DK162231B - Phenolsulfonphthaleinyl-beta-d-galactosider, fremgangsmaade til deres fremstilling, anvendelse heraf til bestemmelse af beta-d-galactosidase samt et diagnostisk middel indeholdende disse - Google Patents

Phenolsulfonphthaleinyl-beta-d-galactosider, fremgangsmaade til deres fremstilling, anvendelse heraf til bestemmelse af beta-d-galactosidase samt et diagnostisk middel indeholdende disse Download PDF

Info

Publication number
DK162231B
DK162231B DK604184A DK604184A DK162231B DK 162231 B DK162231 B DK 162231B DK 604184 A DK604184 A DK 604184A DK 604184 A DK604184 A DK 604184A DK 162231 B DK162231 B DK 162231B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
galactoside
galactosides
galactosidase
solution
sulfonephthaleinyl
Prior art date
Application number
DK604184A
Other languages
English (en)
Other versions
DK604184D0 (da
DK162231C (da
DK604184A (da
Inventor
Manfred Kuhr
Rudolf Machat
Herbert Buschek
Wolfgang Weckerle
Hans-Georg Batz
Rupert Herrmann
Wolfgang Kleemann
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of DK604184D0 publication Critical patent/DK604184D0/da
Publication of DK604184A publication Critical patent/DK604184A/da
Publication of DK162231B publication Critical patent/DK162231B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK162231C publication Critical patent/DK162231C/da

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20Carbocyclic rings
    • C07H15/203Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/40Triphenylmethane dye chromogens, e.g. fluorescein derivatives
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914Hydrolases (3)
    • G01N2333/924Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

DK 162231 B
Oligo- eller polysaccharider, som indeholder D-galactose med β-glycosidisk binding forekommer i næsten alle organismer.
Som følge heraf er også de tilsvarende β-D-galactosidaser (EC 3.2.1.23) vidt udbredt, og de kan påvises i talrige mikro-5 organismer/ dyr og planter.
β-D-galactosidase opfylder en mangesidet fysiologisk funktion på pattedyrsområdet: den spiller en vigtig rolle i carbohydrat-stofskiftet/ hvorigennen hydrolyse af lactosen sker. Desuden 10 udgør β-D-galactosidasen nøgleenzymet ved nedbrydningen af gly-colipider/ mucopolysaccharider og glycoproteiner.
Udover den fysiologiske betydning har β-D-galactosidasen i de senere år fået betydning på det diagnostiske område. Således 15 anvendes f.eks. dette enzym i voksende grad som indikator-enzym til enzymimmunoanalyser/ de såkaldte enzymimmunoassays [se f. eks. Annals og Clinical Biochemistry 167 221-240 (1979)].
Bestemmelsen af β-D-galactosidases aktivitet spiller følgelig 20 en voksende rolle såvel i den kemiske kemi som i diagnostikken. Hertil bliver ganske almindeligt den galactosidaseholdige prøve behandlet med en egnet β-D-galactosidasesubstrat. Substratet bliver spaltet af enzymet. Et af spaltningsprodukterne bliver påvist på egnet måde. Der kan enten måles den ved indvirk-25 ning af enzymet frigjorte glycon eller aglyconen. I reglen bestemmes sidstnævnte. Som substrat egner sig det naturlige substrat lactose samt især et chromogent galactosid.
I Biochem. Z. 333, 209 (1960) er således beskrevet phenyl-β-30 D-galactosid samt nogle yderligere ved den aromatiske ring substituerede derivater (f.eks. o-nitrophenyl- og p-nitrophe-nyl-S-D-galactosid) som'substrat for β-D-galactosidase. De ved hydrolyse frigjorte phenoler bestemmes fotometrisk i UV-området eller ved nitrophenolerne i det kortbølgede synlige bølgelæng-35 deområde. Som indikatorreaktion kan også tilføjes en oxidativ- kobling med aminoantipyrin [Nanlytical Biochem. 40, 281 (1971)].
DK 162231 B
2
Til histokemiske undersøgelser anvendes for det første naphthyl-β-D-galactosider: således f.eks. 1-naphthylforbindelsen i Histo-chemie 35/ 199 (1973) , 6-brom-2-naphthylderivatet i J. Biol.
Chem. 195/ 239 (1952) eller naphthol-AS-BI-£-D-galactosider 5 [Histochemie 37/ 89 (1973)]. Til visualiseringen bliver derved de dannede naphtholer omsat med forskellige diazoniumsalte til azo-farvestoffer.
Yderligere kendes 5-brom-4-chlor-indoxyl-3^-D-galactosid som 10 β-galactosidasesubstrat. Indikatorreaktion er her den oxidative dimerisering af det dannede indoxyl til indigo [histochemie 23/ 266 (1970)] eller kobling med diazoniumsalte til indoxyl-azo-farvestoffer [Histochemistry 57, 323 (1978)].
15 De ovennævnte, bestemmelsesmetoder har væsentlige ulemper: for det første er de for ufølsomme. Desuden er de i de histokemiske påvisninger anvendte substrater meget tungtopløselige.
Til påvisning af N-acetyl-ø-D-g1ucosaminidase er der blevet 20 foreslået et chromogent substrat, der som farvedannende agly-con indeholder en chromofor fra phenophthalein-rækken, se DK patentansøgning nr. 1152/82 svarende til EP offentliggørelses-skrift nr. 60.793. Tilsvarende galactosidasesubstrater spaltes dog væsentligt bedre fra galactosidase, end det kunne forven-25 tes ud fra de tilsvarende NAG-substrater.
Der fås væsentligt mere følsomme prøver , når der som substrater anvendes galactosider/ hvis aglyon kan påvises fluorometrisk: I Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. 47, 19·81 (1961) ér således beskre-30 vet fluorescein-di-Ø-D-galactosid som substrat. Desuden anvendes 2-naphthyl-3~D-galactosid [analytical Biochem. 42, 275 (1971)] eller 4-methyl-umbelliferyl-3-D-galactosid [Biochem. J. 102, 525 (1967)].
35 De f luorometiske metoders ulempe består i,at der her er betydelige udgifter til apparatur.
Der er desuden et behov for substrater med hvilke β-D-galac-tosidasen kan bestemmes på simpel, hurig og pålidelig måde. Opgaven var at opfylde dette behov.
DK 162231 B
3
Det har nu vist sig, at man kan påvise β-D-^galactosidase me·*· get følsomt i det synligt spektralområde visuelt eller med simp-5 le spektrafotometerap: arater, når man som substrater anvender sulfonphthaleinyl-p-D-galactosider. !>isse forbindelser har desuden den fordel, at de er meget let opløselige i vand.
10
Den foreliggende opfindelse angår derfor sulfonphthaleinyl-β-D-galactosider ejendommelige ved den almene formel I
CH20H rS Rl0
Ttyvr*· "W
η4 - δθΓΜ+ ψ.· R2 hvori
Rl-R*, der kan være ens eller forskellige, hver betegner hy-25 drogen, halogen, en nitro- eller en aminogruppe, r5_r12, der kan være ens eller forskellige, hver betegner hydrogen, halogen, en (Ci-C5)-alkyl-, en hydroxy- en (Cj-CsJ-al-koxy-, en carboxyl- eller en nitrogruppe, 30 M+ betegner et proton, en alkali-, en jordalkali- eller en ammon i umi on.
Samtlige sulfonphthaleinyl-p-D-galactosider med den almene 35 formel I er hidtil ukendte forbindelser. De kan fremstilles ifølge i og for sig kendt metoder fra carbohydratkemien.
DK 162231 B
4
Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til fremstilling af sul f onphthal ei nyl-/3-D-gal actosider med den almene formel I, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at. man på i og for sig kendt måde omsætter phenol sulfonphthaleiner med den almene 5 formel II, R6 R10
HOv/yR5 RV'S^0H
*·γγ“ι_ π» 15 i* hvori 1 12 R -R har ovennævnte betydning/ 20 med per-O-substituerede 1-halogeno-a-D-galactoser med
den almene formel III
CH2OR13
R1 30 I
1/ °\
YORi 3N
25 \| /1 - N—X CIII) 0R1 3 hvori 13 X betegner halogen, og R betegner en i carbohydratkemien 30 almindelig beskyttelsesgruppe, under Walden-omdannelse ved C-l-atomet i sukkerresten til per-O-substi tuerede sulfonphthaleinyl-3-D-galactosider med den almene formel IV 35
DK 162231 B
5 CH2OR13 13 I R6 R10 R ? J—O /Ox^x/R5
k°r'V iY YY
X-/ rt/vX. ' 6 I r! X r'! OR15 (iv)
Ri'xxN^so>'il+ -XX, 10 R2 ] 3 og beskyttelsesgrupperne R ' afspaltes fra sidstnævnte på i og for sig kendt måde.
15 Omsætningen af forbindelserne med formlerne II og III til ga-lactosider med den almene formel IV foretages fortrinsvis i næ-rværelse af syreacceptorer, såsom alkalihydroxid eller -car-bonat i vandig acetone eller (under faseoverføringsbetingelser) i en vand/benzen- eller vand/chloroform-blanding.
20
Galactosiderne med den almene formel IV kan desuden fremstilles ved at man først ved hjælp af alkalihydroxid eller -alkoholat overfører phenolsulfonphthaleinerne med den almene formel II i di-alkalisaltene eller ved hjælp af eventuelt substituere- 25 de aminer i ammoniumsaltene og derpå i polære aprotiske opløsningsmidler , såsom acetone, dimethylsulfoxid, dichlormethan, tetrahydrofuran eller dimethyl formamid/ omsætter disse med de perKJ-substituerede 1-halogeno-galactoser med den almene formel III.
