JPH0560920B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0560920B2 JPH0560920B2 JP58174117A JP17411783A JPH0560920B2 JP H0560920 B2 JPH0560920 B2 JP H0560920B2 JP 58174117 A JP58174117 A JP 58174117A JP 17411783 A JP17411783 A JP 17411783A JP H0560920 B2 JPH0560920 B2 JP H0560920B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nad
- reaction
- measured
- dehydrogenase
- absorbance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 33
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 30
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 18
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 18
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 17
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims description 13
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 13
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 11
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 11
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 11
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 11
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 claims description 10
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical group COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910001447 ferric ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 2
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims 2
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 48
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 47
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 42
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 40
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 38
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 33
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 33
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 31
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 27
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 27
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 26
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 19
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 17
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 16
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 14
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 12
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 12
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 12
- 150000004697 chelate complex Chemical class 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 10
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 9
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 8
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 8
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 8
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 8
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 8
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 8
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 7
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 6
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 6
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 6
- 229940045189 glucose-6-phosphate Drugs 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- FPFSGDXIBUDDKZ-UHFFFAOYSA-N 3-decyl-2-hydroxycyclopent-2-en-1-one Chemical compound CCCCCCCCCCC1=C(O)C(=O)CC1 FPFSGDXIBUDDKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DHDHJYNTEFLIHY-UHFFFAOYSA-N 4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=NC2=C1C=CC1=C(C=3C=CC=CC=3)C=CN=C21 DHDHJYNTEFLIHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 5
- 239000004368 Modified starch Substances 0.000 description 5
- -1 hydrogen tetrazolium chloride Chemical class 0.000 description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 5
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 6-Phospho-D-gluconate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 4
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 229940120503 dihydroxyacetone Drugs 0.000 description 4
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 3
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108010079870 Sarcosine Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 102000013000 Sarcosine dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 3
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 3
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 3
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 3
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000013522 chelant Chemical class 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 3
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=CC=C1C(N=[N+]1C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FNTOMPCYJCXKDL-UHFFFAOYSA-N 3-(3-hydroxy-4-nitroso-n-propylanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CCC)C1=CC=C(N=O)C(O)=C1 FNTOMPCYJCXKDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010058733 Choline dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100032363 Choline dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 2
- 108030005073 Glycolate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 108010007100 Pulmonary Surfactant-Associated Protein A Proteins 0.000 description 2
