CN101290287A - 还原型辅酶及其衍生物再生技术及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及还原型辅酶及其衍生物的再生技术及其应用“碳酸氢根定量测定试剂盒的制备方法”。在碳酸氢根定量测定试剂盒中利用还原型辅酶及其衍生物再生技术，克服还原型辅酶稳定性差的缺陷，制备出单试剂剂型的液体试剂盒。该试剂盒2－8℃可稳定12－18个月，且具有操作简便、快速、准确性和精密度高，抗干扰能力强的优点，适用于手工及自动化分析。

Description

还原型辅酶及其衍生物再生技术及其应用

技术领域

本发明涉及一种还原型辅酶及其衍生物再生技术，同时还包括此技术的一项应用——即单一、稳定的液体碳酸氢根测定试剂盒的制备技术。本发明属于医学检验技术领域，用于测定体液中(血清和血浆)碳酸氢根的含量。

背景技术

血液内碳酸氢根的含量对人体内酸碱平衡的调节起着重要的作用。血液pH的恒定是维持生命活动必不可少的条件，血浆中的多种缓冲系统中以碳酸氢盐缓冲系统最为重要，直接影响血液的pH。

血液内碳酸氢根的含量变化主要反映代谢性酸碱平衡紊乱。单纯代谢性酸或碱中毒时，血液碳酸氢根下降或升高，总碳酸氢根含量也随之下降或上升。而单纯性呼吸酸或碱中毒时，血液碳酸氢根升高或下降。

在血清或血浆中总CO₂主要以三种化学形式存在：溶解的CO₂(3％)、血浆蛋白的氨甲酰衍生物(33％)和碳酸氢根阴离子(64％)。人体中三种化学形式达到以下平衡：

其他数量上较小的形式是碳酸和碳酸根离子。血清或血浆中总CO₂含量的定量方法大都涉及到样品的酸化(以便把所有的CO₂转化为CO₂气体)和生成气体量的分析测定。

总二氧化碳和碳酸根的测定方法可分为直接测定和间接推算两类。直接测定主要有气压法、量压法、滴定法、比色法、Conway微量扩散法、流动注射气体扩散法等。间接推算则利用血气分析仪测得的pH与P_CO2获得。虽然以上的传统方法检测的结果亦能令人满意，但是酶分析方法在测定血清碳酸氢盐水平方面比其他这些方法更精确、可靠和简单，并适于自动化操作。

中华人民共和国专利申请号为200410065052.3的专利公开了一种酶法检测二氧化碳的试剂盒，该试剂通过样本中CO₂与磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式羧化酶的作用下，生成草酰乙酸和磷酸根，草酰乙酸与还原型辅酶在苹果酸脱氢酶的作用下生成氧化型辅酶，导致340nm吸光度的下降，从而检测样本中碳酸氢根的浓度。申请专利号为200410065053.8的专利公开了如下原理的测定方法：碳酸氢根与磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下生成草酰乙酸和磷酸根，磷酸根与甘油醛-3-磷酸、氧化型辅酶在甘油醛-3-磷酸脱氢酶作用下生成还原型辅酶和甘油酸-1，3-双磷酸。检测主反应在340nm的变化速率测定碳酸氢根含量。专利200410065054.2、200410065055.7专利报告了碳酸氢根与磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下生成草酰乙酸和磷酸根，然后磷酸根与核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、脲酶、过氧化物酶等作用下最后生成过氧化氢，利用Trinder反应确定碳酸氢根含量。专利200410065056.1、200410065057.6则利用生成的磷酸根在核苷磷酸酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶作用下生成乙醛，乙醛与氧化型辅酶在醛脱氢酶作用下生成乙酸和还原型辅酶，根据吸光度的变化确定样本中碳酸氢根含量。200410066186.7根据碳酸氢根和丙酮酸经苹果酸脱氢酶脱羧后产生苹果酸，并将还原型辅酶氧化为氧化型辅酶，测定主波长340nm的吸光度变化确定碳酸氢根含量。

但是NADH、NADPH或由其衍生的还原型辅酶在溶液中不稳定，尤其是酸性溶液中更不易稳定，上述专利未报道试剂的稳定性，而且采用双试剂或三试剂来保存试剂，选择适合还原型辅酶的碱性环境，试剂成份复杂，反应步骤很多，很难控制。而通过酶学、化学、物理方法还原再生NADH或NADPH，在有机合成和生物反应器领域是相当普遍采用的，以降低因持续不断投入大量还原型辅酶增加的成本。美国专利5116728报道了一种双试剂测定碳酸氢根的方法，并报道了一种再生NADH/NADPH的方法，R1中包含磷酸烯醇式丙酮酸及辅酶再生系统，R2包含磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶，与无NADH/NADPH再生的体系相比，含再生系统的体系定标稳定性由4小时提高到5天。美国专利5801006报道了一系列NADH/NADPH的类似物，这些类似物同样可以用于NADH/NADPH适用的场合。