30 Ved syntesen af galactosider med den almene formel IV ud fra phenolsulfonphthaleinerne med den almene formel II og 1-halo-geno-galactoserne med den almene formel III har det desuden vist sig værdifult at tilsætte enkelte sølvsalte eller blandinger af sølvsalte (sølvoxid, -carbonat, -carbonat på celite, 35 -triflat, -salicylat) og/eller enkelte kviksølvsalte eller blandinger af kviksølvsalte (kviksølvperbromid, -cyanid, -acetat, -oxid) eventuelt under anvendelse af tørringsmidler, såsom calciumchlorid eller drierit i opløsningsmidler,såsom methylenchlorid, chloroform, benzen, toluen eller dioxan.
DK 162231 B
6
De således opnåede per-O-substituerede sulfonphthaleinyl-3-D-galactosider med den almene formel IV er ligeledes hidtil u-kendte forbindelser.
13 5 Afspaltningen af beskyttelsesgrupperne R af per-O-substitueren. de sulfonphthaleinyl-'-p-D-galactosider med den almene formel IV til sulfonphthaleinyΙ-β-D-galactosiderne med den almene formel I gennemføres efter de i carbohydratkemien sædvanlige metoder [se f.eks. Advances Carbohydrate Chem./ 12, 157 (1957)], f.eks. ved acylbeskyttelsesgrupperne ved hjælp af natriummethylat eller bariummethylat eller ammoniak i methanol.
Phenholsulfonphthaleinerne med den almene formel II er kendte i handelen værende stoffer eller fremstilles ifølgé kendte frem-15 gangsmåder af den tilsvarende phenol og den'tilsvarende o-sul-fonbenzoesyre (se f.eks. D.S. Breslow og H. Skolnik i A. Weiss-berger, The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Interscience-Pub lishers, Nexsrk, 1966, bind 21, side 118) eller bliver, idet man går ud fra kendte sulfonphthaleiner, senere derivatiseret, 20 f.eks. halogeneret eller nitreret (jf. f.eks. D.S. Breslow og H. Skolnik, ibid., side 141* side 144).
De som udgangsmateriale anvendte per-O-substituerede 1-halogeno-α-galactoser med den almene formel III er ligeledes kendte for-25 bindeiser. De er f.eks. beskrevet i Chem. Ber. 35, 836 (1902)j Nature 165, 369 (1950)* Acta Chem. Scand., Ser. B. 33, 116 (1979)* J. Chem. Soc., 1419 (1965)* Carbohydr. Res., 11, 85 (1969) .
30 I forbindelse med definitionen af R-Rx og X skal der med halogen forstås· fluor, chlor, brom og jod, ved R -R fortrinsvis fluor, chlor og brom,og ved X fortrinsvis chlor og brom.
5 12 3 5 Ved definitionen af RD-R"L indeholder den lavere alkylgruppe 1-5, fortrinsvis 1-3 carbonatomer, hvorhos methyl- og iso-propylgruppen ganske særligt foretrækkes.
DK 162231 B
7 5 12
Ved definitionen af R -R indeholder den lavere alkylgruppe 1-5, fortrinsvis 1-3 carbonatomer, hvorhos methoxygruppen 5 ganske særligt foretrækkes.
Ved definitionen af M+ skal der med alkalimetalion forstås lithium-, natrium- og kaliumionen, hvorhos lithium- og natriumionen foretrækkes.
10 Ved definitionen af betegner jordalkaliionen magnesium-, calcium- og bariumionen, hvorhos calciumionen foretrækkes.
Ved definitionen af M+ skal der med ammoniumion forstås [N R14 „15 „16 „17.+ . .
R R R ] , hvorhos 15 14 17 R -R , som kan være ens eller forskellige, hver betegner hydrogen, en lavere alkylgruppe med 1-4, fortrinsvis 1-2 car-bonatomer^ eller en benzylgruppe.
13
20 Som "i carbohydratkemien sædvanlig beskyttelsesgruppe" R
egner sig især en acetyl-, benzoyl-, benzyl- eller trimethylsi-lylgruppe.
Opfindelsen angår desuden anvendelsen af de hidtil ukendte 25 sulfonphthaleinyl-ø-D-galactosider med den almene formel I til bestemmelse af jS-D-galactosidases aktivitet.
Opfindelsen angår yderligere et diagnostisk middel til bestemmelse af j8-D-galactosidasers aktivitet, hvilket middel inde-30 holder et eller flere chromogene substrater, et egnet pufferstof samt eventuelt yderligere sædvanligt anvendte hjælpestoffer, og hvilket middel er ejendommeligt ved, at der som chromogene substrater anvendes pheno 1 su 1 f onphthal ei ny 1-/S-D-gal ac-tosider med den almene formel I.
35
DK 162231 B
8
Anvendelsen af sulfonphthaleinyl-,6-D-galactosiderne som substrater for β-D-galactosidaderne fører til β-D-galactosidase-testsystemer, der er tydeligt mere følsomme erid de hidtil kendte. De hidtil ukendte substrater kan med fordel anvendes til 5 bestemmelsen af aktiviteten af β-D-galactosidaser, såvel på det biokemiske som på det klinisk-kemiske område. De er mere følsomme. Deraf fremkommer flere fordele: a) Der kan måles ringere β-D-galactosidaseaktiviteter.
10 b) Der kan anvendes mindre prøvemængder.
c) Bestemmelsen af β-D-galactosidaseaktiviteten kan ske på væsentlig kortere tid.
15 d) Den ringe prøvemængde og den gunstige målebølgelængde forhindrer desuden tilbøjelighed til, at metoden forstyrres af andre prøvebestanddele.
Det har vist sig, at de omhandlede substrater til bestemmelse 20 af aktiviteten af β-D-galactosidaser af enhver oprindelse, som gennemgående kan være forskellige i deres optimale pH-værdi, er egnede. Også i sådanne tilfælde reagerer diagnostiske midler med substraterne med den almene formel i væsentligt mere følsomt end de hidtil kendte testmidler.
25
Sulfonphthaleinyl^-D-galactosiderne med formlen I egner sig også til immunologiske bestemmelsesmetoder, ved hvilke β-D- galactosidase anvendes som indikatorsystem, hvis aktivitet må bestemmes efter gennemførelse af den immunologiske reaktion.
30 Sådanne immunologiske bestemmelsesmetoder med enzymatisk indikatorreaktion kendes af fagfolk som enzymimmunoassays. Disse metoder tjener til bestemmelse af koncentrationen af proteiner, polysaccharider, hormoner, lægemidler og andre lavmolekylære -5 -12 stoffer i intervallet fra 10 til 10 mol/1. Alt efter krav 35 til fasesepareringstrin skelner man mellem homogen og heterogen testgennemførelse. En yderligere opdeling kan ske i kompetitive og ikke-kompetitive testprincipper.
9 DK 162231 B
Alle testprincipper arbejdei dog med enzym-antigen- eller enzym-antiskof-konjugater. Den enzymatiske indikatorreaktion er fælles for alle enzymimmunoassays.
Et til sådanne formål egnet indikatorenzym er β-D-galactosidasen. 5
Bestemmelsen af β-D-galactosidasen i sådanne enzymimmunoassays sker på sædvanlig måde, idet der tilsættes et egnet β-D-galacto-sidasesubstrat, som spaltes enzymatisk og på sædvanlig måde måles fotometrisk.
10
En forbedring af β-D-galactosidase-testsystemet fører derfor ligeledes til væsentlige fordele ved sådanne enzymimmunoassays: 1. Den højere følsomhed muliggør også her en yderligere sænkning af påvisningsgrænserne, kortere reaktionstider og ringere prøvemængde og dermed også ringere forstyrrelser af andre prøvebestanddele.
2. De gunstigere målebølgelængder formindsker ved bestemte reaktionsforløb tendensen til at metoden forstyrres af uopløselige bestanddele, f.eks. uklarheder.
Det diagnostiske middel indeholder udover en eller flere af stofferne ifølge opfindelsen med den almene formel I et egnet puffersytem samt eventuelt yderligere egnede sædvanligvis til sådanne diagnostiske midler anvendte tilsætningsstoffer, som f.eks. befugtningsmidler, stabilisatorer osv. Det diagnostiske middel kan foreligge i form af en opløsning, som lyo-filisat, som pulverblanding, reagenstabletter eller opsuget på en sugedygtig bærer.
30
Det diagnostiske middel ifølge opfindelsen i form af en opløsning indeholder fortrinsvis samtlige til testen nødvendige reagenser. Som opløsningsmiddel kommer vand eller blandinger af vand med et vandopløseligt organisk opløsningsmiddel, som f.
<5 c eks. methanol, ethanol, acetone eller dimethylformamid, på tale . Af holdbarhedsgrunde kan det være fordelagtigt at fordele de til testen nødvendige reagenser på to eller flere opløsninger, som først blandes ved den egentlige undersøgelse.
DK 162231 B
10
Til fremstillingen af det diagnostiske middel i form af et lyofilisat i en samlet vægt på ca. 5-20 mg, fortrinsvis 10 mg, . tørres en opløsning, som foruden samtlige til testen nødvendige reagenser indeholder sædvanlige strukturmidler, som f.eks.
5 polyvinylpyrrolidon, og evt. yderligere fyldstoffer, som f.esk. mannit, sorbit eller xylit.