- 102100027773 Pulmonary surfactant-associated protein A2 Human genes 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PCNDSIWXTYFWIA-UHFFFAOYSA-L disodium 4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline 4',4''-disulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC(S(=O)(=O)[O-])=CC=C1C1=CC=NC2=C1C=CC1=C(C=3C=CC(=CC=3)S([O-])(=O)=O)C=CN=C21 PCNDSIWXTYFWIA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 125000000018 nitroso group Chemical group N(=O)* 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003109 sodium starch glycolate Polymers 0.000 description 2
- 229940079832 sodium starch glycolate Drugs 0.000 description 2
- 239000008109 sodium starch glycolate Substances 0.000 description 2
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- NFBQIWJDUKFHJP-SQOUGZDYSA-N (2r,3s,4r,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-2-phosphonooxyhexanoic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C(O)=O)OP(O)(O)=O NFBQIWJDUKFHJP-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- MASUWVVNWALEEM-UHFFFAOYSA-M 1-methoxy-5-methylphenazin-5-ium;methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2N=C3C(OC)=CC=CC3=[N+](C)C2=C1 MASUWVVNWALEEM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBUYCZFBVCCYFD-JJYYJPOSSA-N 2-dehydro-D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)C(O)=O VBUYCZFBVCCYFD-JJYYJPOSSA-N 0.000 description 1
- QGZCUOLOTMJILH-UHFFFAOYSA-N 2h-tetrazol-2-ium;bromide Chemical compound [Br-].C1=N[NH+]=NN1 QGZCUOLOTMJILH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OJPYZWGULWNRSE-UHFFFAOYSA-O 3,5-diphenyl-2h-tetrazol-3-ium Chemical class C1=CC=CC=C1C1=[NH+]N(C=2C=CC=CC=2)N=N1 OJPYZWGULWNRSE-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- YRQOYBUTMAVHDJ-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-2-hydroxyanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CC)C1=CC=CC=C1O YRQOYBUTMAVHDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N ADP alpha-D-glucoside Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 108010077078 Creatinase Proteins 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N D-glucono-1,5-lactone Chemical compound OC[C@H]1OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078483 Gluconate 2-dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 101710084369 Lipase 4 Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- UMEAURNTRYCPNR-UHFFFAOYSA-N azane;iron(2+) Chemical compound N.[Fe+2] UMEAURNTRYCPNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXKNCCSPZDCRFD-UHFFFAOYSA-N betaine aldehyde Chemical compound C[N+](C)(C)CC=O SXKNCCSPZDCRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- OEUUFNIKLCFNLN-LLVKDONJSA-N chembl432481 Chemical compound OC(=O)[C@@]1(C)CSC(C=2C(=CC(O)=CC=2)O)=N1 OEUUFNIKLCFNLN-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- MTFJSAGADRTKCI-VMPITWQZSA-N chembl77510 Chemical compound O\N=C\C1=CC=CC=N1 MTFJSAGADRTKCI-VMPITWQZSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229950010030 dl-alanine Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000012209 glucono delta-lactone Nutrition 0.000 description 1
- 229960003681 gluconolactone Drugs 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000797 iron chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229940075525 iron chelating agent Drugs 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- ZHVWWEYETMPAMX-IFKAHUTRSA-N naltriben Chemical compound N1([C@@H]2CC3=CC=C(C=4O[C@@H]5[C@](C3=4)([C@]2(CC=2C3=CC=CC=C3OC=25)O)CC1)O)CC1CC1 ZHVWWEYETMPAMX-IFKAHUTRSA-N 0.000 description 1
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 1
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UKXAGBYRVKMKEA-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid trihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.P(O)(O)(O)=O UKXAGBYRVKMKEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は内因性又は外因性干渉物質の影響を受
けることなく生体液中の成分を容易かつ正確に測
定する方法に関する。 検出系に酵素法を適用して生体液中の目的成分
を測定する方法においては、反応過程に遊離の補
酵素を必要とする脱水素酵素による酵素反応を適
用する場合は、生成する還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸を最終的に電子伝
達体と被還元性発色剤との反応に導き、発色物を
比色定量するか、あるいは、遊離の補酵素を必要
とせず既に酵素蛋白に補酵素をもつ脱水素酵素に
よる酵素反応を適用する場合は、次いで電子伝達
体と被還元性発色剤との反応に導き、同様に発色
物を比色定量することによつて、目的成分の量を
測定することが行なわれる。 血清あるいは血漿中の成分の測定に上述のよう
な酵素法を適用して発色物を比色定量する方法は
従来から数多く診断試薬に応用されている。例え
ば次の反応式で示す方法は、その1例で各反応が
定量的に進行するので、最終のホルマザンの発色
を比色定量すれば成分の測定ができる。 (1) 測定すべき成分→誘導物質 (2) 誘導物質+NAD(P)+脱水素酵素 ―――――→ 酸化型誘導物質+NAD(P)H+H+ (3) NAD(P)H+H++m−PMS→NAD(P)+ +m−PMSH2 (4) m−PMSH2+NTB→m−PMS +ホルマザン(発色) ただし、NTB:テトロゾリウム化合物の一つ、
ニトロテトラゾリウムブルーを表わす。 しかしこの反応系は検体中に存在する干渉物質
の影響を受け易く予めこれを除かないと正確な測
定ができない。もし上記反応(1)の誘導物質と同じ
ものが検体中に干渉物質として存在するときは、
測定すべき成分からの誘導物質と共に反応(2)以下
が進行し、反応(4)のホルマザンの比色定量に正の
誤差を与える。このような干渉物質には、α−ア
ミラーゼ測定における内因性のグルコース、外因
性のマルトース、GOT、GPT測定におけるL−
グルタメート、トリグリセライド測定におけるグ
リセリン等がある。 従来は、このような場合測定すべき成分と干渉
物質を一緒に測定した吸光度から干渉物質のみを
測定した吸光度を差し引くことにより誤差を修正
した。しかしこの方法は操作を二度繰り返さなけ
ればならず煩雑でありしかも試薬の無駄も大き
い。 この様な干渉物質による測定誤差は、酵素蛋白
に補酵素をもつ酸化還元酵素による酵素反応を適
用する場合にも同様に起るため、これら内因性及
び外因性の干渉物質の作用を排除することが重要
な技術的課題となつている。 本発明はこの様な実情に鑑みてなされたもので
あり、その目的は、内因性及び外因性干渉物質の
影響を全く受けずに、生体液中の目的成分を容易
かつ正確に測定する方法を提供することにある。 即ち、本発明の要旨は、酵素法を適用しかつ検
出系に脱水素酵素、電子伝達体及び被還元性発色
剤を用いて生体液中の目的成分を測定する方法に
おいて、予め、目的成分以外に反応系に関与し干
渉作用を有する生体液中の内因性及び外因性の物
質を、目的成分に直接作用する酵素及び被還元性
発色剤の非存在下でしかも少なくとも遊離の補酵
素を必要としない脱水素酵素及びカタラーゼまた
はペルオキシダーゼ及び電子伝達体の存在下で反
応させ水分子あるいは水分子と溶存酸素まで変換
させて消去し、次いで目的成分に直接作用する酵
素および被還元性発色剤を用いて目的成分を測定
することを特徴とする生体液成分の測定方法にあ
る。 本発明で使用する脱水素酵素は、反応過程に遊
離の補酵素を必要とする脱水素酵素であつても、
あるいは遊離の補酵素を必要とせず既に酵素蛋白
に補酵素をもつ脱水素酵素であつてもよい。以下
にそれぞれの具体例を挙げる。 グリセロール脱水素酵素(EC 1・1・1・6) グリセロール+NAD+→ジヒドロキシアセトン +NADH グリセロ・3・リン酸脱水素酵素(EC 1・1・
