JP2899061B2 - カルシウムの定量法 - Google Patents
カルシウムの定量法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、生体成分中に含まれるカルシウムの定量法
に関する。臨床検査の分野では、副甲状腺の疾患、閉塞
性黄疸などの診断の目的で生体成分中、主に血中のカル
シウム濃度の定量が行われている。
に関する。臨床検査の分野では、副甲状腺の疾患、閉塞
性黄疸などの診断の目的で生体成分中、主に血中のカル
シウム濃度の定量が行われている。
従来の技術 生体成分中のカルシウムの定量法としては、シュウ酸
またはEDTAを用いた滴定法、アリザリン、Ｏ−クレゾー
ルフタレインコンプレクソンなどを用いた直接比色法、
カルセインを用いた蛍光法、原子吸光法などの化学的な
方法が知られている（臨床検査技術全集 第６巻、臨床
化学検査II D 電解質および無機物の測定法）。
またはEDTAを用いた滴定法、アリザリン、Ｏ−クレゾー
ルフタレインコンプレクソンなどを用いた直接比色法、
カルセインを用いた蛍光法、原子吸光法などの化学的な
方法が知られている（臨床検査技術全集 第６巻、臨床
化学検査II D 電解質および無機物の測定法）。
滴定法は迅速性、簡便性、試料の微量化に欠け、比色
法、蛍光法はカルシウムと有機化合物とのキレート反応
が原理であることから、どうしても２価の金属の影響が
あり、特異性の面で満足ではない。また原子吸光法は特
異性が良くないばかりでなく、特別な装置が必要な点、
操作が煩雑な点からルーチン分析に不向きである（臨床
検査技術全集 第５巻 臨床化学検査Ｉ 原子吸光分
析）。さらに、レシチン、フォスフォリパーゼＤ（EC,
3.1.4.4）（以下PLDと略す）およびコリンオキシダーゼ
を用いた酵素法による方法が報告されている（特開昭62
−195297）。
法、蛍光法はカルシウムと有機化合物とのキレート反応
が原理であることから、どうしても２価の金属の影響が
あり、特異性の面で満足ではない。また原子吸光法は特
異性が良くないばかりでなく、特別な装置が必要な点、
操作が煩雑な点からルーチン分析に不向きである（臨床
検査技術全集 第５巻 臨床化学検査Ｉ 原子吸光分
析）。さらに、レシチン、フォスフォリパーゼＤ（EC,
3.1.4.4）（以下PLDと略す）およびコリンオキシダーゼ
を用いた酵素法による方法が報告されている（特開昭62
−195297）。
該公報にはカルシウムイオン含有試料に天然レシチン
及びPLDを加えるとカルシウムイオンによってPLDが活性
化され、活性化PLDによってレシチンが分解されてコリ
ンを生成し、この生成コリンをコリンオキシダーゼで分
解して生成する過酸化水素を定量することによってカル
シウムイオンを定量する方法が開示されている。
及びPLDを加えるとカルシウムイオンによってPLDが活性
化され、活性化PLDによってレシチンが分解されてコリ
ンを生成し、この生成コリンをコリンオキシダーゼで分
解して生成する過酸化水素を定量することによってカル
シウムイオンを定量する方法が開示されている。
この方法は、天然レシチンは、水に対する溶解性の
低さから基質量が限られてしまうため、定量域が狭い、
天然レシチンは反応性が良すぎる（少しPLDで多量の
コリンが生成する）ので、その後に続く反応で大量のコ
リンオキシダーゼが必要になる、たとえ十分な量のコ
リンオキシダーゼを使ったとしても吸光度変化が短時間
に飽和するなどの理由でどうしてもPLD量を抑えること
になるが、PLD量が少なければ定量域は狭くなる、など
種々の問題を抱えている。
低さから基質量が限られてしまうため、定量域が狭い、
天然レシチンは反応性が良すぎる（少しPLDで多量の
コリンが生成する）ので、その後に続く反応で大量のコ
リンオキシダーゼが必要になる、たとえ十分な量のコ
リンオキシダーゼを使ったとしても吸光度変化が短時間
に飽和するなどの理由でどうしてもPLD量を抑えること
になるが、PLD量が少なければ定量域は狭くなる、など
種々の問題を抱えている。
発明が解決しようとする課題 前記特開昭62−195297の方法において天然レシチンに
代わる定量域の広い新しい基質の提供が求められてい
る。
代わる定量域の広い新しい基質の提供が求められてい
る。
課題を解決するための手段 本発明は、カルシウムイオンを含有する試料中一般式
（Ｉ） 〔式中、X1およびX2は同一または異なって、単結合また
はカルボニル を示し、Y1およびY2は同一または異なって、酸素または
硫黄を示す。R1およびR2は、一方が炭素数１〜４のアル
キル、炭素数１〜10の置換アルキル、炭素数２〜10の置