Et diagnostisk middel i form af pulverblandinger eller reagenstabletter kan fremstilles ved^ at man blander testbestanddelene 10 med sædvanlige galeniske tilsætningsstoffer og granulerer blandingen. Tilsætningsstoffer af denne art er f.eks. car-bohydrater, som f.eks. mono-, oligo- eller polysaccharide^ eller sukkeralkoholer, som f.eks. mannit, sorbit eller xylit, eller andre opløselige inerte forbindelser, såsom polyethylen-15 glucoler eller polyvinyIpyrrolidon. Pulverblandingerne eller reagenstabletterne har i almindelighed en slutvægt på ca. 30-200 mg, fortrinsvis 50-80 mg.
Til fremstillingen af det diagnostiske middel i form af en 20 teststrimmel bliver en sugedygtig bærer, fortrinsvis filterpapir, cellulose eller kunstfiberfilt, imprægneret med opløsninger af de nødvendige sædvanligvis til fremstillingen af test-strimler anvendte reagenser i letflygtige opløsningsmidler, som f.eks. vand, methanol, ethanol eller acetone. Dette kans ske i 25 et imprægneringstrin. Ofte er det dog hensigtsmæssigt at gennemføre imprægneringen i flere trin, hvorved der anvendes opløsninger, som hver indeholder en del af det diagnostiske middels bestanddele. Således kan f.eks. imprægneres i et første trin med en vandig opløsning, som indeholder pufferen og an-30 dre vandopløselige tilsætningsstoffer og derpå imprægneres i et andet trin med en opløsning, som indeholder β-D-galactosi-dasesubstraterne. Det færdige testpapir kan anvendes som sådant eller på i og for sig kendt måde klæbet på greb eller fortrinsvis placeret mellem syntetiske stoffer og finmaskede net-35 værk ifølge DE 2118455.
De følgende eksempler viser nogle af de talrige fremgangsmådevarianter, der kan anvendes til syntese af forbindelserne ifølge opfindelsen, samt eksempelvis anvendelsen af hidtil ukendte
11 DK 162231 B
sulfonphthaleinyl-Ø-D-calactosider til bestemmelse af 3-D-ga-lactosidases aktivitet. De skal dog ikke anses for en begrænsning af den foreliggende opfindelses omfang.
Der anvendes følgende forkortelser: 5 HEPES 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsyre BSA Bovinserum-albumin
Tween-20 Polyoxyetbylen(20)sorbitanmonolaurat Tricin [N-tris(hydroxymethyl)]methyl-glycin 10
Eksempel 1.
3 , 3'-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-fi-D-galactosid-natriumsalt.
15 a) En opløsning af 45 g (0/11 mol) 2,3,4,6-tetra-0-acetyl-<x- D-galactopyranosylbromid opvarmes i 450 ml chloroform til 60°C. Under omrøring tilsættes ved denne temperatur: en opløsning af 29/9 g (0,11 mol) benzyltriethylammoniumbromid i 114 ml 1,25 N vandig natriumhydroxid (0,142 mol), derefter 46,5 g 20 (0,11 mol) 3,3’-dichlor-phenolsulfonphthalein (chlorphenolrød).
Farvestofresten skylles ned fra beholdervæggen med noget vand og yderligere 114 ml 1,25 N vandig natriumhydroxid.
Reaktionsblandingen koges i 12 timer under tilbagesvaling og 25 henstår derpå i 8 timer ved stuetemperatur. Den organiske fases skilles fra, og den vandige fase udrystes flere gange med chloroform. Til fjernelse af endnu tilstedeværende udgangsmateriale udrystes de forenede organiske faser flere gange med 0,IN vandig natriumhydroxid.
30
Efter vask af chloroformfasen med vand og tørring med natriumsulfat inddampes det organiske opløsningsmiddel. Resten rives med ether, og herved fås 36 46 g 3,3,-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-2,3-4,6-tetra-0- aceiyl-3-D-galactosid-natriumsalt.
DK 162231 B
12 som et gult amorft stof (udbytte54% af det teoretiske udbytte) smeltepunkt 190°C (dekomponering) NMR: (DMSO-dg): 1,95 (s, 3H) , 1,99 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), .
2,12 (s, 3H) , 4,0 - 4,6 (m, 4H) , 5,1 =· 5,7 5 (m, 3H), 6,1 - 6,8 (m, IH) 6,9 ^ 7,7 (m, 8H), 7,8 - 8,0 (m, IH).
b) En opløsning af 28 g (0,036 mol) af det ifølge a) fremstillede tetraacetylgalactosid afkøles i 270 ml absolut me-10 thanol til 0-5°C. Til desacetylering tilsættes under omrøring ved denne temperatur 72 ml af en 1 molær (0,072 mol) natriummethylat-opløsning i methanol.
Efter 15 min. ved 0-5°C behandles opløsningen til fjernelse af 15 overskud af natriumioner med ca. 300 ml "Amberlite" IRC 50, og blandingen omrøres i 2 timer ved 5°C. Efter frasugning af ionbutteren vaskes denne flere gange med methanol.
Efter inddampning af de forenede filtrater renses resten søjle-20 kromatografisk på kieselgel med methylenchlorid/methanol (5:1) og herved fås 12 g 3,3'-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-p-D-galactosid-natriumsalt 25 som et gult amorft pulver (udbytte 55% af det teoretiske udbytte) smeltepunkt 210°C (dekomponering) NMR: (DMSO-dg): 3,3 - 3,7 (m, 6H), 3,9 - 5,0 (m, 4H), 5,1 (d, J = 7 HZ, IH), 6,1 - 6,8 (m, IH), 30 6,9 - 7,6 (m, 8H), 7,8 - 8,0 (m, IH).
Eksempel 2 På tilsvarende måde, som beskrevet i eksempel 1, fremstilles de 35 i det efterfølgende skema under "slutprodukt" anførte β-D- galactosider ved omsætning af 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-D-ga-lactopyranosylbromid med de under "udgangsmateriale" anførte phenolsulfonphthaleiner over de tilsvarende peracetylerede ga-lactosider.
O
DK 162231 B
Udgangsmateriale Slutprodukt Smeltepunkt (°C) 13 1) Phenolrød phenolsulfonphthaleinyl-β- 218-220 5 D-galactosid-natriumsalt 2) Fluorphe- 3,3'-difluorphenolsulfon- glasagtig nolrød phthaleinyl-g-C-galactosid- natriumsalt 10 3) Chlorphe- 3,3 ' ,5,5'-tetrachlorphe- 145-150 nolblå nol-sulfonphthaleinyl-β- D-galactosid-natriumsalt 15 4) Pyrocate- 3,3-dihydroxyphenolsulfon- 115-120 chinviolet phthaleinyl-.Ø-D-galactosid-natriumsalt 5) Jodphenol- 3,315,51-tetraiodphenol- 210-215 20 blå sulfonphthaleinyl-Ø-D- galactosid-natriumsalt 6) m-cresul- 2,2'-dimethylphenolsulfon- 205-209 purpur phthaleinyl-Ø-D-galactosid- 25 natriumsalt 7) Bromere- 3,3'-dibrom-5,5'-dimethyl- 200-203 solpurpur phenolsulfonphthaleinyl-β- D-galactosid-natriumsalt 30 8) o-cresol- 3,3'-dimethylphenolsulfon- 200-204 rød phthaleinyl-3-D-galactosid~ natriumsalt 35 9) Thymolblå 3,3'-diisopropyl-6,6'-dime- 205-209 thylphenolsulfonphthaleinyl- β-D-galactosid-natriumsalt
Udgangsmateriale Slutprodukt Smeltepunkt (°C)
DK 162231 B
O
14 10) Bromthy- 3,3'-dibrom-5,5'-diisopro- 190-195 5 molblå py1-2,2'-dimethylphenolsul- fonphthaleinyl-3“D-galac- tosid-natriumsalt 11) Salicyl- 3,3'-dicarboxyphenolsulfon- 178-180 10 rød phthaleinyl-6-D-galactosid- natriumsalt 12) 3,3^5,5^ 3,3 ' ,5,5 '-tetrabrom-2,2 100-103 tetrabrom- dimethylphenolsulfonphtha- 15 2,2'-dime- leinyl-p-D-galactosid- thylphenol- natriumsalt sulfon-phthalein 20 13) 3,3'-dini- 3,3‘-dinitrophenolsulfon- 16 7-170 tro-phe- phthaleinyl-3-D-galactosid- nolsulfon- natriumsalt phthalein 25 14) 3,3'-di- 3,3'-dichlor-5,51-dinitro- 115-118 chlor-5,5'- phenol-sulfonphthaleinyl-dinitrophe- 3-D-galactosid-natrium-nolsulfon- salt phthalein 30 15) 3,3'-dime- 3,3'-dimethy1-5,5'-dinitro- 155-158 thy1-5,5'- phenolsulfonphthaleiny1-dinitrophe- 3-D-galactosid-natrium-nolsulfon- salt 35 phthalein
Udgangsmateriale Slutprodukt Smeltepunkt (°C)
DK 162231 B
O
15 16) 3,3’-dimetho- 3 r 3'-dimethoxyphenolsul- 5 xy-phenolsul- fonphthaleinyl-3-D-galac- fon-phthalein tosid 17) 3/3'-difluor- 3/3’-difluorphenyl-3"/4" , phenyl 3 ,4 , 5"76"-tetrabromsulfonphtha- 10 5"/6"-tetra- leinyl-3-D-galactosid bromsulfon- phthalein 18) 2,2’.dimethyl- 272'-dimethyl-3,3"-dinitro- 15 3/3'-dinitro- phenolsulfonphthaleinyl- phenolsulfon- β-D-galactosid phthalein 19) 2/2’-dimethyl- 2,2'-dimethy1-5,5’-dinitro- 20 5/5'-dinitro- phenolsulfonphthaleinyl- phenolsulfon- β-D-galactosid phthalein 20) Phenol-4"- phenol-4"-nitrosulfonphpta- 300 25 nitrosulfon- leinyl-3-D-galactosid-na- phthalein triumsalt 21) Phenol-5"- phenol-5"-nitrosulfonphtha- nitrosulfon- leinyl-3-D-galactosid 30 phthalein 22) 3/3'-dichlor- 3,3 ’-dichlorphenol-4"- 160- 300 phenol-4"-ni- nitro-sulfonphthaleinyl- trosulfon- β-D-galactosid-natrium- 35 phthalein salt
Udgangsmateriale Slutprodukt Smeltepunkt (°C)
O
DK .162231 B
16 23) 3,3'-difluor- 3/3'-difluorphenol-4"- 5 phenol-4"-ni- nitro-sulfonphthaleinyl- trosulfon- β-D-galactosid phthalein 24) 3,3'“4"- 3/3'4"-trinitrophenolsul- 300 10 trinitro- fonphthaleinyl-3-D-galacto- phenolsul- sid-natriumsalt fonphthale in 15 25) Phenol-4"- phenol-4"-aminosulfonphthale-·' amorft aminosulfon- inyl-3-D-galactosid-natriumsalt phthalein 20 Eksempel 3 3,3'-difluor-phenolsulfonphthaleinyl-fi-D-galactosid-natriumsalt.