本发明尝试利用NADH及其类似物作为辅酶来源，并利用再生技术以提高其稳定性，最终获得了简便、可靠的测定碳酸氢根含量的单一试剂。

发明内容

本发明的目的是：提供一种可用于检测血清碳酸氢盐水平的还原型辅酶再生技术，以制备稳定的单一试剂。

采用该试剂可以在紫外/可见分光光度计或半、全自动生化分析仪上进行的体液碳酸氢根含量测定，测定速度快、准确度高，易于推广应用。

该试剂主要包括：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和苹果酸脱氢酶(MDH)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、还原型辅酶及其再生系统。

本发明测定碳酸氢根含量的步骤如下：

1)将样品加入主要由磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶的试剂中，使之发生如下反应原理的反应：

2)试剂的主要成分

本发明测定碳酸氢根含量的试剂盒成分中，选择缓冲液的基本要求是pH在6.0-11.0之间，可以是：2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液、二(2-羟乙基)亚氨基(Bis-Tris)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、N(2-乙酰氨基)-2-亚氨基二醋酸(ADA)缓冲液、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)缓冲液、3-(N-吗啉基)--2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液、N，N-双(2羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)缓冲液、吗啉代丙烷磺酸(MOPS)缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2乙磺酸(HEPES)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、三乙醇胺(TEA)缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸(DIPSO)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)缓冲液、3-(环己氨基)丙磺酸(CAPSO)缓冲液、3-环己胺基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)缓冲液、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液等缓冲液中的至少一种，但缓冲液的选择范围并不受以上这些列举的限制。

磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的不同盐并不危及试剂的稳定性，但是为了使试剂达到最佳状态，必须选择PEP的水平，这可以根据试剂选用的其他成分而改变，优选1.5-20mM，低于1.5mM会出现底物耗竭而影响稳定性，过高则会增加成本，另外PEP添加会影响试剂pH，需要调整缓冲液至合适水平。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)优选来自微生物的酶，因为在试剂中加入来自微生物的酶能消除像NADH氧化酶和蛋白酶这类以前严重影响试剂稳定性的内源性污染物的影响。微生物酶还有热稳定性更好的附加优点，可以提高PEPC在溶液中的长期稳定性。

苹果酸脱氢酶(MDH)也优选微生物来源，以便降低试剂内源性污染的危险。合适的水平是50-10000U/L，更优选100-2000U/L。

可选用的辅酶有：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、3-乙酰吡啶-脱氨-NAD、3-乙酰嘧啶-NAD、3-乙酰嘧啶-NADPH、3-嘧啶醛-NAD或3-嘧啶醛NADP等类似物。

试剂中辅酶的水平可根据下列因素变动：

●测定中的线性要求

●选择的波长

●样品与试剂的体积比率

●所选分析仪器的光度系统

辅酶再生系统：还原型辅酶(NADH/NADPH及其类似物)在溶液中是非常不稳定的，很容易被氧化为氧化型的辅酶(NAD/NADP及其类似物)。再生系统使被氧化的还原型辅酶被还原，因此可以保持溶液中还原型辅酶的稳定性。再生系统最好能够满足以下条件：

●再生系统所用的酶本身最好是稳定的；

●底物和辅酶的反应是稳定的，再生速度应该是慢且可控的，不会与主反应产生竞争；

再生系统所用的酶和底物如下表所示，但并不局限于下表。

试剂中稳定剂可选用以下所述的一种和几种，但并不局限于所列物质。山梨醇、甘露醇、海藻糖、d-生物素、无水硫酸镁、氯化镁、醋酸镁、牛血清白蛋白、牛γ球蛋白、N-乙酰半胱氨酸、巯基乙醇、EDTA等。草氨酸钠、草酸或棉子酚能抑制由乳酸脱氢酶造成的干扰，对于丙酮酸盐水平高的病人来说，需要这种成份抑制乳酸脱氢酶活性，因为丙酮酸盐会干扰第二步反应，消耗试剂中的还原型辅酶，导致吸光度下降，造成测值的假性升高。

可选用的防腐剂有：叠氮钠、羟苯甲酸、庆大霉素、柳硫汞、羟甲基甘氨酸钠、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)等。

3)检测最终反应产物在主波长下(405nm或其他选定的波长)吸光度下降的速率，测定样本中碳酸氢根含量。测定波长优选还原性辅因子有最大吸收的波长。

4)该试剂也可配制成双试剂进一步消除内外源的污染。如：

具体实施方式

实施例：下面通过实施例进一步描述本发明，但是不应将其理解为对本发明的限制。

实施例1：

实施例1配方

试剂对照配方

在全自动生化分析仪(日立7060)设置参数如下：反应温度37℃，反应时间：5min，主波长：340nm，副波长：660nm，两点终点法，试剂样本比为300∶3，样本与试剂在37℃保温240S后，以试剂空白调零，记录吸光度A。对照标准反应曲线可测得样本中的碳酸氢根含量。