1・8) グリセロ・3・リン酸+NAD+ →ジヒドロキシアセトンリン酸+NADH グルコース・6・リン酸脱水素酵素(EC 1・
1・1・49) グルコース・6・リン酸+NADP+ →グルコノラクトン・6・リン酸+NADPH グルタミン酸脱水素酵素(EC1・4・1・2,
1・4・1・3,1・4・1・4) L−グルタミン酸+H2O+NAD(P)+→2−オキソ
グルタレイト+NH3+NAD(P)H などがあり、各々、生体液中のトリグリセリド、
α−アミラーゼ活性、トランスアミナーゼ活性の
測定に有用である。 遊離の補酵素を必要としない脱水素酵素: アルコール脱水素酵素(EC 1・1・99・8) 一級アルコール+アクセプター→アルデヒド +還元型アクセプター グリコール酸脱水素酵素(EC 1・1・99.14) グリコール酸+アクセプター→グリオキシル酸 +還元型アクセプター グルコン酸2−脱水素酵素(EC 1・1・99・
3) グルコン酸+アクセプター→2−ケトグルコン酸 +還元型アクセプター コリン脱水素酵素(EC 1・1・99・1) コリン+アクセプター→ベタインアルデヒド +還元型アクセプター ザルコシン脱水素酵素(EC 1・5・99・1) ザルコシン+H2O+アクセプター→グリシン +ホルムアルデヒド+還元型アクセプター などがあり、いずれも電子伝達体の存在下に反応
が進行する。 本発明で使用する電子伝達体としては、フエナ
ジンメトサルフエート又はメトキシフエナジンメ
トサルフエート等のフエナジンメトサルフエート
誘導体、ジアホラーゼ、メルドラブルーなどがあ
る。 本発明で使用する被還元性発色剤としては、3
−(p−インドフエニル)−2−(p−ニトロフエ
ニル)−5−フエニル−2水素テトラゾリウムク
ロライド、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾ
リル)−2,5−ジフエニル−2水素テトラゾリ
ウムブロマイド、3,3′−(3,3′−ジメトキシ
−4,4′−ビフエニレン)−ビス〔2−(p−ニト
ロフエニル)−5−フエニル−2水素テトラゾリ
ウムクロライド〕(通称ニトロテトラゾリウムブ
ルー)、3,3′−(3,3′−ジメトキシ−4,4′−
ビフエニレン)−ビス(2,5−ジフエニル−2
水素テトラゾリウムクロライドなどのテトラゾリ
ウム塩、及び硫酸第2鉄アンモニウム、塩化第二
鉄等の第二鉄イオンとバソフエナンスロリン、バ
ソフエナンスロリンスルホン酸ナトリウム、2−
ピリジルアルドキシム、3−(2−ピリジル)−
5,6−ビス(4−スルフオフエニル)−1,2,
4−トリアジンスルホン酸ナトリウム、オルトフ
エナンスロリン、2−ニトロソ−5−(N−プロ
ピル−N−スルホプロピルアミノ)フエノール
(通称ニトロソ−PSAP)、2−ニトロソ−5−
(N−エチル−N−スルホプロピルアミノ)フエ
ノール、などのキレート剤との組合せなどを用い
ることができ、これらの組成物は使用目的によつ
て適宜選択することができる。 本発明方法を適用する検出系として、被還元性
発色剤として硫酸第2鉄アンモニウムとバソフエ
ナンスロリンスルホン酸ナトリウムを用いた具体
例を挙げる。ここで最終的に得られるキレート複
合物の発色を比色定量することからなる方法は従
来よりあまり例はなく例えばトリグリセリドの定
量法が特開昭54−80192号に記載されており、次
の反応式で示す各反応が定量的に進行するので最
終のキレート複合物の発色を比色定量すれば目的
成分の測定ができる。 (5) 目的成分→生成物 (6) 生成物+NAD(P)++脱水素酵素 ―――――→ 酸化型生成物+NAD(P)H+H+ (7) NAD(P)H+H++2Fe3+電子伝達体 ―――――→ NAD(P)++2Fe2+ (8) Fe2++3(バソフエナンスロリンスルホン酸ナト
リウム)→キレート複合物(発色) もし、上記反応(5)の生成物と同じものが検体中
に干渉物質として存在するときは、目的成分から
の生成物と共に反応(6)以下が進行し反応(8)のキレ
ート複合物の比色定量に正の誤差を与える。 α−アミラーゼの測定における内因性グルコー
ス、外因性マルトースは マルトースα−グルコアミラーゼ ―――――――――――――→ 2(グルコース) グルコース+ATPヘキソキナーゼ ―――――――――→ グルコース・6・リン酸+ADP グルコース・6・リン酸+NAD(P)+グルコース・
6・リン酸脱水素酵素 ――――――――――――――――――――→ 6 ・ホスホグルコン酸+NAD(P)H の反応を介してNBD(P)Hを生じる。 また、トリグリセリド測定における内因性グリ
セロールは、 グリセロール+NAD(P)+グリセロール脱水素酵素 ――――――――――――――→ ジヒドロキシアセトン+NAD(P)H の反応を介してNAD(P)Hを生じる。 GOT、GPT測定におけるL−グルタメート
は、グルタメート脱水素酵素(GLDH)によつ
て L−グルタメート+NAD(P)++H2OGLDH ―――→ NAD(P)H+α−ケトグルタル酸+NH3 の反応を介して、同様にNAD(P)Hを生じる。 これらの各々の目的成分の測定に対応した干渉
物質から生ずるNAD(P)Hは以下の反応により消
去される。 NAD(P)H+H++m−PMS→NAD(P)++m−PMSH
2 m−PMSH2+O2→m−PMS+H2O2 H2O2カタラーゼ ―――――→ H2O+1/2O2 又は {m−PMSH2+1/2O2POD ―――→ m −PMS+H2O ただし、 O2:溶存酸素 H2O2:過酸化水素 を表わす。 該NAD(P)HはNAD(P)+に戻り、またm−PMSH2
はm−PMSに戻る。以下、カタラーゼを使用す
る場合は最終的に水と酸素を生ずるのみであり、
またPODを使用する場合は水を生ずる。したが
つて、続く目的成分の測定の際には干渉物質の影
響は全く除かれている。 すなわち、消去反応を行わせた後硫酸第2鉄ア
ンモニウムとバソフエナンスロリンスルホン酸ナ
トリウム及びα−アミラーゼ測定の場合は、その
基質となる修飾デンプン、トリグリセリドの測定
にはリパーゼ、GOT,GPTの測定ではL−アス
パラギン酸またはL−アラニン、α−ケルグルタ
レートを各々添加すればよい。また、クレアチニ
ンの測定の場合、内因性クレアチンは クレアチン+H2Oクレアチンアミジノヒドロラーゼ ―――――――――――――――――――→ ザルコシン+ウレア ザルコシン+H2O+m−PMSザルコシン脱水素酵素 ―――――――――――――→ グリシン+ホルムアルデヒド+m−PMSH2 の反応を介してm−PMSの存在下にm−PMSH2
を生成する。以下カタラーゼあるいはPODを用
いることにより、上記と同様の反応が進行し、干
渉物質は消去される。続く目的成分の測定に際し
てクレアチニンアミドヒドロラーゼ及び硫酸第2
鉄アンモニウムとバソフエナンスロリンスルホン
酸ナトリウムを添加することにより、 クレアチニン+H2Oクレアチニンアミドヒドロラーゼ ―――――――――――――――――――→ クレアチン クレアチン+H2Oクレアチンアミジノヒドロラーゼ ―――――――――――――――――――→ ザルコシン+ウレア ザルコシン+H2O+m−PMSザルコシン脱水素酵素 ―――――――――――――→ グリシン+ホルムアルデヒド+m−PMSH2 m−PMSH2+2Fe3+→m−PMS+Fe2+ 2Fe2++6−バソフエナンスロリンスルホン酸ナトリウ
ム→キレート複合物(発色) で示される反応を介して正確な測定ができる。 また、前述のテトラゾリウム塩としてニトロテ
トラゾリウムブルーを被還元性発色剤として用い
る(1)〜(4)の検出系においては、測定反応の過程で
干渉作用を示す内因性、外因性物質あるいはその
生成物を脱水素酵素の存在下に酸化してその干渉
能力を失わせると同時にNAD(P)+を還元し生成す
るNAD(P)Hを次にPMSまたはm−PMSの存在
下に酸化しNAD(P)+に戻すと同時にPMS、m−
PMSを還元してPMSH2、m−PMSH2を生ずる。
このものは反応液中の溶存酸素により直に酸化さ
れ元のPMS、m−PMSに戻ると同時に過酸化水
素を生成するが、この過酸化水素はカタラーゼの
作用で分解されて消失する。またペルオキシダー
ゼ(POD)の存在下の場合は溶存酸素により酸
化され元のPMS、m−PMSに戻ると同時に水を
生成する。また、遊離の補酵素を必要としない酸
化還元酵素の場合にもPMSまたはm−PMSを介
して同様に反応が進行する。 このようにして検体中の干渉物質を後に影響を
残すことなく消去した後前述の通り成分の測定を
行なうので、最終段階のホルマザン又はキレート
複合物の発色は成分の量に比例するものとなり正
確な比色定量ができる。なおこの場合には被還元
性発色剤が存在するので最終段階のPMSH2、m
−PMSH2は溶存酸素との反応に優先して定量的
にホルマザン又はキレート複合物の発色を実現す
る。これらのことは、その他に電子伝達体として
ジアホラーゼを用いても同様に行なえ、各組成物
について種々の組み合せが可能である。 本発明の方法は上述のように、酵素反応を適用
して、目的成分より順次定量的に生成する生成物
を最終的に電子伝達体−被還元性発色剤を用いて
測定する。体液中のα−アミラーゼの測定、トラ
ンスアミナーゼの測定、およびグリセリン脱水素
酵素、またはグリセロキナーゼ−グリセロホスフ
エート脱水素酵素によるトリグリセライドの測定
等に適用でき、その効果は顕著である。 次に本発明の方法およびその効果について実施
例、試験例によりさらに詳細に説明する。 なお消去反応の実施を前処理と表現する。 実施例 1 α−アミラーゼの測定 体液中のα−アミラーゼは次の反応系により測
定できる: (1) 修飾デンプンα−アミラーゼ ―――――――――→ 分解デンプン (2) 分解デンプンα−グルコアミラーゼ ―――――――――――――→ グルコース (3) グルコース+ATPヘキソキナーゼ ―――――――――→ グルコース−6−リン酸+ADP (4) グルコース−6−リン酸+NAD(P)+グルコー
ス−6−リン酸脱水素酵素 ――――――――――――――――――――→ 6 −ホスホグルコン酸+NAD(P)H (5) NAD(P)H+2Fe3+m−PMS ―――――→ NAP(P)++2Fe2+ (6) 2Fe2++6(バソフエナンスロリンスルホン
酸ナトリウム)→キレート複合物(発色) ただし、ATP:アデノシリン三リン酸 ADP:アデノシリン二リン酸 を表わす。 反応(6)で生成するキレート複合物の吸光度を測
定し、その結果から、α−アミラーゼの活性値を
計算する。もし生体液中に内因性グルコース、ま
たは、最近盛んに輸液として用いられているマル
トースが干渉物質として存在するときは反応(3)ま
た、反応(2)、(3)により、次いで反応(4)(5)(6)により
キレート複合物が生成するため、α−アミラーゼ
の測定値に正の誤差を与える。 本発明においては、始めに反応(1)の修飾デンプ
ンを加えることなく反応(2)以下を行なわせ内因性
グルコース、およびマルトースは反応(2)、(3)、(4)
により6−ホルホグルコン酸へと代謝させること
によつてグルコースとマルトースは除去する。次
いで反応(5)(6)は鉄キレート剤が存在しないので起
らず次の別反応が進行する。 (7) NAD(P)H+H++m−PMS→NAD(P)+ +m−PMSH2 (8) m−PMSH2+O2→m−PMS+H2O2 (9) H2O2カタラーゼ ―――――→ H2O+1/2O2 (10) m−PMSH2+1/2O2POD ―――→ m−PMS+H2O ただし、O2:溶存酸素 H2O2:過酸化水素 を表わす。 反応(7)〜(10)により干渉物質から生ずるNAD(P)
HはNAD(P)+に戻り、またm−PMSH2はm−
PMSに戻り、カタラーゼを使用する場合は最終
的には水と酸素を生ずるのみであり、またPOD
を使用する場合は水を生ずる。したがつて、続く
成分の測定の際には干渉物質の影響は全く除かれ
ている。すなわち前処理をした後、反応(1)より反
応(6)までを実施すればα−アミラーゼの正確な測
定ができる。 1 試 薬 (1) ATP 5mmol/ NADP+ 0.4mmol/ m−PMS 30μmol/ MgCl2 20mmol/ ヘキソキナーゼ 600u/ グルコース−6−リン酸脱水素酵素
