CN114354524A - 一种稳定的液体检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种稳定的液体检测试剂盒。本申请的试剂盒包含酰基化的NAD变体/酰基化的NADP变体作为氢供体。由于在传统的酶检测系统中引入了改进的氢供体，使试剂稳定性明显提升。
Description
本申请要求2021年03月02日提交的中国专利申请(申请号2021102296772)的优先权。
技术领域
本申请涉及生物化学、临床检验领域。具体而言，涉及一种改进的酶法检测方法、改进的液体检测试剂、经修饰的辅酶及其用途。
背景技术
在临检领域，用还原型烟酰胺辅酶(NADH或NADPH)检测样本中的待测物是一个广泛使用的方法。试剂中NADH或NADPH的氧化程度，与样本中待测物的浓度/含量成比例。根据样本中待测物的不同，采用作用于该待测物的相应酶，经过酶与底物一步或多步反应，直接或间接使得试剂中的NADH或NADPH被氧化，反应物中吸光度发生变化，通过测量吸光度的变化，可计算出样本中待测物的浓度。
1)比如，在肌酐的检测中，血清中内源性NH3在谷氨酸脱氢酶催化及NADH/NADPH供氢的条件下，与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，清除内源性NH3：
样本中的肌酐经肌酐亚胺基水解酶水解，生成1-甲脲乙醇酸酐和NH3；再经过谷氨酸脱氢酶催化α-酮戊二酸和NH3，在NADH/NADPH供氢的条件下生成谷氨酸，然后测定340nm处NADH/NADPH吸光度降低速率计算肌酐含量：
2)例如，血浆样本中氨浓度的检测，血浆中的氨在谷氨酸脱氨酶作用下与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸盐，同时NADH或NADPH被氧化为NAD+或NADP+，反应系统在340nm处的吸光度值下降，通过检测340nm处吸光度的下降值。就可以算出样本中氨的浓度。
3)再例如，血清样本中丙氨酸氨基转移酶浓度的检测，样本中丙氨酸氨基转移酶催化丙氨酸氨基转换至α-氧代戊二酸，生成丙酮酸和L-谷氨酸；生成的丙酮酸被试剂中的脱氢酶还原为L-乳酸，同时NADH或NADPH被氧化为NAD+或NADP+，反应系统在340nm处的吸光度值下降。通过检测340nm处吸光度的下降值，就可以计算出样本中丙氨酸氨基转移酶的浓度。
然而，NADH或NADPH通常在试剂中并不稳定，尤其是偏酸/中性的缓冲液环境中。因此，现有技术中可见以下策略来稳定NADH或NADPH：
1)制备成干粉试剂，通过保持试剂的干燥状态，保持NADH或NADPH的稳定。
2)调整NADH或NADPH所处试剂的pH值，使pH在9.0至11.5的范围；但是较高的pH会使酶的活性降低。
3)Joseph De Giorgio等发明了在检测试剂中加入NADH或NADPH的再生系统，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和葡萄糖，将试剂保存过程中NADH或NADPH，被氧化生成的NAD或NADP再缓慢还原为NADH或NADPH，从而保持检测试剂中有效的NADH或NADPH浓度。
4)Richard A Kaufman利用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及葡萄糖-6-磷酸，在试剂检测过程中原位快速再生还原型辅酶，其再生速率需要大于待测物酶系统再氧化的速率。然而，实际上待测物的检测是在还原型辅酶再生的同时或以后进行的，试剂中葡萄糖-6-磷酸的浓度低于用于再生还原型辅酶的氧化型辅酶的摩尔浓度，因此检测试剂配制成单一液体试剂后，再生的NADH或NADPH与普通检测试剂中一样不稳定。
5)US5278044提供了一种用脂质体来稳定还原型辅酶的方法，然而这个策略不适用于诊断试剂领域。
6)US5278044提供了用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲体系来稳定NADH的方法，该方法的最佳pH值为10.0-10.4，这个范围的pH过高，使得很多酶在该pH范围的活性受到影响。
7)CN101140279A和CN1311335A向试剂中添加螯合剂来稳定还原型辅酶，然而金属离子螯合剂使得酶的活性受影响。
综上，仍有必要提供一种稳定性好的还原型辅酶，可与酶混合，用于临床生化的液体型试剂中。
发明内容
鉴于上述本领域的需求，提供了一种还原型辅酶试剂，其包含：
-还原型辅酶、
-缓冲液、
-任选地，氧化还原酶，其能够接受来自还原型辅酶的供氢。
在一个实施方案中，所述还原型辅酶试剂不是干粉制剂。