a) 6,2 g (0/016 mol) 3,3'-difluor-phenolsulfonphthalein (fluor-25 phenolrød) opløses i 170 ml absolut methanol. Til dannelse af dinatriumsaltet tilsættes 32 ml (0,032 mol) af en 1 molær natriummethylatopløsning i methanol. Opløsningen inddampes til tørhed. Til opløsning af resten i 140 ml absolut dimethylformamid tilsættes 7,3 g (0,0176 mol) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-30 D-galactopyranosylbromid ,og der omrøres i 6 timer ved stuetemperatur. Efter frasugning inddampes filtratet ved stuetemperatur under oliepumpevacuum. Resten rives med ether, frasuges og tørrs, hvilket giver 35 6,9 g 3/3,^difluor-phenolsulfonphthaleinyl-2/3,4,6-tetra-0- acetyl-Ø-D-galactosid-natriumsalt
DK 162231 B
O
17 som et orangefarvet amorft stof (udbytte 63% af det teoretiske udbytte) smeltepunkt 215°C (dekomponering) NMR: (DMSO-dg): 1,94 (s, 3H) , 1,96 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 5 2,15 (s, 3H) , 3,9 - 4,7 (m, 4H), 5,0 - 5,6 (m, 3H),6,2 - 6,6 (m, IH), 7,0 - 7,6 (m, 8H), 7,9 - 8,2 (m, IH) 10 b) En opløsning af 3,5 g (0,005 mol) af det ifølge a) fremstillede tetraacetylgalactosid i 750 ml absolut methanol behandles ved stuetemperatur med 1,5 ml (0,0015 mol) af en 1 molær natriummethylatopløsning i methanol. Efter henstand natten over inddampes opløsningen. Resten renses søjlekromatografisk på 15 kieselgel med methylenchlorid/methanol (5:1).
Der fås 1,2 g 3,3’-difluor-phenolsulfonphthaleinyl-8-D-galactosid-20 natriumsalt som et orangerødt, hygroskopisk amorft pulver (udbytte 41% af det teoretiske udbytte) 25 NMR: (DMSO-dg): 3,1 - 3,9 (m, 6H), 4,1 - 5,3 (m, 4H), 4,95 ( d,J =7 Hz, IH), 6,2 - 6,6 (m, IH), 6,8 - 7,6 (m, 8H), 7,8 - 8,0 (m, IH)
Eksempel 4 30 På tilsvarende måde, som anført i det foregående eksempel 3, fremstilles af 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a-D-galactopyranosyl-bromid og de under "udgangsmateriale" anførte phenolsulfon-phthaleine'r de under "slutprodukt" nævnte β-D-galactosider: 35
DK .162231 B
Udgangsmateriale Slutprodukt Smeltepunkt °C
18 o 1) Phenolrød phenolsulfonphthalei- 208-212 5 nyl-|3-D-galactosid~ natriumsalt 2) o-cresolrød 3,3'-dimethylsulfon- 202-205 phthaleinyl-3-D-galac-10 tosid-natriumsalt 3) Bromcreseo- 3,3'-dibrom-5,5'-dime- 198-202 purpur thylphenolsulfonphtha- leinyl-3-D-galactosid-15 natriumsalt
Eksempel 5 3/31-dibrom-5/5'-dimethylphenolsulfonphthaleinyl-g-D-galac-20 tos id-natriums alt.
a) En opløsning af 11703 g (0r027 mol) 2,3,4,6-tetra-CKacetyl-α-D-galactopyranosylbromid og 5/6 g (0,007 mol)bromcresolpur-pur-tribenzylammoniumsalt i 60 ml dichlormethan behandles med 25 3/1 g (0/013 mol) sølvoxid og 3,7 g (0,013 mol) sølvcarbonat og omrøres i 12 timer ved stuetemperatur. Efter frafiltrering af bundfaldet inddampes filtratet^ og resten renses søjlekroma·-tografisk på kieselgel med toluen/eddikeester/methanol (1:1:0,2). Inddampning af den tilsvarende fraktion giver 30 4,4 g 3,3 *-dibrom-5,5'-dimethylphenolsulphthaleiny1-2,3,4,6^tetra- 0-acetyl-3-D-galactosid-tribenzylammoniumsalt som et gult amorft stof (udbytte 54% af det teoretiske udbytte).
35 NMR: (DMS/-dg): 1,8 - 2,3 (m, 18H), 3,8 - 4,4 (m, 4H) 5,2 - 5,6 (m, 9H), 6,6 - 8,1 (m, 23H)
O
DK 162231 B
19 b) En opløsning af 4 g (0,0035 mol) af det ifølge a) fremstilled tetraacetylgalactosid i 40 ml absolut methanol afkøles til -40°C og behandles til desacetylering med 15/5 ml af 1 M (0,015 mol) natriummethylat-opløsning.
5
Efter en times forløb neutraliseres opløsningen ved behandling med ca. 30 ml "Amberlite" IRC 50 (H-form) og inddampes. Resten renses søjlekromatografisk på kieselgel med methylenchlorid/ methanol/acetone (6:2:1) og herved fås 10 2 g 3,3'-dibrom-5,5'-dimethylphenolsulfonphthaleinyl-p-D-galactosid-natriumsalt som et gult amorft pulver (udbytte 62% af det teoretiske udbytte) 15 smeltepunkt 200-203°C (dekomponering) NMR: (DMSO-dg):1,9 - 2,4 (m, 6H), 3,2 - 4,0 (m, 6H), 4,4 (m, 2H), 4,8 (m, 2H)[efter deuteriumbytning: 4,9 (d,J = 7 HZ, IH], 6,7 - 8,1 (m, 8H) 20 Eksempel 6 På tilsvarende måde, som beskrevet i det foregående eksempel 5 fremstilles af 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-a^D-galactopyjianosyl-bromid 25 0g 1) Fluorphenolrød 3,3’-difluorphenolsulfonphthaleinyl-ft-D-galactosid-natriumsalt hygroskopisk glas 30 2) Phenol-3",4",5",6"-tetrabromsulfonphthalein phenol-3",4",5",6"-tetrabromsulfonphthaleinyl-8-D-galactosid-natriumsalt smeltepunkt 215°C (dekomponering) 35
O
20
DK 162231 B
3) 3,3',5,5'-tetrachlorphenol-3",4",5",6"-tetrabromsul-fonphthalein 3,31 ,5,5 '-tetrachlorphenol-3" ,4" ,5",6"-tet-rabromsul-fonphthaleinyl-3-D-galactosid-natrjumsalt 5 smeltepunkt 150°C (dekomponering) 4) Phenol-4"-nitrosulfonphthalein
phenol-4"-nitrosulfonphthaleinyl-8-D-galatosid-natriumsalt smeltepunkt *> 300°C
10 5) 3,3'-dichlorphenol-4"-nitrosulfonphthalein 3,3l-dichlorphenol-4"-nitrosulfonphthaleinyl-3-D-galactosid-natriumsalt
dobbelt-smeltepunkt 160°C/300°C
15 6) 3,3 ,-dimethylphenol-4,,-nitrosulfonphthaelin 3,3 l-dimethylphenol-4"-nitrosulfonphthaleinyl-,S-D- galactosid-natriumsalt
smeltepunkt 210-220°C
20 7) 3,3',4"-trinitrophenolsulfonphthalein 3,3', 4"-trinitrophenolsulfonphthaleinyl-.8-D-galactosid-natriumsalt smeltepunkt >· 300°C 25 8) Phenol-4"-aminosulfonphthalein phenol-4”-am inosulfonphthaleinyl-fi-D-galactosid-natriumsalt lyofislisat (amorf) 30 Eksempel 7 3,3'-difluorphenolsulfonphthaléinyl-g-D-galactosid-tribenzyl-ammoniums alt.