500u/ グルコアミラーゼ 4800u/ POD 10000u/ 牛アルブミン 0.1% を含む100mmol/コハク酸緩衝液(PH8.2) (2) バソフエナンスロリンスルホン酸ナトリウム
10mmol/ ソデイウム・スターチ・グリコレート
7.2mg/ml を含む200mmol/トリエタノールアミン緩
衝液(PH7.0) (3) 硫酸第二鉄アンモニウム 1.25mmol/ クエン酸 5 mmol/ を含む50mmol/トリエタノール緩衝液 PH
6.6 (4) シユウ酸 50mmol/ EDTA−OH 4mmol/ を含む0.1mol/トリエタノールアミン緩
衝液(PH8.6) 2 操作性 試薬(1)2mlに血清検体20μを加え37℃、5分
間保温後、試薬(2)(3)を等溶混和したもの1mlを加
えさらに37℃、5分間保温後に試薬(4)1mlを加え
て、反応を停止した後、波長535nmで吸光度を測
定する。別にα−アミラーゼ活性既知の検体を上
記と同様に操作し、検量線を造り、この検量線よ
り血清検体のα−アミラーゼ活性を求める。 試験例 1 (1) α−アミラーゼ測定におけるグルコースの影
響 血清検体にグルコースを200,400,600,800,
1000mg/dlの濃度で添加した検体について実施例
1により吸光度を測定した。別に同じ検体につい
て本発明の前処理を行なわない方法、すなわち、
試薬(1)2mlと試薬(2)(3)を等溶混和したもの1mlを
混合試薬に検体20μを加えて、37℃、5分間保
温後に試薬(4)1mlを加えて反応を停止した後、吸
光度を測定した。その結果は、次の表に示す。
けることなく生体液中の成分を容易かつ正確に測
定する方法に関する。 検出系に酵素法を適用して生体液中の目的成分
を測定する方法においては、反応過程に遊離の補
酵素を必要とする脱水素酵素による酵素反応を適
用する場合は、生成する還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸を最終的に電子伝
達体と被還元性発色剤との反応に導き、発色物を
比色定量するか、あるいは、遊離の補酵素を必要
とせず既に酵素蛋白に補酵素をもつ脱水素酵素に
よる酵素反応を適用する場合は、次いで電子伝達
体と被還元性発色剤との反応に導き、同様に発色
物を比色定量することによつて、目的成分の量を
測定することが行なわれる。 血清あるいは血漿中の成分の測定に上述のよう
な酵素法を適用して発色物を比色定量する方法は
従来から数多く診断試薬に応用されている。例え
ば次の反応式で示す方法は、その1例で各反応が
定量的に進行するので、最終のホルマザンの発色
を比色定量すれば成分の測定ができる。 (1) 測定すべき成分→誘導物質 (2) 誘導物質+NAD(P)+脱水素酵素 ―――――→ 酸化型誘導物質+NAD(P)H+H+ (3) NAD(P)H+H++m−PMS→NAD(P)+ +m−PMSH2 (4) m−PMSH2+NTB→m−PMS +ホルマザン(発色) ただし、NTB:テトロゾリウム化合物の一つ、
ニトロテトラゾリウムブルーを表わす。 しかしこの反応系は検体中に存在する干渉物質
の影響を受け易く予めこれを除かないと正確な測
定ができない。もし上記反応(1)の誘導物質と同じ
ものが検体中に干渉物質として存在するときは、
測定すべき成分からの誘導物質と共に反応(2)以下
が進行し、反応(4)のホルマザンの比色定量に正の
誤差を与える。このような干渉物質には、α−ア
ミラーゼ測定における内因性のグルコース、外因
性のマルトース、GOT、GPT測定におけるL−
グルタメート、トリグリセライド測定におけるグ
リセリン等がある。 従来は、このような場合測定すべき成分と干渉
物質を一緒に測定した吸光度から干渉物質のみを
測定した吸光度を差し引くことにより誤差を修正
した。しかしこの方法は操作を二度繰り返さなけ
ればならず煩雑でありしかも試薬の無駄も大き
い。 この様な干渉物質による測定誤差は、酵素蛋白
に補酵素をもつ酸化還元酵素による酵素反応を適
用する場合にも同様に起るため、これら内因性及
び外因性の干渉物質の作用を排除することが重要
な技術的課題となつている。 本発明はこの様な実情に鑑みてなされたもので
あり、その目的は、内因性及び外因性干渉物質の
影響を全く受けずに、生体液中の目的成分を容易
かつ正確に測定する方法を提供することにある。 即ち、本発明の要旨は、酵素法を適用しかつ検
出系に脱水素酵素、電子伝達体及び被還元性発色
剤を用いて生体液中の目的成分を測定する方法に
おいて、予め、目的成分以外に反応系に関与し干
渉作用を有する生体液中の内因性及び外因性の物
質を、目的成分に直接作用する酵素及び被還元性
発色剤の非存在下でしかも少なくとも遊離の補酵
素を必要としない脱水素酵素及びカタラーゼまた
はペルオキシダーゼ及び電子伝達体の存在下で反
応させ水分子あるいは水分子と溶存酸素まで変換
させて消去し、次いで目的成分に直接作用する酵
素および被還元性発色剤を用いて目的成分を測定
することを特徴とする生体液成分の測定方法にあ
る。 本発明で使用する脱水素酵素は、反応過程に遊
離の補酵素を必要とする脱水素酵素であつても、
あるいは遊離の補酵素を必要とせず既に酵素蛋白
に補酵素をもつ脱水素酵素であつてもよい。以下
にそれぞれの具体例を挙げる。 グリセロール脱水素酵素(EC 1・1・1・6) グリセロール+NAD+→ジヒドロキシアセトン +NADH グリセロ・3・リン酸脱水素酵素(EC 1・1・
1・8) グリセロ・3・リン酸+NAD+ →ジヒドロキシアセトンリン酸+NADH グルコース・6・リン酸脱水素酵素(EC 1・
1・1・49) グルコース・6・リン酸+NADP+ →グルコノラクトン・6・リン酸+NADPH グルタミン酸脱水素酵素(EC1・4・1・2,
1・4・1・3,1・4・1・4) L−グルタミン酸+H2O+NAD(P)+→2−オキソ
グルタレイト+NH3+NAD(P)H などがあり、各々、生体液中のトリグリセリド、
α−アミラーゼ活性、トランスアミナーゼ活性の
測定に有用である。 遊離の補酵素を必要としない脱水素酵素: アルコール脱水素酵素(EC 1・1・99・8) 一級アルコール+アクセプター→アルデヒド +還元型アクセプター グリコール酸脱水素酵素(EC 1・1・99.14) グリコール酸+アクセプター→グリオキシル酸 +還元型アクセプター グルコン酸2−脱水素酵素(EC 1・1・99・
3) グルコン酸+アクセプター→2−ケトグルコン酸 +還元型アクセプター コリン脱水素酵素(EC 1・1・99・1) コリン+アクセプター→ベタインアルデヒド +還元型アクセプター ザルコシン脱水素酵素(EC 1・5・99・1) ザルコシン+H2O+アクセプター→グリシン +ホルムアルデヒド+還元型アクセプター などがあり、いずれも電子伝達体の存在下に反応
が進行する。 本発明で使用する電子伝達体としては、フエナ
ジンメトサルフエート又はメトキシフエナジンメ
トサルフエート等のフエナジンメトサルフエート
誘導体、ジアホラーゼ、メルドラブルーなどがあ
る。 本発明で使用する被還元性発色剤としては、3
−(p−インドフエニル)−2−(p−ニトロフエ
ニル)−5−フエニル−2水素テトラゾリウムク
ロライド、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾ
リル)−2,5−ジフエニル−2水素テトラゾリ
ウムブロマイド、3,3′−(3,3′−ジメトキシ
−4,4′−ビフエニレン)−ビス〔2−(p−ニト
ロフエニル)−5−フエニル−2水素テトラゾリ
ウムクロライド〕(通称ニトロテトラゾリウムブ
ルー)、3,3′−(3,3′−ジメトキシ−4,4′−
ビフエニレン)−ビス(2,5−ジフエニル−2
水素テトラゾリウムクロライドなどのテトラゾリ
ウム塩、及び硫酸第2鉄アンモニウム、塩化第二
鉄等の第二鉄イオンとバソフエナンスロリン、バ
ソフエナンスロリンスルホン酸ナトリウム、2−
ピリジルアルドキシム、3−(2−ピリジル)−
5,6−ビス(4−スルフオフエニル)−1,2,
4−トリアジンスルホン酸ナトリウム、オルトフ
エナンスロリン、2−ニトロソ−5−(N−プロ
ピル−N−スルホプロピルアミノ)フエノール
(通称ニトロソ−PSAP)、2−ニトロソ−5−
(N−エチル−N−スルホプロピルアミノ)フエ
ノール、などのキレート剤との組合せなどを用い
ることができ、これらの組成物は使用目的によつ
て適宜選択することができる。 本発明方法を適用する検出系として、被還元性
発色剤として硫酸第2鉄アンモニウムとバソフエ
ナンスロリンスルホン酸ナトリウムを用いた具体
例を挙げる。ここで最終的に得られるキレート複
合物の発色を比色定量することからなる方法は従
来よりあまり例はなく例えばトリグリセリドの定
量法が特開昭54−80192号に記載されており、次
の反応式で示す各反応が定量的に進行するので最
終のキレート複合物の発色を比色定量すれば目的
成分の測定ができる。 (5) 目的成分→生成物 (6) 生成物+NAD(P)++脱水素酵素 ―――――→ 酸化型生成物+NAD(P)H+H+ (7) NAD(P)H+H++2Fe3+電子伝達体 ―――――→ NAD(P)++2Fe2+ (8) Fe2++3(バソフエナンスロリンスルホン酸ナト
リウム)→キレート複合物(発色) もし、上記反応(5)の生成物と同じものが検体中
に干渉物質として存在するときは、目的成分から
の生成物と共に反応(6)以下が進行し反応(8)のキレ
ート複合物の比色定量に正の誤差を与える。 α−アミラーゼの測定における内因性グルコー
ス、外因性マルトースは マルトースα−グルコアミラーゼ ―――――――――――――→ 2(グルコース) グルコース+ATPヘキソキナーゼ ―――――――――→ グルコース・6・リン酸+ADP グルコース・6・リン酸+NAD(P)+グルコース・
6・リン酸脱水素酵素 ――――――――――――――――――――→ 6 ・ホスホグルコン酸+NAD(P)H の反応を介してNBD(P)Hを生じる。 また、トリグリセリド測定における内因性グリ
セロールは、 グリセロール+NAD(P)+グリセロール脱水素酵素 ――――――――――――――→ ジヒドロキシアセトン+NAD(P)H の反応を介してNAD(P)Hを生じる。 GOT、GPT測定におけるL−グルタメート
は、グルタメート脱水素酵素(GLDH)によつ
て L−グルタメート+NAD(P)++H2OGLDH ―――→ NAD(P)H+α−ケトグルタル酸+NH3 の反応を介して、同様にNAD(P)Hを生じる。 これらの各々の目的成分の測定に対応した干渉
物質から生ずるNAD(P)Hは以下の反応により消
去される。 NAD(P)H+H++m−PMS→NAD(P)++m−PMSH
2 m−PMSH2+O2→m−PMS+H2O2 H2O2カタラーゼ ―――――→ H2O+1/2O2 又は {m−PMSH2+1/2O2POD ―――→ m −PMS+H2O ただし、 O2:溶存酸素 H2O2:過酸化水素 を表わす。 該NAD(P)HはNAD(P)+に戻り、またm−PMSH2
はm−PMSに戻る。以下、カタラーゼを使用す
る場合は最終的に水と酸素を生ずるのみであり、
またPODを使用する場合は水を生ずる。したが
つて、続く目的成分の測定の際には干渉物質の影
響は全く除かれている。 すなわち、消去反応を行わせた後硫酸第2鉄ア
ンモニウムとバソフエナンスロリンスルホン酸ナ
トリウム及びα−アミラーゼ測定の場合は、その
基質となる修飾デンプン、トリグリセリドの測定
にはリパーゼ、GOT,GPTの測定ではL−アス
パラギン酸またはL−アラニン、α−ケルグルタ
レートを各々添加すればよい。また、クレアチニ
ンの測定の場合、内因性クレアチンは クレアチン+H2Oクレアチンアミジノヒドロラーゼ ―――――――――――――――――――→ ザルコシン+ウレア ザルコシン+H2O+m−PMSザルコシン脱水素酵素 ―――――――――――――→ グリシン+ホルムアルデヒド+m−PMSH2 の反応を介してm−PMSの存在下にm−PMSH2
を生成する。以下カタラーゼあるいはPODを用
いることにより、上記と同様の反応が進行し、干
渉物質は消去される。続く目的成分の測定に際し
てクレアチニンアミドヒドロラーゼ及び硫酸第2