在一个实施方案中，所述缓冲液选自：Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑缓冲液、CAPSO缓冲液、Tricine缓冲液。
在所有实施方案中，所述还原型辅酶不是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。
在所有实施方案中，所述还原型辅酶不是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。
在一个实施方案中，所述还原型辅酶是酰基化NADH或其盐。
在一个实施方案中，所述还原型辅酶是酰基化NADPH或其盐。
在一个实施方案中，所述还原型辅酶是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸或其盐，如3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸二钠盐：
在一个实施方案中，所述还原型辅酶是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐，如3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸四钠盐：
在一个实施方案中，所述酰基化NADH或其盐在还原型辅酶试剂中的浓度为0.05至10.0g/L；例如0.1至1.0g/L。具体地，所述酰基化NADH或其盐在还原型辅酶试剂中的浓度为0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0g/L；前述任意两个数值之间的任何整数和小数视为在本申请中被明确地提及。或者，所述酰基化NADH或其盐在还原型辅酶试剂中的浓度为0.1mmol/L至50mmol/L。
在一个实施方案中，所述酰基化NADPH或其盐的浓度为0.05至10.0g/L，优选为0.1至1.0g/L。所述酰基化NADPH或其盐在还原型辅酶试剂中的浓度为0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0g/L；前述任意两个数值之间的任何整数和小数视为在本申请中被明确地提及。或者，所述酰基化NADPH或其盐在还原型辅酶试剂中的浓度为0.1mmol/L至50mmol/L。
在一个实施方案中，还原型辅酶试剂的pH不大于9；具体是9.0、8.9、8.8、8.7、8.6、8.5、8.4、8.3、8.2、8.1、8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.5、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0；更具体地，pH为7至9；前述任意两个数值之间的任何整数和小数视为在本申请中被明确地提及。
在一个实施方案中，还原型辅酶试剂还包含选自以下任一组的再生底物和再生底物酶：
i)葡萄糖和葡萄糖脱氢酶；
ii)异柠檬酸盐和异柠檬酸脱氢酶；
iii)乳酸盐和乳酸脱氢酶；
iv)甘油和甘油脱氢酶；
v)葡萄糖6磷酸和葡萄糖6磷酸脱氢酶；
vi)半乳糖和半乳糖脱氢酶。
在一个实施方案中，还原型辅酶试剂还包含选自以下任一项或其组合：稳定剂、表面活性剂、防腐剂。
在一个实施方案中，所述稳定剂选自以下任一项或其组合：乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、甘油、乙二醇、巯基乙醇、二硫苏糖醇。
在一个实施方案中，所述表面活性剂选自以下任一项或其组合：Brij35、Thesit、Tween20、Tween80、AEO、Triton X。
在一个实施方案中，所述防腐剂选自以下任一项或其组合：叠氮钠、叠氮锂、ProClin300。
根据一些实施方案，提供了前述根据本申请的还原型辅酶在制备检测试剂中的用途。
在一个实施方案中，前述根据本申请的还原型辅酶尤其适用于以还原型辅酶作为氢供体的检测试剂。
在一个实施方案中，检测试剂是选自以下的试剂：肌酐检测试剂、同型半胱氨酸检测试剂、总胆汁酸检测试剂、二氧化碳或碳酸氢根检测试剂、尿素检测试剂、半乳糖检测试剂、甘氨酸检测试剂、无机磷检测试剂、镁离子检测试剂、钾离子检测试剂、钙离子检测试剂、总胆固醇检测试剂、甘油三酯检测试剂、血氨检测试剂、涂唾液酸检测试剂、单胺氧化酶检测试剂、5’-核苷酸酶检测试剂、腺苷脱氨酶检测试剂、天门冬氨酸转移酶检测试剂、丙氨酸氨基转移酶检测试剂、α-羟丁酸脱氢酶检测试剂、肌酸激酶同工酶检测试剂、脂肪酶检测试剂、乳酸脱氢酶检测试剂。
根据一些实施方案，提供了前述根据本申请的还原型辅酶、再生底物和再生底物酶的组合在制备检测试剂中的用途。在一个实施方案中，再生底物和再生底物酶选自以下任一组：
