JPH06209795A - 尿素窒素測定用組成物 - Google Patents

尿素窒素測定用組成物

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JPH06209795A
JPH06209795A JP596293A JP596293A JPH06209795A JP H06209795 A JPH06209795 A JP H06209795A JP 596293 A JP596293 A JP 596293A JP 596293 A JP596293 A JP 596293A JP H06209795 A JPH06209795 A JP H06209795A
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urease
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敦子 近藤
Shigeki Asano
茂樹 浅野
Shinichi Tejima
真一 手嶋
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、定量性、正確性、安定性、高値直
線性に優れた尿素窒素測定用組成物を提供するものであ
る。 【構成】 (a)ウレアーゼ、(b)α−ケトグルタル
酸、(c)NADHまたはNADPH、(d)グルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼおよび(e)グルタミン酸デヒロ
ドロゲナーゼ阻害剤を含有することを特徴とする尿素窒
素測定用組成物。 【効果】 高い濃度の尿素窒素を含む溶液であっても、
尿素窒素を短時間に正確にかつ簡単に定量することがで
き、また尿素窒素測定試薬の保存安定性を向上させるこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は尿素窒素測定用組成物、
更に詳しくは液体、特に血液及び尿中の尿素窒素の測定
用組成物に関するものである。
【0002】
【従来の技術】従来、尿素窒素の定量法としては、ウレ
アーゼ−インドフェノール法、尿素アミドリアーゼ−ピ
ルビン酸オキシダーゼ法、ウレアーゼ−グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ法が主に使用されている。しかしなが
ら、ウレアーゼ−インドフェノール法では反応触媒とし
て使用するニトロプルシドナトリウムが劇薬であること
と、発色試薬による測定ライン汚染が問題であり、尿素
アミドリアーゼ−ピルビン酸オキシダーゼ法では溶存酸
素の不足から高値直線性が不良となる点が問題であっ
た。また、ウレアーゼ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
法では、ウレアーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの
Kmが十分に大きくないために、高値直線性が不良とな
るという問題点があった。これまでにウレアーゼ−グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ法の改良法として、ウレアー
ゼの抗阻害物質としてヒドロキシウレア(クリニカルケ
ミストリー、25巻、1721頁、1979年)、ホウ
酸(特開昭59−151900)、アセトヒドロキサム
酸(特開平2−255099)等を使用してウレアーゼ
の見かけのKm値を大きくし、尿素窒素の測定範囲を広
げるという方法が報告されている。しかし、これらの抗
阻害剤を用いて尿素窒素測定用の試薬を調製すると、試
薬の保存安定性、特にウレアーゼの安定性が十分ではな
く、保存に伴い感度の著しい低下が見られることが判明
した。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
現状に鑑み、定量性、正確性、安定性、高値直線性に優
れた尿素窒素の酵素的測定用組成物を提供することであ
る。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために、鋭意検討したところ、グルタミン酸
デヒドロゲナーゼの抗阻害剤を用いると良好な結果を得
られることを見い出し、本発明を完成した。 すなわ
ち、本発明は(a)ウレアーゼ、(b)α−ケトグルタ
ル酸、(c)NADHまたはNADPH、(d)グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼおよび(e)グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ阻害剤を含有することを特徴とする尿素窒
素測定用組成物である。
【0005】上記の測定用組成物は、下記反応を利用す
るものである。
【0006】
【化1】
【0007】本発明に用いられるウレアーゼ(EC
3.5.1.5)の起源は特に限定されるものではな
い。例えば、ナタマメ由来、微生物由来のものが用いら
れ、好適にはナタマメ由来のものが使用される。
【0008】本発明に用いられるグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼは特に限定されるものではなく、NADHを補
酵素とするもの(EC 1.4.1.3)であっても、
NADPHを補酵素とするもの(EC 1.4.1.