鉄アンモニウムとバソフエナンスロリンスルホン
酸ナトリウムを添加することにより、 クレアチニン+H2Oクレアチニンアミドヒドロラーゼ ―――――――――――――――――――→ クレアチン クレアチン+H2Oクレアチンアミジノヒドロラーゼ ―――――――――――――――――――→ ザルコシン+ウレア ザルコシン+H2O+m−PMSザルコシン脱水素酵素 ―――――――――――――→ グリシン+ホルムアルデヒド+m−PMSH2 m−PMSH2+2Fe3+→m−PMS+Fe2+ 2Fe2++6−バソフエナンスロリンスルホン酸ナトリウ
ム→キレート複合物(発色) で示される反応を介して正確な測定ができる。 また、前述のテトラゾリウム塩としてニトロテ
トラゾリウムブルーを被還元性発色剤として用い
る(1)〜(4)の検出系においては、測定反応の過程で
干渉作用を示す内因性、外因性物質あるいはその
生成物を脱水素酵素の存在下に酸化してその干渉
能力を失わせると同時にNAD(P)+を還元し生成す
るNAD(P)Hを次にPMSまたはm−PMSの存在
下に酸化しNAD(P)+に戻すと同時にPMS、m−
PMSを還元してPMSH2、m−PMSH2を生ずる。
このものは反応液中の溶存酸素により直に酸化さ
れ元のPMS、m−PMSに戻ると同時に過酸化水
素を生成するが、この過酸化水素はカタラーゼの
作用で分解されて消失する。またペルオキシダー
ゼ(POD)の存在下の場合は溶存酸素により酸
化され元のPMS、m−PMSに戻ると同時に水を
生成する。また、遊離の補酵素を必要としない酸
化還元酵素の場合にもPMSまたはm−PMSを介
して同様に反応が進行する。 このようにして検体中の干渉物質を後に影響を
残すことなく消去した後前述の通り成分の測定を
行なうので、最終段階のホルマザン又はキレート
複合物の発色は成分の量に比例するものとなり正
確な比色定量ができる。なおこの場合には被還元
性発色剤が存在するので最終段階のPMSH2、m
−PMSH2は溶存酸素との反応に優先して定量的
にホルマザン又はキレート複合物の発色を実現す
る。これらのことは、その他に電子伝達体として
ジアホラーゼを用いても同様に行なえ、各組成物
について種々の組み合せが可能である。 本発明の方法は上述のように、酵素反応を適用
して、目的成分より順次定量的に生成する生成物
を最終的に電子伝達体−被還元性発色剤を用いて
測定する。体液中のα−アミラーゼの測定、トラ
ンスアミナーゼの測定、およびグリセリン脱水素
酵素、またはグリセロキナーゼ−グリセロホスフ
エート脱水素酵素によるトリグリセライドの測定
等に適用でき、その効果は顕著である。 次に本発明の方法およびその効果について実施
例、試験例によりさらに詳細に説明する。 なお消去反応の実施を前処理と表現する。 実施例 1 α−アミラーゼの測定 体液中のα−アミラーゼは次の反応系により測
定できる: (1) 修飾デンプンα−アミラーゼ ―――――――――→ 分解デンプン (2) 分解デンプンα−グルコアミラーゼ ―――――――――――――→ グルコース (3) グルコース+ATPヘキソキナーゼ ―――――――――→ グルコース−6−リン酸+ADP (4) グルコース−6−リン酸+NAD(P)+グルコー
ス−6−リン酸脱水素酵素 ――――――――――――――――――――→ 6 −ホスホグルコン酸+NAD(P)H (5) NAD(P)H+2Fe3+m−PMS ―――――→ NAP(P)++2Fe2+ (6) 2Fe2++6(バソフエナンスロリンスルホン
酸ナトリウム)→キレート複合物(発色) ただし、ATP:アデノシリン三リン酸 ADP:アデノシリン二リン酸 を表わす。 反応(6)で生成するキレート複合物の吸光度を測
定し、その結果から、α−アミラーゼの活性値を
計算する。もし生体液中に内因性グルコース、ま
たは、最近盛んに輸液として用いられているマル
トースが干渉物質として存在するときは反応(3)ま
た、反応(2)、(3)により、次いで反応(4)(5)(6)により
キレート複合物が生成するため、α−アミラーゼ
の測定値に正の誤差を与える。 本発明においては、始めに反応(1)の修飾デンプ
ンを加えることなく反応(2)以下を行なわせ内因性
グルコース、およびマルトースは反応(2)、(3)、(4)
により6−ホルホグルコン酸へと代謝させること
によつてグルコースとマルトースは除去する。次
いで反応(5)(6)は鉄キレート剤が存在しないので起
らず次の別反応が進行する。 (7) NAD(P)H+H++m−PMS→NAD(P)+ +m−PMSH2 (8) m−PMSH2+O2→m−PMS+H2O2 (9) H2O2カタラーゼ ―――――→ H2O+1/2O2 (10) m−PMSH2+1/2O2POD ―――→ m−PMS+H2O ただし、O2:溶存酸素 H2O2:過酸化水素 を表わす。 反応(7)〜(10)により干渉物質から生ずるNAD(P)
HはNAD(P)+に戻り、またm−PMSH2はm−
PMSに戻り、カタラーゼを使用する場合は最終
的には水と酸素を生ずるのみであり、またPOD
を使用する場合は水を生ずる。したがつて、続く
成分の測定の際には干渉物質の影響は全く除かれ
ている。すなわち前処理をした後、反応(1)より反
応(6)までを実施すればα−アミラーゼの正確な測
定ができる。 1 試 薬 (1) ATP 5mmol/ NADP+ 0.4mmol/ m−PMS 30μmol/ MgCl2 20mmol/ ヘキソキナーゼ 600u/ グルコース−6−リン酸脱水素酵素
500u/ グルコアミラーゼ 4800u/ POD 10000u/ 牛アルブミン 0.1% を含む100mmol/コハク酸緩衝液(PH8.2) (2) バソフエナンスロリンスルホン酸ナトリウム
10mmol/ ソデイウム・スターチ・グリコレート
7.2mg/ml を含む200mmol/トリエタノールアミン緩
衝液(PH7.0) (3) 硫酸第二鉄アンモニウム 1.25mmol/ クエン酸 5 mmol/ を含む50mmol/トリエタノール緩衝液 PH
6.6 (4) シユウ酸 50mmol/ EDTA−OH 4mmol/ を含む0.1mol/トリエタノールアミン緩
衝液(PH8.6) 2 操作性 試薬(1)2mlに血清検体20μを加え37℃、5分
間保温後、試薬(2)(3)を等溶混和したもの1mlを加
えさらに37℃、5分間保温後に試薬(4)1mlを加え
て、反応を停止した後、波長535nmで吸光度を測
定する。別にα−アミラーゼ活性既知の検体を上
記と同様に操作し、検量線を造り、この検量線よ
り血清検体のα−アミラーゼ活性を求める。 試験例 1 (1) α−アミラーゼ測定におけるグルコースの影
響 血清検体にグルコースを200,400,600,800,
1000mg/dlの濃度で添加した検体について実施例
1により吸光度を測定した。別に同じ検体につい
て本発明の前処理を行なわない方法、すなわち、
試薬(1)2mlと試薬(2)(3)を等溶混和したもの1mlを
混合試薬に検体20μを加えて、37℃、5分間保
温後に試薬(4)1mlを加えて反応を停止した後、吸
光度を測定した。その結果は、次の表に示す。
【表】
上の表が示すように、内因性グルコースに対す
る前処理を行なわない場合は、グルコースによ
り、かなりの影響を受け、結果として、α−アミ
ラーゼ活性を測定しているとはいえない。本発明
によれば、1000mg/dlの高濃度のグルコースによ
つても影響を受けずにα−アミラーゼ活性を正確
に測定できる。 (2) 本発明方法のα−アミラーゼ活性濃度と吸光
度との関係 実施例1の方法により、α−アミラーゼ活性の
濃度系列について吸光度を測定した結果を第1図
に示す。 この図が示すようにα−アミラーゼ活性の濃度
と吸光度とは、直線関係を示し、正しく、α−ア
ミラーゼ活性を測定できることが分る。 実施例 2 トリグリセリドの測定 体液中のトリグリセリドは次の反応系により測
定できる。 (1) トリグリセリドリパーゼ ―――――→ グリセロール+脂肪酸 (2) グリセロール+NAD(P)+グリセロール脱水素酵素 ――――――――――――――→ ジヒドロキシアセトン+NAD(P)H (3) NAD(P)H+2Fe3+ジアホラーゼ ――――――→ NAD(P)++2Fe2+ (4) 2Fe2++8(Nitroso PSAP) →キレート複合物(発色) 上述の反応で生成するキレート複合物の吸光度
を測定しその結果からトリグリセリド値を算出す
る。 生体液中の内因性グリセロールあるいは透析患
者に用いられるグリセロールが干渉物質として存
在するときは測定値に正の誤差を与える。 本発明においては、始めにグリセロールをグリ
セロール脱水素酵素とNAD(P)+の反応により、ジ
ヒドロキシアセトンへと代謝させることによりグ
リセロールは除去する。ついで生成したNAD(P)
Hの除去はジアホラーゼとペルオキシダーゼによ
り実施例1でのm−PMSとペルキオキシダーゼ
の反応の場合と同様に行なわれ干渉物質であるグ
リセロールは消去される。 次いでリバーゼおよび鉄キレート剤を含む試薬
を添加し、トリグリセリドを正確に測定すること
ができる。 1 試 薬 (1) NAD+ 40mmol ジアホラーゼ 4000u/ ペルオキシダーゼ 80mg/ グリセロール脱水素酵素 20000u/ 牛アルブミン 1g/ を含む100mmol/トリエタノールアミン
緩衝液(PH7.8) (2) Nitroso PSAP 10mmol/ を含む100mmol/トリエタノールアミン
緩衝液(PH7.8) (3) シユウ酸 20mmol/ 硫酸第二鉄アンモニウム 10mmol/ リパーゼ 4×105u/ を含む100mmol/トリエタノールアミン
緩衝液(PH7.2) (4) EDTA 4mmol/ を含む100mmol/トリエタノールアミン
緩衝液(PH8.6) 2 操作法 試薬(1)500μに血清検体5μを加え、37℃10
分間保温後に試薬(2)、(3)各々250μを加えさら
に37℃、20分間保温後に試薬(4)mlを加えて反応を
停止した後、波長750nmで吸光度を測定する。別
に、グリセロール既知の検体を上記と同様に操作
し、検量線を造り、この検量線より血清検体のト
リグリセリド量を求める。 試験例 2 (1) トリグリセリド測定におけるグリセロールの
影響 血清検体にグリセロールを20,40,60,80,
100mg/dlの濃度で添加した検体について、実施
例2により吸光度を測定した。別に同じ検体につ
いて、本発明の前処理を行なわない方法、即ち、
試薬(1)500μと試薬(2)(3)各々250μの混合試薬
に検体5μを加えて、37℃20分間保温後に試薬
(4)4mlを加えて反応停止した後、吸光度を測定し
た。その結果は次の表に示す。
る前処理を行なわない場合は、グルコースによ
り、かなりの影響を受け、結果として、α−アミ
ラーゼ活性を測定しているとはいえない。本発明
によれば、1000mg/dlの高濃度のグルコースによ
つても影響を受けずにα−アミラーゼ活性を正確
に測定できる。 (2) 本発明方法のα−アミラーゼ活性濃度と吸光
度との関係 実施例1の方法により、α−アミラーゼ活性の
濃度系列について吸光度を測定した結果を第1図
に示す。 この図が示すようにα−アミラーゼ活性の濃度
と吸光度とは、直線関係を示し、正しく、α−ア
ミラーゼ活性を測定できることが分る。 実施例 2 トリグリセリドの測定 体液中のトリグリセリドは次の反応系により測
定できる。 (1) トリグリセリドリパーゼ ―――――→ グリセロール+脂肪酸 (2) グリセロール+NAD(P)+グリセロール脱水素酵素 ――――――――――――――→ ジヒドロキシアセトン+NAD(P)H (3) NAD(P)H+2Fe3+ジアホラーゼ ――――――→ NAD(P)++2Fe2+ (4) 2Fe2++8(Nitroso PSAP) →キレート複合物(発色) 上述の反応で生成するキレート複合物の吸光度
を測定しその結果からトリグリセリド値を算出す
る。 生体液中の内因性グリセロールあるいは透析患
者に用いられるグリセロールが干渉物質として存
在するときは測定値に正の誤差を与える。 本発明においては、始めにグリセロールをグリ
セロール脱水素酵素とNAD(P)+の反応により、ジ
ヒドロキシアセトンへと代謝させることによりグ