i)葡萄糖和葡萄糖脱氢酶；
ii)异柠檬酸盐和异柠檬酸脱氢酶；
iii)乳酸盐和乳酸脱氢酶；
iv)甘油和甘油脱氢酶；
v)葡萄糖6磷酸和葡萄糖6磷酸脱氢酶；
vi)半乳糖和半乳糖脱氢酶。
根据一些具体的实施方案，提供了一种肌酐检测试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂，其中：
所述第一试剂包含：
所述第二试剂包含：
根据另一些具体的实施方案，提供了一种肌酐检测试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂，其中：
所述第一试剂包含：
所述第二试剂包含：
在一个涉及肌酐检测试剂盒的实施方案中，Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑缓冲液、CAPSO缓冲液、Tricine缓冲液。
在一个涉及肌酐检测试剂盒的实施方案中，稳定剂选自以下任一项或其组合：乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、甘油、乙二醇、巯基乙醇、二硫苏糖醇。
在一个涉及肌酐检测试剂盒的实施方案中，表面活性剂选自以下任一项或其组合：Brij35、Thesit、Tween20、Tween80、AEO、Triton X。
在一个涉及肌酐检测试剂盒的实施方案中，所述防腐剂选自以下任一项或其组合：叠氮钠、叠氮锂、ProClin300。
在一个涉及肌酐检测试剂盒的实施方案中，再生底物和再生底物酶选自以下的任一组：
i)葡萄糖和葡萄糖脱氢酶；
ii)异柠檬酸盐和异柠檬酸脱氢酶；
iii)乳酸盐和乳酸脱氢酶；
iv)甘油和甘油脱氢酶；
v)葡萄糖6磷酸和葡萄糖6磷酸脱氢酶；
vi)半乳糖和半乳糖脱氢酶。
根据一些实施方案，提供了一种钾离子的检测试剂，其包含：
第一试剂：
第二试剂：
在一个涉及钾离子检测试剂的实施方案中，再生底物和再生底物酶选自以下的任一组：
i)葡萄糖和葡萄糖脱氢酶；
ii)异柠檬酸盐和异柠檬酸脱氢酶；
iii)乳酸盐和乳酸脱氢酶；
iv)甘油和甘油脱氢酶；
v)葡萄糖6磷酸和葡萄糖6磷酸脱氢酶；
vi)半乳糖和半乳糖脱氢酶。
根据一些实施方案，提供了一种单胺氧化酶的检测试剂，其包含：
在一个涉及单胺氧化酶检测试剂的实施方案中，再生底物和再生底物酶选自以下的任一组：
i)葡萄糖和葡萄糖脱氢酶；
ii)异柠檬酸盐和异柠檬酸脱氢酶；
iii)乳酸盐和乳酸脱氢酶；
iv)甘油和甘油脱氢酶；
v)葡萄糖6磷酸和葡萄糖6磷酸脱氢酶；
vi)半乳糖和半乳糖脱氢酶。
根据一些实施方案，提供了一种同型半胱氨酸的检测试剂，其包含：
第一试剂包含：
第二试剂包含：
同型半胱氨酸甲基转移酶 1KU/L至10KU/L、
谷氨酸脱氢酶 5KU/L至20KU/L；
第三试剂包含：
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 1KU/L至10KU/L、
腺苷脱氨酶 1KU/L至10KU/L。
在一个涉及同型半胱氨酸检测试剂的实施方案中，再生底物和再生底物酶选自以下的任一组：
i)葡萄糖和葡萄糖脱氢酶；
ii)异柠檬酸盐和异柠檬酸脱氢酶；
iii)乳酸盐和乳酸脱氢酶；
iv)甘油和甘油脱氢酶；
v)葡萄糖6磷酸和葡萄糖6磷酸脱氢酶；
vi)半乳糖和半乳糖脱氢酶。
根据一些具体的实施方案，提供了一种检测样本中待测物的方法，其包括步骤：
1)提供样本，所述样本包含待测物或不包含待测物；
2)样本接触前述根据本申请的还原型辅酶试剂；
3)测量步骤2)所得混合物在340nm处吸光度的变化；
4)确定所述样本中所述待测物是否存在或所述待测物的量。
具体实施方式
还原型辅酶
现有技术中的还原型辅酶是NADH、NADPH、或硫代NADH、硫代NADPH。
NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide)是一种化学物质，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态(也称为还原型辅酶I)。N指烟酰胺、A指腺嘌呤、D是二核苷酸。NADH是辅酶NAD的还原形式，NAD+是其氧化形式。在氧化还原反应中，NADH作为氢和电子的供体，NAD+作为氢和电子的受体(《Essentials of Medical Biochemistry》，第13章，ElectronTransport Chain,Oxidative Phosphorylation,and Other Oxygen-ConsumingSystems)。
