JPH0466864B2 - - Google Patents

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JPH0466864B2
JPH0466864B2 JP1046717A JP4671789A JPH0466864B2 JP H0466864 B2 JPH0466864 B2 JP H0466864B2 JP 1046717 A JP1046717 A JP 1046717A JP 4671789 A JP4671789 A JP 4671789A JP H0466864 B2 JPH0466864 B2 JP H0466864B2
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JP
Japan
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group
formula
alkyl
phospholipase
acid
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JP1046717A
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Yuniusu Maruchina
Noiman Ururihi
Fuon Deru Erutsu Heruberuto
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Roche Diagnostics GmbH
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Boehringer Mannheim GmbH
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Publication date
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Publication of JPH0466864B2 publication Critical patent/JPH0466864B2/ja
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    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
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    • C07C305/04—Esters of sulfuric acids having oxygen atoms of sulfate groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being acyclic and saturated
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
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    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/10—Phosphatides, e.g. lecithin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase

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Description

【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野 本発明は、ホスホリパーゼ基質、およびホスホ
リパーゼを光学的に定量する方法および試薬に関
する。 従来の技術 ホスホリパーゼは、sn−３−ホスホグリセリド
の加水分解に触媒作用する。 基質が水溶液中でミセルを形成し、かつ酵素が
脂質−水界面に作用する。 殊に重要である一連のホスホリパーゼ、とりわ
けPL ＣおよびPL A2（これらは人体の最も検査
されるPLである）が公知である。特定の疾患、
例えば膵臓炎、感染症、自己免疫疾患、アレルギ
ーの場合、血液および他の体液中のPL A2濃度
が増大する。従つて、PL A2活性の測定が診断
学的に極めて重要である。 最近、PL Ｃ、とくにまたホスフアテイジル−
イノシトール固有のPL Ｃ＝PIナーセが益々重要
性を増した。調節系であるホスフアテイジル−イ
ノシツトが多数の研究集団により集中的に研究さ
れている。さらにまたPL Ｃは、膜結合蛋白質が
剥離する際の役割を果す。 またPL A2は若干の蛇毒（コブラ、ガラガラ
へビ）にも含有されていて、大きい濃度は致命的
である。PL A2は消化酵素に数えられ、かつそ
の測定が、臨床化学だけでなく、生化学、製薬化
学および食品化学においても大きい役割を果す
〔G.E.ホフマン（Hoffman）、デーテーゲス・エ
フ・クリン・ケム・エー・フアウ（Dt.Ges.f.
Klin.Chem.e.）報告第４巻、196頁（86年）〕。 すでに、多数のホスホリパーゼ測定法、例え
ば、エステル分解に際し遊離せる脂肪酸の滴定に
よる定量〔フイガレラ（Figarella）、スカンド・
ジエイ・ガストロエント（Scand.J.Gastroent.）
第６巻、133頁（71年）〕または放射能標識せる遊
離脂肪酸の測定〔シエキーア（Shakir）、アナ
ル・ビオケム（Anal.Biochem.）第114巻、64頁
（81年）〕が公知である。しかし、これら方法は常
用目的には極めて費用がかかりかつ故障し易い。 さらに、側光法による定量法が公知である： (a) ヘンドリクソン（Hendrickson）、ジエイ・
リピド・レス（J.Lipid Res.）第24巻、1532頁
（83年）、 (b) ホフマン（Hoffman）、デーテー・ゲス・エ
フ・クリン・ケム（Dt.Ges.f.Klin.Chem.）報
告第４巻、201頁（86年）。 (a)について： この方法は、−SH基の分離とそのDTNBを使
用する測定に基づくが、感度不良であると判明し
た。 (b)について： 和光社（Fa.Wako，Japan）による脂肪酸の全
酵素的測定法は費用がかかりかつ極めて故障し易
い（多数のピペツト測定工程）。 NEFA−Ｃ−試験 また、基質としての螢光性ホスホリピドが公知
である〔トウーレン（Thuren）、クリン・ケム
（Clin.Chem.）第31巻、714頁（85年）〕。とりわ
けこの方法は極めて故障し易く、かつ螢光測定装
置の備えられている実験室は極めてわずかであ
る。 また公知であるのが、PL Ａの免疫学的測定法
である： 放射線免疫アツセイ：西島（Nishijima）、ジ
エイ・ビオケム（J.Biochem.）第94巻、137頁
（83年）、および螢光免疫アツセイ：エスコラ
（Eskola）、クリン・ケム（Clin.Chem.）第29巻、
1777頁（83年）は、感度の点で十分であるが、但
し活性のホスホリパーゼＡおよびその不活性の前
駆体間を区別することができない。 ホスホリパーゼＣの定量にはわずかな方法が公