換もしくは非置換のアルケニル、アラルキル、置換もし
くは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキル
アミンまたは ＨＯ−CH2CH2 ｎ（ｎ＝１〜20の整数）を示し、他方
は同一または異なって上記と同義の基であるかあるいは
水素または炭素数１〜24のアルキルを示す。〕で表され
るフォスフォリルコリン類にフォスフォリパーゼＤを作
用させて生成するコリンを定量することを特徴とするカ
ルシウムの定量法を提供する。
（Ｉ） 〔式中、X1およびX2は同一または異なって、単結合また
はカルボニル を示し、Y1およびY2は同一または異なって、酸素または
硫黄を示す。R1およびR2は、一方が炭素数１〜４のアル
キル、炭素数１〜10の置換アルキル、炭素数２〜10の置
換もしくは非置換のアルケニル、アラルキル、置換もし
くは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキル
アミンまたは ＨＯ−CH2CH2 ｎ（ｎ＝１〜20の整数）を示し、他方
は同一または異なって上記と同義の基であるかあるいは
水素または炭素数１〜24のアルキルを示す。〕で表され
るフォスフォリルコリン類にフォスフォリパーゼＤを作
用させて生成するコリンを定量することを特徴とするカ
ルシウムの定量法を提供する。
一般式（Ｉ）の各基の定義において、アルキル、置換
アルキルおよびアルキルアミンにおけるアルキル部分
は、直鎖または分岐状のアルキル例えばメチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、se
c−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペンチル、s
ec−ペンチル、tert−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、
オクチル、ノニル、デシルを包含する。置換アルキルに
おける置換基は同一または異なって置換数１〜３のヒド
ロキシル、低級アルコキシ、アミノ、モノまたはジ低級
アルキル置換アミノ、低級アルカノイル、カルボキシ
ル、低級アルコキシカルボニル、スルフォを包含する。
炭素数２〜10の置換もしくは非置換のアルケニルは、直
鎖または分岐状の例えばビニル、アリル、プロペニル、
ブテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネ
ニル、デセニルを包含する。置換アルケニルにおける置
換基は、上記置換アルキルにおけるそれと同義である。
アラルキルは、ベンジル、フェニルエチルを包含する。
置換もしくは非置換のアリールは、フェニル、ナフチル
を包含する。置換アリールにおける置換基は、上記置換
アルキルにおける置換基と同義である。
アルキルおよびアルキルアミンにおけるアルキル部分
は、直鎖または分岐状のアルキル例えばメチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、se
c−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペンチル、s
ec−ペンチル、tert−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、
オクチル、ノニル、デシルを包含する。置換アルキルに
おける置換基は同一または異なって置換数１〜３のヒド
ロキシル、低級アルコキシ、アミノ、モノまたはジ低級
アルキル置換アミノ、低級アルカノイル、カルボキシ
ル、低級アルコキシカルボニル、スルフォを包含する。
炭素数２〜10の置換もしくは非置換のアルケニルは、直
鎖または分岐状の例えばビニル、アリル、プロペニル、
ブテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネ
ニル、デセニルを包含する。置換アルケニルにおける置
換基は、上記置換アルキルにおけるそれと同義である。
アラルキルは、ベンジル、フェニルエチルを包含する。
置換もしくは非置換のアリールは、フェニル、ナフチル
を包含する。置換アリールにおける置換基は、上記置換
アルキルにおける置換基と同義である。
本発明の原理が次に示される。
PLDはカルシウムイオン非存在下では活性化されない
がカルシウムイオンの存在下で活性化し、PLDの活性度
はカルシウムイオンの量に比例する。
がカルシウムイオンの存在下で活性化し、PLDの活性度
はカルシウムイオンの量に比例する。
化合物（Ｉ）は活性化されていないPLDの作用を受け
ないが活性化されたPLDによって分解されコリンを生成