NADPH即还原型辅酶II(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，是一种辅酶，N是指烟酰胺，A是指腺嘌呤，D是指二核苷酸，P是指磷酸基团。NADPH是电子受体NADP+接受电子后的产物。NADP+作为脱氢酶的辅酶，在酶促反应中起氢供体的作用。
根据本申请的一方面，提供了一种新型的经修饰的还原型辅酶，它不是NADPH，也不是NADH；而是NADPH或NADH的衍生物，具体而言是NADPH或NADH的酰基化衍生物。
“酰基化”(或酰化、酰化作用)是指在有机分子中的氮、氧、碳或硫等原子上引入脂肪族酰基RCO－或芳香族酰基ArCO－的反应。按照酰基导入部位可以将酰化反应分为氧酰化、氮酰化和碳酰化反应。
在一些实施方案中，根据本申请的还原型辅酶是酰基化NADH或其盐。
在另一些实施方案中，根据本申请的还原型辅酶是酰基化NADPH或其盐。
在一个实施方案中，根据本申请的还原型辅酶是3-乙酰NADH或其盐。
在一个实施方案中，根据本申请的还原型辅酶是3-乙酰NADPH或其盐。
3-乙酰NADH/NADPH的盐是指药学上可接受的盐(也涵盖诊断或生化领域可接受的盐)；包括但不限于金属盐，可以提及的示例性盐：钠、钾、钙、镁盐。
在一个实施方案中，根据本申请的还原型辅酶是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸钠。
在一个实施方案中，根据本申请的还原型辅酶是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸钠。
还原型辅酶试剂
根据本申请的还原型辅酶试剂，其包含根据本申请的还原型辅酶。还原型辅酶试剂可以制备成液体或固体形式，然而由于本申请的修饰的还原型辅酶提供了更好的稳定性以及对pH的耐受性，还原型辅酶试剂尤其是指液体形式的试剂。
还原型辅酶试剂可以任选地包含缓冲液，为还原型辅酶提供缓冲环境。
技术人员知晓，氧化还原酶(如脱氢酶)的天然受体是NAD+或NADP+(例如苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶等)。氧化还原酶的底物经这类脱氢酶的催化使NAD(P)+还原生成NAD(P)H。因此，根据本申请的还原型辅酶试剂还任选包含氧化还原酶。
氧化还原酶
氧化还原酶的选择取决于待测物的类型。例如，在单胺氧化酶的检测中，氧化还原酶是谷氨酸脱氢酶。在二氧化碳的检测中，氧化还原酶是苹果酸脱氢酶。技术人员能够根据待测物的类型确定氧化还原酶。
缓冲液
现有技术中，常规NADH/NADPH对pH的适应范围窄，通常在pH较高的缓冲液体系中提供NADH/NADPH以确保其稳定性。得益于本申请酰基化修饰的NADH/NADPH，其对pH范围耐受性更广(从而在广泛的pH环境下具有比传统NADH/NADPH更显著的稳定性)，例如pH 4-11(5-10、5-9、5-8、5-7、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8)。然而，试剂中的酶(多肽、蛋白质)其活性对pH敏感。因此，在本申请中，尤其对于那些能提供pH 7-9缓冲能力的缓冲液感兴趣。所述缓冲液的示例是：Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑缓冲液、CAPSO缓冲液、Tricine缓冲液。
再生底物和再生底物酶
在待测物的检测反应链中，还原型辅酶被氧化成氧化型辅酶，而被消耗掉，不能再参与反应。因此，任选地，本领域有时会加入再生底物和再生底物酶使消耗掉的还原型辅酶，得以还原而再生。再生底物在再生底物酶的催化下，将再生底物提供的氢转移给氧化型辅酶，从而被还原为还原型辅酶，以便循环利用而再次参与反应。
作为一个示例，在检测试剂中加入NADH或NADPH的再生系统，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和葡萄糖，将被氧化生成的NAD或NADP还原为NADH或NADPH，从而保持检测试剂中有效的NADH或NADPH浓度(此处的再生底物是葡萄糖，再生底物酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)。这种配对的再生底物和再生底物酶是本领域公知的，技术人员可以根据待测物、检测原理、与试剂中其他成分的兼容性等因素而确定适当的再生底物和再生底物酶。再生底物和再生底物酶的示例包括选自以下任一组：
i)葡萄糖和葡萄糖脱氢酶；
ii)异柠檬酸盐和异柠檬酸脱氢酶；
iii)乳酸盐和乳酸脱氢酶；
iv)甘油和甘油脱氢酶；
v)葡萄糖6磷酸和葡萄糖6磷酸脱氢酶；
vi)半乳糖和半乳糖脱氢酶。
检测试剂