知であるにすぎない。従つて公知であるのは、基
質を、補酵素としてリパーゼを有するPL Ｃによ
り分解することによりグリセリンを遊離させ、か
つその後にこの遊離せるグリセリンの全酵素法に
よる定量を実施することである〔ウアーレフエル
ト・イン・ベルグマイヤー（Wahlefeld in
Bergmeyer）：メトーデン・デル・エンツイマテ
イツシエン・アナリーゼ（Methoden der
enzymatischen Analyse）、第３版、第巻、
1978頁、フエルラーク・ヒエーミー・ヴアインハ
イイム（Verlag Chemie Weinheim）1974年〕。
しかし、この方法は極めて故障し易くかつ時間が
かかる。 さらに、放射能標識された基質を使用すること
によるPL Ｃの定量が発表されている。〔ワク
（Waku）、ジエイ・ビオケム（J.Biochem.）第72
巻、149頁（72年）〕。しかしながら、この方法は
煩雑かつ感度不良である。 従つて、簡単な装置で実施されかつ直接に可視
的に制御されることのできる比色定量法が必要で
ある。 発明が解決しようとする課題 従つて、本発明の根底をなす課題は、基質およ
び、この基質の使用下にホスホリパーゼを定量す
るための、公知の測定法の欠点を有せず、正確な
結果が得られ、操作が簡単であり、高い感度を有
し、かつわずかな遅延工程を有するにすぎず、従
つて種々の自動分析装置への適用が容易である方
法をつくり出すことである。 課題を解決するための手段 本発明によればこの課題が、一般式： または 〔式中、 ＡがＣ原子数１〜16を有するアルキレン−または
アルケニレン基、 ＲがＨまたはＣ原子数１〜20を有するアルキル
−、アルケニル−またはアシル基、またはアルキ
ル基中の炭素原子数１〜８を有する、場合により
アルキル置換されたアリール−またはアルアルキ
ル基、 Ｘが芳香族ヒドロキシ−またはチオール化合物、
およびそれぞれのＹが独立に相互に−Ｓ−または
−Ｏ−、 Ｚが−SO3 または
【式】を表わし、但 しR1が水素原子または基：（CH2）oNR2 3（式中ｎが
２〜４の数およびR2がＨまたはCH3を表わす）、
またはイノシトール、またはセリン
【式】またはグリセリンであ ることができる〕のホスホリパーゼ基質により解
決される。 ホスホリパーゼが作用した際に、本発明による
ホスホリパーゼ基質が基Ｘに相応する芳香族ヒド
ロキシ−またはチオール化合物の遊離下に分解さ
れ、これら化合物は直接に光学的に定量される
か、または適当な発色団または螢光体とカツプリ
ングさせかつこのカツプリング生成物を測定する
かまたは場合により補酵素を添加した後に測定す
る。 Ｒは、有利にＣ原子数６〜20、殊に有利にＣ原
子数12〜18を有する。意外にも判明したのは、天
然の基質がアシル基を有するにせよ、Ｒ＝アルキ
ル、アルケニルまたはアルアルキルを有する化合
物が良好なホスホリパーゼ基質であることであ
る。 Ｒの例は、アルキル基としてメチル−、エチル
−、プロピル−、ブチル−、ペンチル−、ヘキシ
ル−、ヘプチル、オクチル−、ノニル−、デシル
−、ウンデシル−、ドデシル−、テトラデシル
−、ヘキサデシル−、およびオクタデシル基、並
びに相応するアシル基、例えば、アセチル−、プ
ロピオニル−、ブチリル−、バレリル−、カプロ
ニル−、カプリル−、カプリニル−、ラウリル
−、ミリスチル−、パルミチル−、およびステア
リル基、オレイル−、クロトニル−、リノリル
基、フエニル−、ベンジル−またはオクチルフエ
ニル基である。 さらに本発明によるホスホリパーゼ基質は、ジ
カルボン酸の基：COOH−Ａ−COOH〔式中、Ａ
は有利にＣ原子数３〜７を有する〕を含有する。
Ａが誘導される酸の例は、マロン酸、コハク酸、
グルタル酸、アジピン酸、ヒメリン酸、コルク
酸、アゼライン酸、セバシン酸、ノナンジカルボ
ン酸、デカンジカルボン酸およびウンデカンジカ
ルボン酸である。有利なのが、グルタン酸からア
ゼライン酸までの酸である。Ｃ原子数４以上を有
するＡには、補酵素の添加が推奨される。 Ｘは、発色団であるかまたは差当り逐次反応に
より色素に変換されることのできる芳香族ヒドロ
キシ−またはチオール化合物であればよい。代表
例が、フエノール、チオフエノール、ナフトー
ル、チオナフトールおよびそれらの誘導体、並び
に自体発色性の化合物、例えば、レゾルフイン
−、クロルフエノールレツド−、インドキシル−
またはチオフルオレセイン基である。適当なヒド
ロキシ−またはチオール化合物を全て列挙するこ
とはそれらが多数であることにより不可能であ
る、しかしながら当業者には、直接に発色性の、
または発色団に変換可能な芳香族ヒドロキシ−ま
たはチオール化合物が公知である。 一般式（）ないし（）の化合物として有利
なのが、 １−Ｏ−オクタデシル−２−グルタル酸−メチ
ルレズルフインエステル−sn−グリセロ−３−ホ
スホコリン、 １−Ｏ−オクタデシル−２−グルタル酸−ｐ−
ニトロフエニルエステル−sn−グリセロ−３−ホ
スホコリン、 １−Ｏ−ドデシル−２−グルタル酸−ｐ−ニト
ロフエニルエステル−rac−グリセロ−３−サル
フエート、 １−Ｏ−ドデシル−２−アジピン酸−ニトロフ
エニルエステル−rac−グリセロ−３−サルフエ
ートおよび／または １−Ｏ−ヘキサデシル−２−グルタル酸−ニト
ロフエニルエステル−rac−グリセロ−３−サル
フエートである。 色素を得るための前記逐次反応は、直接のカツ
プリング〔例えば、４−クロル−２−メチルベン
ゾールジアゾニウム塩（フアスト・レツド）、４
−ベンズアミド−２−メトキシ−５−メチルベン
ゾール−ジアゾニウム塩（フアスト・バイオレツ
ト）、ジアゾ化スルフアニル酸、２，４−および
２，５−置換フエニルジアゾニウム塩、例えば
２，４−ジクロルフエニルジアゾニウム−１，５
−ナフタリン−ジスルホン酸のようなジアゾニウ
ム塩との〕によるか、または例えば４−アミノア
ンチピリンまたは他のアミノピラゾロン（例え
ば、トリメチルアミノピラゾロン、ジアミノアン
チピリン）またはMBTHS（３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノン−ヒドラゾン−６−スルホン
酸）との酸化形カツプリングにより行なわれるこ
とができる。 有利な発色団は、わずかな極性を有しかつ親油
性であるものである。しかしながらこの場合さら
に水溶性が保証されなければならない。 前記発色団の親油特性は、適当な置換基によ
り、例えばアルキル基で有利に調節されることが
できる。レゾルフイン基に適当な置換基として判
明したのが、とりわけメチル−、ジメチル−およ
びエチル基であり、並びに臭素原子による置換が
適当である。 本発明による化合物は新規である。これらは、
不整中心を有しかつ従つて光学的に活性である。
ホスホリパーゼ基質として、常用の製造法で生じ
るラセミ化合物もまた光学的異性体も使用される
ことができる。しかしながら、有利なのが光学異
性体である。 本発明によるホスホリパーゼ基質の製造は自体
公知の方法により行なわれることができる。従つ
て適当であると判明したのが、例えば、メソツ
ヅ・イン・エンチモロジー（Methods in
Enzymology）第98巻、623頁（1983年）および
ビオキム・ビオフイズ・アクタ（Biochim.