リセロールは除去する。ついで生成したNAD(P)
Hの除去はジアホラーゼとペルオキシダーゼによ
り実施例1でのm−PMSとペルキオキシダーゼ
の反応の場合と同様に行なわれ干渉物質であるグ
リセロールは消去される。 次いでリバーゼおよび鉄キレート剤を含む試薬
を添加し、トリグリセリドを正確に測定すること
ができる。 1 試 薬 (1) NAD+ 40mmol ジアホラーゼ 4000u/ ペルオキシダーゼ 80mg/ グリセロール脱水素酵素 20000u/ 牛アルブミン 1g/ を含む100mmol/トリエタノールアミン
緩衝液(PH7.8) (2) Nitroso PSAP 10mmol/ を含む100mmol/トリエタノールアミン
緩衝液(PH7.8) (3) シユウ酸 20mmol/ 硫酸第二鉄アンモニウム 10mmol/ リパーゼ 4×105u/ を含む100mmol/トリエタノールアミン
緩衝液(PH7.2) (4) EDTA 4mmol/ を含む100mmol/トリエタノールアミン
緩衝液(PH8.6) 2 操作法 試薬(1)500μに血清検体5μを加え、37℃10
分間保温後に試薬(2)、(3)各々250μを加えさら
に37℃、20分間保温後に試薬(4)mlを加えて反応を
停止した後、波長750nmで吸光度を測定する。別
に、グリセロール既知の検体を上記と同様に操作
し、検量線を造り、この検量線より血清検体のト
リグリセリド量を求める。 試験例 2 (1) トリグリセリド測定におけるグリセロールの
影響 血清検体にグリセロールを20,40,60,80,
100mg/dlの濃度で添加した検体について、実施
例2により吸光度を測定した。別に同じ検体につ
いて、本発明の前処理を行なわない方法、即ち、
試薬(1)500μと試薬(2)(3)各々250μの混合試薬
に検体5μを加えて、37℃20分間保温後に試薬
(4)4mlを加えて反応停止した後、吸光度を測定し
た。その結果は次の表に示す。
【表】
上の表が示すように、前処理によるグリセロー
ル消去の有無はトリグリセリド測定に大きな影響
を与える。 (2) 本発明方法のトリグリセリド濃度と吸光度と
の関係 実施例2の方法により、トリグリセリドの濃度
系列について吸光度を測定した結果を第2図に示
す。この図が示すように、トリグリセリド濃度と
吸光度はとは直線関係を示し、正しくトリグリセ
リド濃度を測定できることが分る。 実施例 3 グルタメートオキザルアセテート転移酵素
(GOT)およびグルタメートピルベート転移酵
素(GPT)の測定 体液中のGOT、GPTはグルタメート脱水素酵
素(GLDH)を用い次の反応系により測定でき
る。 1 α−ケトグルタレート+L−アスパラギン酸GOT ―――→ L−グルタメート+オキサル酢酸 2 α−ケトグルタレート+L−アラニンGPT ―――→ L−グルタメート+ピルビン酸 3 L−グルタメート+NAD(P)++H2OGLDH ――――→ NAD(P)H+α−ケトグルタレート+NH3 4 NAD(P)H+NTBm−PMS又はジアホラーゼ ――――――――――――――――→ NAD(P)+ホルマザン 上述の反応で生成するホルマザンの吸光度を測
定し、その結果からGOT、GPTの活性値を計算
する。 血清あるいは血漿中に干渉物質として存在する
L−グルタメートはGLDHと反応し、NAD(P)H
を生成するため、GOTあるいはGPTの測定値に
正の誤差を与える。 本発明においては始めに内因性L−グルタメー
トをGLDHとNAD(P)+の反応により、α−ケト
グルタレートに転化することによつて除去する。
次いで、生成したNAD(P)Hの除去については実
施例1で述べたのと全く同様に行なわれ干渉物質
であるL−グルタメートは消侭される。 次いで、L−アスパラギン酸またはL−アラニ
ン、α−ケトグルタレートおよびNTBを含む試
薬を添加し、トランスアミナーゼ(GOT、
GPT)活性を正確に測定することができる。 1 試 薬 (1) カタラーゼ 10000u/ グルタメート脱水素酵素 40000u/ NAD+ 46mmol/ m−PMS100μmol/又はジアホラーゼ
4000u/ を含む100mmol/リン酸緩衝液(PH7.8) (2) GPT測定用 DL−アラニン 800mmol/ α−ケトグルタレート 11mmol/ NTB 1.0mmol/ を含む100mmol/リン酸緩衝液(PH7.8) GOT測定用 L−アスパラギン酸 400mmol/ α−ケトグルタレート 16mmol/ NTB 1.0mmol/ を含む100mmol/リン酸緩衝液(PH7.8) (3) トリトンX−100 0.1%を含む0.1N−HCl溶
液 2 操作法 試薬(1)250μに血清検体20μを加え、37℃、
10分間保温後に、試薬(2)250μを加え、さらに
37℃、30分間保温後に、試薬(3)3mlを加えて反応
を停止した後、波長560nmで吸光度を測定する。 別に、GOT、GPT活性既知の検体を上記と同
様に操作し、検量線を造り、この検量線より、血
清検体のGOT、GPT活性を求める。 試験例 3 (1) GOT、GPT測定におけるL−グルタメート
の影響 血清検体にL−グルタメートを20,40,60,
80,100mg/dlの濃度で添加した検体について、
実施例2により、吸光度を測定した。別に同じ検
体について、本発明の前処理を行なわない方法
法、即ち試薬(1)250μと試薬(2)250μの混合試
薬に検体20μを加えて、37℃、30分間保温後に
試薬(3)3mlを加えて反応停止した後、吸光度を測
定した。その結果は、次の表に示す。
ル消去の有無はトリグリセリド測定に大きな影響
を与える。 (2) 本発明方法のトリグリセリド濃度と吸光度と
の関係 実施例2の方法により、トリグリセリドの濃度
系列について吸光度を測定した結果を第2図に示
す。この図が示すように、トリグリセリド濃度と
吸光度はとは直線関係を示し、正しくトリグリセ
リド濃度を測定できることが分る。 実施例 3 グルタメートオキザルアセテート転移酵素
(GOT)およびグルタメートピルベート転移酵
素(GPT)の測定 体液中のGOT、GPTはグルタメート脱水素酵
素(GLDH)を用い次の反応系により測定でき
る。 1 α−ケトグルタレート+L−アスパラギン酸GOT ―――→ L−グルタメート+オキサル酢酸 2 α−ケトグルタレート+L−アラニンGPT ―――→ L−グルタメート+ピルビン酸 3 L−グルタメート+NAD(P)++H2OGLDH ――――→ NAD(P)H+α−ケトグルタレート+NH3 4 NAD(P)H+NTBm−PMS又はジアホラーゼ ――――――――――――――――→ NAD(P)+ホルマザン 上述の反応で生成するホルマザンの吸光度を測
定し、その結果からGOT、GPTの活性値を計算
する。 血清あるいは血漿中に干渉物質として存在する
L−グルタメートはGLDHと反応し、NAD(P)H
を生成するため、GOTあるいはGPTの測定値に
正の誤差を与える。 本発明においては始めに内因性L−グルタメー
トをGLDHとNAD(P)+の反応により、α−ケト
グルタレートに転化することによつて除去する。
次いで、生成したNAD(P)Hの除去については実
施例1で述べたのと全く同様に行なわれ干渉物質
であるL−グルタメートは消侭される。 次いで、L−アスパラギン酸またはL−アラニ
ン、α−ケトグルタレートおよびNTBを含む試
薬を添加し、トランスアミナーゼ(GOT、
GPT)活性を正確に測定することができる。 1 試 薬 (1) カタラーゼ 10000u/ グルタメート脱水素酵素 40000u/ NAD+ 46mmol/ m−PMS100μmol/又はジアホラーゼ
4000u/ を含む100mmol/リン酸緩衝液(PH7.8) (2) GPT測定用 DL−アラニン 800mmol/ α−ケトグルタレート 11mmol/ NTB 1.0mmol/ を含む100mmol/リン酸緩衝液(PH7.8) GOT測定用 L−アスパラギン酸 400mmol/ α−ケトグルタレート 16mmol/ NTB 1.0mmol/ を含む100mmol/リン酸緩衝液(PH7.8) (3) トリトンX−100 0.1%を含む0.1N−HCl溶
液 2 操作法 試薬(1)250μに血清検体20μを加え、37℃、
10分間保温後に、試薬(2)250μを加え、さらに
37℃、30分間保温後に、試薬(3)3mlを加えて反応
を停止した後、波長560nmで吸光度を測定する。 別に、GOT、GPT活性既知の検体を上記と同
様に操作し、検量線を造り、この検量線より、血
清検体のGOT、GPT活性を求める。 試験例 3 (1) GOT、GPT測定におけるL−グルタメート
の影響 血清検体にL−グルタメートを20,40,60,
80,100mg/dlの濃度で添加した検体について、
実施例2により、吸光度を測定した。別に同じ検
体について、本発明の前処理を行なわない方法
法、即ち試薬(1)250μと試薬(2)250μの混合試
薬に検体20μを加えて、37℃、30分間保温後に
試薬(3)3mlを加えて反応停止した後、吸光度を測
定した。その結果は、次の表に示す。
【表】
上の表が示すように、内因性L−グルタメート
に対する前処理を行なわない場合は、L−グルタ
メートにより、かなりの影響を受け、結果とし
て、GOT、GPT活性を測定しているとはいえな
い。本発明によれば、100mg/dlの高濃度のL−
グルタメートによつても影響を受けずに、GOT、
GPT活性を正確に測定できる。 (2) 本発明方法のGOT、GPT活性濃度と吸光度
との関係 実施例3の方法により、GOT、GPT活性の濃
度系列について吸光度を測定した結果を第3図に
示す。 この図が示すように、GOT、GPT活性の濃度
と吸光度とは、直線関係を示し、正しくGOT、
GPT活性を測定できることが分つた。 実施例 4 α−アミラーゼの測定 体液中のα−アミラーゼは次の反応系により測
定できる: (1) 修飾デンプンα−アミラーゼ ―――――――――→ 分解デンプン (2) 分解デンプンα−グルコアミラーゼ ―――――――――――――→ グルコース (3) グルコース+ATPヘキソキナーゼ ―――――――――→ グルコース−6−リン酸+ADP (4) グルコース−6−リン酸+NAD(P)+グルコース−6
−リン酸脱水素酵素 ――――――――――――――――――――→ 6 −ホスホグルコン酸+NAD(P)H (5) NAD(P)H+NTBm−PMS又はジアホラーゼ ――――――――――――――――→ NAD(P)++ホルマザン ただし、ATP:アデノシン三リン酸 ADT:アデノシン二リン酸 NTB:ニトロテトラゾリウムブルー
(テトラゾリウム化合物) を表わす。 反応(5)で生成するホルマザンの吸光度を測定
し、その結果から、α−アミラーゼの活性値を計
算する。もし生体液中に内因性グルコース、また
は、最近盛んに輸液として用いられているマルト
ースが干渉物質として存在するときは反応(3)また
は、反応(2)、(3)により、次いで反応(4)、(5)により
ホルマザンが生成するため、α−アミラーゼの測
定値に正の誤差を与える。 本発明においては、始めに反応(1)の修飾デンプ
ンを加えることなく反応(2)以下を行なわせ内因性
グルコース、およびマルトースは反応(2)、(3)、(4)
により6−ホスホグルコン酸へと代謝させること
によつてグルコースとマルトースは除去する。次
いで反応(5)はNTBが存在しないので起らず次の
別反応が進行する。 (6) NAD(P)H+H++m−PMS→NAD(P)+ +m−PMSH2 (7) m−PMSH2+O2→m−PMS+H2O2 (8) H2O2カタラーゼ ―――――→ H2O+1/2O2 (9) m−PMSH2+1/2O2POD ―――→ m−PMS+H2O ただし、O2:溶存酸素 H2O2:過酸化水素 を表わす。 又は、 (6′) NAD(P)H+H++O2カタラーゼ ――――――→ ジアホラーゼNAD(P)++1/2O2+H2O (7′) NAD(P)H+H++1/2O2POD ――――――→ ジアホラーゼNAD(P)++H2O 反応(6)〜(9)又は(6′)及び(7′)により干渉物質から
生ずるNAD(P)HはNAD(P)+に戻り、カタラーゼ
を使用する場合は最終的には水と酸素を生ずるの