35 En opløsning af 6,77 g (0,01 mol) fluorphenolrød-tribenzyl-ammoniumsalt og 5,3 g (0,01 mol) per-O-trimethylsilyl-a-D- 21
DK 162231B
O
galctopyranolsylbromid i 70 ml dichlormethan behandles med 1,15 g (0,005 mol) sølvoxid og 1,4 g (0,005 mol) sølvcarbonat og omrøres i 18 timer under udelukkelse af fugtighed. Efter frafiltrering af bundfaldet inddampes filtratet, og resten op-5 tages til afspaltning af beskyttelsesgrupperne i 60 ml methanol og opbevares i 12 timer ved stuetemperatur. Til rensning kro-matograferes med dichlormethan/methanol (5:1) over kieselgel. Der fås 10 1/2 g 3,3'-difluorphenolsulfonphthaleinyl^-D-galactosid-tri- benzylammoniumsalt
som et orangefarvet amorft pulver .(udbytte 14% af det teoretiske udbytte) smeltepunkt 157-165°C
15 NMR: (DMSO-dg): 3,1 - 3,9 (m, 6H), 4,2 - 5,2 (m,llH) 6,3 (m, IH), 6,8 - 7,6 (m, 23H), 7,9 (m, IH)
Eksempel 8 20 3,3'-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-g-D-galactosid-lithiumsalt.
1,5 g (0,0025 mol 3,3'-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-$-D-galactosid-natriumsalt, fremstillet ifølge eksempel 1, opløses i en ringe mængde vand. Opløsningen føres til en med "Am-25 berlite” IR 120 (Li-form) fyldt søjle.
Lyofilisering af eluatet giver 1,4 g 3,3'-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-Ø-D-galactosid-lithiumsalt 30 som et orangefarvet, amorft pulver (udbytte 96% af det teoretiske udbytte) smeltepunkt 190°C (dekomponering NMR: (DMSO-dg): 3,3-3,8 (m, 6H), 4,3 - 4,9 (m, 4H), 5,07 35 (s, J = 7 Hz, IH), 6,1 - 7,7 (m, 9H), 7,8 - 8,1 (m, IH)
DK-162231 B
O
22
Eksempel 9 På tilsvarende måde, som beskrevet i det foregående eksempel 8/fremstilles af 3,3'-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-Ø-D-ga-5 lactosid-natriumsalt (se eksempel 1) a) ved bytterkromatografi på "Amberlite" IR 120 i Ca-formen 3,3 *-dichlor-phenolsulfonphthaleinyΙ-β-D-galactosid-calcium- :·. 10 saltet som et orangerødt, amorft pulver (udbytte:78% af det teoretiske udbytte) smeltepunkt 250°C (dekomponering) NMR: (DMSO-dg) : 3,2 - 3,8 (m, 6H) 4,4 - 5,1 (m, 4H), 5,1 15 (s, J= 7Hz, IH), 6,2 - 7,6 (m, 9H) , 7,8 - 8,0 (m, IH) b) Ved bytterkromatografi på "Amberlite" IR 120 i (H^C)^N-formen 3,3' -dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-|3-D-galactosid-tetra- 20 methylammoniumsaltet som et gult, amorft pulver (udbytte 85% af det teoretiske udbytte)
smeltepunkt 190-195°C
NMR: (DMSO-dg) : 3,2 (s, 12H) , 3,3 - 4,0 (m, 6H) , 4,1-5,3 25 (m, 4H) , 5,1 (d, J = 7 Hz, IH) , 6,4 (m, IH), 7,0 - 7,7 (m, 8H) , 7,9 (m, IH)
Eksempel 10 30 3,3'-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-ft-D-galactosid-triben- zylammonlums alt.
1,5 g (0,0025 mol) 3,3 1 -dichlor-phenolsulfonphthaleinyl^fi-D-galactosid-natriumsalt (se eksempel 1) opløses i en ringe 35 mængde vand og passerer gennem en med "Amberlite" IR 120 (H-form) fyldt søjle. Eluatet behandles med en støkiometrisk
DK 162231 B
O
23 (O,72 g) mængde tribenzylamin, opløst i 15 ml ethanol, og inddampes. Der fås 1,7 g 3,3'-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-p-D-galactosid-5 tribenzylammoniumsalt som et gult,amorft stof (udbytte 78% af det teoretiske udbytte) smeltepunkt 140-150°C.
Eksempel 11 10 På tilsvarende måde, som beskrevet i eksempel 1¾ fremstilles af 3,3'-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-3-D-galactosid-na-triumsalt (se eksempel 1) under anvendelse af benzyldiethylamin det tilsvarende 15 3,3'- dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-3--D-galactosid-benzyldi-ethylammoniumsalt som et gult, amorft pulver (udbytte 69% af det teoretiske udbytte) smeltepunkt 245-248°C.
20
Eksempel 12
Bestemmelsen af aktiviteten af β-D-galactosidase.
25 a) Tilberedning af de anvendte opløsninger :
Pufferopløsning; HEPES 100 mmol/1
Natriumchlorid 154’mmol/1
Magnesium-L-aspartat 2 mmol/1 BSA 10 g/1 30 "Tween"-20 0,5 g/1 pH-værdi (indstillet med 7,3 natriumhydroxid) (37°C)
Reagensopløsning 1; I den ovenforbeskrevne pufferopløsning opløses 5 mmol/1 phenol- 35
O
24
DK 162231 B
sulfonphthaleinyl-8-D-galactosid-natriumsalt. pH-værdien indstilles med· natriumhydroxid på 8,5 (37°C) .
Reagensopløsning 2; 5 I den ovenfor beskrevne pufferopløsning opløses 5 mmol/1 3,3’-difluor-phenolsulfonphthaleinyl-Ø-D-galactosid-natrium-salt. pH-værdien indstilles med natriumhydroxid på 7,5 (37°C).
10 Reagensoplsøning 3: I den ovenfor beskrevne pufferopløsning opløses 5 mmol/1 3,3'-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-Ø-D-galactosid-natriumsalt.
Pufferopløsningens pH-værdi holdes på 7,3 (37°C).
15
Reagensopløsning 4; I den ovenfor beskrevne pufferopløsning opløses 5 mmol/1 3,3*,5,5'-tetrachlorphenol-3",4",5",6"-tetrabromsulfonphtha-20 leinyl-Ø-D-galactosid-natriumsalt. Pufferopløsningens pH-værdi holdes på 7,3 (37°C) .
Substratkoncentrationen og pH-værdien optimeres for hvert anvendt substrat. Der kan således ganske bevidst optræde for-25 skellige værdier for substraikoncentrationer eller pH-værdier ved de enkelte reagensopløsninger.
Enzymopløsning.
30 I handelen værende β-D-galactosidase af Escherichia coli opløses i den ovennævnte pufferopløsning. Denne opløsningsaktivitet udgør ca. 0,08 U/ml ( baseret på fabrikant--angivelserne) .
b) Gennemførelse af målingerne.
Målingen sker fotometrisk ved de nedenfor anførte bølgelængder.
35 25
DK 162231B
O
950 μΐ reagens blandes i en 1 cm kyvette ved 37°C med 50 μΐ enzymopløsning. Som mål for reaktionen bestemmes ekstinktionsstigningen pr. tidsendhed i [mExt/min]. Den beregnes af den målte ekstinktion ved division med reaktionstiden.
5 I den efterfølgende tabel er anført de fundne måleværdier:
Reagensnummer Målebølgelængde Reaktion [nm] [mExt/min] 10--- 1 560 9 2 578 71 3 578 123 15 4 578 121
Eksempel 13 20 Bestemmelse af β-D-galactosides aktivitet a) Tilberedning af de anvendte opløsninger
Pufferopløsning: HEPES 50 mmol/1
Citronsyre 50 mmol/1 25 Tricin 50 mmol/1
Natriumchlorid 154 mmol/1
Magnesium-L-aspartat 1 mmol/1 BSA 10 g/1 pH-værdi (indstillet 6,9 3Q med natriumhydroxid) (37°C)
Reagensopløsning 1: I den ovennævnte pufferopløsning opløses 5 mmol/1 3,3'-35 dimet lyl-phenolsulfonphthaleinyl-ft-D-galactosid.
Reagensopløsning 2;
O
26
DK 162231 B
I den ovennævnte pufferopløsning opløse 5 mmol/1 3,3’-dihydroxy-phenolsulfonphthaleinyl-p-D-galactosid.
5
Enzymopløsning i I handelen værende β-D-galactosidase af Escherichia coli opløses i den ovennævnte pufferopløsning. Aktiviteten af denne 10 . opløsning udgør ca 0,08 U/ml (baseret på fabrikant-angivelser ne) .
Gennemførelse af målingerne 15 950 μΐ reagens blandes i en 1 cm kyvette ved 37°C med 50 μΐ enzymopløsning. Efter lo minutters reaktionstid indstilles pH-værdien på 10 med natriumhydroxid,og ekstinktionen måles. Med en blindpr øre med puffer i stedet for enzymopløsning går man frem på samme måde. Temperaturen holdes under reaktionen og 20 målingen på 37°C. Af de bestemte ekstinktioner af blandingerne med eller uden enzym beregnes ekstinktionsdifferencen. Ved division af denne ekstinktionsdifferens med reaktionstiden fås som mål for reaktionen ekstinktionsstigningen pr. tidsenhed i [mExt/min].