Biophys.Acta）第666巻、230頁（81年）に記載
されているエーテル−グリセロ−およびアシル−
グリセロ−ホスホコリンの合成法である。サルフ
エートの合成が、例えばバイルシユタイン
（Beilstein）第２巻、EII、356頁に記載されてい
る。 この場合、記載された１−アルキル−ないしは
１−アシル−３−０−トリチル−グリセリン化合
物から出発し、相応する無水ジカルボン酸と、水
不含の媒体、例えばクロロホルム／ピリジン中で
反応させることにより、相応するグリセロジカル
ボン酸−モノエステスが得られる。無水ジカルボ
ン酸の適当な製造法が、ホウベン−ウエイル−ミ
ユラー（Houben−Weyl−Mu‥iier）の“メト
ーデン・デル・オルガニツシエン・ヒエミー”
（Methoden der organischen Chemie）第／
４巻、786頁に記載されている。 ３−０−トリチル基の代りに、他の保護基、例
えばベンジル−も使用されることができる。 例えば、基Ｘを誘導する芳香族ヒドロキシ−ま
たはチオール化合物を使用するモノエステルのエ
ステル化が、ジカルボン酸モノエステルと芳香族
アルコールまたはチオールとを水抽出剤、例えば
ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在において
直接に反応させることにより実施されることがで
きる。選択的に、ジカルボン酸モノエステルが差
当り活性形エステル、例えばヒドロキシスクシン
イミドエステルまたはイミダゾリドへ変換され、
かつその後にこの活性形エステルが芳香族アルコ
ールまたはチオールと反応される。 また同じく可能であるのが、差当りジカルボン
酸と芳香族アルコールまたはチオールとのモノエ
ステル、例えば、アジピン酸−モノニトロフエニ
ルエステルまたはグルタル酸モノフエニルエステ
ルを製造し、かつその後にこれをアルキル−ない
しは−アシルグリセリンで、例えば酸クロリド、
−無水物または活性形エステルの中間的形成を経
てエステル化することである。例えば、芳香族ア
ルコールまたはチオールを使用するジカルボン酸
モノエステルの製造は、酸無水物および芳香族化
合物（モル比１：１）から、またはジカルボン酸
および芳香族化合物（モル比２：１）から、また
は易離脱性の保護基を有するジカルボン酸モノエ
ステルおよび芳香族化合物から行なわれることが
できる。適当な方法が、例えばアーク・フアーム
（Arch.Pharm.）第287巻、514頁（1954年）に記
載されている。 選択的に、１−Ｏ−アルキル−ないしは１−Ｏ
−アシル−３−Ｏ−トリチルグリセロ−ジカルボ
ン酸モノエステルが、差当りジカルボン酸モノエ
ステルをジカルボン酸および易離脱性のアルコー
ル、例えばベンジルアルコールまたは２，２，２
−トリクロルエチルアルコールから製造し、かつ
その後にこうして得られた酸を前記アルキル−な
いしはアシル−３−Ｏ−トリチル−グリセリンで
エステル化することによつても製造されることが
できる。引続き保護基を除去し、かつ芳香族アル
コールまたはチオールとの反応を前記にように実
施する。 その後に前記生成物において、保護基を離脱さ
せかつＣ−３−OH位置をサルフエート化または
ホスホリル化する。 もう１つの製造法は、差当り保護されたグリセ
リン、例えば１，２−イソプロピリデングリセリ
ンとジカルボン酸モノエステルとを相応する保護
されたグリセロ−３−ジカルボン酸ジエステルの
形成下に反応させ、その後にグリセリンの保護基
を除去しかつ遊離せる１−OH基および遊離せる
２−OH基をアルキル化ないしはアシル化するこ
とである。最後に、差当り導入されたモノエステ
ル基（カルボキシル保護基）を離脱させかつ芳香
族アルコールまたはチオールと反応させる。Ｃ−
１−OHの保護基を離脱した後、ホスフエート化
またはサルフエート化する。 さらに、所望の基質が、相応するリゾ化合物
（例えば１−アルキル−グリセロ−３−サルフエ
ート）から出発し、例えば活性化されたジカルボ
ン酸モノエステルと反応させることにより製造さ
れることができる。 本発明による基質の前記製造は全てではなく、
かつ当業者に使用される他の一連の公知方法がそ
れぞれの本発明による化合物を直接に製造するこ
とを可能にする。所望の場合には、前述の方法に
より得られたラセミ生成物から、公知の分離法に
より純粋な光学異性体が得られることができる。
しかしまた同じくこれら異性体は、同じく自体公
知の方法による立体特異性に進行する合成によつ
ても得られることができる。 ホスホリパーゼを光学的に定量するための本発
明による方法は、本発明によるホスホリパーゼ基
質に、ホスホリパーゼを含有する被検体を作用さ
