JPH04187098A - カルシウムイオン測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液、原簿生体液中のカルシウムイオン測定
用試薬に関するものである。

（従来の技術） 現在、臨床検査の分野で、副甲状腺機能異常等の内分泌
系の疾患、高血圧、動脈硬化症等の循環器系疾患等の診
断の目的で、血液、尿等の生体液中のカルシウムイオン
濃度が定量されている。その定量法は大きく二つに分け
られる。一つは原子吸光法、電極法に代表される機器分
析に基づく方法であり、他の一つは、オルトクレゾール
フタレインコンブレキフン法（以降ｏｃｐｃ法と略記す
る。）に代表されるキレート発色法によるものである。

近年、第三の方法としてカルシウムによる酵素の活性化
あるいは阻害を利用したカルシウムイオン測定法が報告
されている。たとえば、特開昭６２−１９５２９７号公
報にはカルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性
化を利用した分析用組成物、特開昭６２−３６１９９号
公報にはカルシウムによってカルモジュリンを活性化し
。

この活性化カルモジュリンによるカルモジュリン依存性
酵素の活性化を利用した分析用組成物、そして特開平１
−２３１８９６号公報にはカルシウムイオンによるホス
ホリパーゼＡ２の活性化を利用した分析用組成物が提案
されている。特開平２−１４２４９８号公報にはカルシ
ウムイオンによるピルビン酸キナーゼ活性の阻害を利用
した分析用組成物が提案されている。

（発明が解決しようとする課ａｔ） 前記の機器分析法による定量では比較的正確な値が得ら
れるが、高価な機器を特別に必要とし。

操作も煩雑である。特に、原子吸光法では検体の希釈が
必要であり、この希釈の操作が測定値に誤差のでる原因
となる。

一方、前記した。ｃｐｃ法に代表されるキレート法によ
る定量では、特別な分析装置を必要とせず、希釈の必要
もなく、簡単な比色計で測定可能であるという理由から
普及しているが９発色の度合いが、気温やｐＨ等によっ
て変化する他にカルシウムイオンに対する詩興性に欠け
るため、共存する物質の影響が避けられずに、大きな誤
差要因を含んだ結果しか得られないという問題点があっ
た。

新しく捷案されている酵素法は、カルシウムイオン測定
域が狭い、あるいは検体中の共存物質の影響を受けやす
く再現性に乏しい等の欠点があった。例えば、前述のカ
ルモジュリンを用いた方法（特開昭６２−３６１９９号
公報）では、カルモジュリンの入手が難しく、カルシウ
ム測定域が狭いため検体の希釈が必要であり、かつ二段
階の活性化を利用するため反応時間が長いという問題点
があった。ホスホリパーゼＡ２を用いた方法（特開平１
−２３１８９６号公報）、ピルビン酸キナーゼを用いた
方法（特開平２−１４２４９８号公報）では、これらの
酵素が血液中にも存在するため、血清中のカルシウムイ
オンを測定する際に誤差が生じるという問題点があった
。さらに、ピルビン酸キナーゼを用いた方法（特開平２
−１４２４９８号公報）では、カルシウムイオンによる
酵素の阻害を利用した方法であり測定精度が悪いことも
問題点である。ホスホリパーゼＤを用いた方法（特開昭
６２−１９５２９７号公報）は、この酵素が血液中に存
在せず、正確に測定できる方法であるが、共存する塩類
の影響を受けることや連続測定に不向きであることなど
の欠点があった。

（課題を解決するための手段） そこで本発明者らは、この様な点に鑑み、調製が容易で
あり、広いカルシウムイオン濃度範囲において簡便にか
つ正確にカルシウムイオンを測定することができる試薬
を提供することを目的として鋭意研究した結果、リン脂
質、ホスホリパーゼＤ、コリンオキシダーゼ、界面活性
剤及び２価金属塩からなる試薬は試料中のカルシウムイ
オン濃度に比例した発色が得られ、かつ広いカルシウム
イオン濃度範囲において正確なカルシウムイオン濃度を
連続して測定できることを見い出し１本発明を完成した
。

すなわち１本発明は、リン脂質、ホスホリパーゼＤ、コ
リンオキシダーゼ、界面活性剤及び２価金属塩からなる
カルシウムイオン測定用試薬を要旨とするものである。

本発明の試薬はリン脂質、ホスホリパーゼＤ。

コリンオキシダーゼ、界面活性剤及び２価金属塩からな
り、その他通常の賦活剤などの添加剤及び緩衝液が含有
されている。

本発明に用いられるリン脂質としては、塩基部分がコリ
ンであるものであれば、いずれのものを用いてもよく、
たとえば、リゾレシチン、レシチン、スフィンゴミエリ
ン等が挙げられるが、好ましくは、入手が容易であり、
水溶性に研れ１品質が安定しているという点でリゾレシ
チンが望ましい。

ホスホリパーゼＤとしては、いずれのものでも使用でき
１例えば、キャベツ、ニンジン、ブタ膵等の動植物由来
、ストレプトマイセス・クロモファカス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ　）等の微生
物由来のものが挙げられるが、好ましくは、安定性、入
手の容易さ、ロフト間のばらつきの少なさ等より、微生
物由来のものが望ましい。

また、コリンオキシダーゼとしては、いずれのものでも
使用できるが１例えば、アースロバクター°グラビホー
ミス（＾ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍ
ｉｓ）。

アルカリ土類金属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ、）
等の微生物由来のものが挙げられる。

界面活性剤としては１例えば、トリトンＸ−１００，５
ｐａｎ２０等非イオン性界面活性剤、ラウリル硫酸ナト
リウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、デオ
キシコール酸ナトリウム等陰イオン性界面活性剤が挙げ
られ、これらのうち１［！あるいは２種以上混合して使
用することが出来る。好ましくは、白濁防止効果、低温
での流動性、入手の容易さ、試薬の調製のしやすさの点
から、トリトンＸ−１００，ラウリル硫酸ナトリウム及
びラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムの組合せ、あ
るいは、デオキシコール酸ナトリウム。

トリトンｘ−ｉｏｏ及びラウリルベンゼンスルホン酸ナ
トリウムの組合せが望ましい。

２価金属塩としては９例えば、塩化マンガン。

硫酸マンガン、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、塩化バリウム等が
挙げられるが、好ましくは、溶解性、カルシウムイオン
測定域拡大効果等の点より、塩化マンガン、塩化亜鉛が
望ましい。

本発明の試薬の各成分としては１例えば、リゾレシチン
を０．２〜１０．抛ｇ　／　ｗ　ｌ　、好ましくは０．
５〜５Ｂ／ｍｌ、ホスホリパーゼＤを０．００１〜１．
ＯＵ／ｓｏｌ、好ましくは０．００５〜１．　ＯＵ／ｍ
ｌ、　　コリンオキシダーゼを０．１〜５０　Ｕ／ｍｇ
、好ましくは０．１〜１５０／＋１．　　）リドンＸ−
１００を０．００１〜５重量パーセント好ましくは０．
０１〜０．５重量パーセント、ラウリル硫酸ナトリウム
を０．００１〜５重量パーセント、好ましくは０．０１
〜０．５重量パーセット　ラウリルベンゼンスルホン酸
ナトリウムを０．００１〜５重量パーセント、好ましく
は０゜０１〜０．５重量パーセント、２価金属塩を０．
１〜２００　ｍＭ、好ましくは０．５〜１００ｍＭ使用
すればよい、緩衝液はｐＨを４．０〜１０．０．濃度を
１〜１０００ｍＭとして使用すればよいが、特にｐＨを
５．０〜９．０．濃度を１０〜５００ｍＭとして使用す
ることが望ましい。

本発明の試薬の測定原理を、リン脂質のうちのレシチン
（リゾレシチン）を用いた場合を代表例として次に示す
。

コリンオキシダーゼ コリン　＋０□−一−−−−−−−−−−−−−→　ベ
タイン　＋２Ｈｚ（ｈ　　・−■反応式■に於けるホス
ホリパーゼＤの活性発現にはカルシウムイオンの存在が
必須であり、ホスホリパーゼＤの活性はカルシウムイオ
ンの濃度に比例して上昇する。ここに本発明の２価金属
塩を共存させるとカルシウムイオン測定域が大幅に拡大
する効果が得られる。また、ここに界面活性剤を共存さ
せることにより、試薬の濁り等の防止。

カルシウム測定感度の大幅な上昇、ホスホリパーゼＤ反
応の安定化を計ることが出来る。最終的に反応式■に於
いて生成したＨ２Ｏ，を過酸化水素電極で定量するか、
またはある色原体の存在下ペルオキシダーゼを作用させ
２色調の変化を比色定置すればカルシウムイオンの定量
は完了する。特に後者が特別な装置を必要としないとい
う点で日常の検査に適している。その原理を下に示す。

□キノン　型色素 上記で用いられるペルオキシダーゼとしては。

たとえば西洋わさび由来のものが挙げられ、その濃度と
しては９例えば１〜３００　Ｕ／ｓ＋１．好ましくは５
〜２００　Ｕ／ｍｌである。

フェノール系化合物としては、たとえばフェノール、ト
ルイジン、アニリン及びそれらの誘導体が挙げられる。

その濃度としては９例えば０．０１〜２０重量パーセン
ト、好ましくは０．１〜１０重量パーセントである。色
原体としては９例えば。

４−アミノアンチピリンが挙げられる。その濃度として
は１例えば０．００１〜１０重量パーセント。

好ましくは０．０１〜５重量パーセントである。緩衝液
はｐＨを４．０〜１０．０．濃度を１〜１０００ｍＭと
して使用すればよいが、特にｐＨを５．０〜９．０．濃
度を１０〜５００ｍＭとして使用することが望ましい。

本発明の試薬を用いてカルシウムイオンを定量するには
５例えば、まず、ホスホリパーゼＤ、コリンオキシダー
ゼ、界面活性剤１色原体及びその他賦活剤を含有する試
薬溶液とサンプルをあらかじめ混合し予備加温（２５〜
３７℃のいずれの温度でもよい）した後、２価金属塩、
リン脂質、ペルオキシダーゼ、界面活性剤、フェノール
系化合物及びその他賦活剤を含有する試薬溶液を添加し
。

５００〜６４０　ｎｍの任意の波長（フェノール系化合
物９芭原体の選択により任意に設定できる）における吸
光度の上昇速度を測定すればよい、あるいは、２価金属
塩、リン脂質、コリンオキシダーゼ、界面活性剤９色原
体及びその他賦活剤を含有する試薬溶液とサンプルをあ
らかじめ混合し予備加温、（２５〜３７°Ｃのいずれの
温度でもよい）した後、ホスホリパーゼＤ、ペルオキシ
ダーゼ。

界面活性剤、フェノール系化合物及びその他賦活剤を含
有する試薬溶液を添加し、５００〜６４０ｎｍの任意の
波長（フェノール系化合物１芭原体の選択により任意に
設定できる）における吸光度の上昇速度を測定すればよ
い。

（実施例） 次に本発明を実施例によって具体的に説明する。

実施例１ リゾレシチン（卵黄由来）はシグマ社より購入。

コリンオキシダーゼおよびパーオキシダーゼは東洋紡績
社より購入、ホスホリパーゼＤはベーリンガーマンハイ
ム山之内社より購入、Ｎ−エチル−Ｎ−２−ヒドロキシ
エチル−ｍ−トルイジン（ＥＨＥＴ）は東京化成社より
、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）エチル−２−アミノ
メタンスルホン酸（ＴＢＳ）は同仁化学研究所より購入
した。その他の試薬は市販の特級試薬を使用した。

第一試薬： ＴＥＳ緩衝液・・・・・１４０ｍＭ、ｐＨ７，４ホスホ
　リパーゼＤ　（ストレプトマイセス・り■モファカス
　由来）・　・　・　・　・　・　・　・　０．０　２
　Ｕ／ｍｌコリンオキシダーゼ（アルカリ土類金属由来
）・　・　・　・　・　・　・　・　１０．５Ｕ／蒙１
４−アミノアンチピリン・・・・０．２５ｍｇ／ｍｌト
リトンＸ−１００・・・・・・・・０．０２ｗ／ｖ％第
二試薬： ＴＢＳ緩衝液−・・・−１４０ｍＭ、ｐＨ７，４リゾレ
シチン・・・・・・・・・・４．３＋ｎｇ／＋ＩＭ　ｎ
　Ｃ１ｚ　　・・・・・・・・・・・・１４．４ｓＭパ
ーオキシダーゼ（西洋わさび由来） ・・・・・・・・・１６．８Ｕ／ｍ１ ＥＨＥＴ　　　　　・・・・・・・・・１　ｍｇ／ｓｎ
ｌラウリル硫酸ナトリウム・・・・０．１１ｗ／ｖ％ラ
ウリルベンゼンスルフォン酸ナトリウム・・・・・・０
．１１ｗ／ｖ％ トリトンＸ−１００・・・・・・・・０．２０％１／ｖ
％第一試薬３２０μｌにサンプル２０μｉ、（既知濃度
のカルシウム標準液）を加え、予め３７℃で予備加温し
１次いで第二試薬２５０μｌを加え、３７℃、５４６ｎ
ｍにおける１分間あたりの吸光度変化を測定した。

第１図はカルシウム濃度と吸光度変化速度との相関を示
すもので、カルシウム濃度２５ｍｇ／ｄｌまでの従来法
に見られない良好な直線性を有することが判明した。第
２図は反応の経時変化を示すものであるが９時間経過に
対して直線的に反応が進むことが確認された。

次に上記と同一のカルシウムイオン標準液をカルシウム
イオン電極法を用いて測定し、その相関関係を調べた。

その結果を第３図に示す。第３図により２本発明によっ
て得られた値とカルシウムイオン電極法によって得られ
た値とは良好な相関関係を示していることが明らかであ
る。

比較例１ 第４図は、上記の試薬よりＭｎＣ１，のみを抜いた組成
の試薬を作成しこれを用いてカルシウム濃度と吸光度変
化速度との相関関係を示すものであるが、この条件では
良好な直線性は得られないことが明らかである。

実施例２ 基質として、レシチンを使用することも可能である。以
下にその組成を示す。レシチン（卵黄由来）はシグマ社
より購入した。その他の試薬は。

実施例１と同じである。

第一試薬： ＴＢＳ緩衝液・・・・・１３８ｍＭ、ＰＨ７，４レシチ
ン・・・・・・・・・・・・６　ｍｇ／ｍ１Ｍ　ｎ　Ｃ
１，、・・・・・・・・・・・・１０顛門コリンオキシ
ダーゼ（アルカリ土類金属由来）・・・・・・・・９．
３ｔｌ／ｍ１ ４−アミノアンチピリン・・・・０．２２　ｐｇ／ｍｌ
ラウリル硫酸ナトリウム・・・・０．２８ｗ／ν％デオ
キシコール酸ナトリウム・・０．２８ｗ／ｖ％Ｔｒｉｔ
ｏｎｘ−１００・・・・・・・・・０．７５賀／ｖ％第
二試薬： ＴＢＳ緩衝液・・・・・１４２ｍＭ、ｐＨ７，４ホスホ
　リパーゼＤ（ストレプトマイセス・りＵモファカス　
由来）・　・　・　・　・　・　・　・　０．０３Ｕ／
■ｌパーオキシダーゼ（西洋わさび由来） ・・・・・・・・・２０Ｕ／■１ ＥＨＥＴ　　　　　・・・・・・・・・１　ｍｇ／ｍｌ
測定の手順等は実施例１と同じである。

第５図に示すとおり、カルシウム濃度と吸光度変化速度
の相関は、２０＋ｇ／ｄｉまで良好な直線性が得られた
。

実施例３ ２価金属塩として塩化亜鉛を用いることも可能である。

試薬組成を以下に示す。

第一試薬： ＴＢＳ緩衝液・・・・・１３８ｍＭ、ＰＨ７，４リゾレ
シチン・・・・・・・・・・・３Ｉｌ１ｇ／１ＩｌｌＺ
ｎ　　Ｃ／！、　　・　・　・　・　・　・　・　・　
・　・　・　・　・　６６ｍＭコリンオキシダーゼ（ア
ルカリ土類金属由来）・　・　・　・　・　・　・　・
　９．３Ｕ／ｍ１４−アミノアンチピリン・・・・０．
２２　ｍｇ／ｍｌラウリル硫酸ナトリウム・・・・０．
０８ｗ／ｖ％ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム・
・・・・０．０８ｗ／ｖ％ トリトンＸ−１００・　・・　・　・　・　・　・０．
０８ｗ／ｖ％第二試薬： ＴＢＳ緩衝液・・−・・１４２ｍＭ、ｐＨ７，４ホスホ
リパーゼＤ　（ストレプトマイセス・りＵモファカス　
由来）・　・　・　・　・　・　・　・　・　０．３　
Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ（西洋わさび由来） ・・・・・・・・・２０υ／ｍ１ ＥＨＥＴ　　　　　・・・・・・・・・１　ｍｇ／＋１
測定の手順等は、実施例１と同しである。

第６図に示すとおり、カルシウム濃度と吸光度変化速度
の相関は、　　２０Ｗ１ｇ／ｄｉまで良好な直線性が得
られた。

実施例４ サンプルとしてマグネシウムイオンを添加したカルシウ
ム標準液（マグネシウム濃度：　３０　ｍｇ／ｄ１゜１
５ｍｇ／ｄｉ　）を用いて、実施例１と同様の検討をし
た。その結果９本測定系は共存するマグネシウムイオン
の影響を受けないことが判った。

（発明の効果） 本発明により、簡単な操作で精度よく、連続して生体液
中のカルシウムイオン濃度を定量出来るようになった。

２価金属塩と界面活性剤を加えたことにより、従来問題
となっていたカルシウムイオンの測定範囲を大幅に改善
し、また、生体液中に含有されている塩類や金属イオン
等による影響を受けず、さらに連続測定が可能となり、
カルシウムイオン測定用試薬の性能が飛躍的に向上した
。

本発明は、自動分析機に応用可能な方法であり。

臨床検査の分野において従来にはなかった有利な試薬を
提供出来るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の検量線を示す図である。第２図は実
施例１の経時変化を示す図である。第３図はカルシウム
イオン電極法における測定値と実施例１の試薬における
測定値との関係を示す図である。第４図は比較例１の検
量線を示す図である。 第５図は実施例２の検量線を示す図である。第６図は実
施例３の検量線を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質、ホスホリパーゼＤ、コリンオキシダー
   ゼ、界面活性剤及び２価金属塩からなるカルシウムイオ
   ン測定用試薬。