在现有技术中，任何依赖于还原型辅酶作为氢供体的检测试剂理论上均适用于本申请的各种实施方案。现有技术中，在检测试剂中包含NADH/NADPH的示例性检测产品(试剂、试剂盒等)可以提及选自以下的试剂：肌酐检测试剂、同型半胱氨酸检测试剂、总胆汁酸检测试剂、二氧化碳或碳酸氢根检测试剂、尿素检测试剂、半乳糖检测试剂、甘氨酸检测试剂、无机磷检测试剂、镁离子检测试剂、钾离子检测试剂、钙离子检测试剂、总胆固醇检测试剂、甘油三酯检测试剂、血氨检测试剂、涂唾液酸检测试剂、单胺氧化酶检测试剂、5’-核苷酸酶检测试剂、腺苷脱氨酶检测试剂、天门冬氨酸转移酶检测试剂、丙氨酸氨基转移酶检测试剂、α-羟丁酸脱氢酶检测试剂、肌酸激酶同工酶检测试剂、脂肪酶检测试剂、乳酸脱氢酶检测试剂。
检测试剂可以是单试剂或多试剂的形式。
检测方法
采用根据本申请的酰基化修饰的还原型辅酶替代现有技术检测方法中的NADH/NADPH，从而提供一个新型的检测方法平台(或称为一种改进的酶学检测法)。具体而言，在这样的检测方法平台/酶学检测法中，涉及以下步骤：
1)提供样本(无论是否包含待测物)；
2)样本接触根据本申请的还原型辅酶试剂；
3)测量步骤2)所得混合物在340nm处吸光度的变化；
4)确定所述样本中所述待测物是否存在或所述待测物的量。
酶学检测(也作酶法检测)
本领域中，酶学检测是指以酶作为分析工具或以酶作为被分析对象的检测方法。
在酶学检测的反应原理中，待测物经反应生成中间体，而中间体随后和还原型辅酶在酶的作用下反应生成氧化型辅酶，通过340nm处吸光度的变化来体现待测物的浓度。简言之，通过还原型辅酶和其对应的氧化型辅酶之间的相互转换，作为指示系统来间接体现待测物的情况。
尽管下面结合具体的待测物检测试剂对本申请的技术方案作进一步说明，但是技术人员理解本申请的方法、试剂和用途并不限于对特定待测物的检测，任何利用NADH(或NADPH)作用氢供体的检测方法、试剂和用途均适用于本申请。
实施例
实施例1.肌酐检测试剂盒的制备
1.稳定的液体紫外酶法肌酐检测试剂盒的制备，包括第一试剂和第二试剂。按照以下成分配制试剂盒：
第一试剂包含：
第二试剂包含：
2.检测方法：
分析方法：两点速率法或两点终点法；
主波长：340nm，副波长：570nm；
反应方向：降反应；
样本量：16μl，第一试剂：160μl，第二试剂：40μl；
校准方式：线性；
检测温度：37℃；
操作步骤：样品与第一试剂混匀后，于37℃下孵育300s，读取吸光度A1，加入第二试剂后混匀，孵育300s后读取吸光度A2，ΔA＝A2-A1。
计算方法：
实施例2.肌酐检测试剂盒的制备
1.稳定的液体紫外酶法肌酐检测试剂盒的制备，包括第一试剂和第二试剂：
第一试剂包含：
第二试剂包含：
2.检测方法、操作步骤和计算方法与实施例1相同。
实施例3.肌酐检测试剂盒的制备
1.稳定的液体紫外酶法肌酐检测试剂盒的制备，包括第一试剂和第二试剂：
第一试剂包含：
第二试剂包含：
2.检测方法、操作步骤和计算方法与实施例1相同。
实施例4.钾离子检测试剂
按照以下制备一种测定钾离子的液体双试剂试剂盒，其由下述成分组成：
第一试剂：
第二试剂：
实施例5.单胺氧化酶检测试剂
按照以下制备一种单胺氧化酶的检测试剂盒：
实施例6.同型半胱氨酸检测试剂
按照以下制备一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其中：
第一试剂包含：
第二试剂包含：
同型半胱氨酸甲基转移酶 1KU/L至10KU/L(具体是5.0KU/L)
谷氨酸脱氢酶 5KU/L至20KU/L(具体是10KU/L)；
第三试剂包含：
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶1KU/L至10KU/L(具体是3.0KU/L)
腺苷脱氨酶 1KU/L至10KU/L(具体是5.0KU/L)。
对比例1至对比例3
和实施例1至实施例3相比，区别仅在于将Ac-NADH或Ac-NADPH替换成非乙酰化的常规NADH或NADPH，得到对比试剂盒1至对比试剂盒3。
对比例4至对比例6
和实施例4至实施例6相比，区别仅在于将Ac-NADH或Ac-NADPH替换成非乙酰化的常规NADH或NADPH，得到对比试剂盒4至对比试剂盒6。
对比例7至对比例9
和实施例1至实施例3相比，区别仅在于制备成干粉型制剂，得到对比试剂盒7至对比试剂盒9。
测试例1.稳定性
1.将实施例1的试剂盒和对比例1的试剂盒在2℃至8℃密闭保存。实施例1的试剂盒可稳定至少12个月，实验结果见表1，在2℃至8℃中开盖可稳定至少28天，实验结果见表2。对比例1试剂盒随着时间的延长，显示出不稳定性。
表1：实施例1试剂盒的实时稳定性
表2：对比例1试剂盒的实时稳定性
表3：实施例1与对比例1测定低值质控的开盖稳定性