せ、かつ遊離せる芳香族ヒドロキシ−または化合
物の量を直接に、または適当な発色体とカツプリ
ングした後これにより形成された色相を光学的に
測定することを特徴とする。場合により、１種ま
たは２種の補酵素の添加が必要である。 本発明のもう一つの目的は、ホスホリパーゼを
光学的に定量するための簡単かつ良保存性の試薬
に関し、このものは本発明によるホスホリパーゼ
基質および緩衝剤とともに、表面活性剤、例えば
とくに胆汁酸、発色性カツプラーおよび／または
塩、例えば塩化カルシウムをも含有する。さらに
この試薬は、有利に保存剤および／または活性化
剤を含有してもよい。 有利な組成の場合、この試薬は、それぞれ使用
準備のできた、試薬としての溶液に対し、基質
0.05〜10mg／ml、有利に0.5〜10mg／ml、 胆汁酸２〜50mg／ml、 塩化カルシウム（活性剤）0.5〜10ｍＭ／、 表面活性剤20〜250ｍＭ／、 緩衝剤20〜250ｍＭ／、 を含有する。 胆汁酸基の表面活性剤として挙げられるのがコ
ール酸、タウロコール酸、デスオキシコール酸、
タウロデスオキシコール酸、グリコデスオキシコ
ール酸ないしはそれらのアルカリ金属塩、とくに
ナトリウム塩である。有利な量が0.5〜1.5ｍＭ／
である。選択的または付加的に、この試薬は１
種またはそれ以上の非イオン性表面活性剤を含有
してもよい。 表面活性剤として、イオン性のまた非イオン性
の表面活性剤が使用されることができる。有利に
使用されるのが、非イオン性表面活性剤、例えば
トライトン（Triton ：アルキルアリールポリ
エーテル）である。殊に適当な濃度範囲が０〜10
ｇ／である。殊に有利に使用される濃度範囲が
１〜５ｇ／である。 緩衝剤として適当なのが、本発明による試薬の
範囲内でPH価を6.0〜10.5に調節することのでき
る緩衝剤である。有利なPH価範囲が7.0〜9.5であ
る。適当な緩衝剤の例が、ジエタノールアミン緩
衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、トリス緩衝
剤および良緩衝剤、例えば、ヘプス緩衝剤（凍結
乾燥前の添加に好適）、タツプス緩衝剤、CHES
緩衝剤（２−（シクロヘキシルアミノ）−エタンス
ルホン酸）およびバイシン（Bicine）である。殊
に有利なのがトリス緩衝剤である。有利な緩衝剤
量が20〜250ｍＭ／である。 本発明の範囲内で保存剤として使用されるの
が、測定すべきホスホリパーゼの酵素活性に不利
に利用しないものである。殊に適当なのが、アル
カリ金属アジド、とくにナトリウムアジドであ
る。しかしながら、他の保存剤、例えばチオジド
および他の硫黄含有保存剤も同じく適当である。
有利な保存剤量が0.001〜２mg／mlである。 活性剤として適当なのが、アルカリ土金属イオ
ン、有利にカルシウムイオンである。このものは
デスオキシコール酸とともに不溶性の化合物を形
成するので、カルシウムが存在する場合には胆汁
酸としてタウロデスオキシコール酸が有利であ
る、それというのもこのものが１〜５ｍモルの範
囲内の大きいカルシウム濃度を許容するからであ
る。 本発明による試薬が、最終的な組成物に希釈す
るために特定の、乾燥または濃縮せる形で使用さ
れる場合、このものは前記成分を相応する量比
で、並びに有利に保護コロイド中に含有する。 保護コロイドとして挙げられるのが、当業者に
公知の物質、例えば、ポリヒドロキシ化合物、血
漿アルブミン、ポリビニルピロリドン、固体ポリ
エチレンオキシド等である。有利なのが、ポリヒ
ドロキシ化合物、とくに１分子中のペントース−
ないしはヘキソース単位数１〜10を有するペント
ースまたはヘキソースモノマーまたはポリマー、
および／または室温で固体のポリエチレングリコ
ールである。適当なポリヒドロキシ化合物の有利
な例が、マンニツトおよび類似の糖アルコール、
グルコースのオリゴサツカライド、マンノース、
マルトヘプタオース、平均分子量3500〜7000を有
するポリエチレングリコール等である。他の使用
可能な保護コロイドは、例えば、アミノ酸、例え
ばアラニン、植物ゴム、例えばアラビアゴム等で
ある。保護コロイドないしは保護コロイドの混合
物の有利な量が20〜90重量％である。殊に適当で
あると判明したのが、糖アルコールとポリアルキ
レングリコールとの混合物である。 また本発明による試薬は、適当なキヤリヤ材料
に含浸されて存在してもよい。挙げられるのが、
吸収性のキヤリヤ材料、また膨潤性、可溶性のフ
イルム形成性キヤリヤ材料である。この形で、本
発明による試薬は試験ストリツプの製造が可能で
あり、このものは直接可視的に、または適当な測
定装置を使用し評価されることができる。 ホスホリパーゼを定量するための本発明による