25 I den følgende tabel er anført de fundne måleværdier: i
Reagensnummer Målebølgelængde Reaktion [nm] [mExt/min] 30__- _ 1 * 578 98 2 593 6 35
DK 162231 B
O
27
Eksempel 14
Bestemmelse af aktiviteten af β-D-galactosidaser af forskellig oprindelsen.
5
Der anvendes i handelen værende β-D-galactosidase præparater af forskellig oprindelse. Disse giver som karakteristiske kendetegn deres maksimale aktivitet ved forskellige pH-værdier.
10 Fabrikant-angivelser; af bønner (Jack Beans) pH 3,5 af Aspergillus niger pH 4,0 af Escherichia coli pH 6,9 15 af bovinlever pH 7,3 s) Fremstilling af de anvendte opløsninger;
Pufferopløsninger; HEPES 50 mmol/1
Citronsyre 50 mmol/1 20 Tricin 50 mmol/1
Natriumchlorid 154 mmol/1
Magnesium-L-aspartat 1 mmol/1 BSA 10 g/1 25 Der fremstilles opløsninger af ovennævnte sammensætning med forskellige pH-værdier ifølge β-D-galactosidasernes optimale pH-værdier (pH 3,5/4,0/6,9/7,3). Indstillingen af pH-vær-dien skete med NaOH eller HC1 ved 37°C.
30 Reagensopløsninger: I de ovennævnte pufferopløsninger med de forskellige pH-værdier 3,5/4,0/6,9/7,3 opløses i hvert tilfælde 5 mmol/1 3,3'-dichlor- phenolsulfonphthaleinyl^-D-galactosid-natriumsalt.
35
Enzymopløsninger:
O
28
DK 162231 B
(3-D-galactosidaserne opløses i pufferen med den til enhver tid optimale pH-værdi: 5 af bønner (Jack Beans) i puffer pH 3,5 af Aspergillus niger i puffer pH 4,0 af Escherichia coli i puffer pH 6,9 af bovinlever i puffer pH 7,3 10
Disse opløsningers aktivitet udgør ca. 0,08 U/ml (baseret på fabrikant-angivelserne).
b) Gennemførelse af målingerne: 15
Enzymreaktionen skete i løbet af en defineret reaktionstid ved den for det pågældende enzym optimale pH-værdi. 1000 pi reagens behandles i en 1 cm kyvette ved 37°C med 30 pi af en enzymopløsning. Efter 15 minutters reaktionstid indstilles 20 pH-væriden med natriumhydroxid på 8,5 og ekstinktionen bestemmes ved 578 nm. Under reaktionen og målingen holdes temperaturen konstant på 37°C. På samme måde gennemføres der til hver måling en bliiidprøve. Hertil anvendes i stedet for enzym- opløsningen 30 μΐ pufferopløsning.
25 c) Beregning: Først bestemmes differencen mellem måleværdien med enzym og måleværdien med blindprøven. Ved division af denne differens 30 med reaktionstiden bestemmes som mål for reaktionen ekstinktionsstigningen pr. tidsenhed i [mExt/min].
Måleværdi (med enzym - måleværdi (blindprøve) -måleværdi 35 ~ måleværdi - = reaktion [mExt/min] reaktionstid
DK 162231B
29 o
De fundne måleværdier for reaktionen af de enkelte enzymer kan tages af følgende sammenstilling: 5 Enzym af pH-værdi Reaktionshastighed [mExt/min] Bønner (Jack Beans 3,5 71
Aspergillus niger 4,0 112 10 Escherichia coli 6,9 74
Bovinlever 7,3 32
De ovenfor beskrevne forsøgsresultater viser, at sulfonphtha-15 leinyl-3-D-galactosiderne egner som substrater for β-D-galac-tosidaser af enhver oprindelse.
Eksempel 15 20 Bestemmelse af aktiviteten af frie og konjugerede β-D-galac-tosidaser.
a) Fremstilling af de anvendte opløsninger:
Pufferopløsning: HEPES 100 mmol/1 25 Natriumchlorid 154 mmol/1
Magnesium-L-aspartat 2 mmol/1 BSA 10 g/1 "Tween"-20 0,5 g/1 pH-værdi (indstillet med 7,3 30 natriumhydroxid) (37°C)
Reagensopløsning: I den ovennævnte pufferopløsning opløses5 mmol/1 3,3 ' -dichlor-phenol-35 sulfonphthaleinyl-p-D-galactosid-natriumsalt. Pufferopløsnin gens pH-værdi holdes på 7,3 (37°C).
En z ymopløsning;
DK 162231 B
30 o I handelen værende β-D-galactosidase af Escherichia coli opløses i puffer. Denne opløsnings aktivitet udgør.ca. 0,08 5 U/ml (baseret på fabrikant-angivelserne).
Enzym-konjugat-opløsning;
Der anvendes et β-D-galactosidase-antistof-præparat. Frem-10 stillingen af sådanne enzym-antistof-konjugater kendes. De er f.eks. beskrevet i Biochem. Biophys. Acta 612, 40-49 (1980). Pærparatet fortyndes således i puffer, at det giver en med den ovenfor beskrevne enzymopløsning omtrent sammenlignelig aktivitet.
15 b) Gennemførelse af målingen: Målingen sker fotometrisk ved 758 nm. 950 ul reagensopløsning blandes hver gang i en 1 cm kyvette ved 37°C med 50 ul enzym-20 opløsning eller med 50 ul enzyn-konjugat-opløsning. Som mål for reaktionen bestemmes ekstinktionsstigningen pr tidsenhed i [mExt/min].
Til reaktionen med den frie β-D-galactosidase måles 124 mExt/min 25 og for reaktionen med β-D-galactosidase-antistof-konjugat 120 mExt/min.
Begge måleværdier viser, at såvel med fri som med konjugeret β^D-galactosidase findes en meget let målelig ekstinktionsfor*· 30 skel. Heraf fremgår, at sulfonphthaleinyl^-D-galactosider på samme måde er egnede som substrater såvel for frie β-D-galac-tosidaser som for β-D-galactosidase-konjugater.
De hidtil ukendte substrater kan således ikke kun anvendes 35 som diagnostiske midler til bestemmelsen af frie β-D-galac-tosidaser. De er på fordelagtig måde også anvendelige ved enzymimmunoassays, ved hvilke β-D-galactosidaser anvendes som indikaterenzym.
DK 162231 B
31
Sammenligningsforsøg mellem N-acetyl-β-D-glucosaminider ifølge DK patentansøgning nr. 1152/82 svarende til EP offentliggørelsesskrift nr. 60.793 og β-D-galactosider med phenolsulfon-phthaleiny1 rester som aglyconrester i substrater for enzymerne 5 N-acetyl-j8-D-glucosaminidase og β-galactosidase .
I. Forkortelser
Alment 10 RT stuetemperatur Ext ekstintion β-NAG-substrater 15 pNP-NAG p-nitrophenyl-N-acetyl-j3-D-gl ucosami nid PR-NAG phenolrødt-N-acetyl-j8-D-glucosaminid = phenolsu1fonphthalei nyl-N-acetyl-^-D-glucosaminid 20 CPR-NAG ch1orpheno1rødt-N-acetyl-β-D-glucosaminid = 3,3'-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-N-acetyl-/3-D-g1ucosami n i d β-GAL-substrater 25 pNP-GAL p-nitrophenyl-/5-D-galactosid PR-GAL phenolrødt-Ø-D-galaetos id = phenolsulfonphthalei- nyl-ø-D-galactosid 30 CPR-GAL chlorpheno!rødt-p-D-galactosid = 3,3'-dichlor-phe- nolsulfonphthaleinyl-/3-D-galactosid
Enzymer β-NAG N-acetyl-β-D-glucosaminidase 35
DK 162231 B
32 β-GAL β-galactosidase II. Fremstilling af de til gennemføring af forsøgene nødven- diqe substanser og opløsninger._ 5 pNP-NAG kan købes hos Boehringer Mannheim GmbH (bestillingsnummer 874 574) PR-NAG blev fremstillet ifølge eksempel 1 i EP offentliggørelsesskrift nr. 60.793 10 CPR-NAG opnåedes i form af et lyofilisat med citratpuffer fra Shionogi som "NAG rate test Shionogi" (lot nr. WU 02), sammensætningen svarer til eksempel 3 i EP-A-0 294.804. pNP-GAL kan købes hos Boehringer Mannheim GmbH (bestillingsnummer 528 510) 15 PR-GAL blev fremstillet ifølge eksempel 2 i EP-A-0 146 866 CPR-GAL blev fremstillet ifølge eksempel 1 i EP-A-0 146 866.
Alle reagenser for β-NAG-systemet betegnes med 1.
Alle reagenser for β-GAL-systemet betegnes med 2.
20
Puffer 1
Basispuffer til β-NAG-forsøg 25 Citrat 0,1 mol/1, pH-værdi 4,5 ved RT (med NaOH).
Fremsti11ing: 19,2 g vandfri citronsyre opløses med ca. 700 ml bidesti.lieret 30 vand pH-værdien indstilles med 1 molær NaOH til 4,5 ved RT der fyldes op til 1000 ml med bidesti lieret vand
Puffer 2 35
Basispuffer til β-GAL-forsøg phosphat 0,1 mol/1, pH-værdi 7,0 ved RT (med NaOH)
DK 162231 B
33
Frems ti 11 i ng: 13,8 g natriumdihydrogenphosphatmonohydrat opløses med ca. 700 ml bidesti 1 leret vand 5 pH-værdien indstilles med 1 molær NaOH til 7,0 ved RT der opfyldes med bidesti 1 leret vand til 1000 ml,
Bemærkning til pufferopløsninqerne.