表4：实施例1与对比例1测定高值质控的开盖稳定性
2.实施例2和实施例3的试剂盒与实施例1相比，具有无统计学意义上显著差异的稳定性。
表5：实施例2试剂盒的实时稳定性
表6：实施例3试剂盒的实时稳定性
表7：实施例2与实施例3试剂盒测定低值质控的开盖稳定性
表8：实施例2与实施例3试剂盒测定高值质控的开盖稳定性
3.在等同测试条件下(参照测试例1第1节)，测试实施例4至6、对比例4至6试剂盒的实时稳定性。实施例4至6显著优于对比例4至6。
表9：实施例4试剂盒的实时稳定性
表10：对比例4试剂盒的实时稳定性
表11：实施例5试剂盒的实时稳定性
表12：对比例5试剂盒的实时稳定性
表13：实施例6试剂盒的实时稳定性
表14：对比例6试剂盒的实时稳定性
测试例2.准确度
将实施例1的试剂盒测试与其干粉试剂(对比例7)测值的相关性。经保存(2-8℃)12个月后，两种试剂盒相关性＞0.99。这表示即便制备成对稳定性更不利的液体剂型，也没有影响检测性能。
表15：实施例1试剂盒与其干粉试剂测值相关性
实施例2和实施例3的试剂盒与实施例1相比，具有无统计学意义上显著差异。
测试例3.线性范围
实施例1的试剂盒的线性范围为30μmol/L至2000μmol/L，与对应的干粉试剂相当。这表示即便制备成对稳定性更不利的液体剂型，也没有影响检测性能。
表16：实施例1试剂盒线性
实施例2和实施例3的试剂盒与实施例1相比，无统计学意义上显著差异。
表17：实施例2试剂盒线性
表18：实施例3试剂盒线性
测试例4.抗干扰性
常规干扰物抗坏血酸、胆红素、血红蛋白、羟苯磺酸钙、甲基多巴、安乃近对实施例1的试剂盒的影响不具有统计学显著性。实施例2和实施例3的试剂盒与实施例1相比，无统计学意义上显著差异。
表19：实施例1试剂盒抗干扰性
表20：实施例2试剂盒抗干扰性
表21：实施例3试剂盒抗干扰性
Claims (9)
1.一种还原型辅酶试剂，其包含：
-还原型辅酶、
-缓冲液、
-任选地，氧化还原酶；
其中：
所述还原型辅酶试剂不是干粉制剂；
所述缓冲液选自以下任一项或其组合：Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑缓冲液、CAPSO缓冲液、Tricine缓冲液；
所述氧化还原酶是指可以接受还原型辅酶供氢的酶；
所述还原型辅酶不是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)；
所述还原型辅酶不是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)；
所述还原型辅酶是酰基化NADH或其盐、或酰基化NADPH或其盐；
优选地，所述还原型辅酶是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸或其盐；
优选地，所述还原型辅酶是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐；
优选地，所述盐选自以下任一项：钠盐、钾盐、钙盐、镁盐。
2.根据权利要求1所述的还原型辅酶试剂，其中：
还原型辅酶的浓度为0.05g/L至10.0g/L，优选为0.1g/L至1.0g/L。
3.根据权利要求1或2所述的还原型辅酶试剂，其pH不大于9；优选pH为7至9。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的还原型辅酶试剂，其还包含选自以下任一组的再生底物和再生底物酶：
i)葡萄糖和葡萄糖脱氢酶；
ii)异柠檬酸盐和异柠檬酸脱氢酶；
iii)乳酸盐和乳酸脱氢酶；
iv)甘油和甘油脱氢酶；
v)葡萄糖6磷酸和葡萄糖6磷酸脱氢酶；
vi)半乳糖和半乳糖脱氢酶。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的还原型辅酶试剂，其还包含选自以下任一项或其组合：
稳定剂、
表面活性剂、
防腐剂；
优选地，所述稳定剂选自以下任一项或其组合：乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、甘油、乙二醇、巯基乙醇、二硫苏糖醇；
优选地，所述表面活性剂选自以下任一项或其组合：Brij35、Thesit、Tween20、Tween80、AEO、Triton X；
优选地，所述防腐剂选自以下任一项或其组合：叠氮钠、叠氮锂、ProClin300。
6.还原型辅酶在制备检测试剂中的用途，其中所述还原型辅酶是酰基化NADH或其盐、或酰基化NADPH或其盐；
优选地，所述还原型辅酶是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸或其盐；