する。コリンは一定量のPLDについて活性度即ちカルシ
ウムイオンの量に比例して生成する。従って生成するコ
リンを定量することによってカルシウムイオンを定量す
ることができる。
ないが活性化されたPLDによって分解されコリンを生成
する。コリンは一定量のPLDについて活性度即ちカルシ
ウムイオンの量に比例して生成する。従って生成するコ
リンを定量することによってカルシウムイオンを定量す
ることができる。
上記反応の反応式が以下に示される。
生成するコリンは、それ自体公知のコリンの定量法を
適用することによって定量できる。例えばコリンオキ
シダーゼ（EC.1.1.3.17、以下CLODと略す）および酸素
によってコリンを分解し、定量的に生成する過酸化水素
と色源体とをパーオキシダーゼ（以下PODと略す）の存
在下に反応させ、生成する色素を定量する、コリンデ
ヒドロゲナーゼ（EC.1.1.99.1、以下CLDHと略す）、フ
ェナジンメトサルフェート（以下PMSと略す）およびテ
トラゾリウム類を共存させ、生成するフォルマザン色素
を比色定量することによって定量できる。コリンの生成
速度を測定することにより、あらかじめ作製しておいた
検量線から試料中のカルシウムイオンを算出することが
できる。
適用することによって定量できる。例えばコリンオキ
シダーゼ（EC.1.1.3.17、以下CLODと略す）および酸素
によってコリンを分解し、定量的に生成する過酸化水素
と色源体とをパーオキシダーゼ（以下PODと略す）の存
在下に反応させ、生成する色素を定量する、コリンデ
ヒドロゲナーゼ（EC.1.1.99.1、以下CLDHと略す）、フ
ェナジンメトサルフェート（以下PMSと略す）およびテ
トラゾリウム類を共存させ、生成するフォルマザン色素
を比色定量することによって定量できる。コリンの生成
速度を測定することにより、あらかじめ作製しておいた
検量線から試料中のカルシウムイオンを算出することが
できる。
上記のコリンの定量法の反応式は、それぞれ下記のと
おりである。
おりである。
本発明の特徴は、PLDの基質として用いる上記のフォ
スフォリルコリン類が天然のレシチンに比べてPLDに対
する反応性が低いので、天然のレシチンを用いる場合に
比べて多量の基質を用いることができ、また水に対する
溶解度の大きい化合物は多量用いることができるので、
定量域が広くとれる点である。
スフォリルコリン類が天然のレシチンに比べてPLDに対
する反応性が低いので、天然のレシチンを用いる場合に
比べて多量の基質を用いることができ、また水に対する
溶解度の大きい化合物は多量用いることができるので、
定量域が広くとれる点である。
本発明は酵素の至適条件下で反応を行うのが好適であ
る。即ち反応は５−50℃の温度、pH5−９の緩衝液中で
行われる。PLDは、検体中のカルシウムの濃度、あるい
は緩衝剤の種類もしくは基質の種類によって異なるが通
常0.01−100単位/mlで用いられる。またPLDの起源は問
わないが菌由来、キャベツ由来、ピーナッツ由来などい
ずれも使用できる。緩衝剤としては、グッドの緩衝剤
（同仁化学研究所 第15版総合カタログ）、ほう酸塩、
酢酸塩、トリス塩酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩などが
例示され、10−3000mMの範囲で用いられる。
る。即ち反応は５−50℃の温度、pH5−９の緩衝液中で
行われる。PLDは、検体中のカルシウムの濃度、あるい
は緩衝剤の種類もしくは基質の種類によって異なるが通
常0.01−100単位/mlで用いられる。またPLDの起源は問
わないが菌由来、キャベツ由来、ピーナッツ由来などい
ずれも使用できる。緩衝剤としては、グッドの緩衝剤
（同仁化学研究所 第15版総合カタログ）、ほう酸塩、
酢酸塩、トリス塩酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩などが
例示され、10−3000mMの範囲で用いられる。
この反応系はそのままでも良好な特異性を示すが、よ
り厳密に特異性を増すために、必要に応じて特殊なキレ
ート剤を添加することもできる。
り厳密に特異性を増すために、必要に応じて特殊なキレ
ート剤を添加することもできる。
本発明方法はキレート法であるから、適当な時間を経
た時点で停止剤を添加して反応を停止し、しかる後に吸
光度を測定する方法をとっても良い。この目的で加えら
れる停止剤としてはGEDTA（同仁化学研究所 第15版総
合カタログ、以下のキレート剤についても同じ）、EDT
A,NTA,EDTA−OH,IDA,DHEG,EDDA,EDDHA,DPTA−OH,NTP,HI
DA,EDDP,EDTPO,NTPO,BAPTA,TTHA,CyDTAなどがあげられ
る。使用濃度は10−1000mMである。
た時点で停止剤を添加して反応を停止し、しかる後に吸
光度を測定する方法をとっても良い。この目的で加えら
れる停止剤としてはGEDTA（同仁化学研究所 第15版総
合カタログ、以下のキレート剤についても同じ）、EDT
A,NTA,EDTA−OH,IDA,DHEG,EDDA,EDDHA,DPTA−OH,NTP,HI
DA,EDDP,EDTPO,NTPO,BAPTA,TTHA,CyDTAなどがあげられ
る。使用濃度は10−1000mMである。
PLDの基質としては、酵素の作用によりコリンを生成
する基質であれば、Km値の大小は関係しないが、Km値が
小さければ定量域が狭くなる傾向があり、好適には0.1m
M以上を示すものが用いられる。さらに反応液中で十分
に溶解し、また安定な物質の方が好適である。このよう
な例として次の物質があげられる。
する基質であれば、Km値の大小は関係しないが、Km値が
小さければ定量域が狭くなる傾向があり、好適には0.1m
M以上を示すものが用いられる。さらに反応液中で十分
に溶解し、また安定な物質の方が好適である。このよう
な例として次の物質があげられる。
一般式（Ｉ） 生成するコリンを検出するのに用いられる上記の
酵素系の反応速度は、PLDの反応速度より速いことが求
められる。このためにはについてはCLODの濃度が１−
100単位/ml、PODが0.1−200単位/ml、色素源の濃度とし
ては0.02−20mg/mlが良い。色素源としては、PODと過酸
化水素により色素を生成するものであればいずれも使用
できるが、ジアミノベンチジン、3.3′−ジメチルベン
ジジン、3.3′5.5′−テトラメチルベンジジン、3.3′
−ジメチル−Ｎ−スルフォプロピルベンジジン、3.3′
5.5′−テトラメチル−Ｎ−スルフォプロピルベンジジ
ンもよく用いられる。また４−アミノアンチピリン（4A
A）または３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン（MBTH）とカップリングして色素を生成するフェノ
ール、NN−ジメチルトルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒド
ロキシエチルトルイジン（EHET）、NN−ジエチルトルイ
ジン、NN−ジメチルアニリン、NN−ジエチルアニリン、
Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリン、3.5−ジ
メトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリ
ン、3.5−ジメトキシNN−ジメチルアニリン、3.5−ジメ
トキシNN−ジエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−
メチルフェニル）Ｎ′−アセチルエチレンジアミン（EM
AE）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）Ｎ′−
サクシニルエチレンジアミン（EMSE）、NN−ジスルホプ
ロピルトルイジン（DSPT）、3.5−ジメトキシNN−ジス
ルホプロピルアニリン（DSPA）、NN−ジスルホプロピル
アニリン、トリンダー試薬類（同仁化学研究所 第15版
総合カタログ）などの組合せの他特開昭62−296、同57
−29297、同59−182361、同56−145352、同63−246356
で示される色素源がいずれも用いうる。についてはPM
Sの他メルドラブルー（同仁化学研究所 第15版総合カ
タログ）、１−メトキシPMS（同仁化学研究所 第15版
総合カタログ）も使用でき、0.01−2mg/mlで用いられ
る。テトラゾリウム塩としては、INT、MTT、Neo−TB、N
itro−TB、TB、TNTB（いずれも同仁化学研究所 第15版
総合カタログ）が0.01−5mg/mlで用いられる。
酵素系の反応速度は、PLDの反応速度より速いことが求
められる。このためにはについてはCLODの濃度が１−
100単位/ml、PODが0.1−200単位/ml、色素源の濃度とし
ては0.02−20mg/mlが良い。色素源としては、PODと過酸
化水素により色素を生成するものであればいずれも使用
できるが、ジアミノベンチジン、3.3′−ジメチルベン
ジジン、3.3′5.5′−テトラメチルベンジジン、3.3′
−ジメチル−Ｎ−スルフォプロピルベンジジン、3.3′
5.5′−テトラメチル−Ｎ−スルフォプロピルベンジジ
ンもよく用いられる。また４−アミノアンチピリン（4A
A）または３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン（MBTH）とカップリングして色素を生成するフェノ
ール、NN−ジメチルトルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒド
ロキシエチルトルイジン（EHET）、NN−ジエチルトルイ
ジン、NN−ジメチルアニリン、NN−ジエチルアニリン、
Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリン、3.5−ジ
メトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリ
ン、3.5−ジメトキシNN−ジメチルアニリン、3.5−ジメ
トキシNN−ジエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−
メチルフェニル）Ｎ′−アセチルエチレンジアミン（EM
AE）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）Ｎ′−
サクシニルエチレンジアミン（EMSE）、NN−ジスルホプ
ロピルトルイジン（DSPT）、3.5−ジメトキシNN−ジス
ルホプロピルアニリン（DSPA）、NN−ジスルホプロピル
アニリン、トリンダー試薬類（同仁化学研究所 第15版
総合カタログ）などの組合せの他特開昭62−296、同57
−29297、同59−182361、同56−145352、同63−246356
で示される色素源がいずれも用いうる。についてはPM
Sの他メルドラブルー（同仁化学研究所 第15版総合カ
タログ）、１−メトキシPMS（同仁化学研究所 第15版
総合カタログ）も使用でき、0.01−2mg/mlで用いられ
る。テトラゾリウム塩としては、INT、MTT、Neo−TB、N
itro−TB、TB、TNTB（いずれも同仁化学研究所 第15版
総合カタログ）が0.01−5mg/mlで用いられる。
以下に本発明を実施例および参考例によって説明す
る。
る。
実施例１ 50mM PIPES緩衝液（pH7.0） トリトン Ｘ−100 1mg/ml EMSE 1mg/ml 4AA 0.5mg/ml PLD 0.1単位/ml CLOD 5.0単位/ml POD 10単位/ml 基質 PC−１ 0.2mg/ml 上記試薬3.0mlに、10mg/dlのカルシウム溶液0.02mlを
加えて37℃で10分間反応させ、生成する色素を555nmの
吸光度で測定した。この反応は下記で示される（ただし
式中R1＝CH3（CH2）16−， R2＝HOOCCH2CH2−,X1＝−CO−,X2＝−CO−,Y1＝−Ｏ−
およびY2＝−Ｏ−である）。吸光度の変化を第１図に示
す。
加えて37℃で10分間反応させ、生成する色素を555nmの
吸光度で測定した。この反応は下記で示される（ただし
式中R1＝CH3（CH2）16−， R2＝HOOCCH2CH2−,X1＝−CO−,X2＝−CO−,Y1＝−Ｏ−
およびY2＝−Ｏ−である）。吸光度の変化を第１図に示
す。
試験管６本にそれぞれ呈色試薬を3.0ml入れ、37℃で予
備加温する。次に0,10,20,30,40,50mg/dlの塩化カルシ
ウム溶液を50μずつ添加撹拌し、そのまま37℃で10分
間保った後、10mg/mlのグリコールエーテルジアミン４
酢酸（GEDTA 同仁化学研究所 第15版総合カタログ）
溶液を0.1ml加えて反応を停止させた。この際カルシウ
ムはGEDTAによりキレート化され、PLDの反応が停止す
る。555nmの吸光度を測定して第２図の検量線を得た。
備加温する。次に0,10,20,30,40,50mg/dlの塩化カルシ
ウム溶液を50μずつ添加撹拌し、そのまま37℃で10分
間保った後、10mg/mlのグリコールエーテルジアミン４
酢酸（GEDTA 同仁化学研究所 第15版総合カタログ）
溶液を0.1ml加えて反応を停止させた。この際カルシウ
ムはGEDTAによりキレート化され、PLDの反応が停止す
る。555nmの吸光度を測定して第２図の検量線を得た。
実施例２ 本発明方法と従来標準法として行われてきたクラーク
・コリップ法、および比色法としてＯ−クレゾールフタ
レインコンプレクソン（OCPC）を使う方法（いずれも臨
床検査技術全集 第６巻 臨床化学検査II Ｄ 電解質
および無機物の測定法）を比較するために、カルシウ
ム10.0mg/dlを含む水溶液、カルシウム10.0mg/dl、マ
グネシウム3.0mg/dlを含む水溶液、カルシウム10.0mg
/dl、マグネシウム3.0mg/dl、カリウム100mg/dlを含む
水溶液、カルシウム9.2mg/dl、マグネシウム2.6mg/dl
を含む血清を実施例１と同様の方法および臨床検査技術
全集第６巻 臨床化学検査II Ｄ 電解質および無機物
の測定法記載の方法で測定して第２表の結果を得た。こ
の結果から本発明方法が特異性の高い方法であることが
わかる。
・コリップ法、および比色法としてＯ−クレゾールフタ
レインコンプレクソン（OCPC）を使う方法（いずれも臨
床検査技術全集 第６巻 臨床化学検査II Ｄ 電解質
および無機物の測定法）を比較するために、カルシウ
ム10.0mg/dlを含む水溶液、カルシウム10.0mg/dl、マ
グネシウム3.0mg/dlを含む水溶液、カルシウム10.0mg
/dl、マグネシウム3.0mg/dl、カリウム100mg/dlを含む
水溶液、カルシウム9.2mg/dl、マグネシウム2.6mg/dl
を含む血清を実施例１と同様の方法および臨床検査技術
全集第６巻 臨床化学検査II Ｄ 電解質および無機物
の測定法記載の方法で測定して第２表の結果を得た。こ
の結果から本発明方法が特異性の高い方法であることが
わかる。
実施例３ 50mM PIPES緩衝液（pH7.0） トリトン Ｘ−100 1mg/ml ドータイトPMS＊１ 0.2mg/ml ドータイトNitro−TB＊１ 0.2mg/ml PLD 0.1単位/ml CLDH 5.0単位/ml 基質 PC−２ 0.2mg/ml ＊1:同仁化学研究所 第15版総合カタログ 上記試験3.0mlに10mg/dlのカルシウム標準溶液および
実施例２のの血清をそれぞれ0.05mlずつ加えて37℃で
10分間反応させ、生成するホルマザン色素を530nmの吸
光度で測定した。標準液の吸光度と比較して計算された
血清中のカルシウム濃度は9.24mg/dlとなり、ほぼ正確
な値が得られた。
実施例２のの血清をそれぞれ0.05mlずつ加えて37℃で
10分間反応させ、生成するホルマザン色素を530nmの吸
光度で測定した。標準液の吸光度と比較して計算された
血清中のカルシウム濃度は9.24mg/dlとなり、ほぼ正確
な値が得られた。
実施例４ 実施例１のPC−１の代わりに上記第１表記載の基質PC
−３、PC−４、PC−５、PC−６、PC−７、PC−８、PC−
９、PC−10、PC−11、PC−12、PC−13、PC−14、PC−1
5、PC−16、PC−17およびPC−18を用いた他は、実施例
１と同じ組成の試薬を作成し、試薬3.0mlに10mg/dlのカ
ルシウム標準溶液および実施例２のの血清をそれぞれ
0.05mlずつ加えて37℃で10分間反応させ、生成する色素
を555nmの吸光度で測定した。標準液の吸光度と比較し
て計算された血清中のカルシウム濃度は第３表に示すと
おりであった。
−３、PC−４、PC−５、PC−６、PC−７、PC−８、PC−
９、PC−10、PC−11、PC−12、PC−13、PC−14、PC−1
5、PC−16、PC−17およびPC−18を用いた他は、実施例
１と同じ組成の試薬を作成し、試薬3.0mlに10mg/dlのカ
ルシウム標準溶液および実施例２のの血清をそれぞれ
0.05mlずつ加えて37℃で10分間反応させ、生成する色素
を555nmの吸光度で測定した。標準液の吸光度と比較し
て計算された血清中のカルシウム濃度は第３表に示すと
おりであった。
実施例５ 実施例１記載の試薬のEMSEの代わりにDSPT、DSPA、ト
リンダー試薬類のTOOS（同仁化学研究所 第15版総合カ
タログ）、DAOS（同）、HALPS（同）、ADOS（同）およ
びEHET（和光純薬 1988−89年版カタログ）を用いた他
は、実施例１と同じ組成の試薬を作成し、試薬3.0mlに1
0mg/dlのカルシウム標準溶液および実施例２のの血清
をそれぞれ0.05mlずつ加えて37℃で10分間反応させ、生
成する色素をそれぞれ第４表に示す波長で吸光度を測定
した。標準液の吸光度と比較して計算された血清中のカ
ルシウム濃度は第４表に示すとおりであった。
リンダー試薬類のTOOS（同仁化学研究所 第15版総合カ
タログ）、DAOS（同）、HALPS（同）、ADOS（同）およ
びEHET（和光純薬 1988−89年版カタログ）を用いた他
は、実施例１と同じ組成の試薬を作成し、試薬3.0mlに1
0mg/dlのカルシウム標準溶液および実施例２のの血清
をそれぞれ0.05mlずつ加えて37℃で10分間反応させ、生
成する色素をそれぞれ第４表に示す波長で吸光度を測定
した。標準液の吸光度と比較して計算された血清中のカ
ルシウム濃度は第４表に示すとおりであった。
実施例６ 実施例１記載の試薬の4AAとEMSEの代わりに下記に示
す色素源を使った他は、実施例１と同じ組成の試薬を作
成し、試薬3.0mlに10mg/dlのカルシウム標準溶液および
実施例２のの血清をそれぞれ0.02mlずつ加えて37℃で
10分間反応させ、生成する色素をそれぞれ第５表に示す
波長で吸光度を測定した。標準度の吸光度と比較して計
算された血清中のカルシウム濃度は第５表に示すとおり
であった。
す色素源を使った他は、実施例１と同じ組成の試薬を作
成し、試薬3.0mlに10mg/dlのカルシウム標準溶液および
実施例２のの血清をそれぞれ0.02mlずつ加えて37℃で
10分間反応させ、生成する色素をそれぞれ第５表に示す
波長で吸光度を測定した。標準度の吸光度と比較して計
算された血清中のカルシウム濃度は第５表に示すとおり
であった。
3.3′.5.5′−テトラメチルベンジジン（TMBZ） 3.3′.5.5′−テトラメチル−Ｎ−スルフォプロピルベ
ンジジン（TMSBZ） 2.2′−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスル
フォニックアシッド）（ABTS） 実施例７ 基質の溶解性および実施例１に準じた反応系に於ける
該基質の定量域を調べたところ、本発明の基質は特開昭
62−195297で用いられているレシチンに比べて高い溶解
性および広い定量域を有することを確認した。
ンジジン（TMSBZ） 2.2′−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスル
フォニックアシッド）（ABTS） 実施例７ 基質の溶解性および実施例１に準じた反応系に於ける
該基質の定量域を調べたところ、本発明の基質は特開昭
62−195297で用いられているレシチンに比べて高い溶解
性および広い定量域を有することを確認した。
参考例１（エステル型PC−１の合成法） 卵黄より得られるレシチンを水に懸濁し、フォスフォ
リパーゼA2（EC.3.1.1.4）で処理した後、クロロホルム
抽出で１−ステアリル（パルミトイルも一部含まれる）
−フォスファチジルコリンを得る。抽出液に無水コハク
酸を添加してPC−１を合成し、エチルエーテル／石油エ
ーテル＝1/1の混合溶媒で沈澱させ、白色無定型粉末を
得る。
リパーゼA2（EC.3.1.1.4）で処理した後、クロロホルム
抽出で１−ステアリル（パルミトイルも一部含まれる）
−フォスファチジルコリンを得る。抽出液に無水コハク
酸を添加してPC−１を合成し、エチルエーテル／石油エ
ーテル＝1/1の混合溶媒で沈澱させ、白色無定型粉末を
得る。
その他のエステル化物についてもその相当するアシル
化剤を反応させる。
化剤を反応させる。
参考例２（エーテル型PC−３の合成法） 参考例１で得られた１−ステアリル（パルミトイル）
−フォスファチジルコリンのクロロホルム溶液に1,3プ
ロパンサルトンを反応させた後、エチルエーテルで沈澱
させ１−ステアリル（パルミトイル）−２−スルフォプ
ロピルフォスファチジルコリンを得る。これを再度水に
溶解しフォスフォリパーゼA1（EC.3.1.1.32）で処理し
て２−スルフォプロピルフォスファチジルコリンとし、
シリカゲルクロマトで単離した物にイソ酪酸クロリドを
反応させ目的物を得る。その他のエーテル化物について
も相当する環状サルトン、ラクトン類、またはグリシジ
ル基を持つものをそのまま反応させるか、またはヒドロ
キシ基、あるいはチオール基、あるいはクロール基、あ
るいはブロム基を持つものとを触媒の元に加熱して合成
できる。
−フォスファチジルコリンのクロロホルム溶液に1,3プ
ロパンサルトンを反応させた後、エチルエーテルで沈澱
させ１−ステアリル（パルミトイル）−２−スルフォプ
ロピルフォスファチジルコリンを得る。これを再度水に
溶解しフォスフォリパーゼA1（EC.3.1.1.32）で処理し
て２−スルフォプロピルフォスファチジルコリンとし、
シリカゲルクロマトで単離した物にイソ酪酸クロリドを
反応させ目的物を得る。その他のエーテル化物について
も相当する環状サルトン、ラクトン類、またはグリシジ
ル基を持つものをそのまま反応させるか、またはヒドロ
キシ基、あるいはチオール基、あるいはクロール基、あ
るいはブロム基を持つものとを触媒の元に加熱して合成
できる。
参考例３ PC−２、４〜18は、以下のようにして合成する。グリ
セロフォスフォリルコリン〔シグマ社 1988年プライス
リスト（PRICE LIST）〕と、下記第７表Ａ記載の物質
を50〜60℃で反応させた後アセトンで沈澱単離したもの
に、第７表Ｂ記載の物質を70〜80℃で反応させて、アセ
トンで沈澱させて得る。
セロフォスフォリルコリン〔シグマ社 1988年プライス
リスト（PRICE LIST）〕と、下記第７表Ａ記載の物質