表1

*对照试剂未包含再生系统，其他成分同实施例1完全相同。试剂均开盖置于2-8度冰箱。

由表1可见，包含再生系统的试剂，在24天内的吸光度基本是稳定的，而不包含再生系统的试剂，开盖放置过程中吸光度一直下降，第6天之后已经下降的很严重，影响测值。

实施例2：

实施例2配方

检测波长为405nm，其他参数与实施例1相同，对照试剂与实施例1的对照试剂相同。

表2

由表2可见，使用葡萄糖-葡萄糖脱氢酶再生系统，在2-8℃开盖24天内，405nm吸光度稳定性极大优于对照，测定质控的稳定性也优于对照。

实施例3

实施例3配方

检测参数同实施例2。

表3

从表3的数据可见：37℃、41℃分别加速8天、3天，25mM质控分别下降4％、8％，50mM质控分别下降14.4％、13.7％。按照通常法则，生物试剂在37℃每稳定1天，相当于在4-10℃稳定1.5月，41℃每稳定1天，相当于在4-10℃稳定5-6个月，因此可推算该试剂盒在4-10℃可稳定12月左右。

实施例4

用含再生系统的新配试剂，含再生系统的2-8℃储存6个月的试剂，不含再生系统的新配的常规试剂同时检测病人血清中碳酸氢盐水平。检测参数同实施例2。结果如下：

表4

由表4的结果可见，试剂加盖储存2-8℃条件下：含再生系统的试剂显示出至少6-7个月的稳定性，从前面的例子可以看到，当吸光度大于1.0时才能测值，而6个月后，试剂的吸光度仍有1.5左右，反应完成时间仍为4-5min，几乎没有改变。测定病人结果也显示储存6个月的试剂与新鲜试剂在功能上没有显著的差异。

根据本发明，包含再生系统的试剂比不含再生系统的试剂，2-8℃开盖稳定性由3天左右，提升到24天，加速稳定性实验也表明，改进后的试剂储存时间也将会显著增长。本发明的显著优点是试剂为单一瓶装，并具有试剂稳定，即开即用，节省试剂位置等优点，适合手工、半自动、自动检测系统。

Claims (10)

1.还原型辅酶及其衍生物的再生技术。

2.碳酸氢根定量测定试剂盒的制备方法。

3.权力要求1的再生技术，其特征在于包含可再生还原型辅酶的辅酶还原系统抗氧化，以保证所述试剂在整个储存过程中能持续再生所述辅酶。

4.权力要求1和2的试剂，其中所述酶均来源于微生物。

5.权力要求1-3中的任一项，其中所述的再生系统包含：乳酸盐/乳酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、谷氨酸/谷氨酸脱氢酶、半乳糖/半乳糖脱氢酶等。

6.权力要求2，所述碳酸氢根测定试剂盒，其特征在于将该试剂盒置于紫外/可见分光光度计或半、全自动生化分析仪下，检测波长在340-600nm的吸光度下降的速度，从而定量测定样本中二氧化碳的含量。权力2所述试剂盒，成分如下：

7.根据权力要求6，所述的辅酶可以为：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、3-乙酰吡啶-脱氨-NAD、3-乙酰嘧啶-NAD、3-乙酰嘧啶-NADPH、3-嘧啶醛-NAD或3-嘧啶醛NADP等类似物。

8.根据权力要求6，所述稳定剂可以为：山梨醇、甘露醇、海藻糖、d-生物素、无水硫酸镁、氯化镁、醋酸镁、牛血清白蛋白、牛γ球蛋白、N-乙酰半胱氨酸、巯基乙醇、EDTA等。

9.根据权力要求6，所述缓冲液pH在6.0-11.0之间，可以是：2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液、二(2-羟乙基)亚氨基(Bis-Tris)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、N(2-乙酰氨基)-2-亚氨基二醋酸(ADA)缓冲液、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)缓冲液、3-(N-吗啉基)--2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)缓冲液、吗啉代丙烷磺酸(MOPS)缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、三乙醇胺(TEA)缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸(DIPSO)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)缓冲液、2-氨基-2甲基-1-丙醇(AMP)缓冲液、3-(环己氨基)丙磺酸(CAPSO)缓冲液、3-环己胺基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)缓冲液、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)缓冲液缓冲液等缓冲液中的至少一种。

10.根据权力要求1-9，改进通过测定辅酶的氧化程度确定样本中碳酸氢根浓度的酶学方法，这种改进包括选择合适的辅酶，合适的酶/底物再生系统，以及稳定该系统的物质，使所述试剂在整个储存过程中能持续再生所述辅酶，从而稳定所述辅酶的试剂。