle beurteilung erlaubendes atp-messverfahren und reagenz dafür |
| JP5570731B2 (ja) * | 2008-02-28 | 2014-08-13 | 旭化成ファーマ株式会社 | ピロリン酸の測定方法 |
| JP6917239B2 (ja) * | 2017-08-03 | 2021-08-11 | 旭化成ファーマ株式会社 | タンパク質およびその製造方法、タンパク質組成物ならびにそれを用いたｎｍｎの測定方法および測定組成物 |
| US20230131011A1 (en) | 2020-05-25 | 2023-04-27 | Yokogawa Electric Corporation | Detection method of target molecule in specimen and detection kit for target molecule |
-
1983
- 1983-03-11 JP JP4120283A patent/JPS59166099A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59166099A (ja) | 1984-09-19 |
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