みであり、またPODを使用する場合は水を生ず
る。したがつて、続く成分の測定の際には干渉物
質の影響は全く除かれている。すなわち前処理を
した後、反応(1)より反応(5)までを実施すればα−
アミラーゼの正確な測定ができる。 1 試 薬 (1) ATP 5mmol/ NADP+ 0.4mmol/ m−PMS30μmol/又はジアホラーゼ
2000u/ MgCl2 20mmol/ ヘキナーゼ 600u/ グルコース−6−リン酸脱水素酵素
500u/ グルコアミラーゼ 4800u/ POD 10000u/ 牛アルブミン 0.1% を含む100mmol/コハク酸緩衝液(PH8.2) (2) NTB 3mmol/ トリトンX−100 1% ソジウム・スターチ・グリコレート
7.2mg/ml を含む40mmolコンク酸緩衝液(PH6.4) (3) トリトンX−100 0.33% を含む0.6NHCl溶液 2 操作法 試薬(1)2mlに血清検体20μを加え37℃、5分
間保温後、試薬(2)1mlを加え、さらに37℃、5分
間保温後に試薬(3)1mlを加えて、反応を停止した
後、波長600nmで吸光度を測定する。別にα−ア
ミラーゼ活性既知の検体を上記と同様に操作し、
検量線を造り、この検量線より血清検体のα−ア
ミラーゼ活性を求める。 試験例 4 (1) α−アミラーゼ測定におけるグルコースの影
響 血清検体にグルコースを200,400,600,800,
1000mg/dlの濃度で添加した検体について実施例
1により吸光度を測定した。別に同じ検体につい
て本発明の前処理を行なわない方法、すなわち、
試薬(1)2mlと試薬(2)1mlの混合試薬に検体20μ
を加えて、37℃、5分間保温後に試薬(3)1mlを加
えて反応を停止した後、吸光度を測定した。その
結果は、次の表に示す。
に対する前処理を行なわない場合は、L−グルタ
メートにより、かなりの影響を受け、結果とし
て、GOT、GPT活性を測定しているとはいえな
い。本発明によれば、100mg/dlの高濃度のL−
グルタメートによつても影響を受けずに、GOT、
GPT活性を正確に測定できる。 (2) 本発明方法のGOT、GPT活性濃度と吸光度
との関係 実施例3の方法により、GOT、GPT活性の濃
度系列について吸光度を測定した結果を第3図に
示す。 この図が示すように、GOT、GPT活性の濃度
と吸光度とは、直線関係を示し、正しくGOT、
GPT活性を測定できることが分つた。 実施例 4 α−アミラーゼの測定 体液中のα−アミラーゼは次の反応系により測
定できる: (1) 修飾デンプンα−アミラーゼ ―――――――――→ 分解デンプン (2) 分解デンプンα−グルコアミラーゼ ―――――――――――――→ グルコース (3) グルコース+ATPヘキソキナーゼ ―――――――――→ グルコース−6−リン酸+ADP (4) グルコース−6−リン酸+NAD(P)+グルコース−6
−リン酸脱水素酵素 ――――――――――――――――――――→ 6 −ホスホグルコン酸+NAD(P)H (5) NAD(P)H+NTBm−PMS又はジアホラーゼ ――――――――――――――――→ NAD(P)++ホルマザン ただし、ATP:アデノシン三リン酸 ADT:アデノシン二リン酸 NTB:ニトロテトラゾリウムブルー
(テトラゾリウム化合物) を表わす。 反応(5)で生成するホルマザンの吸光度を測定
し、その結果から、α−アミラーゼの活性値を計
算する。もし生体液中に内因性グルコース、また
は、最近盛んに輸液として用いられているマルト
ースが干渉物質として存在するときは反応(3)また
は、反応(2)、(3)により、次いで反応(4)、(5)により
ホルマザンが生成するため、α−アミラーゼの測
定値に正の誤差を与える。 本発明においては、始めに反応(1)の修飾デンプ
ンを加えることなく反応(2)以下を行なわせ内因性
グルコース、およびマルトースは反応(2)、(3)、(4)
により6−ホスホグルコン酸へと代謝させること
によつてグルコースとマルトースは除去する。次
いで反応(5)はNTBが存在しないので起らず次の
別反応が進行する。 (6) NAD(P)H+H++m−PMS→NAD(P)+ +m−PMSH2 (7) m−PMSH2+O2→m−PMS+H2O2 (8) H2O2カタラーゼ ―――――→ H2O+1/2O2 (9) m−PMSH2+1/2O2POD ―――→ m−PMS+H2O ただし、O2:溶存酸素 H2O2:過酸化水素 を表わす。 又は、 (6′) NAD(P)H+H++O2カタラーゼ ――――――→ ジアホラーゼNAD(P)++1/2O2+H2O (7′) NAD(P)H+H++1/2O2POD ――――――→ ジアホラーゼNAD(P)++H2O 反応(6)〜(9)又は(6′)及び(7′)により干渉物質から
生ずるNAD(P)HはNAD(P)+に戻り、カタラーゼ
を使用する場合は最終的には水と酸素を生ずるの
みであり、またPODを使用する場合は水を生ず
る。したがつて、続く成分の測定の際には干渉物
質の影響は全く除かれている。すなわち前処理を
した後、反応(1)より反応(5)までを実施すればα−
アミラーゼの正確な測定ができる。 1 試 薬 (1) ATP 5mmol/ NADP+ 0.4mmol/ m−PMS30μmol/又はジアホラーゼ
2000u/ MgCl2 20mmol/ ヘキナーゼ 600u/ グルコース−6−リン酸脱水素酵素
500u/ グルコアミラーゼ 4800u/ POD 10000u/ 牛アルブミン 0.1% を含む100mmol/コハク酸緩衝液(PH8.2) (2) NTB 3mmol/ トリトンX−100 1% ソジウム・スターチ・グリコレート
7.2mg/ml を含む40mmolコンク酸緩衝液(PH6.4) (3) トリトンX−100 0.33% を含む0.6NHCl溶液 2 操作法 試薬(1)2mlに血清検体20μを加え37℃、5分
間保温後、試薬(2)1mlを加え、さらに37℃、5分
間保温後に試薬(3)1mlを加えて、反応を停止した
後、波長600nmで吸光度を測定する。別にα−ア
ミラーゼ活性既知の検体を上記と同様に操作し、
検量線を造り、この検量線より血清検体のα−ア
ミラーゼ活性を求める。 試験例 4 (1) α−アミラーゼ測定におけるグルコースの影
響 血清検体にグルコースを200,400,600,800,
1000mg/dlの濃度で添加した検体について実施例
1により吸光度を測定した。別に同じ検体につい
て本発明の前処理を行なわない方法、すなわち、
試薬(1)2mlと試薬(2)1mlの混合試薬に検体20μ
を加えて、37℃、5分間保温後に試薬(3)1mlを加
えて反応を停止した後、吸光度を測定した。その
結果は、次の表に示す。
【表】
上の表が示すように、内因性グルコースに対す
る前処理を行なわない場合は、グルコースによ
り、かなりの影響を受け、結果として、α−アミ
ラーゼ活性を測定しているとはいえない。本発明
によれば、1000mg/dlの高濃度のグルコースによ
つても影響を受けずにα−アミラーゼ活性を正確
に測定できる。 (2) 本発明方法のα−アミラーゼ活性濃度と吸光
度との関係 実施例4の方法により、α−アミラーゼ活性の
濃度系列について吸光度を測定した結果を第4図
に示す。 この図が示すようにα−アミラーゼ活性の濃度
と吸光度とは、直線関係を示し、正しく、α−ア
ミラーゼ活性を測定できることが分る。 実施例 5 クレアチニンの測定 体液中のクレアチニンは次の反応系により測定
できる。 (1) クレアチニン+H2Oクレアチニンアミドヒドロラー
ゼ ―――――――――――――――――――→ クレアチン (2) クレアチン+H2Oクレアチンアミジノヒドロラーゼ ――――――――――――――――――→ ザルコシン+ウレア (3) ザルコシン+H2O+m−PMSザルコシン脱水素酵素 ―――――――――――――→ グリシン+ホルムアルデヒド+m−PMSH2 (4) m−PMSH2+2Fe3+→m−PMS+2Fe2+ (5) 2Fe2++8PDTS→キレート複合物(発色) ただし、PDTSは3−(2−ピリジル)−5,6
−ビス(4−スルフオフエニル)1,2,4−ト
リアジンスルホン酸ナトリウム を表す。上述の反応により生成するキレート複合
物の吸光度を測定し、その結果からクレアチニン
量を算出する。 生体液中に内因性のクレアチンが干渉物質とし
て存在するときは、測定値に正の誤差を与える。
本発明においては、はじめにクレアチニンアミド
ヒドロラーゼ及び第二鉄イオン非存在下にクレア
チンを反応(2)と(3)によりグリシンとホルムアルデ
ヒドへと代謝させる。この時生成されるm−
PMSH2は溶存酸素を電子受容体として以下の反
応式(6)に示したように反応する。 (6) m−PMSH2+O2→m−PMS+H2O2 したがつて、カタラーゼあるいはペルオキシダ
ーゼを予め添加しておけば、先の実施例1と同様
にm−PMSH2はm−PMSに戻り、カタラーゼを
使用する場合は最終的には水と酸素を生ずるのみ
であり、またペルオキシダーゼを使用する場合は
水を生ずる。このことから続く成分の測定の際に
は干渉物質の影響は全く除かれている。すなわ
ち、前処理をした後、反応(1)より(5)までを実施す
ればクレアチニンの正確な測定が可能となる。 1 試薬 (1)クレアチンアミジノヒドロラーゼ 244U/ml ザルコシン脱水素酵素 2U/ml PDTS 10mmol/ m−PMS 240μmol/ を含む20mmol/トリス塩酸緩衝液(PH8.3) (2)クレアチニンアミドヒドロラーゼ 70U/ml 硫酸第二鉄アンモニウム 0.55mmol/ シユウ酸 37mmol/ を含む100mmol/トリエタノールアミン緩
衝液(PH7.5) 2 操作法 試薬(1)200μに血清検体20μを加え37℃、5
分間保温後、試薬(2)200μを加え、さらに37℃、
5分間保温し、波長570nmでの吸光度を測定す
る。別にクレアチニン含量既知の検体を上記と同
様に操作して検量線を作成し、この検量線より血
清検体のクレアチニン量を求める。 試験例 5 (1) クレアチニン測定におけるクレアチニンの影
響 血清検体にクレアチンを4,8,12,16,20
mg/dlの濃度で添加した検体について実施例5に
したがつて測定を行つた。別に同じ検体について
本発明の前処理を行わない方法、すなわち、試薬
(1)200μと試薬(2)200μの混合試薬に検体20μ
を加えて、37℃、5分間保温後に吸光度を測定し
た。その結果は、次表に示す。
る前処理を行なわない場合は、グルコースによ
り、かなりの影響を受け、結果として、α−アミ
ラーゼ活性を測定しているとはいえない。本発明
によれば、1000mg/dlの高濃度のグルコースによ
つても影響を受けずにα−アミラーゼ活性を正確
に測定できる。 (2) 本発明方法のα−アミラーゼ活性濃度と吸光
度との関係 実施例4の方法により、α−アミラーゼ活性の
濃度系列について吸光度を測定した結果を第4図
に示す。 この図が示すようにα−アミラーゼ活性の濃度
と吸光度とは、直線関係を示し、正しく、α−ア
ミラーゼ活性を測定できることが分る。 実施例 5 クレアチニンの測定 体液中のクレアチニンは次の反応系により測定
できる。 (1) クレアチニン+H2Oクレアチニンアミドヒドロラー
ゼ ―――――――――――――――――――→ クレアチン (2) クレアチン+H2Oクレアチンアミジノヒドロラーゼ ――――――――――――――――――→ ザルコシン+ウレア (3) ザルコシン+H2O+m−PMSザルコシン脱水素酵素 ―――――――――――――→ グリシン+ホルムアルデヒド+m−PMSH2 (4) m−PMSH2+2Fe3+→m−PMS+2Fe2+ (5) 2Fe2++8PDTS→キレート複合物(発色) ただし、PDTSは3−(2−ピリジル)−5,6
−ビス(4−スルフオフエニル)1,2,4−ト
リアジンスルホン酸ナトリウム を表す。上述の反応により生成するキレート複合
物の吸光度を測定し、その結果からクレアチニン
量を算出する。 生体液中に内因性のクレアチンが干渉物質とし
て存在するときは、測定値に正の誤差を与える。
本発明においては、はじめにクレアチニンアミド
ヒドロラーゼ及び第二鉄イオン非存在下にクレア
チンを反応(2)と(3)によりグリシンとホルムアルデ