优选地，所述还原型辅酶是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐；
优选地，所述盐选自以下任一项：钠盐、钾盐、钙盐、镁盐；
所述检测试剂是指以还原型辅酶作为氢供体的检测试剂；
所述检测试剂是单试剂或多试剂；
优选地，所述检测试剂选自以下的任一项：
肌酐检测试剂、同型半胱氨酸检测试剂、总胆汁酸检测试剂、二氧化碳或碳酸氢根检测试剂、尿素检测试剂、半乳糖检测试剂、甘氨酸检测试剂、无机磷检测试剂、镁离子检测试剂、钾离子检测试剂、钙离子检测试剂、总胆固醇检测试剂、甘油三酯检测试剂、血氨检测试剂、涂唾液酸检测试剂、单胺氧化酶检测试剂、5’-核苷酸酶检测试剂、腺苷脱氨酶检测试剂、天门冬氨酸转移酶检测试剂、丙氨酸氨基转移酶检测试剂、α-羟丁酸脱氢酶检测试剂、肌酸激酶同工酶检测试剂、脂肪酶检测试剂、乳酸脱氢酶检测试剂。
7.根据权利要求6所述的用途，所述检测试剂还包含选自以下任一组的再生底物和再生底物酶：
i)葡萄糖和葡萄糖脱氢酶；
ii)异柠檬酸盐和异柠檬酸脱氢酶；
iii)乳酸盐和乳酸脱氢酶；
iv)甘油和甘油脱氢酶；
v)葡萄糖6磷酸和葡萄糖6磷酸脱氢酶；
vi)半乳糖和半乳糖脱氢酶。
8.一种肌酐检测试剂盒，其包含：
第一试剂、和
第二试剂，
其中：
所述第一试剂包含：
所述第二试剂包含：
其中：
优选地，所述缓冲液选自以下任一项或其组合：Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑缓冲液、CAPSO缓冲液、Tricine缓冲液；
优选地，所述稳定剂选自以下任一项或其组合：乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、甘油、乙二醇、巯基乙醇、二硫苏糖醇；
优选地，所述表面活性剂选自以下任一项或其组合：Brij35、Thesit、Tween20、Tween80、AEO、Triton X；
优选地，所述防腐剂选自以下任一项或其组合：叠氮钠、叠氮锂、ProClin300；
优选地，所述酰基化NADH或其盐是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸或其盐；
优选地，所述酰基化NADPH或其盐是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐；
优选地，所述盐选自以下任一项：钠盐、钾盐、钙盐、镁盐。
9.一种肌酐检测试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂，其中：
所述第一试剂包含：
所述第二试剂包含：
其中：
优选地，所述缓冲液选自以下任一项或其组合：Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑缓冲液、CAPSO缓冲液、Tricine缓冲液；
优选地，所述稳定剂选自以下任一项或其组合：乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、甘油、乙二醇、巯基乙醇、二硫苏糖醇；
优选地，所述表面活性剂选自以下任一项或其组合：Brij35、Thesit、Tween20、Tween80、AEO、Triton X；
优选地，所述防腐剂选自以下任一项或其组合：叠氮钠、叠氮锂、ProClin300；
所述再生底物和再生底物酶选自以下的任一组：
i)葡萄糖和葡萄糖脱氢酶；
ii)异柠檬酸盐和异柠檬酸脱氢酶；
iii)乳酸盐和乳酸脱氢酶；
iv)甘油和甘油脱氢酶；
v)葡萄糖6磷酸和葡萄糖6磷酸脱氢酶；
vi)半乳糖和半乳糖脱氢酶；
优选地，所述酰基化NADH或其盐是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸或其盐；
优选地，所述酰基化NADPH或其盐是3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸或其盐；
优选地，所述盐选自以下任一项：钠盐、钾盐、钙盐、镁盐。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5286627A (en) * | 1989-04-18 | 1994-02-15 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method of high-sensitive analysis of bile acid and reagent composition for the analysis |