呈色試薬は、高い感度で極めて正確な結果が得ら
れる。操作が極めて簡単であり、かつ試験ストツ
プとしても適当である。極めてわずかな遅延工程
を有するにすぎないかまたはこれを全く有しない
ので、本発明による試薬は種々の自動分析装置に
直接に適合されることができる。 定量自体は、終点測定としてもまた動的測定と
しても実施されることができる。多数の公知の方
法と比べ、動的に実施可能である利点は、停止も
また形成された反応生成物の振とう抽出も実施さ
れる必要がないことである。 実施例 以下に、本発明を実施例につき詳説する。 例 １ １−Ｏ−オクタデシル−２−グルタル酸−ｐ−
ニトロフエニルエステル−sn−グリセロ−３−
ホスホコリン (a)１−Ｏ−オクタデシル−２−グルタル酸−sn−
グリセロ−３−ホスホコリン １−Ｏ−オクタデシル−sn−グリセロ−３−
ホスホコリン１ｇ、無水グルタル酸0.73ｇ、ジ
メチルアミノピリジン0.2ｇを、ピリジン30ml
中で70時間50℃に加熱する。その後に溶剤を蒸
発させ、かつ残渣をLH20（溶離剤：クロロホ
ルム／メタノール１：１）上でクロマトグラフ
処理する。引続きRP18（展開剤：イソプロパノ
ール／水９：１）上でクロマトグラフ処理す
る。 収量：0.87ｇ DC：｜Ｈ Rf｜＝0.26（シリカゲル；メタノー
ル） 噴霧試薬：ヘインズ−イシヤ−ウツド試薬
（Hanes−Isherwood−Reagenz） 1H−NMR（CDCl3）：δ〔ppm〕：0.87（ｔ，
3H）；1.26（ｍ，32H）；1.90（ｍ，2H）；2.40
（ｍ，4H）；3.1−3.6（ｍ，13H）；3.78（ｍ，
2H）；4.02（ｍ，2H）；4.25（ｍ，2H）；5.18
（ｍ，1H）。 (b) １−Ｏ−オクタデシル−２−グルタル酸−ｐ
−ニトロフエニルエステル−sn−グリセロ−３
−ホスホコリン （1a）の化合物310mgを水／テトラヒドロフ
ラン１：１より成る混合物に溶解し、かつｐ−
ニトロフエノール70mg、Ｎ−エチル−N′−ジ
メチルアミノプロピルカルボジイミド480mgを
混合する。引続き40時間60℃で撹拌する。溶剤
を蒸発させた後、RP18（溶離剤：イソプロパノ
ール／水８：２）上でクロマトグラフ処理す
る。 DC：｜Ｈ Rf｜＝0.21（RP18；イソプロパノ
ール／水８：２） 1H−NMR（CDCl3）：δ〔ppm〕：0.88（ｔ，
3H）；1.25（ｍ，32H）；2.04（ｍ，2H）；2.2−
2.8（ｍ，4H）；3.1−3.6（ｍ，13H）；3.80（ｍ，
2H）；3.96（ｍ，2H）；4.28（ｍ，2H）；5.15（ｍ，
1H）；7.30（ｄ，2H）；8.26（ｄ，2H）。 例 ２ １−Ｏ−オクタデシル−２−グルタル酸−メチ
ルレゾルフインエステル−sn−グリセロ−３−
ホスホコリン 表記化合物を（1b）と類似に、（1a）の化合物
31mg、水／テトラヒドロフラン（１：１）10ml、
４−メチルレゾルフイン110mg、Ｎ−エチル−
N′−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド48
mgから製造する。 DC：｜Ｈ Rf｜＝0.20（RP18；イソプロパノー
ル／水８：２）1 H−NMR（d4−Methanol）：δ〔ppm〕：0.90
（ｔ，3H）；1.28（ｍ，32H）；1.92（ｍ，2H）；
2.16（ｓ，3H）；2.44（ｍ，4H）；3.51（ｍ，
2H）；3.69（ｍ，11H）；4.00（ｍ，2H）；4.29
（ｍ，2H）；4.47（ｍ，2H）；5.2（ｍ，1H）；6.7
−7.9（ｍ，5H）。 例 ３ １−Ｏ−ドデシル−２−グルタル酸−ｐ−ニト
ロフエニルエステル−グリセロ−３−サルフエ
ート (a) １−Ｏ−ドデシル−２−グルタル酸−３−Ｏ
−トリチル−グリセリン １−Ｏ−ドデシル−３−Ｏ−トリチル−グリ
セリン20.1ｇ、無水グルタン酸9.2ｇおよびジ
メチルアミノピリジン0.4ｇを、ピリジン100ml
中で８時間50℃に加熱する。溶剤を蒸発させ、
残渣を酢酸エステルにとり、かつ0.05N塩酸で
振とうする。酢酸エステル相を硫酸ナトリウム
上で乾燥した後、溶剤を蒸発させ、かつ残渣を
シリカゲル（展開剤：酢酸エステル／石油エー
テル１：４）でクロマトグラフ処理する。 収量：14ｇ DC：｜Ｈ Rf｜＝0.20（シリカゲル；酢酸エス
テル／石油エーテル１：１） 1H−NMR（CDCl3）：δ〔ppm〕：0.88（ｔ，
3H）；1.25（ｍ，20H）；1.99（ｑ，2H）；2.43
（ｔ，4H）；3.15−3.45（ｍ，4H）；3.59（ｄ，
2H）；5.22（ｍ，1H）；7.3（ｍ，15H）。 (b) １−Ｏ−ドデシル−２−グルタル酸−ｐ−ニ