ヒドへと代謝させる。この時生成されるm−
PMSH2は溶存酸素を電子受容体として以下の反
応式(6)に示したように反応する。 (6) m−PMSH2+O2→m−PMS+H2O2 したがつて、カタラーゼあるいはペルオキシダ
ーゼを予め添加しておけば、先の実施例1と同様
にm−PMSH2はm−PMSに戻り、カタラーゼを
使用する場合は最終的には水と酸素を生ずるのみ
であり、またペルオキシダーゼを使用する場合は
水を生ずる。このことから続く成分の測定の際に
は干渉物質の影響は全く除かれている。すなわ
ち、前処理をした後、反応(1)より(5)までを実施す
ればクレアチニンの正確な測定が可能となる。 1 試薬 (1)クレアチンアミジノヒドロラーゼ 244U/ml ザルコシン脱水素酵素 2U/ml PDTS 10mmol/ m−PMS 240μmol/ を含む20mmol/トリス塩酸緩衝液(PH8.3) (2)クレアチニンアミドヒドロラーゼ 70U/ml 硫酸第二鉄アンモニウム 0.55mmol/ シユウ酸 37mmol/ を含む100mmol/トリエタノールアミン緩
衝液(PH7.5) 2 操作法 試薬(1)200μに血清検体20μを加え37℃、5
分間保温後、試薬(2)200μを加え、さらに37℃、
5分間保温し、波長570nmでの吸光度を測定す
る。別にクレアチニン含量既知の検体を上記と同
様に操作して検量線を作成し、この検量線より血
清検体のクレアチニン量を求める。 試験例 5 (1) クレアチニン測定におけるクレアチニンの影
響 血清検体にクレアチンを4,8,12,16,20
mg/dlの濃度で添加した検体について実施例5に
したがつて測定を行つた。別に同じ検体について
本発明の前処理を行わない方法、すなわち、試薬
(1)200μと試薬(2)200μの混合試薬に検体20μ
を加えて、37℃、5分間保温後に吸光度を測定し
た。その結果は、次表に示す。
【表】
上の表が示すように、前処理によるクレアチン
消去の有無はクレアチニン測定に影響を与える。 (2) 本発明方法のクレアチニン濃度と吸光度と関
係 実施例5の方法により、クレアチニンの各濃度
について吸光度を測定した結果を第5図に示す。
この図が示すようにクレアチニン濃度と吸光度と
は直線関係を示し、正しくクレアチニン濃度を測
定できることがわかる。 以上述べた通り本発明方法は簡単な方法で検体
中の干渉性物質を除去し試薬の無駄な使用もなく
正確な測定を可能にした点で極めて有用なもので
ある。
消去の有無はクレアチニン測定に影響を与える。 (2) 本発明方法のクレアチニン濃度と吸光度と関
係 実施例5の方法により、クレアチニンの各濃度
について吸光度を測定した結果を第5図に示す。
この図が示すようにクレアチニン濃度と吸光度と
は直線関係を示し、正しくクレアチニン濃度を測
定できることがわかる。 以上述べた通り本発明方法は簡単な方法で検体
中の干渉性物質を除去し試薬の無駄な使用もなく
正確な測定を可能にした点で極めて有用なもので
ある。
第1図乃至第4図の縦軸は吸光度を示し、横軸
は血清の希釈度を示す。又、第5図の縦軸は吸光
度を示し、横軸はクレアチニンの濃度を示す。 第1図●印は血清中のα−アミラーゼ活性を、
第2図●印はトリグリセリド濃度を、第3図の〇
印はGOT活性を、△印はGPT活性を示す。ま
た、第3図〇印は、血清中のα−アミラーゼ活性
を、第2図の〇印はGOT活性を、△印はGPT活
性を、第4図〇印は、α−アミラーゼ活性、第5
図の●印は、クレアチニン濃度を示す。
は血清の希釈度を示す。又、第5図の縦軸は吸光
度を示し、横軸はクレアチニンの濃度を示す。 第1図●印は血清中のα−アミラーゼ活性を、
第2図●印はトリグリセリド濃度を、第3図の〇
印はGOT活性を、△印はGPT活性を示す。ま
た、第3図〇印は、血清中のα−アミラーゼ活性
を、第2図の〇印はGOT活性を、△印はGPT活
性を、第4図〇印は、α−アミラーゼ活性、第5
図の●印は、クレアチニン濃度を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 酵素法を適用しかつ検出系に脱水素酵素、電
子伝達体及び被還元性発色剤を用いて生体液中の
目的成分を測定する方法において、予め、目的成
分以外に反応系に関与し干渉作用を有する生体液
中の内因性及び外因性の物質を、目的成分に直接
作用する酵素及び被還元性発色剤の非存在下でし
かも少なくとも遊離の補酵素を必要としない脱水
素酵素及びカタラーゼまたはペルオキシダーゼ及
び電子伝達体の存在下で反応させ水分子あるいは
水分子と溶存酸素まで変換させて消去し、次いで
目的成分に直接作用する酵素および被還元性発色
剤を用いて目的成分を測定することを特徴とする
生体液成分の測定方法。 2 電子伝達体はフエナジンメトサルフエートも
しくはその誘導体又はジアホラーゼである特許請
求の範囲第1項記載の生体液成分の測定方法。 3 被還元性発色剤はテトラゾリウム塩又は酸化
型金属イオンとキレート剤との組合せである特許
請求の範囲第1項記載の生体液成分の測定方法。 4 酸化型金属イオンは第二鉄イオンである特許
請求の範囲第3項記載の生体液成分の測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17411783A JPS6066993A (ja) | 1983-09-22 | 1983-09-22 | 生体液成分の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17411783A JPS6066993A (ja) | 1983-09-22 | 1983-09-22 | 生体液成分の測定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6066993A JPS6066993A (ja) | 1985-04-17 |
JPH0560920B2 true JPH0560920B2 (ja) | 1993-09-03 |
Family
ID=15972932
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP17411783A Granted JPS6066993A (ja) | 1983-09-22 | 1983-09-22 | 生体液成分の測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6066993A (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0230343A3 (en) * | 1986-01-06 | 1988-08-10 | Isolab, Inc. | Method of determining the amount of phosphatidylglycerol in amniotic fluids as a diagnostic indicator |
DE69328182T2 (de) * | 1992-07-02 | 2000-09-28 | Roche Diagnostics Corp | Reagenz stabilisiert durch zweiwertige metallsalze |
US20050164330A1 (en) | 2004-01-27 | 2005-07-28 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method for quantitatively determining a specific component in a biological specimen, and reagent for quantitative determination |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0316119A (ja) * | 1989-03-17 | 1991-01-24 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 化合物半導体ウエハ |
-
1983
- 1983-09-22 JP JP17411783A patent/JPS6066993A/ja active Granted
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0316119A (ja) * | 1989-03-17 | 1991-01-24 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 化合物半導体ウエハ |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6066993A (ja) | 1985-04-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4242446A (en) | Method for determining a substance in a biological fluid and reagent combination for use in the method | |
Ishihara et al. | Enzymatic determination of ammonia in blood plasma | |
EP0199363B1 (en) | Method of terminating isocitrate dehydrogenase reaction | |
EP0207493B1 (en) | Method of terminating isocitrate dehydrogenase reaction | |
JPH0560920B2 (ja) | ||
EP0396584A1 (en) | QUANTITATIVE DETERMIMATION OF REDUCED PYRIDINE SALICYLATES OR NUCLEOTIDES. | |
US3985621A (en) | Stopping agents for enzyme reactions of dehydrogenase systems | |
US5258286A (en) | Method of terminating isocitrate dehydrogenase reaction | |
CS227331B2 (en) | Method of glycerol determination | |
JPS61247963A (ja) | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 | |
US7300769B2 (en) | Stabilized coenzyme solutions for determining dehydrogenase activity | |
JP2534859B2 (ja) | 生体物質のエンザイムアツセイ | |
JPH0343096A (ja) | 基質又は酵素の定量方法 | |
JPH047200B2 (ja) | ||
JPH0316119B2 (ja) | ||
EP0392021B1 (en) | Method for analyzing components | |
JPH0253039B2 (ja) | ||
JPH0412120B2 (ja) | ||
JPH0675516B2 (ja) | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量法 | |
JPS6030519B2 (ja) | 内因性、外因性物質の干渉を受けない生体液中の成分を測定する方法 | |
CN114354524A (zh) | 一种稳定的液体检测试剂盒 | |
JP3566976B2 (ja) | 生体成分中の測定対象の測定方法 | |
JPS6214797A (ja) | ドリグリセライドの定量方法 | |
JPH0673476B2 (ja) | イソクエン酸脱水素酵素反応の停止方法 | |
JPS5934900A (ja) | 生体液中の成分の測定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |