CN100354630C - 样品中钙的测定试剂和测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供可以低成本且准确地测定样品中钙的测定试剂和测定方法。本发明样品中钙的测定方法包括，a)所述样品与磷脂酶C和/或磷脂酶D和通式(I)表示的化合物磷脂酶C和/或磷脂酶D的底物混合反应(式中，X1是显色基团；X2是氢原子、显色基团或有或无取代基的烷基或苯基；X3是氢原子、显色基团或有或无取代基的烷基或苯基)，使显色基团从所述化合物解离的步骤，和b)比色测定该解离的显色基团的步骤。本发明还涉及含有所述测定方法中使用的各反应成分的样品中钙的测定试剂。

Description

样品中钙的测定试剂和测定方法

技术领域

本发明涉及测定样品中钙的钙测定试剂和测定方法。

本发明的样品中钙的测定试剂和测定方法，可以低成本地测定样品中的钙，并且可以提高测定灵敏度，重现性好，可以准确地测定钙浓度。

本发明特别适用于化学、生命科学、分析化学和临床检查等的领域。

背景技术

人体内大约存在1200g钙，其中大约99％的钙存在于骨和牙齿中，剩下的大约1％的钙存在于血液等体液或肌肉等中。这1％的钙具有止血，神经功能或肌肉运动等作用，在维持生命和活动中起重要作用。血液中的钙浓度随钙的吸收异常、骨疾病、内分泌疾病、高血压或动脉硬化症等变化，所以对其的测定在临床上非常重要。

现在，作为钙的测定方法而使用的方法有原子吸光法，电极法，邻甲酚酞络合酮法(以下，简称OCPC法)。这些方法需要昂贵的机器，样品需要预处理。特别是OCPC法受镁离子的影响，存在温度或测定时间不同时吸光度发生变化等缺点。

因此，最近，作为利用钙离子对酶的活化或阻碍的测定方法，提出了利用钙离子对磷脂酶D的活化进行测定(例如，特开昭62-195297号公报和特开平4-187098号公报。)，利用钙离子对丙酮酸激酶活性的阻碍进行测定(例如，特开平2-142498号公报)，利用钙离子对α-淀粉酶的活化进行测定(例如，特开平2-276597号公报)等。

但是，这些对样品中钙的测定方法(测定试剂)中，利用钙离子的阻碍时，存在测定范围有限的缺点。另外，利用α-淀粉酶的活化时，存在容易受到样品中α-淀粉酶的影响的问题。另外，利用钙离子对磷脂酶D的活化时，特征明显，测定灵敏度也很高，但是，通过联结酶对磷脂酶D和磷脂酶D的底物反应生成的产物进行测定时，必需进行pH的调整等复杂的操作。

因此，这些钙测定试剂和测定方法的测定成本也高。

发明内容

所以，本发明的目的是提供测定试剂和测定方法，其利用钙离子对磷脂酶C和/或磷脂酶D的活化进行测定体系中，控制测定成本，可以低成本地测定样品中钙浓度，并且可以提高测定灵敏度，重现性好，能够准确测定钙浓度

本发明者们，以解决所述问题为目标，进行了认真研讨，结果发现，利用钙离子对磷脂酶C和/或磷脂酶D的活化进行测定时，作为磷脂酶C和/或磷脂酶D的底物使用下述通式(I)表示的化合物(式中，X1是显色基团；X2是氢原子、显色基团或有或无取代基的烷基或苯基；X3是氢原子、显色基团或有或无取代基的烷基或苯基)，可以准确测定样品的钙。另外，还发现测定体系中存在金属离子、螯合剂或含氮化合物中的至少一种物质可以扩大样品的钙浓度的测定范围，从而完成了本发明。

即，本发明提供下述发明。

(1)样品中钙的测定试剂，其至少含有磷脂酶C和/或磷脂酶D及磷脂酶C和/或磷脂酶D的底物，所述底物是下述通式(I)表示的化合物(式中，X1是显色基团；X2是氢原子、显色基团或有或无取代基的烷基或苯

基；X3是氢原子、显色基团或有或无取代基的烷基或苯基)。

(2)如(1)所述的测定样品中钙的测定试剂，其特征为，含有调整磷脂酶C和/或磷脂酶D对应钙表现出的Km值在0.3～10mM的物质。

(3)如(1)或(2)所述的测定样品中钙的测定试剂，其特征为，含有金属离子、螯合剂或含氮化合物中的至少一种物质。

(4)如(1)～(3)任意一项所述的样品中钙的测定试剂，其特征为，含有非离子型表面活性剂和/或阴离子型表面活性剂。

(5)样品中钙的测定方法，其特征为，所述方法包括以下步骤：

a)所述样品与磷脂酶C和/或磷脂酶D、通式(I)表示的化合物磷脂酶C和/或磷脂酶D的底物混合反应(式中，X1是显色基团；X2是氢原子、显色基团或有或无取代基的烷基或苯基；X3是氢原子、显色基团或有或无取代基的烷基或苯基)，使显色基团从所述化合物解离的步骤，和

b)比色测定该游离的显色基团的步骤。

(6)如(5)所述的样品中钙的测定方法，其特征为，所述步骤a)中，存在调整磷脂酶C和/或磷脂酶D对应钙表现出的Km值为0.03～10mM的物质。

(7)如(5)或(6)所述的所述步骤a)中，存在金属离子、螯合剂或含氮化合物中的至少一种物质。

(8)如(5)～(7)任意一项所述的样品中钙的测定方法，其特征为，所述步骤a)中，含有非离子型表面活性剂和/或含阴离子型表面活性剂。

附图说明

[图1]磷脂酶D的底物是二(4-硝基苯基)磷酸、4-硝基苯基苯基磷酸和4-硝基苯基磷酸的样品中钙的测定结果的图解。

[图2]测定试剂含有钴离子的样品中钙的测定结果的图解。

[图3]测定试剂含有镍离子的样品中钙的测定结果的图解。

[图4]测定试剂含有锌离子的样品中钙的测定结果的图解。

[图5]测定试剂含有螯合剂柠檬酸的样品中钙的测定结果的图解。

[图6]测定试剂含有螯合剂草酸、酒石酸或柠檬酸的样品中钙的测定结果的图解。

[图7]测定试剂含有非离子型表面活性剂BO-10TX时测定反应时程的图解。

[图8]测定试剂含有阴离子型表面活性剂LMT时样品中钙的测定结果的图解。

[图9]测定试剂含有各种表面活性剂时测定样品空白试验值(血清空白试验值)的结果的图解。

[图10]测定试剂含有含氮化合物硫酸铵时样品中钙的测定结果的图解。

[图11]测定试剂含有含氮化合物精氨酸时样品中钙的测定结果的图解。

[图12]测定试剂含有含氮化合物咪唑时样品中钙的测定结果的图解。

具体实施方式

(1)磷脂酶C和/或磷脂酶D的底物

本发明中，用下述通式(I)表示的化合物(式中，X1是显色基团；X2是氢原子、显色基团或有或无取代基的烷基或苯基；X3是氢原子、显色基团或有或无取代基的烷基或苯基)作为磷脂酶C和/或磷脂酶D的底物。

所述通式(I)表示的化合物中，作为显色基团，只要是磷酸根上成酯时和通过水解与磷酸根解离时的吸光度或透过率等信号有差别的显色基团即可。

另外，作为所述显色基团，优选磷酸根上成酯时和与磷酸根解离时的吸光度或透过率等信号的差别大。

所以，显色基团X1、显色基团X2和显色基团X3之间可以完全相同，也可以部份不同，或全部不同。

所述显色基团X1、显色基团X2和显色基团X3部份不同时，或全部不同时，优选各自的测定波长范围，即最大吸收波长相同或相近。

所述通式(I)表示的化合物中，作为显色基团，可以举出例如，4-硝基苯基、2-氯-4-硝基苯基、2，6-二氯-4-硝基苯基、2，6-二氯-乙酰苯基或乙酰苯基等。

还有，所述通式(I)表示的化合物中，作为烷基，可以举出例如，甲基、乙基、丙基或异丙基等。

并且，作为取代烷基和取代苯基的取代基，可以相同或不同，取代数为1～3，例如，羟基、低级烷氧基、氨基或卤素基团等。

还有，所述通式(I)表示的化合物中，作为X2和X3都不是显色基团的化合物，可以举出例如，4-硝基苯基磷酸(以下，也称作4-NPP)，4-硝基苯基苯基磷酸〔以下也称4-NPPP〕、2-氯-4-硝基苯基磷酸〔以下也称4-CNPP〕、2-氯-4-硝基苯基苯基磷酸〔以下也称4-CNPPP〕、2，6-二氯-4-硝基苯基磷酸〔以下也称2，6-DCNPP〕、2，6-二氯-4-硝基苯基苯基磷酸〔以下也称2，6-DCNPPP〕、2，6-二氯-乙酰苯基磷酸〔以下也称2，6-DCAPP〕、2，6-二氯-乙酰苯基苯基磷酸〔以下也称2，6-DCAPPP〕、乙酰苯基磷酸〔以下也称APP〕或乙酰苯基苯基磷酸〔以下也称APPP〕或者这些物质的盐等。

再者，所述通式(I)表示的化合物中，X2是显色基团，且X3不是显色基团的化合物，可以举出例如，二(4-硝基苯基)磷酸〔以下也称Bis-4-NPP〕、二(2-氯-4-硝基苯基)磷酸〔以下也称Bis-4-CNPP〕、二(2，6-二氯-4-硝基苯基)磷酸〔以下也称Bis-2，6-DCNPP〕、二(2，6-二氯-乙酰苯基)磷酸〔以下也称Bis-2，6-DCAPP〕或二乙酰苯基磷酸〔bis-APP〕或这些物质的盐等。

另外、所述通式(I)表示的化合物中，作为X2是显色基团、且X3也显色基团的化合物，可以举出例如、三(4-硝基苯基)磷酸〔以下也称Tris-4-NPP〕、三(2-氯-4-硝基苯基)磷酸〔以下也称Tris-4-CNPP〕、三(2，6-二氯-4-硝基苯基)磷酸〔以下也称Tris-2，6-DCNPP〕、三(2，6-二氯-乙酰苯基)磷酸〔以下也称Tris-2，6-DCAPP〕或三乙酰苯基磷酸〔Tris-APP〕或这些物质的盐等。

作为本发明所述通式(I)表示的化合物，优选二(4-硝基苯基)磷酸、二(2-氯-4-硝基苯基)磷酸、二(2，6-二氯-4-硝基苯基)磷酸、二(2，6-二氯-乙酰苯基)磷酸或者二乙酰苯基磷酸或这些物质的盐等X1，X2都是显色基团的化合物。

这是因为在被钙活化的磷脂酶C和/或磷脂酶D的催化作用下，在X2和X3不是显色基团时，与磷酸根解离的显色基团，只有X1，而X1和X2是显色基团时，X1和X2双方与磷酸根解离，得到的信号是原来的2倍，所以可以高灵敏度地进行测定。

同理，作为本发明所述通式(I)表示的化合物，优选三(4-硝基苯基)磷酸〔以下也称Tris-4-NPP〕、三(2-氯-4-硝基苯基)磷酸〔以下也称Tris-4-CNPP〕、三(2，6-二氯-4-硝基苯基)磷酸〔以下也称Tris-2，6-DCNPP〕、三(2，6-二氯-乙酰苯基)磷酸〔以下也称Tris-2，6-DCAPP〕或三乙酰苯基磷酸〔Tris-APP〕或这些物质的盐等X1、X2和X3都是显色基团的化合物。

另外，所述通式(I)表示的化合物与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D混合反应时，浓度优选在0.02～200mM的范围，特别优选在0.1～100mM的范围。

另外，对于本发明的样品中钙的测定试剂中含有的所述通式(I)表示的化合物的浓度，与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D混合反应时，浓度定为0.02～200mM，优选定为0.1～100mM。

例如，含有所述通式(I)表示的化合物0.02～200mM，优选含有0.1～100mM。

另外，所述通式(I)表示的化合物，作为商品获取较容易，专业人士也可以适宜的配合众所周知的合成方法容易地进行制造。

(2)磷脂酶C

本发明中，磷脂酶C(EC3.1.4.3)是使甘油磷脂的二酰基甘油基与胆碱磷酸基之间的酯键水解成游离的二酰基甘油基与胆碱磷酸基的酶。

作为本发明使用的磷脂酶C，也可以使用以往任何的磷脂酶C，可以举出例如，来源于链霉菌属、梭菌属、杆菌属或假单孢菌属等微生物，或来源于高等动物的脑、肝、脾脏或红血球等动物组织的磷脂酶C等。

另外，作为所述磷脂酶C，也包括通过将微生物等的基因植入大肠菌等微生物等的基因重组技术制造的，或从通过改变基因来改良性质的微生物等得到的磷脂酶C等。

所述磷脂酶C与样品、所述通式(I)表示的化合物混合反应时的活性值，优选在0.01～10单位/mL的范围，更优选在0.01～5单位/mL的范围。

还有，关于本发明的样品中钙的测定试剂中含有的磷脂酶C的活性值，与样品、所述通式(I)表示的化合物混合反应时的活性值是0.01～10单位/mL，优选为0.01～5单位/mL。

例如，含有磷脂酶C 0.01～10单位/mL，优选含有0.01～5单位/mL。

(3)磷脂酶D

本发明中，磷脂酶D(EC3.1.4.4)是使甘油磷脂的磷脂酰基和碱之间的酯键水解，解离成磷脂酸和碱的酶。

作为本发明使用的磷脂酶D，也可以使用以往的任何磷脂酶D，可以举出例如，来源于洋白菜、胡萝卜、菠菜、棉籽或花生等植物组织，来源于猪胰脏等动物组织，或来源于链霉菌属、小单孢菌属、拟诺卡氏菌属、放线菌属或诺卡氏菌属等微生物等的磷脂酶D。

另外，作为所述磷脂酶D，也包括通过将微生物等的基因植入大肠菌等微生物等的基因重组技术制造的，或从通过改变基因等方法的改良性质的微生物等制造的磷脂酶D等。

本发明中，优选使用来源于链霉菌属微生物的磷脂酶D。

所述磷脂酶D与样品、所述通式(I)表示的化合物混合反应时的活性值，优选在0.01～10单位/mL的范围，特别优选0.01～5单位/mL的范围。

还有，关于本发明的样品中钙的测定试剂中含有的磷脂酶D活性值，与样品、所述通式(I)表示的化合物混合反应时的活性值为0.01～10单位/mL，优选为0.01～5单位/mL。

例如，含有磷脂酶D0.01～10单位/mL，优选含有0.01～5单位/mL。

(4)调整磷脂酶C和/或磷脂酶D对应钙表现出的Km值在0.03～10mM的物质

(a)调整表现出的Km值在0.03～10mM的物质

本发明的样品中钙的测定试剂中，优选含有调整磷脂酶C和/或磷脂酶D对应钙表现出的Km值在0.03～10mM的物质。

而且，更优选含有调整表现出的Km值在0.1～3mM的物质。

还有，本发明的样品中钙的测定方法中，样品与磷脂酶C和/或磷脂酶D、所述通式(I)表示的化合物混合反应时，优选显色基团从所述化合物解离的步骤中存在调整磷脂酶C和/或磷脂酶D对应钙表现出的Km值在0.03～10mM的物质

并且，更优选存在调整所述表现出的Km值在0.1～3mM的物质。

测定试剂中含有所述调整表现出的Km值在0.03～10mM(更加优选0.1～3mM)的物质，或在该物质存在下进行测定，样品中钙的测定的线性可延伸到高浓度。

作为所述调整表现出的Km值在0.03～10mM(更优选0.1～3mM)的物质，可以举出例如，金属离子、螯合剂或含氮化合物等。

即，作为所述调整表现出的Km值在0.03～10mM(更优选0.1～3mM)的物质，金属离子、螯合剂或含氮化合物等中至少一种包含在本发明的样品中钙的测定试剂中，或存在于本发明测定方法中使显色基团解离于底物的步骤。

调整磷脂酶C和/或磷脂酶D对应钙表现出的Km值在0.03～10mM(更优选0.1～3mM)的物质可以只使用一种，也可以同时使用多种。

另外，本发明中，可以同时使用所述金属离子、螯合剂和/或含氮化合物。

(b)金属离子

本发明中，作为所述调整磷脂酶C和/或磷脂酶D对应钙表现出的Km值在0.03～10mM(更优选0.1～3mM)的物质，优选使用金属离子。

作为所述金属离子，可以举出例如，钴离子、镍离子或锌离子等。

所述金属离子可以只使用1种，也可以同时使用几种。

另外，所述金属离子与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物共存时，浓度优选在0.005～50mM的范围。

例如，钴离子优选在0.1～50mM的范围，镍离子优选在0.05～25mM的范围，而锌离子优选在0.005～2.5mM的范围。

还有，关于本发明的样品中钙的测定试剂中含有的所述金属离子的浓度，与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，浓度可以为0.005～50mM。

例如，可以含有所述金属离子0.005～50mM。

具体地说，钴离子优选0.1～50mM，镍离子优选0.05～25mM，而锌离子优选0.005～2.5mM。

(c)螯合剂

还有，本发明中，作为所述调整磷脂酶C和/或磷脂酶D对应钙表现出的Km值在0.03～10mM(更优选0.1～3mM)的物质，也可以使用螯合剂。

其中，作为螯合剂，可以举出例如，柠檬酸、酒石酸、草酸、丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸或苹果酸等羧酸或其盐等。

所述螯合剂可以只使用1种，也可以同时使用几种。

另外，所述螯合剂与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物共存时，浓度优选在0.1～200mM的范围，更优选在5～150mM的范围。

还有，关于本发明的样品中钙的测定试剂中含有的所述螯合剂的浓度，与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，浓度可以为0.1～200mM，特别优选为5～150mM。

例如，所述螯合剂优选为0.1～200mM，特别优选为5～150mM。

(d)含氮化合物

另外，本发明中，作为所述调整磷脂酶C和/或磷脂酶D对应钙表现出的Km值在0.03～10mM(更优选0.1～3mM)的物质，也可以使用含氮化合物。

其中，作为含氮化合物，可以举出例如，胺类、碱性氨基酸、杂环化合物或胍或这些的衍生物等。

更具体的有，作为胺类，可以举出例如，氨、铵或其衍生物或这些物质的盐等。作为所述铵盐，可以举出例如，氯化铵或硫酸铵等。

还有，作为碱性氨基酸，可以举出例如，精氨酸、赖氨酸、组氨酸或其衍生物或这些物质的盐等。

还有，作为杂环化合物，可以举出例如，咪唑或其衍生物或这些物质的盐等。

还有，作为胍或其衍生物，可以举出例如，胍盐酸盐、胍硫氰酸盐、胍硫酸盐、胍硝酸盐、胍碳酸盐或胍磷酸盐等胍盐，氨基胍或苯基胍等。

另外，这些含氮化合物可以只使用一种，也可以同时使用几种。

另外，所述含氮化合物与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物共存时，浓度优选在1mM～2M的范围，特别优选在10mM～1M的范围。

还有，关于本发明的样品中钙的测定试剂中含有的所述含氮化合物的浓度，与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，浓度优选为1mM～2M，特别优选为10mM～1M。

例如，所述含氮化合物优选为1mM～2M，特别优选为10mM～1M。

(5)金属离子

本发明的样品中钙的测定试剂中，优选含有金属离子。

还有，本发明的样品中钙的测定方法优选样品与磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应，使显色基团与所述化合物解离的步骤中存在金属离子。

作为所述金属离子，可以举出例如，钴离子，镍离子，或锌离子等。

所述金属离子可以只使用1种，也可以同时使用几种。

通过测定试剂中含有所述金属离子或与所述金属离子共存下进行测定，样品中钙的测定的线性可延伸到高浓度。

另外，所述金属离子与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物共存时，浓度优选在0.005～50mM的范围。

例如，钴离子优选在0.1～50mM的范围，镍离子优选在0.05～25mM的范围，而锌离子优选0.005～2.5mM的范围。

还有，关于本发明的样品中钙的测定试剂中含有的所述金属离子的浓度，与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，浓度可以为0.005～50mM。

例如，钴离子优选0.1～50mM，镍离子优选0.05～25mM，而锌离子优选0.005～2.5mM。

(6)螯合剂

本发明的样品中钙的测定试剂中，优选含有螯合剂。

还有，本发明的样品中钙的测定方法优选样品与磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应，使显色基团与所述化合物解离的步骤中存在螫合剂。

通过测定试剂中含有所述螯合剂或与所述螯合剂共存下进行测定，样品中钙的测定的线性可以延伸到高浓度。

其中，作为螯合剂，可以举出例如，柠檬酸、酒石酸、草酸、丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸或苹果酸等羧酸或其盐等。

所述螫合剂可以只使用1种，也可以同时使用几种。

另外，所述螯合剂与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物共存时，浓度优选在0.1～200mM的范围，更优选在5～150mM的范围。

还有，关于本发明的样品中钙的测定试剂中含有的所述螯合剂的浓度，与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，浓度可以为0.1～200mM，特别优选为5～150mM。

例如，所述螯合剂优选为0.1～200mM，特别优选为5～150mM。

(7)含氮化合物

本发明的样品中钙的测定试剂中，优选含有含氮化合物。

还有，本发明的样品中钙的测定方法优选样品磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应，使显色基团与所述化合物解离的步骤中存在含氮化合物。

通过测定试剂中含有所述含氮化合物或与所述含氮化合物共存下进行测定，样品中钙的测定的线性可以延伸到高浓度。

其中，作为含氮化合物，可以举出例如，胺类、碱性氨基酸、杂环化合物或胍或这些的衍生物等。

更具体的有，作为胺类，可以举出例如，氨、铵或其衍生物或这些物质的盐等。作为所述铵盐，可以举出例如，氯化铵或硫酸铵等。

还有，作为碱性氨基酸，可以举出例如，精氨酸、赖氨酸、组氨酸或其衍生物或这些物质的盐等。

还有，作为杂环化合物，可以举出例如，咪唑或其衍生物或这些物质的盐等。

还有，作为胍或衍生物，可以举出例如，胍盐酸盐、胍硫氰酸盐、胍硫酸盐、胍硝酸盐、胍碳酸盐或胍磷酸盐等胍盐，氨基胍或苯基胍等。

另外，这些含氮化合物可以只使用一种，也可以同时使用几种。

另外，所述含氮化合物与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物共存时，浓度优选在1mM～2M的范围，特别优选在10mM～1M的范围。

还有，本关于发明的样品中钙的测定试剂中含有的所述含氮化合物的浓度，与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，浓度优选为1mM～2M，特别优选为10mM～1M。

例如，所述含氮化合物优选为1mM～2M，特别优选为10mM～1M。

(8)测定样品中钙时的pH

本发明的样品中钙的测定方法中，作为样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时的pH，可以举出pH5.0～pH9.0。

还有，作为本发明的样品中钙的测定试剂的pH，样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，pH可以为pH5.0～pH9.0。

但是，样品是体液等时，所述样品中可能混有磷酸二酯酶，这样即使样品中不存在钙，所述磷酸二酯酶也会使显色基团解离于所述通式(I)表示的化合物，使信号产生，从而导致测定值产生正误差。

而所述磷酸二酯酶的酶活性的适宜pH范围为pH8.0～pH9.0。

因此，所述混合反应时的pH设定为pH5.5～pH8.0，优选为pH5.5～pH7.5，这样可以抑制因为所述磷酸二酯酶产生的误差。

另外，作为形成所述pH范围使用的缓冲液，可以使用在所述pH范围有缓冲能力的以往公知的适宜的缓冲液。

作为所述缓冲液，可以举出例如，磷酸、三(羟基甲基)氨基甲烷、咪唑、甘氨酰甘氨酸、MES、Bis-Tris、ADA、ACES、Bis-Tris丙烷、PIPES、MOPSO、MOPS、BES、HEPES、TES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPS、HEPPSO、Tricine、Bicine、TAPS等各种缓冲液。

(9)非离子型表面活性剂

本发明的样品中钙的测定方法中，为了稳定反应的时程，样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，优选存在非离子型表面活性剤。

还有，同理，本发明的样品中钙的测定试剂中，优选含有非离子型表面活性剂。

作为所述非离子型表面活性剂，可以举出如下所述物质等。

(a)聚氧乙烯烷基醚、聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧丙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯聚苯乙烯基苯基醚或聚氧乙烯聚氧丙二醇等聚氧烯烃醚类化合物。

(b)甘油脂肪酸部分酯、脱水山梨醇脂肪酸部分酯、季戊四醇脂肪酸部分酯、丙二醇单脂肪酸酯或蔗糖脂肪酸部分酯等多元醇部分酯化合物。

(c)聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸部分酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸部分酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸部分酯、聚乙烯二醇脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸部分酯或聚氧乙烯化蓖麻油等聚氧乙烯化多元醇脂肪酸酯。

(d)脂肪酸二乙醇酰胺、N，N-二2-羟基烷基胺、聚氧乙烯烷基胺、三乙醇胺脂肪酸酯或三烷基氧化胺等氨化物或胺化物。

另外，作为所述非离子型表面活性剂，优选例如，Triton X-100(和光纯药工业社)或BO-10TX(日光化学社)等。

另外，所述非离子型表面活性剂与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物共存时，浓度优选在0.0001～1％的范围，特别优选在0.001～0.5％的范围。

还有，关于本发明的样品中钙的测定试剂中含有的所述非离子型表面活性剂的浓度，与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，浓度为0.0001～1％，特别优选为0.001～0.5％。

例如，钙测定试剂中含有0.0001～1％的所述非离子型表面活性剂，特别优选含有0.001～0.5％的所述非离子型表面活性剂。

(10)阴离子型表面活性剂

本发明的样品中钙的测定方法优选样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，存在阴离子型表面活性剂。

还有，本发明的样品中钙的测定试剂中，优选含有阴离子型表面活性剂。

作为所述阴离子型表面活性剂，可以举出如下所述等。

(a)脂肪族单羧酸盐、N-脂酰基肌氨酸盐、N-脂酰基-β-丙氨酸盐或N-脂酰基谷氨酸盐等脂肪族化合物羧酸盐；或松香酸盐等环状化合物羧酸盐。

(b)二烷基硫代琥珀酸盐、烷烃磺酸盐或羟基烷烃磺酸盐等脂肪族化合物磺酸盐；直链烷基苯磺酸盐、烷基(支链)苯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、烷基苯氧基聚氧乙烯丙磺酸酸盐、聚氧乙烯烷基酚磺酸盐或萘磺酸盐-甲醛缩合物等环状化合物磺酸盐；或N-甲基-N-油烯基牛磺酸钠或N-烷基硫代琥珀酸单酰胺二钠盐等含氮化合物磺酸盐。

(c)硫酸蓖麻油，硫酸牛脚油、脂肪酸烷基酯、硫酸酯盐、烷基硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸酯盐、脂肪酸单甘油硫酸酯盐或聚氧乙烯烷酰胺硫酸酯盐等脂肪族化合物硫酸酯盐；或聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸酯盐或聚氧乙烯苯乙烯基苯基醚硫酸酯盐等环状化合物硫酸酯盐。

(d)烷基磷酸酯盐或聚氧乙烯烷基醚磷酸酯盐等脂肪族化合物磷酸酯盐；或聚氧乙烯烷基苯基醚磷酸酯盐等环状化合物磷酸酯盐。

(e)苯乙烯-马来酸酐共聚物的部分皂化物或链烯烃-马来酸酐共聚物的部分皂化物等聚合型高分子化合物的皂化物。

(f)萘磺酸盐-甲醛缩合物等聚合型高分子化合物。

(g)聚氧乙烯烷基醚醋酸盐，聚氧乙烯烷基苯基醚醋酸盐。

本发明的样品中钙的测定方法中，样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，存在阴离子表面活性剂，或本发明的样品中钙的测定试剂中含有阴离子型表面活性剂，可以改善钙测定的灵敏度，即使样品中只有微量的钙，也可以进行准确测定。

再者，本发明的样品中钙的测定方法中，样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，存在阴离子表面活性剂，或本发明的样品中钙的测定试剂中含有阴离子型表面活性剂，可以抑制磷酸二酯酶的酶活性，例如即使样品中混有磷酸二酯酶，也可以防止所述磷酸二酯酶带来的测定误差。

即，存在所述阴离子型表面活性剂或含有所述阴离子型表面活性剂，即使pH没有如前所述设定为pH5～pH8.0(更优选pH5.5～pH7.5)，也可以防止所述磷酸二酯酶带来的测定误差。

另外，存在所述阴离子型表面活性剂或含有所述阴离子型表面活性剂，可以改善钙测定的灵敏度，作为阴离子型表面活性剂，优选磺酸盐化合物，聚氧乙烯烷基醚硫酸酯盐或N-酰基牛磺酸盐等。

更具体的可以举出，例如，作为所述磺酸盐化合物的硫代琥珀酸二辛烷基钠(OTP-100)〔日光化学社〕等，作为聚氧乙烯烷基醚硫酸酯盐的SBL-2N-27〔日光化学社〕等，还有，作为N-酰基牛磺酸盐的CMT-30或LMT〔日光化学社〕等。

还有，存在所述阴离子型表面活性剂或含有所述阴离子型表面活性剂，可以抑制磷酸二酯酶的酶活性，可以防止样品中混有的磷酸二酯酶导致的测定误差，其中，作为阴离子型表面活性剂，优选例如，N-脂酰基肌氨酸盐、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸酯盐、聚氧乙烯烷基醚醋酸盐、胆酸或其盐、去氧胆酸或其盐等。

更具体可以举出，例如，作为所述N-脂酰基肌氨酸盐的可可酰基肌氨酸钠(肌氨酸酯CN-30)〔日光化学社〕或十二烷酰基肌氨酸钠(肌氨酸酯LN)〔日光化学社〕等，作为聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸酯盐的聚氧乙烯壬基苯基醚硫酸三乙醇胺(SNP-4T)〔日光化学社〕等，作为聚氧乙烯烷基乙醚醋酸盐的聚氧乙烯烷基醚醋酸钠(ECTD-6NEX)〔日光化学社〕等，作为胆酸盐的胆酸钠等，作为去氧胆酸盐的去氧胆酸钠等。

所述阴离子型表面活性剂与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物共存时，浓度优选在0.0001～1％范围，特别优选在0.001～0.5％的范围。

还有，关于本发明的样品中钙的测定试剂中含有的所述阴离子型表面活性剂的浓度，与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，浓度设定为0.0001～1％，特别优选设定为0.001～0.5％。

例如，所述阴离子型表面活性剂设定为0.0001～1％，特别优选设定为0.001～0.5％。

(11)钙的添加

本发明的样品中钙的测定试剂或钙测定方法中，可以根据需要向所述测定试剂或测定反应液添加钙离子或其盐等，使其共存。

根据所述钙离子或其盐的添加、共存可以改善样品中钙的测定检测线的拥挤现象。

(12)构成测定试剂等的成分

本发明的样品中钙的测定试剂或钙测定方法中，除了所述成分以外，根据需要可适当地含有ケ一ソンCG等抗菌剂或庆大霉素等抗生素等已知的防腐剂等或与其共存。

(13)试剂等的构成

本发明的样品中钙的测定方法和钙测定试剂，可以1步法(1试剂体系)实施构成，但测定试剂长期保存使用时，优选采用2步法(2试剂体系)等多步法(多试剂体系)实施构成。

另外，优选在测定试剂中分别含有磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物。

这是因为，共存时即使只有少量的钙混入，长期保存中所述通式(I)表示的化合物也会被磷脂酶C和/或磷脂酶D分解。

(14)作用于磷酸单酯化合物的酶

本发明的样品中钙的测定方法中，所述通式(I)表示的化合物X2或X3是显色基团时，或所述通式(I)表示的化合物X2和X3是显色基团时，优选样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，还存在不作用于磷酸二酯化合物和磷酸三酯化合物，只对磷酸单酯化合物的酯键水解的酶。

这是因为，样品中存在钙时，磷脂酶C和/或磷脂酶D虽然使所述通式(I)表示的化合物的X1、X2和/或X3水解解离，但由于反应时的条件限制，从第一个(或第二个)的显色基团的水解到第二个(或第三个)显色基团的水解时间长。

此时，如果存在不作用于磷酸二酯化合物和磷酸三酯化合物只作用于磷酸单酯化合物的酯键的使其水解的酶，第一个(或第二个)的显色基团水解生成的磷酸单酯化合物在所述不作用于磷酸二酯化合物只水解磷酸单酯化合物的酯键的酶的作用下，可以缩短第二个(或第三个)显色基团水解的时间。

另外，所述酶不作用于磷酸二酯化合物和磷酸三酯化合物，所以样品中不存在钙，则磷脂酶C和/或磷脂酶D不对所述通式(I)表示的化合物起作用(没有水解)，所述酶也不会水解显色基团，所以不会产生测定正误差。

同理，本发明的样品中钙的测定试剂中，所述通式(I)表示的化合物的X2或X3是显色基团时，或所述通式(I)表示的化合物的X2和X3是显色基团时，优选含有不作用于磷酸二酯化合物和磷酸三酯化合物只水解磷酸单酯化合物的酯键的酶。

作为所述不作用于磷酸二酯化合物和磷酸三酯化合物只水解磷酸单酯化合物的酯键的酶，可以举出例如，碱性磷酸酯酶(ALP)或酸性磷酸酯酶(ACP)等。

所述不作用于磷酸二酯化合物和磷酸三酯化合物只水解磷酸单酯化合物的酯键的酶与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时的活性值在0.01～10单位/mL的范围，优选在0.1～5单位/mL的范围。

还有，关于本发明的样品中钙的测定试剂中含有的不作用于磷酸二酯化合物和磷酸三酯化合物只水解磷酸单酯化合物的酯键的酶的活性值，与样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和所述通式(I)表示的化合物混合反应时，活性值是0.01～10单位/mL，优选为0.1～5单位/mL。

例如，含有所述不作用于磷酸二酯化合物和磷酸三酯化合物只水解磷酸单酯化合物的酯键的酶0.01～10单位/mL，优选含有0.1～5单位/mL。

(15)样品中钙的测定的一个例子

本发明的样品中钙的测定方法，包括

a)使样品、磷脂酶C和/或磷脂酶D和作为磷脂酶C和/或磷脂酶D的底物的所述通式(I)表示的化合物混合反应，从所述化合物解离显色基团的步骤，和

b)所述解离显色基团的测定步骤。

另外，本发明的样品中钙的测定方法即使不存在胆碱氧化酶，碱性磷酸酯酶或酸性磷酸酯酶等联接酶也可以进行测定。

对使用本发明的样品中钙的测定方法和测定用试剂测定样品中钙的例子具体说明如下，例如，样品含有的钙接触磷脂酶C和/或磷脂酶D时，磷脂酶C和/或磷脂酶D被所述钙活化。

被所述钙活化的磷脂酶C和/或磷脂酶D与所述通式(I)表示的化合物接触时，磷脂酶C和/或磷脂酶D使所述通式(I)表示的化合物的显色基团(X1，有时还有X2和/或X3)水解，解离。

即，解离4-硝基苯基、2-氯-4-硝基苯基、2，6-二氯-4-硝基苯基、2，6-二氯-乙酰苯基或酰基苯基等显色基团。

解离的4-硝基苯酚、2-氯-4-硝基苯酚、2，6-二氯-4-硝基苯酚、2，6-二氯-乙酰苯酚或酰基苯酚等，通过在有吸收的任意的波长下，用分光光度计等进行吸光度等的测定等，计算解离的显色基团的量，再计算磷脂酶C和/或磷脂酶D的活性值，进一步根据已知钙浓度的标准液测定的吸光度的比例，可以算出样品中钙的浓度。

以作为所述通式(I)表示的化合物使用二(4-硝基苯基)磷酸为例，本发明的测定原理如下

使用二(4-硝基苯基)磷酸作为本发明中所述通式(I)表示的化合物底物，被样品中钙离子活化的磷脂酶C和/或磷脂酶D将二(4-硝基苯基)磷酸的磷酸根和2个4-硝基苯基之间的酯键水解，解离2分子的4-硝基苯酚。

通过在测定波长405nm等下，用分光光度计等测定所述解离的4-硝基苯酚的吸光度，可以测定样品中钙的浓度。

(16)样品

本发明中，样品可以是含有钙，钙离子或其盐等的物质，只要可以进行样品中钙浓度的测定对该物质没有特别的限制。

作为这样的样品，可以举出例如，人或动物的血液、血清、血浆、小便、髓液、唾液或汗等体液；人或动物的肾脏、心脏、肺或脑等内脏器官等的提取液；骨骼肌、骨髓、皮肤或神经组织等的提取液；毛发等的提取液；人或动物的大便的提取液或悬浮液；细胞的提取液；植物的提取液；食品或其提取液；农林水产物品或其提取物；饮用水；饮料；环境样品(土壤、海水、河水、湖沼水、地下水等)；或药剂等。

[实施例]

下面，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明不限于所述实施例。

〔实施例1〕

(样品中钙的的测定)

通过本发明的样品中钙的测定试剂和钙测定方法，测定样品中钙的浓度。

(1)试剂的配制

①第1试剂的配制

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为6.5(20℃)，配制第1试剂。

PIPES(オリエンタル酵母工业社)    80mM

BO-10TX(日光化学社)    0.1％

ケ一ソンCG(ロ一ムアンドハ一ス社)    0.05％

醋酸镍    5mM

磷脂酶D〔来源于链霉菌、クロモフスカス〕(旭化成社)2单位/mL

②第2试剂A的配制

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为6.5(20℃)，配制第2试剂A。

PIPES    2mM

二(4-硝基苯基)磷酸〔底物〕(和光纯药工业社)24mM

③第2试剂B的配制

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为6.5(20℃)，配制第2试剂B。

PIPES    5mM

4-硝基苯基苯基磷酸〔底物〕(希格码社)10mM

④第2试剂C的配制

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为6.5(20℃)，配制第2试剂C。

PIPES    5mM

4-硝基苯基磷酸〔底物〕(第一化学药品社)    96mM

(2)样品的配制

用纯水稀释钙标准液〔含有1000mg/mL碳酸钙的0.1M硝酸水溶液；

原子吸光用〕(和光纯药工业社)，分别配制下述浓度的含钙样品。

①20.0mg/dL

②17.5mg/dL

③15.0mg/dL

④12.5mg/dL

⑤10.0mg/dL

⑥7.5mg/dL

⑦5.0mg/dL

⑧2.5mg/dL

另外，纯水作为不含钙的样品，即“⑨钙浓度为0mg/dL的样品”。

配制上述9种样品。

(3)测定样品中钙的浓度

用日立制作所社制的7170S型自动分析装置测定样品中钙的浓度。

①所述(2)配制的9种样品分别作为样品，取6μL，其中添加所述(1)中①配制的180μL第1试剂A，混合后在37℃反应5分钟。

②然后，向其中添加所述(1)中②配制的60μL第2试剂A，于37℃反应。

③然后，测定第2试剂A添加后1分55秒(第23点)到5分8秒(第34点)的主波长405nm和副波长660nm的吸光度。

④根据所述③中测定的吸光度，算出每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

⑤另外，除用所述(1)中③配制的第2试剂B代替第2试剂A以外，按所述①～④进行操作，算出每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

⑥另外，除用所述(1)中④配制的第2试剂C代替第2试剂A以外，按所述①～④进行操作，算出每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

(4)测定结果

以上的测定结果如图1所示。

该图中横轴表示样品中钙的浓度(mg/dL)，纵轴表示测定的每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

由该图可知，随着样品中钙的浓度的增加，各吸光度变化量(ΔAbs./分钟)基本呈直线性增加。

由此证明可以定量地测定样品中的钙。

还发现，作为底物，使用二(4-硝基苯基)磷酸时，与使用4-硝基苯基苯基磷酸或4-硝基苯基磷酸相比，得到的信号(吸光度变化量)非常高。

由此可以证明，作为底物使用二(4-硝基苯基)磷酸，即，所述通式(I)的化合物中X1和X2双方都是显色基团时，可以进行高感度的测定。

〔实施例2〕

(金属离子)

发现本发明的样品中钙的测定试剂和钙测定方法中，测定试剂含有金属离子时，具有改善线性度的效果。

(1)试剂的配制

①配制含有钴离子的第1试剂

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为6.5(20℃)，配制6种第1试剂。

PIPES   80mM

BO-10TX 0.1％

ケ一ソンCG    0.05％

磷脂酶D〔来源于链霉菌、クロモフスカス〕(旭化成社)2单位/mL

氯化钴  16mM、8mM、4mM、2mM、1mM和不含(0mM)

②配制含有镍离子的第1试剂

除分别含有(或不含)下述浓度的醋酸镍以外，其他与所述①的含有钴离子的第1试剂的成分和浓度相同，配制6种第1试剂。

8mM

4mM

2mM

1mM

0.5mM

0mM

③配制含有锌离子的第1试剂

除分别含有(或不含)下述浓度的醋酸锌以外，其他与所述①的含有钴离子的第1试剂的成分和浓度相同，配制6种第1试剂。

0.8mM

0.4mM

0.2mM

0.1mM

0.05mM

0mM

④第2试剂

用所述实施例1的(1)中②配制的第2试剂A作为第2试剂。

(2)样品的配制

用所述实施例1中(2)配制的9种的样品作为样品。

(3)测定样品中钙的浓度

除分别用所述(1)中①、②和③配制的18种第1试剂代替第1试剂以外，按所述实施例1中(3)所述①～④进行操作，算出每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

(4)测定结果

测定试剂含有钴离子的测定结果如图2所示，含有镍离子的测定结果如图3所示，含有锌离子的测定结果如图4所示。

另外，该图中横轴表示样品中钙的浓度(mg/dL)，纵轴表示测定的每分钟吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

另外，各种情况Km值如表1所示。

另外，关于表现出的Km值的计算，Lineweaver-Burk曲线中，固定Vmax即可算出。

[表1]

		表现出的Km值
				第1试剂不添加金属离子	0.021mM
钴离子	第1试剂中钴离子浓度	表现出的Km值
			1mM	0.051mM
	2mM	0.058mM
			4mM	0.163mM
	8mM	0.330mM
			16mM	0.698mM
	镍离子	第1试剂中镍离子浓度			表现出的Km值
0.5mM			0.058mM
		1mM		0.112mM
2mM			0.301mM
		4mM		0.665mM
8mM			2.065mM
		锌离子		第1试剂中锌离子浓度	表现出的Km值
0.05mM	0.059mM
			0.1mM	0.122mM
0.2mM	0.252mM
			0.4mM	0.839mM
0.8mM	2.927mM

通过以上测定结果，可以得出如下结论。

测定试剂含有钴离子时与不含钴离子时比较，样品中钙的浓度和吸光度变化量(ΔAbs./分钟)的关系〔检测线〕更直线化，证明改善了检测线的线性度。所以，可以改善测定的定量性。

还有，测定试剂含有镍离子时与不含镍离子时比较，样品中钙的浓度和吸光度变化量(ΔAbs./分钟)的关系〔检测线〕更直线化，证明改善了检测线的线性度。所以，可以改善测定的定量性。

再者，测定试剂含有锌离子时与不含锌离子时比较，样品中钙的浓度和吸光度变化量(ΔAbs./分钟)的关系〔检测线〕更直线化，证明改善了检测线的线性度。所以，可以改善测定的定量性。

〔实施例3〕

(螯合剂改善线性度效果的证明-1)

发现本发明的样品中钙的测定试剂和钙测定方法中，测定试剂含有螯合剂柠檬酸时，具有改善线性度的效果。

(1)试剂的配制

①第1试剂的配制

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为7.0(20℃)，配制5种第1试剂。

PIPES    80mM

BO-10TX    0.1％

ケ一ソンCG    0.05％

磷脂酶D〔来源于链霉菌、クロモフスカス〕(旭化成社)1单位/mL

柠檬酸4mM、2mM、1mM、0.5mM和不含(0mM)

②第2试剂

用所述实施例1中(1)的②配制的第2试剂A作为第2试剂。

(2)样品的配制

用纯水稀释钙标准液〔含有1000mg/mL碳酸钙的0.1M硝酸水溶液；原子吸光用〕(和光纯药工业社)，分别配制下述浓度的含钙样品。

①20.0mg/dL

②15.0mg/dL

③10.0mg/dL

④5.0mg/dL

⑤2.5mg/dL

另外，纯水作为不含钙的样品，即“⑥钙浓度为0mg/dL的样品”。

配制上述6种样品。

(3)测定样品中钙的浓度

除分别用所述(1)中①配制的5种第1试剂代替第1试剂和以所述(2)配制的6种样品为样品以外，按所述实施例1中(3)所述①～④进行操作，算出每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

(4)测定结果

测定结果如图5所示。

另外，该图中横轴表示样品中钙的浓度(mg/dL)，纵轴表示测定的每分钟吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

通过以上测定结果，可以得出如下结论。

测定试剂含有螯合剂时与不含螯合剂时比较，样品中钙的浓度和吸光度变化量(ΔAbs./分钟)的关系〔检测线〕更直线化，证明改善了检测线的线性度。所以，可以改善测定的定量性。

〔实施例4〕

(螯合剂改善线性度效果的证明-2)

发现本发明的样品中钙的测定试剂和钙测定方法中，测定试剂含有螯合剂草酸、酒石酸或柠檬酸时，具有改善线性度的效果。

(1)试剂的配制

①配制含有草酸的第1试剂

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为6.5(20℃)，配制含有草酸地第1试剂。

PIPES    80mM

BO-10TX     0.1％

ケ一ソンCG    0.05％

磷脂酶D〔来源于链霉菌、クロモフスカス〕(旭化成社)0.66单位/mL

草酸5mM

②配制含有酒石酸的第1试剂

除含有20mM酒石酸代替5mM草酸以外，其他与所述①的含有草酸的第1试剂的成分和浓度相同，配制含有酒石酸的第1试剂。

③配制含有柠檬酸的第1试剂

除含有1mM柠檬酸代替5mM草酸以外，其他与所述①的含有草酸的第1试剂的成分和浓度相同，配制含有柠檬酸的第1试剂。

④第2试剂

以所述实施例1中(1)的③配制的第2试剂A作为第2试剂。

(2)样品的配制

用纯水稀释钙标准液〔含有1000mg/mL碳酸钙的0.1M硝酸水溶液；原子吸光用〕(和光纯药工业社)，分别配制下述浓度的含钙样品。

①20.0mg/dL

②10.0mg/dL

③5.0mg/dL

④2.5mg/dL

另外，纯水作为不含钙的样品，即“⑤钙浓度为0mg/dL的样品”。

配制上述5种样品。

(3)测定样品中钙的浓度

除分别用所述(1)中①、②和③配制的3种第1试剂代替第1试剂和以所述(2)配制的5种样品为样品以外，按所述实施例1中(3)所述①～④进行操作，算出每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

(4)测定结果

测定结果如图6所示。

另外，该图中横轴表示样品中钙的浓度(mg/dL)，纵轴表示测定的每分钟吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

通过以上测定结果，可以得出如下结论。

测定试剂含有螯合剂草酸、酒石酸、或柠檬酸时，样品中钙的浓度和吸光度变化量(ΔAbs./分钟)的关系〔检测线〕基本为直线，证明改善了检测线的线性度。所以，可以改善测定的定量性。

〔实施例5〕

(非离子型表面活性剂的稳定反应时程作用的证明)

证明本发明的样品中钙的测定试剂和钙测定方法中，测定试剂含有非离子型表面活性剂BO-10TX时稳定反应时程的作用。

(1)试剂的配制

①第1试剂的配制

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为6.5(20℃)，配制5种第1试剂。

PIPES    80mM

ケ一ソンCG    0.05％

磷脂酶D〔来源于链霉菌、クロモフスカス〕(旭化成社)2单位/mL

BO-10TX 0.10％、0.01％、0.001％、0.0001％或不含(0％)

②第2试剂

用所述实施例1的(1)的②配制的第2试剂A作为第2试剂。

(2)样品的配制

用纯水稀释钙标准液〔含有1000mg/mL碳酸钙的0.1M硝酸水溶液；原子吸光用〕(和光纯药工业社)，分别配制10.0mg/dL的含钙样品。

(3)反应时程的证明

用日立制作所社制的7170S型自动分析装置确认样品中钙浓度测定反应的时程。

①取6μL所述(2)配制样品，分别添加所述(1)中①配制的180μL5种第1试剂A，混合后在37℃反应5分钟。

②然后，向其中添加60μL所述(1)中②配制的第2试剂A，于37℃反应。

③然后，从样品和第1试剂混合时开始测定主波长405nm和副波长660nm的吸光度，记录反应时程。

(4)测定结果

测定结果如图7所示。

另外，该图中横轴表示样品和第1试剂混合后经过的时间，纵轴表示测定的吸光度(Abs.)。

由该图可得出如下结论。

测定试剂含有非离子型表面活性剂BO-10TX时与不含时比较，反应进程(时程)不零散，呈直线型，可以改善测定的定量性。

〔实施例6〕

(阴离子型表面活性剂的改善灵敏度作用的证明)

证明本发明的样品中钙的测定试剂和钙测定方法中，测定试剂含有阴离子型表面活性剂LMT时，改善测定灵敏度。

(1)试剂的配制

①第1试剂的配制

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为7.25(20℃)，配制4种第1试剂。

PIPES    80mM

BO-10TX    0.1％

ケ一ソンCG    0.05％

磷脂酶D〔来源于链霉菌、クロモフスカス〕(旭化成社)1单位/mL

LMT  0.1％、0.05％、0.025％和不含(0％)

②第2试剂的配制

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为6.5(20℃)，配制第2试剂A。

PIPES    5mM

二(4-硝基苯基)磷酸〔底物〕(和光纯药工业社)  1mM

柠檬酸    12mM

(2)样品的配制

用纯水稀释钙标准液〔含有1000mg/mL碳酸钙的0.1M硝酸水溶液；原子吸光用〕(和光纯药工业社)，分别配制下述浓度的含钙样品。

①20.0mg/dL

②15.0mg/dL

③10.0mg/dL

④5.0mg/dL

⑤2.5mg/dL

另外，纯水作为不含钙的样品即“⑥钙浓度0mg/dL的样品”。

配制上述6种样品。

(3)测定样品中钙的浓度

除分别用所述(1)中①配制的4种第1试剂代替第1试剂、用所述(1)中②配制的第2试剂代替第2试剂A和样品使用所述(2)配制的6种样品以外，按所述实施例1中(3)所述①～④进行操作，算出每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

(4)测定结果

测定结果如图8所示。

另外，该图中横轴表示样品中钙的浓度(mg/dL)，纵轴表示测定的每分钟吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

由该图可得出如下结论。

测定试剂含有阴离子型表面活性剂LMT时，与不含时比较，得到的每分钟吸光度变化量(信号)显著升高，证实可以提高测定灵敏度。因此，即使微量浓度的钙也可以进行测定。

〔实施例7〕

(阴离子型表面活性剂对磷酸二酯酶活性的抑制作用的证明)

本发明的样品中钙的测定试剂和钙测定方法中，发现测定反应过程中存在阴离子型表面活性剂时，对磷酸二酯酶活性有抑制作用。

(1)试剂的配制

①第1试剂的配制

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为7.75(20℃)，配制第1试剂。

HEPES    60mM

Triton X-100(日光化学社)    0.1％

ケ一ソンCG    0.05％

二(4-硝基苯基)磷酸〔底物〕(和光纯药工业社)4mM

②第2试剂的配制

在纯水中分别溶解图9所述的31种的表面活性剂，配成5％浓度，配制31种第2试剂。

③对照第2试剂的配制

以纯水作为对照.第2试剂

(2)样品的配制

分别以人血清和生理盐水(0.9％氯化钠水溶液)作为样品。

(3)样品空白试验值(血清空白试验值)的测定

用日立制作所社制7150型自动分析装置测定样品空白试验值(血清空白试验值)。

①向所述(2)的10μL人血清样品中添加所述(1)中①配制的第1试剂180μL，混和后于37℃反应5分钟。

②然后，向其中添加所述(1)中②配制的第2试剂20μL，于37℃反应。

③然后，从第2试剂添加后第2分58秒(第40点)到第4分57秒(第50点)测定在主波长405nm和副波长660nm的吸光度，。

④根据所述③中测定的吸光度可以计算每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

⑤另外，除用所述(2)的生理食盐水代替人血清作为样品使用以外，按所述①～④的进行操作，计算每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

⑥用所述④算出的每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)减去所述⑤算出的每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)，算出样品空白试验值(血清空白试验值)。

⑦所述(1)中②配制的全部31种的等2试剂，进行所述①～⑥的操作，计算各个样品空白试验值(血清空白试验值)。另外，用所述(1)中③的对照第2试剂代替第2试剂，同样地计算对照的样品空白试验值(血清空白试验值)。

(4)测定结果

以上测定结果如图9所示。

另外，该图中，横轴表示测定试剂不含磷脂酶C和/或磷脂酶使D，不让本发明的钙产生反应时测定的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)，即表示样品空白试验值(血清空白试验值)，纵轴表示第二试剂中使用的表面活性剂。

由该图可知，从BD-6SY到BPS-30的非离子型表面活性剂的样品空白试验值(血清空白试验值)超过10×10⁴(ΔAbs./分钟)，与反应液中不含有磷脂酶C和/或磷脂酶D无关，底物二(4-硝基苯基)磷酸发生4-硝基苯酚的解离反应。即，血清样品中混有的磷酸二酯酶使4-硝基苯酚从底物解离，导致测定产生正误差。

而阴离子型表面活性剂胆酸、ECTD-6NEX、去氧胆酸钠、SNP-4N、肌氨酸酯LN和肌氨酸酯CN-30中，样品空白试验值(血清空白试验值)都小于等于10×10⁴(ΔAbs./分钟)，从底物二(4-硝基苯基)磷酸解离4-硝基苯酚的反应被抑制，血清样品中混有的磷酸二酯酶的活性被抑制。

上述可以证明，测定试剂或反应测定时含有或存在阴离子型表面活性剂，可以抑制血清样品中混有的磷酸二酯酶的活性，预防测定产生正误差。

〔实施例8〕

(含氮化合物改善线性度的证明-1)

本发明的样品中钙的测定试剂和钙测定方法中，测定试剂含有含氮化合物硫酸铵具有改善线性度的效果。

(1)试剂的配制

①第1试剂的配制

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为7.75(20℃)，配制6种第1试剂。

HEPES           60mM

Triton X-100    0.1％

磷酸酯酶D(来源于链霉菌、クロモフスカス)(旭化成社)0.5单位/mL

肌氨酸酯LN(日光化学社)    0.5％

硫酸铵  1M、0.8M、0.6M、0.4M、0.2M或不含(OM)

②第2试剂

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为7.75(20℃)，配制6种第2试剂。

HEPES    60mM

Triton X-100    0.1％

二(4-硝基苯基)磷酸〔底物〕(和光纯药工业社)4mM

肌氨酸酯  LN    0.5％

硫酸铵1M、0.8M、0.6M、0.4M、0.2M或不含(OM)

(2)样品的配制

用纯水稀释钙标准液〔含有1000mg/mL碳酸钙的0.1M硝酸水溶液；原子吸光用〕(和光纯药工业社)，分别配制下述浓度的含钙样品。

①40.0mg/dL

②35.0mg/dL

③30.0mg/dL

④25.0mg/dL

⑤20.0mg/dL

⑥15.0mg/dL

⑦10.0mg/dL

⑧5.0mg/dL

⑨2.5mg/dL

另外，纯水作为不含钙的样品，即“⑩钙浓度为0mg/dL的样品”。

配制上述10种样品。

(3)测定样品中钙的浓度

用日立制作所社制7150型自动分析装置测定样品。

①向所述(2)配制的样品9μL中添加所述(1)中①配制的第1试剂180μL，混和后于37℃反应5分钟。

②然后，向其中添加所述(1)中②配制的第2试剂180μL，于37℃反应。(另外，第1试剂和第2试剂，分别使用相同硫酸铵浓度的测定试剂。)

③然后，测定第2试剂添加后2分58秒(第40点)到4分57秒(第50点)的主波长405nm和副波长660nm的吸光度。。

④根据所述③中测定的吸光度，算出每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

(4)测定结果

测定结果如图10所示。

另外，该图中横轴表示样品中钙的浓度(mg/dL)，纵轴表示测定得到的每分钟吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

由该图可以得出如下结论。

测定试剂含有硫酸铵时与不含硫酸铵时比较，样品中钙的浓度和吸光度变化量(ΔAbs./分钟)的关系〔检测线〕更直线化，证明改善了检测线的线性度。所以，可以改善测定的定量性。

〔实施例9〕

(含氮化合物改善线性度的证明-2)

本发明的样品中钙的测定试剂和钙测定方法中，测定试剂含有含氮化合物精氨酸(碱性氨基酸)或咪唑(杂环化合物)时，具有改善线性度的作用。

(1)试剂的配制

①配制含有精氨酸的第1试剂

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为7.0(20℃)，配制5种第1试剂。

HEPES       60mM

TritonX-100 0.1％

LMT         0.5％

醋酸钙      0.15mM

磷脂酶D〔来源于链霉菌、クロモフスカス〕(旭化成社)0.75单位/mL

精氨酸(和光纯药工业社)  1M、0.75M、0.5M、0.25M或不含(OM)

②配制含有咪唑的第1试剂

除用下述浓度的咪唑(半井化学社)分别代替精氨酸，其他与所述①含有精氨酸的第1试剂的成分和浓度相同，配制5种第1试剂。

1M

0.75M

0.5M

0.25M

OM

③第2试剂

在纯水中按下述浓度分别溶解下述试剂成分，调整pH为7.0(20℃)，配制第2试剂。

HEPES        60mM

TritonX-100  0.1％

二(4-硝基苯基)磷酸〔底物〕(和光纯药工业社〕  6mM

(2)样品的配制

用纯水稀释钙标准液〔含有1000mg/mL碳酸钙的0.1M硝酸水溶液；原子吸光用〕(和光纯药工业社)，分别配制下述浓度的含钙样品。

①20.0mg/dL

②17.5mg/dL

③15.0mg/dL

④12.5mg/dL

⑤10.0mg/dL

⑥7.5mg/dL

⑦2.5mg/dL

另外，纯水作为不含钙的样品，即“⑧钙浓度为0mg/dL的样品”。

配制8种的样品。

(3)测定样品中钙的浓度

用日立制作所社制7150型自动分析装置测定样品。

①向所述(2)配制的样品9μL中添加所述(1)中①配制的含有精氨酸的第1试剂240μL，混和后于37℃反应5分钟。

②然后，向其中添加所述(1)中③配制的第2试剂120μL，于37℃反应。

③然后，从第2试剂添加后1分47秒(第34点)到4分57秒(第50点)测定在主波长405nm和副波长660nm的吸光度。

④根据所述③中测定的吸光度，计算每分钟的吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

⑤另外，除用所述(1)中②配制的含有咪唑的第1试剂代替含有精氨酸的第1试剂以外，按所述①～④进行操作，计算每分钟吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

(4)测定结果

作为第1试剂使用含有精氨酸的第1试剂的测定结果如图11所示，作为第1试剂使用含有咪唑的第1试剂的测定结果如图12所示。

另外，这些的图中横轴表示样品中钙的浓度(mg/dL)，纵轴表示测定得到的每分钟吸光度变化量(ΔAbs./分钟)。

由这些图可以得出如下结论。

测定试剂含有含氮化合物精氨酸(碱性氨基酸)时与不含时比较，样品中钙的浓度和吸光度变化量(ΔAbs./分钟)的关系〔检测线〕更加直线化，检测线的线性度得到改善。所以，可以改善测定的定量性。

另外，测定试剂含有含氮化合物咪唑(杂环化合物)时与不含时比较，样品中钙的浓度和吸光度变化量(ΔAbs./分钟)的关系〔检测线〕更加直线化，检测线的线性度得到改善。所以，可以改善测定的定量性。

本发明的样品中钙的测定试剂和钙测定方法中使用所述通式(I)表示的化合物作为磷脂酶C和/或磷脂酶D的底物，不用其他的酶进行测定，可以低成本且准确地测定样品中的钙。

另外，测定试剂或反应测定时含有或存在金属离子、螯合剂或含氮化合物中的至少一种物质，可以扩大样品中钙的浓度测定范围，可以测定高浓度的钙。

另外，测定试剂或反应测定时含有或存在非离子型表面活性剂，可以稳定测定样品中钙的浓度时的反应进行(时程)。

另外，测定试剂或反应测定时含有或存在阴离子型表面活性剂，可以提高测定钙浓度的灵敏度，即使微量浓度的钙也可以进行测定。

另外，测定试剂或反应测定时含有或存在阴离子型表面活性剂，即使样品中混有磷酸二酯酶，也可以抑制该磷酸二酯酶解离所述通式(I)表示的化合物形成的底物的显色基团的反应，防止测定正误差的产生。

Claims (6)

1.样品中钙的测定试剂，其特征为，至少含有磷脂酶C和磷脂酶D中的至少一种磷脂酶，以及磷脂酶C的底物和磷脂酶D的底物中的至少一种磷脂酶的底物，所述底物是下述通式I表示的化合物：

式中，X1是选自4-硝基苯基、2-氯-4-硝基苯基、2，6-二氯-4-硝基苯基、2，6-二氯-乙酰苯基或乙酰苯基的显色基团；X2是氢原子或选自4-硝基苯基、2-氯-4-硝基苯基、2，6-二氯-4-硝基苯基、2，6-二氯-乙酰苯基或乙酰苯基的显色基团；X3是氢原子。

2.如权利要求1所述的样品中钙的测定试剂，其特征为，含有选自金属离子、螯合剂或含氮化合物中的至少一种物质作为调整所述磷脂酶对应钙表现出的Km值在0.03～10mM的物质。

3.如权利要求1或2所述的样品中钙的测定试剂，其特征为，含有非离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂中的至少一种表面活性剂。

4.样品钙的测定方法，其特征为，所述方法包括以下步骤：

a)所述样品与磷脂酶C和磷脂酶D中的至少一种磷脂酶以及下述通式I表示的化合物磷脂酶C的底物和磷脂酶D的底物中的至少一种磷脂酶的底物混合反应，使显色基团从所述化合物解离的步骤，

式中，X1是选自4-硝基苯基、2-氯-4-硝基苯基、2，6-二氯-4-硝基苯基、2，6-二氯-乙酰苯基或乙酰苯基的显色基团；X2是氢原子或选自4-硝基苯基、2-氯-4-硝基苯基、2，6-二氯-4-硝基苯基、2，6-二氯-乙酰苯基或乙酰苯基的显色基团；X3是氢原子；和

b)比色测定该解离的显色基团的步骤。

5.如权利要求4所述的样品中钙的测定方法，其特征为，所述步骤a)中，存在选自金属离子、螯合剂或含氮化合物中的至少一种物质作为调整所述磷脂酶对应钙表现出的Km值为0.03～10mM的物质。

6.如权利要求4或5所述的样品中钙的测定方法，其特征为，所述步骤a)中，存在非离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂中的至少一种表面活性剂。

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