トロフエニルエステル−３−Ｏ−トリチル−グ
リセリン （3a）の化合物8.6ｇをクロロホルム150mlに
溶解し、かつ順次にニトロフエノール1.94ｇお
よびジシクロヘキシルカルボジイミド14.4ｇを
添加する。室温で12時間撹拌した後、沈澱物を
濾別しかつ濾液を蒸発濃縮する。残渣をシリカ
ゲル（溶離剤：酢酸エステル／石油エーテル
１：４）でクロマトグラフ処理する。 収量：8.8ｇ DC：｜Ｈ Rf｜＝0.42（シリカゲル：酢酸エス
テル／石油エーテル１：４） 1H−NMR（CDCl3）：δ〔ppm〕：0.88（ｔ，
3H）；1.25（ｍ，20H）；2.12（ｑ，2H）；2.53
（ｔ，2H）；2.71（ｔ，2H）；3.2−3.5（ｍ，
4H）；3.59（ｄ，2H）；5.28（ｍ，1H）；7.18
（ｄ，2H）；7.30（ｍ，15H）；8.20（ｄ，2H）。 (c) １−Ｏ−ドデシル−２−グルタル酸−ｐ−ニ
トロフエニルエステル−グリセリン （3b）の化合物６ｇを石油エーテルに溶解
し、かつ硝酸で処理したシリカゲルへ引上げ
る。生成物を石油エーテル／酢酸エステル８：
２で下方へ洗浄する。 収量：2.7ｇ DC：｜Ｈ Rf｜＝0.21（シリカゲル；クロロホ
ルム／アセトン49：１） 1H−NMR（CDCl3）：δ〔ppm〕：0.87（ｔ，
3H）；1.25（ｍ，20H）；2.10（ｍ，2H）；2.53
（ｔ，2H）；2.71（ｔ，2H）；3.45（ｔ，2H）；
3.63（ｄ，2H）；3.82（ｄ，2H）；5.04（ｍ，
1H）；7.28（ｄ，2H）；8.26（ｄ，2H）。 (b) １−Ｏ−ドデシル−２−グルタル酸−ｐ−ニ
トロフエニルエステル−グリセロ−３−サルフ
エート （3c）の化合物500mgをクロロホルム４mlに
とりかつピリジン0.22mlを混合する。氷冷下
に、クロルスルホン酸0.18mlのクロロホルム２
ml中溶液を滴加する。その後にこの反応溶液
を、さらに２時間０℃でおよび１時間室温で撹
拌する。水２滴を添加した後蒸発濃縮し、かつ
残渣をクロロホルムにとる。硫酸ナトリウム上
で乾燥した後、溶剤を蒸発させ、かつ残渣をシ
リガゲル（展開剤：メチレンクロリド／メタノ
ール１：８）でクロマトグラフ処理する。 収量：180mg DC：｜Ｈ Rf｜＝0.26（シリカゲル；メチレン
クロリド／メタノール６：１） 1H−NMR（CDCl3）：δ〔ppm〕：0.89（ｔ，
3H）；1.21（ｍ，20H）；2.02（ｍ，2H）；2.54
（ｍ，4H）；3.45（ｍ，4H）；4.19（ｍ，2H）；
5.33（ｍ，1H）；7.28（ｄ，2H）；8.22（ｄ，
2H）。 例 ４ １−Ｏ−ヘキサデシル−２−グルタル酸−ｐ−
ニトロフエニルエステル−グリセロ−３−サル
フエート (a) １−Ｏ−ヘキサデシル−２−グルタル酸−３
−Ｏ−トリチル−グリセリン 表記化合物を、（3a）と類似に、１−Ｏ−ヘ
キサデシル−３−Ｏ−トリチル−グリセリン15
ｇ、ピリジン50ml、無水グルタル酸6.2ｇ、ジ
メチルアミノピリジン0.4ｇから製造する。 収量：7.14ｇ DC：｜Ｈ Rf｜＝0.35（シリカゲル；酢酸エス
テル／石油エーテル２：３） 1H−NMR（CDCl3）：δ〔ppm〕：0.87（ｔ，
3H）；1.1−1.65（ｍ，28H）；2.0（ｍ，2H）；
2.43（ｔ，4H）；3.32（ｍ，4H）；3.59（ｄ，
2H）；5.21（ｍ，1H）；7.33（ｍ，15H）。 (b) １−Ｏ−ヘキサデシル−２−グルタル酸−ｐ
−ニトロフエニルエステル−３−Ｏ−トリチル
−グリセリン 表記化合物を、（3b）と類似に、（4a）の化
合物3.5ｇ、クロロホルム50ml、ｐ−ニトロフ
エノール0.84ｇ、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド6.18ｇから製造する。 収量：2.85ｇ DC：｜Ｈ Rf｜＝0.47（シリカゲル；酢酸エス
テル／石油エーテル１：４） 1H−NMR（CDCl3）：δ〔ppm〕：0.88（ｔ，
3H）；1.25（ｍ，28H）；2.13（ｑ，2H）；2.53
（ｔ，2H）；2.7（ｔ，2H）；3.33（ｍ，4H）；
3.59（ｄ，2H）；5.28（ｍ，1H）；7.17（ｄ，
2H）；7.33（ｍ，15H）；8.20（ｄ，2H）。 (c) １−Ｏ−ヘキサデシル−２−グルタル酸−ｐ
−ニトロフエニルエステル−グリセリン 表記化合物を、（3c）と類似に（4b）の化合
物2.8ｇから製造する。 収量：1.8ｇ DC：｜Ｈ Rf｜＝0.22（シリカゲル；クロロホ
ルム／アセトン49：１） 1H−NMR（CDCl3）：δ〔ppm〕：0.87（ｔ，