10 Sammenligning af reaktionssystemerne for β-NAG og j8-GAL skal finde sted under standardiserede betingelser.
Af denne grund tilpasses alle fremgangsmåder i videst muligt omfang til hinanden.
15
Den eneste indrømmelse til de individuelle egenskaber hos begge enzymer skal finde sted ved puffer-opløsningen.
Standard i ser i ngen består her deri, at der anvendes enzym-indi-20 viduelle puffere fra en anerkendt kilde:
Puffersusbstans og pH-værdi for basispufferne 1 og 2 vælges til indstilling af de optimale betingelser for hvert enzym ifølge anbefalingerne fra H. U. Bergmeyer, Methods of Enzyma-25 tic Analysis, trejde udgave, bind II, side 130, 131, 197 og 198.
Reagens 1.1 30 Til indstilling af aktiviteten af β-NAG-startopløsningen på pNP-NAG 3 mmol/1 i bi dest i 11eret vand/puffer.
F remsti 11 i ng: 35 20,5 mg substrat opløses i 10 ml puffer 1 pH-værdien korrigeres med 1 molær HC1 eller NaOH til pH-værdi
4,5 ved RT
opløsningen fyldes op med bidestilleret vand til 20 ml.
DK 162231 B
34
Reagens 1.2 PR-NAG-reagens til kinetisk måling ved optimal pH-værdi for enzymet /3-NAG: 5 PR-NAG 3 mmol/1 i bidestilleret vand/puffer
Fremstilling: 34,8 mg substrat opløses i 10 ml puffer 1 (substratmængde be-10 regnes som natriumsalt) pH-værdien korrigeres med 1 molær HC1 eller NaOH til pH-værdi
4,5 ved RT
opløsningen fyldes op med bidestilleret vand til 20 ml 15 Reagens 1.3 CPR-NAG-reagens til kinetisk måling ved optimal pH-værdi for enzymet J8-NAG: 20 CPR-NAG 3 mmol/1 i bidestilleret vand/puffer
Fremsti 11 i n g: lyofilisat, der kan købes, opløses med 7 ml bidestilleret vand 25 pH-værdi korrigeres med 1 molær HCl til pH-værdi 4,5 ved RT og forbrug x i ml noteres (11-7-x) ml bidestilleret vand tilsættes Reagens 2.1 30
Til indstilling af β-GAL-startopløsningens aktivitet pNP-GAL 3 mmol/1 i bidestilleret vand/puffer 35 Fremstilling: 18,1 mg substrat opløses i 10 ml puffer 2 pH-værdien korrigeres med 1 molær HCl eller NaOH til pH-værdi
DK 162231 B
35
7.0 ved RT
opløsningen fyldes op med bidesti 1 leret vand til 20 ml.
Reagens 2.2 5 PR-GAL-reagens til kinetisk måling ved optimal pH-værdi for enzymet /3-GAL: PR-GAL 3 mmol/1 i bidesti 1 Teret vand/puffer 10
Fremstilling: 32.3 mg substrat opløses i 10 ml puffer 2 (substratmængde beregnes som natriumsalt) 15 pH-værdien korrigeres med 1 molær HC1 eller NaOH til pH-værdi
7.0 ved RT
opløsningen fyldes op med bidesti 1 leret vand til 20 ml.
Reagens 2.3 20 CPR-GAL-reagens til kinetisk måling ved optimal pH-værdi for enzymet β-GAL: CPR-GAL 3 mmol/1 i bidestilleret vand/puffer 25
Fremst i 11 i ng: 36.4 mg substrat opløses i 10 ml puffer 2 (substratmængde beregnes som natriumsalt) 30 pH-værdien korrigeres med 1 molær HC1 eller NaOH til pH-værdi
7.0 ved RT
opløsningen fyldes op med bidestilleret vand til 20 ml.
Stopopløsning
Til indstilling af enzymstartopløsningernes aktivitet boratpuffer 0,4 mol/1, pH-værdi 9,8 (med NaOH).
35
DK 162231B
36
Fremstilling: 12,4 g borsyre opløses med ca. 300 ml bidesti 1 leret vand pH-værdi indstilles med 1 molær NaOH til 9,8 ved RT 5 der fyIdes op ti 1 500 ml med bi desti 1 leret vand.
iB-NAG-startopløsni nq
Enzymopløsning til start af alle reaktioner til vurdering af 10 β-NAG-substraterne.
Denne opløsning skal forud indstilles ifølge en standardiseret testfremgangsmåde til den samme aktivitet, som den for den til sammenligningsforsøgene tilsvarende, påkrævede β-GAL-15 startopløsning.
Enzym β-NAG i puffer 1
Fremst i 11 i ng: 20 I handelen tilgængelig N-acetyl-β-D-glucosaminidase (Boehringer Mannheim, nr. 1017098) opløses i puffer 1. Ved det nævnte præparat begyndes der først med en fortynding på ca. 1:1100.
25 Indstillingen af den til sammenligningsforsøgene påkrævede nøjagtigt definerede aktivitet foretages som beskrevet i det efterfølgende: 30 35
DK 162231 B
37 I reagensglas pipetteres blindværdi enzymprøve reagens 1.1 1/0 ml 1,0 ml
5 der tempereres til 25eC
prøve g-NAG-startopløsning ---- 0,1 ml der blandes og inkuberes i nøjagtigt 5 min., derpå stoppes re-10 aktionen med stopopløsning 2,0 ml 2,0 ml korrektion for blindværdi ved tilsætning af prøve g-NAG-startopløsning 0,1 ml ---- 15 ------------------------------------------------------------ der blandes, ekstinktioner for blindværdi og prøve måles: 405 nm, 1 cm lagtykkelse beregn i ng: 20 signalstigning = Ext-værdi (prøve) - Ext-værdi (blindværdi) signalaktivitet [Ext/min] = signalstigning/5
Derefter indstilles g-NAG-prøven ved fortynding med puffer 1 25 og gentagen måling til en signalaktivitet på 0,02 Ext/min. Denne opløsning anvendes derefter som g-NAG-startopløsni ng.
Bemærkning: Fortyndingstrinnet kan beregnes ud fra måleresultatet. Eventuelt forløber indstillingen i flere 30 trin. Ved en tilnærmelse på 0,02 ± 0,005 Ext/min kan processen afbrydes. I dette tilfælde skal så resultaterne fra sammenligningsforsøgene regnemæssigt normeres til 0,02 Ext/min.
3 5 g-GAL-startopløsning
Enzymopløsning til start på alle reaktioner til vurdering af g-GAL-substraterne.
DK 162231 B
38
Denne opløsning skal forud indstilles efter en standardiseret testfremgangsmåde på den samme aktivitet, som den til sammenligningsforsøgene tilsvarende påkrævede β-NAG-startopløsning.
5 Enzym β-GAL i puffer 2
Fremstilling: I handelen tilgængelig β-galactosidase (Boehringer Mannheim, 10 nr. 105031) opløses i puffer 2. Ved det nævnte præparat begyndes der først med en fortynding på ca. 1:1400.
Indstillingen af den til sammenligningsforsegene påkrævede nøjagtigt definerede aktivitet foretages som beskrevet i det 15 efterfølgende: 20 25 3 0 35
DK 162231 B
39 I reagensglas pipetteres blindværdi enzymprøve reagens 2.1 1,0 ml 1,0 ml
5 der tempereres til 25°C
prøve β-GAL-startopløsning ---- 0,1 ml der blandes og inkuberes i nøjagtigt 5 min., derpå stoppes re-10 aktionen med stopopløsning 2,0 ml 2,0 ml blindværdi-korrektion ved tilsætning af prøve β-GAL-startopiøsning 0,1 ml ---- 15 .....-...............-......................................
der blandes, ekstinktioner for blindværdi og prøve måles: 405 nm, 1 cm lagtykkelse beregning: 20 signalstigning = Ext-værdi (prøve) - Ext-værdi (blindværdi) signalaktivitet [Ext/min] * signalstigning/5
Derefter indstilles β-GAL-prøven ved fortynding med puffer 2 25 og gentagen måling på en nøjagtig signalaktivitet på 0,02 Ext/min. Denne opløsning anvendes derefter som β-GAL-startop-løsning.
Bemærkning: Fortyndingstrinnet kan beregnes ud fra måleresul-30 tatet. Eventuelt forløber indstillingen i flere trin. Ved en tilnærmelse på 0,02 ± 0,005 Ext/min kan forløbet afbrydes. I dette tilfælde skal så resultaterne fra sammenligningsforsøgene regnemæs-sigt normeres til 0,02 Ext/min.
35
DK 162231 B
40 III. Forsøgsbetingelser
Sammenlignende kinetiske målinger med enzymstartopløsninger indstillet til 0,02 Ext/min med pNP-substrater som i det for-5 anstående blev gennemført som følger: I halvmikro-kuvetter pipetteres blindværdi enzym-prøve 10 reagens 1,0 ml 1,0 ml der tempereres til 25°C reaktion startes med enzymopløsning ---- 0,1 ml 15 puffer 0,1 ml ---- der blandes, og reaktionskinetik optegnes med en skriver, som er tilsluttet til et fotometer: (1 cm lagtykkelse, bølgelængder ifølge angivelser til substratet) 20 ------------------------------------------------------------
Beregning:
Reaktionshastigheder for enzym og blindværdi aflæses i [Ext/ min].