| US5801006A (en) * | 1997-02-04 | 1998-09-01 | Specialty Assays, Inc. | Use of NADPH and NADH analogs in the measurement of enzyme activities and metabolites |
| WO2001094370A1 (fr) * | 2000-06-07 | 2001-12-13 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Derives de coenzymes et enzymes appropries |
| CN1500884A (zh) * | 2002-11-15 | 2004-06-02 | 江西特康科技有限公司 | 烟酰胺辅酶试剂及其制法 |
| CN101003831A (zh) * | 2007-01-17 | 2007-07-25 | 王贤理 | 肝胆系统疾病诊断试剂盒 |
| CN101290287A (zh) * | 2007-04-19 | 2008-10-22 | 北京利德曼生化技术有限公司 | 还原型辅酶及其衍生物再生技术及其应用 |
| CN103558370A (zh) * | 2013-10-22 | 2014-02-05 | 青岛金洋生物技术有限公司 | 一种二氧化碳测定试剂盒 |
| CN104726536A (zh) * | 2013-12-24 | 2015-06-24 | 上海复星医药（集团）股份有限公司 | 一种稳定的酶法测定镁离子的试剂 |
| CN112226483A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-01-15 | 洛阳恒恩生物科技有限公司 | 一种稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂及其制备方法 |
-
2022
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Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5286627A (en) * | 1989-04-18 | 1994-02-15 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method of high-sensitive analysis of bile acid and reagent composition for the analysis |
| US5801006A (en) * | 1997-02-04 | 1998-09-01 | Specialty Assays, Inc. | Use of NADPH and NADH analogs in the measurement of enzyme activities and metabolites |
| WO2001094370A1 (fr) * | 2000-06-07 | 2001-12-13 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Derives de coenzymes et enzymes appropries |
| CN1500884A (zh) * | 2002-11-15 | 2004-06-02 | 江西特康科技有限公司 | 烟酰胺辅酶试剂及其制法 |
| CN101003831A (zh) * | 2007-01-17 | 2007-07-25 | 王贤理 | 肝胆系统疾病诊断试剂盒 |
| CN101290287A (zh) * | 2007-04-19 | 2008-10-22 | 北京利德曼生化技术有限公司 | 还原型辅酶及其衍生物再生技术及其应用 |
| CN103558370A (zh) * | 2013-10-22 | 2014-02-05 | 青岛金洋生物技术有限公司 | 一种二氧化碳测定试剂盒 |
| CN104726536A (zh) * | 2013-12-24 | 2015-06-24 | 上海复星医药（集团）股份有限公司 | 一种稳定的酶法测定镁离子的试剂 |
| CN112226483A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-01-15 | 洛阳恒恩生物科技有限公司 | 一种稳定性好的还原型烟酰胺辅酶测定试剂及其制备方法 |
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