3H）；1.25（ｍ，28H）；2.12（ｑ，2H）；2.55
（ｍ，4H）；3.35−4.0（ｍ，6H）；5.1（ｍ，
1H）；7.28（ｄ，2H）；8.27（ｄ，2H）。 (d) １−Ｏ−ヘキサデシル−２−グルタル酸−ｐ
−ニトロフエニルエステル−グリセロ−３−サ
ルフエート 表記化合物を、（3d）と類似に（4c）の化合
物500mgから製造する。 収量：310mg DC：｜Ｈ Rf｜＝0.30（シリカゲル；メチレン
クロリド／メタノール８：１） 1H−NMR（CDCl3）：δ〔ppm〕：0.87（ｔ，
3H）；1.24（ｍ，28H）；2.03（ｍ，2H）；2.3−
2.8（ｍ，4H）；3.20−3.70（ｍ，4H）；4.19
（ｍ，2H）；5.31（ｍ，1H）；7.29（ｄ，2H）；
8.23（ｄ，2H）。 例 ５ １−Ｏ−ドデシル−２−アジピン酸−ｐ−ニト
ロフエニルエステル−グリセロ−３−サルフエ
ート (a) １−Ｏ−ドデシル−２−Ｏ−ベンジル−グリ
セロ−３−サルフエート １−Ｏ−ドデシル−２−Ｏ−ベンジル−グリ
セリン28ｇをクロロホルム200mlに溶解しピリ
ジン20mlを添加し、かつ０℃で、クロルスルホ
ン酸11.2mlのクロロホルム80ml中溶液を少しづ
つ滴加する。引続き３時間室温で撹拌し、かつ
その後にこの混合物を氷に注ぐ。水相をクロロ
ホルムで３回振とうし、かつ有機相を硫酸ナト
リウム上で乾燥した後蒸発濃縮する。残渣をシ
リカゲル（展開剤：クロロホルム／メタノール
４：１）でクロマトグラフ処理する。 収量：23ｇ DC：｜Ｈ Rf｜＝0.25（シリカゲル；メチレン
クロリド／メタノール９：１）噴霧試薬：ジ
クロルフルオレセイン 1H−NMR（CDCl3）：δ〔ppm〕：0.88（ｔ，
3H）；1.24（ｍ，20H）；3.15−3.50（ｍ，
4H）；3.74（ｍ，1H）；4.0（ｓ，1H）；4.22
（ｍ，2H）；4.59（ｓ，1H）；4.64（ｓ，1H）；
7.26（ｍ，5H）。 (b) １−Ｏ−ドデシル−グリセロ−３−サルフエ
ート （5a）の化合物22.8ｇをメタノール500mlに
溶解し、かつPd／C2.3ｇで水素添加する。反
応過程をDCにより制御する。反応の経過後、
濾別しかつ蒸発濃縮する。残渣をアセトンに懸
濁しかつ濾別する。 収量：15.6ｇ DC：｜Ｈ Rf｜＝0.34（シリカゲル：メチレン
クロリド／メタノール４：１） 1H−NMR（d4−メタノール）：δ〔ppm〕：0.89
（ｔ，3H）；1.28（ｍ，20H）；3.4−3.6（ｍ，
4H）；3.9−4.1（ｍ，3H）。 (c) ｐ−ニトロフエニル−アジピン酸無水物アジ
ピン酸−ｐ−ニトロフエニルエステル１ｇを２
時間無水酢酸40ml中で80℃で撹拌する。引続き
溶剤を蒸発させ、かつ残渣を高真空中で乾燥す
る。粗生成物を引続き反応させる。 DC：｜Ｈ Rf｜＝0.6（シリカゲル；酢酸エー
テル） (d) １−Ｏ−ドデシル−２−アジピン酸−ｐ−ニ
トロフエニルエステル−グリセロ−３−サルフ
エート （5b）、（5c）の化合物0.44ｇおよびジメチル
ピリジン100mgをピリジン50ml中で５時間80℃
で撹拌する。溶剤を蒸発させた後シリカゲル
（展開剤：クロロホルム／メタノール６：１）
でクロマトグラフ処理する。 収量：100ｇ DC：｜Ｈ Rf｜＝0.29（シリカゲル；クロロホ
ルム／メタノール６：１） 1H−NMR（CDCl3）：δ〔ppm〕：0.86（ｔ，
3H）；1.23（ｍ，20H）；1.73（ｍ，4H）；2.20
−2.75（ｍ，4H）；3.2−3.7（ｍ，4H）；4.16
（ｍ，2H）；5.31（ｍ，1H）；7.29（ｄ，2H）；
8.24（ｄ，2H） 例 ６ 溶液１：トリス緩衝剤（PH7.1）125ｍＭ、塩化カ
ルシウム4.0ｍＭ、トライトン（Triton）Ｘ−
100 250μ／100ml、ナトリウムデスオキシコ
レート41mg／100ml。 溶液２：溶液１ １mlに、基質である１−Ｏ−ヘ
キサデシル−２−グルタル酸−ニトロフエニル
エステル−rac−グリセロ−３−サルフエート
２mgを添加し、わずかな加熱下にエマルジヨン
が形成されるまで撹拌する。 このものに被検体（酸素溶液）20mlを添加す
る。反応の経過を、測光法によりλ＝405nｍ
で追跡する。 公知のホスホリパーゼ活性を基準として評価す
る場合、被検体のホスホリパーゼ活性を以下のよ
うに計算する： 活性（被検体）＝活性（基準）・ΔE／分（被
検体）／ΔE／分（基準） また、被検体のホスホリパーゼ活性の計算は下
式によつても可能である： 活性（被検体）〔Ｕ／〕＝1000・Vges／ε・