4)であってもよい。
【0009】本発明に用いられるグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼの起源は特に限定されるものではない。例え
ば、牛肝臓由来、微生物由来のものが用いられ、好適に
はプロテウス属由来のものが使用される。
【0010】本発明に用いられるグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ阻害剤はグルタミン酸デヒドロゲナーゼに直接
作用し、酵素の基質(アンモニア)に対する親和性を調
節する物質、すなわち抗阻害剤であれば特に限定される
ものではない。例えば、カルシウムイオン、マンガンイ
オン等の重金属イオンが好適に使用される。これらの重
金属イオンは塩化物、炭酸塩、硫酸塩、酢酸塩の形で使
用される。
【0011】本発明の試薬のpHは緩衝液によりpH5
〜11に保たれているのが好ましい。緩衝液は如何なる
ものでもよく、例えばトリス緩衝液、GOOD緩衝液、
イミダゾール緩衝液が挙げられる。
【0012】本発明の試薬は必要により、界面活性剤、
防腐剤、安定化剤等を加えてもよい。界面活性剤として
は、非イオン性界面活性剤が好適に用いられる。防腐剤
としては、NaN3 、キレート剤、抗生物質が好適に用
いられる。
【0013】試薬構成としては、体液中のアンモニアを
グルタミン酸デヒドロゲナーゼまたはその他のアンモニ
ア消去系の酵素を用いて消去した後に、グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ阻害剤を添加する2試薬系が好ましい。
【0014】試薬の形状としては、液状試薬であって
も、凍結乾燥製剤であってもよく、溶解液を組み合わせ
てもよい。
【0015】本発明に用いられるグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼの濃度は、0.01〜10U/mlの範囲で好
適に用いられる。本発明に用いられるウレアーゼの使用
濃度は、1〜1000U/ml の範囲で好適に用いら
れる。α- ケトグルタル酸、NADPH、NADHの使
用濃度としては、、α- ケトグルタル酸は0.1〜10
0mM、NADPHまたはNADHは0.1〜1mMの
範囲が好適に用いられる。グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ阻害剤の使用濃度は、例えば重金属イオンの濃度は1
〜100mMの範囲が好適に用いられる。
【0016】本発明の尿素窒素測定用組成物を用いて、
尿素窒素を測定する方法は、前記のごとく試料をウレア
ーゼとグルタミン酸デヒドロゲナーゼとグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ阻害剤を含有する該試薬と反応させて消
費されるNADPH、またはNADHを紫外部の吸光度
の減少で測定する方法である。本発明の組成物を用いて
測定する条件としては、特に厳密に規制するものではな
いが、反応温度は、10〜40℃の間で、37℃また
は、30℃が好適に用いられる。測定波長としては,3
40nm付近で測定されることが望ましい。
【0017】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。 実施例1 被検体中の尿素窒素濃度を次の組成を有する試薬Aおよ
び試薬Bを用いて下記方法により測定した。 試薬A 試薬1 トリス緩衝液 0.1M (pH7.0) α- ケトグルタル酸 15 mM NADPH 0.3mM グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 1000U/L (Proteus sp.由来)
【0018】 試薬2 トリス緩衝液 10mM (pH6.5) EDTA・2K 0.1M CaCl2 25mM NADPH 0.3mM ウレアーゼ 30kU/L (ナタマメ由来)
【0019】 試薬B 試薬1 トリス緩衝液 0.1M (pH7.0) α- ケトグルタル酸 15mM NADPH 0.3mM グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 1000U/L (Proteus sp.由来)
【0020】 試薬2 トリス緩衝液 10mM (pH6.5) EDTA・2K 0.1M NADPH 0.3mM ウレアーゼ 30kU/L (ナタマメ由来)
【0021】測定方法 尿素窒素水溶液300mg/dlの10段階希釈液を試
料とし、各50μlを採取し、これに試薬1を3mlを
加え、37℃、5分間加温した後、更に試薬2を1ml
加えて、単位時間当りの吸光度変化を340nmにて測
定した。なお、ブランクは尿素窒素含有被検液の代わり
に蒸留水を用いた。図1にカルシウムイオンを含有する
試薬Aとカルシウムイオンを含有しない試薬Bの希釈直
線性を示す。図1から明らかなように、カルシウムイオ
ンを添加した試薬Aは、高濃度の尿素窒素に対しても直
線性が高く、感度よく測定できる。
【0022】実施例2 被検体中の尿素窒素濃度を次の組成を有する試薬C及び