を50〜60℃で反応させた後アセトンで沈澱単離したもの
に、第７表Ｂ記載の物質を70〜80℃で反応させて、アセ
トンで沈澱させて得る。
発明の効果 本発明によれば、PLDの基質としてフォスフォリルコ
リン類を用いて、生体成分中に含まれるカルシウム濃度
を効率よく測定することができる。
リン類を用いて、生体成分中に含まれるカルシウム濃度
を効率よく測定することができる。
【図面の簡単な説明】 第１図は、実施例１で測定した吸収度の変化を示す。第
２図は、実施例１で既知濃度の塩化カルシウム溶液を用
いて測定した吸光度をもとにして作成した検量線を示
す。
２図は、実施例１で既知濃度の塩化カルシウム溶液を用
いて測定した吸光度をもとにして作成した検量線を示
す。
Claims (1)
- 【請求項１】カルシウムイオンを含有する試料中一般式
（Ｉ） 〔式中、X1およびX2は同一または異なって、単結合また
はカルボニル を示し、Y1およびY2は同一または異なって、酸素または
硫黄を示す。R1およびR2は、一方が炭素数１〜４のアル
キル、炭素数１〜10の置換アルキル、炭素数２〜10の置
換もしくは非置換のアルケニル、アラルキル、置換もし
くは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアルキル
アミンまたは ＨＯ−CH2CH2 ｎ（ｎ＝１〜20の整数）を示し、他方
は同一または異なって上記と同義の基であるかあるいは
水素または炭素数１〜24のアルキルを示す。〕で表され
るフォスフォリルコリン類にフォスフォリパーゼＤを作
用させて生成するコリンを定量することを特徴とするカ
ルシウムの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12820090A JP2899061B2 (ja) | 1990-05-18 | 1990-05-18 | カルシウムの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12820090A JP2899061B2 (ja) | 1990-05-18 | 1990-05-18 | カルシウムの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0423999A JPH0423999A (ja) | 1992-01-28 |
| JP2899061B2 true JP2899061B2 (ja) | 1999-06-02 |
Family
ID=14978944
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12820090A Expired - Lifetime JP2899061B2 (ja) | 1990-05-18 | 1990-05-18 | カルシウムの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2899061B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100354630C (zh) * | 2002-10-31 | 2007-12-12 | 世诺临床诊断制品株式会社 | 样品中钙的测定试剂和测定方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06335400A (ja) * | 1993-05-31 | 1994-12-06 | Kyowa Medex Co Ltd | イオン化カルシウムの測定法 |
| JP3839857B2 (ja) * | 1994-09-20 | 2006-11-01 | 塩野義製薬株式会社 | エーテル型チオリン脂質化合物の製造方法 |
| JP4577863B2 (ja) * | 2001-02-15 | 2010-11-10 | 旭化成ファーマ株式会社 | カルシウムイオン測定用組成物および測定方法 |
-
1990
- 1990-05-18 JP JP12820090A patent/JP2899061B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100354630C (zh) * | 2002-10-31 | 2007-12-12 | 世诺临床诊断制品株式会社 | 样品中钙的测定试剂和测定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0423999A (ja) | 1992-01-28 |
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