Ｖ（被検体）・ｄ・ΔE／分 Vges：測定バツチの総容積〔cm3〕 Ｖ（被検体） ：被検体の容積〔cm3〕 ε：発色体の405nｍにおける吸光係数 ｄ：キユベツトの層厚〔cm〕 ΔE／分：405nｍにおける１分当りの吸光度変動 前記反応条件において、吸光係数が ε＝9.0・１cm2・μモル-1 である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式： または 〔式中、 ＡがＣ原子数１〜16を有するアルキレン−また
    はアルケニレン基、 ＲがＨまたはＣ原子数１〜20を有するアルキル
    −、アルケニル−またはアシル基、またはアルキ
    ル基中の炭素原子数１〜８を有する、場合により
    アルキル置換されたアリール−またはアルアルキ
    ル基、 Ｘが芳香族ヒドロキシ−またはチオール化合
    物、およびそれぞれのＹが独立に相互に−Ｓ−ま
    たは−Ｏ−、 Ｚが−SO3 または【式】を表わし、 但しR1が水素原子または基：（CH2）oNR2 3（式中、
    ｎが２〜４の数およびR2がＨまたはCH3を表わ
    す）、またはイノシトール、またはセリン
    【式】またはグリセリンであ ることができる〕のホスホリパーゼ基質。 ２ ＲがＣ原子数６〜20を有する請求項１記載の
    ホスホリパーゼ基質。 ３ ＡがＣ原子数３〜７を有する請求項１または
    ２記載のホスホリパーゼ基質。 ４ Ｘが、場合により置換されたレゾルフイン
    基、クロルフエノールレツド−、インドキシル
    −、ナフトール−、チオフエノール−、チオフル
    オレセイン−またはフエノール基である請求項
    １、２または３記載のホスポリパーゼ基質。 ５ 一般式： または 〔式中、 ＡがＣ原子数１〜16を有するアルキレン−また
    はアルケニレン基、 ＲがＨまたはＣ原子数１〜20を有するアルキル
    −、アルケニル−またはアシル基、またはアルキ
    ル基中の炭素原子数１〜８を有する、場合により
    アルキル置換されたアリール−またはアルアルキ
    ル基、 Ｘが芳香族ヒドロキシ−またはチオール化合
    物、およびそれぞれのＹが独立に相互に−Ｓ−ま
    たは−Ｏ−、 Ｚが−SO3 または【式】を表わし、 但しR1が水素原子または基：（CH2）oNR2 3（式中、
    ｎが２〜４の数およびR2がＨまたはCH3を表わ
    す）、またはイノシトール、またはセリン
    【式】またはグリセリンであ ることができる〕の基質にホスホリパーゼを含有
    する被検体を作用させ、かつ遊離せる芳香族ヒド
    ロキシ−またはチオール化合物の量を直接にまた
    は、適当な色原体を結合させた後これにより形成
    された色相を光学的に測定することを特徴とする
    ホスホリパーゼを光学的に定量する方法。 ６ 定量を、試薬中のカルシウム濃度0.5〜10ｍ
    Ｍ／で実施する請求項５記載の方法。 ７ 一般式： または 〔式中、 ＡがＣ原子数１〜16を有するアルキレン−また
    はアルケニレン基、 ＲがＨまたはＣ原子数１〜20を有するアルキル
    −、アルケニル−またはアシル基、またはアルキ
    ル基中の炭素原子数１〜８を有する、場合により
    アルキル置換されたアリール−またはアルアルキ
    ル基、 Ｘが芳香族ヒドロキシ−またはチオール化合
    物、およびそれぞれのＹが独立に相互に−Ｓ−ま
    たは−Ｏ−、 Ｚが−SO3 または【式】を表わし、 但しR1が水素原子または基：（CH2）oNR2 3（式中、
    ｎが２〜４の数およびR2がＨまたはCH3を表わ
    す）、またはイノシトール、またはセリン
    【式】またはグリセリンであ ることができる〕の少くとも１種の化合物および
    緩衝剤、並びに胆汁酸、Ca++および場合により
    発色性カツプラーおよび／または補酵素を含有す
    ることを特徴とするホスホリパーゼを光学的に定
    量する試薬。 ８ それぞれ使用準備の出来た、試薬としての溶
    液に対し、 基質0.05〜10mg／ml、 胆汁酸２〜50mg／ml、 Ca++0.5〜10ｍＭ／、 表面活性剤０〜10ｇ／、 緩衝剤20〜250ｍＭ／、 を含有する請求項７記載の試薬。 ９ キヤリヤ物質に含浸配置されている請求項７
    または８記載の試薬。
JP1046717A 1988-03-04 1989-03-01 ホスホリパーゼ基質、およびホスホリパーゼを光学的に定量する方法および試薬 Granted JPH023662A (ja)

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