試薬Dを用いて下記方法により測定した。 試薬C トリス緩衝液 50mM (pH7.0) α- ケトグルタル酸 3.5mM グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 500U/l (Proteus sp.由来) EDTA・2K 25mM MnCl2 10mM NADPH 0.3mM ウレアーゼ 7.5kU/l (ナタマメ由来)
【0023】 試薬D トリス緩衝液 50mM (pH7.0) α- ケトグルタル酸 3.5mM グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 500U/l (Proteus sp.由来) EDTA・2K 25mM NADPH 0.3mM ウレアーゼ 7.5kU/l (ナタマメ由来)
【0024】測定方法 尿素窒素水溶液300mg/dlの10段階希釈液を試
料とし、各50μlを採取し、これに上記試薬4mlを
加えて、37℃で5分間反応させて、単位時間当りの吸
光度変化を340nmにて測定した。なお、ブランクは
尿素窒素含有被験液の代わりに蒸留水を用いた。図2に
マンガンイオンを含有する試薬Cとマンガンイオンを含
有しない試薬Dの希釈直線性を示す。図2から明らかな
ように、マンガンイオンを添加した試薬Cは、高濃度の
尿素窒素に対しても直線性が高く、感度よく測定でき
る。
【0025】実施例3 次の組成を有する試薬Eおよび試薬Fを調製し、冷蔵保
管(1週間)した後、ウレアーゼ活性とグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ活性を測定した。各酵素活性は調製直後
の値を100として比較した。 試薬E トリス緩衝液 50mM (pH7.0) α- ケトグルタル酸 3.5mM グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 1000U/l (Proteus sp.由来) EDTA・2K 25mM CaCl2 10mM NADPH 0.3mM ウレアーゼ 7.5kU/l (ナタマメ由来)
【0026】 試薬F トリス緩衝液 50mM (pH7.0) α- ケトグルタル酸 3.5mM グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 15kU/l (Proteus sp.由来) EDTA・2K 25mM ホウ酸 0.6mM NADPH 0.3mM ウレアーゼ 300U/l (ナタマメ由来)
【0027】第1表にカルシウムイオン(グルタミン酸
デヒドロゲナーゼ阻害剤)を含有する試薬Eとホウ酸
(ウレアーゼ阻害剤)を含有する試薬Fのウレアーゼ活
性とグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を示す。
【0028】
【表1】 表1の結果によれば、本発明のグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ阻害剤を使用した試薬Eは、保存してもウレアー
ゼ活性、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の減少が少
なく、安定であることが判明した。
【0029】
【発明の効果】本発明により、高濃度の尿素窒素を含む
溶液であっても尿素窒素量を短時間に正確かつ簡単に定
量することができ、また尿素窒素測定試薬の保存安定性
を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】グルタミン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤としてカ
ルシウムイオンを使用した場合としない場合の300m
g/dl尿素窒素水溶液の希釈直線性を示す。
【図2】グルタミン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤としてマ
ンガンイオンを使用した場合としない場合の300mg
/dl尿素窒素水溶液の希釈直線性を示す。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 (a)ウレアーゼ、(b)αケトグルタ
    ル酸、(c)NADHまたはNADPH、(d)グルタ
    ミン酸デヒドロゲナーゼおよび(e)グルタミン酸デヒ
    ドロゲナーゼ阻害剤を含有することを特徴とする尿素窒
    素測定用組成物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113957121A (zh) * 2021-10-11 2022-01-21 河北省药品医疗器械检验研究院(河北省化妆品检验研究中心) 一种尿素测定试剂盒

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113957121A (zh) * 2021-10-11 2022-01-21 河北省药品医疗器械检验研究院(河北省化妆品检验研究中心) 一种尿素测定试剂盒
CN113957121B (zh) * 2021-10-11 2024-04-26 河北省药品医疗器械检验研究院(河北省化妆品检验研究中心) 一种尿素测定试剂盒

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