25 Signalaktivitet [Ext/min] = reaktion (enzym) - reaktion (blindværdi)
Multiplikation med 1000 giver signalaktiviteten i dimensionen [mExt/mi n].
30 Målebølgelængder Målebølgelængderne er hver især afhængige af egenskaberne hos farvestoffet, som ved den enzymatiske reaktion frigives fra substratet: 35
DK 162231 B
41
Substrat Fotometer med fast eller variabel bølgelængde 5 pNP-substrater 405 nm 405 nm PR-substrater 546 nm 560 nm CPR-substrater 578 nm 574 nm 10 IV. Resultater
Der opnåedes følgende resultater i [Ext/min]: 15 ( Reaktionssystem |
J_I
g-NAG (EP 60 793 )_]_g-GAL_'| |substans|signal[Ext/min]1 substanslsignal[mExt/min]1 I pNP-NAGI 0,02 I pNP-GAL | 0,02 | 20 I PR-NAG I 0,36 | PR-GAL | 16,64 | i CPR-NAGl 10,99_I CPR-GAL | 1077,24_(
Som det fremgår af tabellen, spaltes galactosidasesubstraterne 25 væsentligt bedre af deres enzym, end det kunne ventes ud fra de tilsvarende NAG-substrater. For phenolrødt-g-D-galactosid opnås med Ø-galactosidase et mere end 40 gange større signal end for det tilsvarende NAG-system. Hos chlorphenolrødt-sub-straterne fører galactosidet endda til et ca. 100 gange større 30 signal end det tilsvarende NAG-substrat. Derfor kan substraterne ifølge opfindelsen anvendes som direkte substrater til kinetiske målinger i løbet af et tidsrum på højest 5 min., medens de fra EP offentliggørelsesskrift nr. 60.793 kendte NAG-substrater ikke er praktisk anvendelige til kinetiske målin-35 ger og kun efter lange reaktionstidsrum {10-30 min) giver gode målelige signaler.
DK 162231 B
42
Disse fordele hos forbindelserne ifølge opfindelsen som direkte substrater står endvidere i kontrast til de fra EP offentliggørelsesskrift nr. 60.793 kendte forbindelser, som yderligere har den ulempe, at de er hygroskope og hydrolysefølsomme.
5 Som det fremgår af eksempel 1 og eksempel 2 i EP offentliggørelsesskriftet er de der beskrevne NAG-substrater overordentligt hygroskope. På grund af denne egenskab anbefales på side 9, linie 16 i skriftet, at NAG-substraterne indsmeltes i ampuller eller opbevares i tætlukkende beholdere. Da N-acetyl-10 glucosaminider i reglen ikke er hygroskopiske, kunne man i dette tilfælde have kunnet forvente, at denne egenskab forårsages af phenol sulfonphthaleinylresten. Hygroskopicitet hos substrater kan i reglen ikke accepteres ved kommercielle enzymtestsystemer. For så vidt ville EP offent1 iggørelsesskrif-15 tet nr. 60.793 snarere have afholdt fagmanden, som søgte efter substrater til galactosidase-undersøgelser, i at fremstille phenolsulfonphthaleinyl-/3-D-galactosider. Det har dog overraskende vist sig, at sådanne galactosidasesubstrater ifølge opfindelsen ikke er hygroskopiske, men at de kan håndteres nor-20 malt.
I øvrigt kan det af beskrivelsen i EP offentliggørelsesskriftet nr. 60.793 udledes, at de deri omhandlede substrater er hydrolysefølsomme (jf side 9, sidste linie til side 10, linie 25 5). Hydrolyse af enzymsubstratet fører til forfalskning af må leresultater, da der dannes mere aglycon, end der fraspaltes fra substratet af enzymet. Til reduktion af hydrolysen anbefales i EP offentliggørelsesskriftet nr. 60.793 anvendelse af borax i testmediet. Derudover må der ved måling medføres en 30 sammenligningsopløsning for ved målingens slutning at kunne tage hensyn til den ikke-enzymati ske hydrolyse. Ved anvendelse af galactosidasesubstraterne ifølge opfindelsen er sådanne yderligere foranstaltninger fordelagtigt ikke nødvendige, da ikke-enzymatisk hydrolyse ikke her forstyrrer anvendelsen.
35

Claims (6)

1. R6 R10 ‘'ivvr·' γγ Mk7/V\ p 3 'y' p 1 2 OR’3 t IV) R3 A|Ar. R2 og d: sidstnævnte på i og for sig kendt måde afspalter be- 25 13 skyttelsesgrupperne R
1. Ln2 UK
1. Phenolsulfonphthaleinyl-Ø-D-galactosider med den almene 5 formel I CH2OH 6 R10 ho I o vY ,XJk 10 ^—I R R1 2 R* S03'M+ xv R3AAr’ (I)
15 R2 hvori r^-r^, der kan være ens eller forskellige, betegner hydrogen, halogen, en nitro- eller en aminogruppe 20 Rs-R*2, der kan være ens eller forskellige, betegner hydrogen halogen, en (C ^-C5)-al kyl-, en hydroxy-, en (Cj-C5)-a 1koxy-, en carboxyl- eller en nitrogruppe 25 M+ betegner en proton, en alkali-, en jordalkali- eller en ammoniumion .
2. Phenolsulfonphthaleinyl-jS-D-galactosid ifølge krav 1, 30 kendetegnet ved, at det er phenol sulfonphthalei nyΙ-β-D-galactosid, 3,3'-difluor-phenolsul-fonphthaleinyl-/3-D-galactosid, 3,3'-dichlor-phenolsulfonphthaleinyl-/3-D-galactosid eller 35 3,3' , 5,5' - tetrachlro-3",4",5",6"-tetrabrom-pheno1 sulfonphthalei- nyl-jS-D-galac tosid.
44 DK 162231 B
3. Fremgangsmåde til fremstilling af phenolsulfonphthaleinyl-(3-D-galactosider med den almene formel I CH20H r6 · R10 %yrY' VT R‘xxSOi"M+ IC (i) r! hvori r-*--r^r der kan være ens eller forskellige, betegner 2g hydrogen, halogen, en nitro- eller en aminogruppe r5_r12/ der kan være ens eller forskellige, betegner hydrogen, halogen, en (C1-C5)-alkyl-, en hydroxy-, en (C1-C5)-alkoxy-, en carboxyl- eller en nitrogruppe 20 M betegner en proton, en alkali-, en jordalkali- eller en ammoniumion, kendetegnet ved, at man på i og for sig kendt måde 2& omsætter forbindelser med den almene formel II R5 R10 R8 ?^9r12
30 T R4vvJ>%/S02 TT (II) hvori I„ R2 35 1 12 R -R har den ovennævnte betydning, •med per-O-substituerede 1-halogeno-a-D-galactoser med den almene formel III DK 162231 B CH2OR13 R1 30 I 0 5 -'x (III) hvori 0R13 X betegner halogen og R13 betegner en i carbohydratkemien sædvanlig beskyttelsesgruppe/ 10 under Walden-omlejring \,=d sukkerrestens C-l-atom til per-0-substituerede sulfonphthaleinyl-|3-D-galactosider med den almene formel IV 13
4. Anvendelse af phenolsulfonphthaleinyl-Ø-D-galactosider ifølge krav 1 eller 2 til bestemmelse af Ø-D-galactosidases 30 aktivitet.
5. Diagnostisk middel til påvisning af Ø-D-galactosidase, hvilket middel indeholder et eller flere chromogene substrater, et egnet pufferstof, samt eventuelt yderligere sædvanligt 35 anvendte hjælpestoffer, kendetegnet ved, at der som chromogene substrater anvendes phenol sulfonphthaleinyl-ø-D-galactosider ifølge krav 1 eller 2. DK 162231 B
6. Diagnostisk middel ifølge krav 5, kendetegnet ved, at der som yderligere hjælpemidler anvendes befugtnings-midler, oxidationsmidler, galeniske tilsætningsstoffer og/el-ler strukturmidler. 5 10 15 20 25 30 35
DK604184A 1983-12-17 1984-12-17 Phenolsulfonphthaleinyl-beta-d-galactosider, fremgangsmaade til deres fremstilling, anvendelse heraf til bestemmelse af beta-d-galactosidase samt et diagnostisk middel indeholdende disse DK162231C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3345748 1983-12-17
DE19833345748 DE3345748A1 (de) 1983-12-17 1983-12-17 Phenolsulfonphthaleinyl-ss-d-galactoside, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der ss-d-galactosidase

Publications (4)

Publication Number Publication Date
DK604184D0 DK604184D0 (da) 1984-12-17
DK604184A DK604184A (da) 1985-06-18
DK162231B true DK162231B (da) 1991-09-30
DK162231C DK162231C (da) 1992-03-16

Family

ID=6217269

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK604184A DK162231C (da) 1983-12-17 1984-12-17 Phenolsulfonphthaleinyl-beta-d-galactosider, fremgangsmaade til deres fremstilling, anvendelse heraf til bestemmelse af beta-d-galactosidase samt et diagnostisk middel indeholdende disse

Country Status (15)

Country Link
US (1) US4668622A (da)
EP (1) EP0146866B1 (da)
JP (1) JPS60192767A (da)
AR (1) AR240606A1 (da)
AT (1) ATE64600T1 (da)
AU (1) AU549177B2 (da)
CA (1) CA1242707A (da)
CS (1) CS268664B2 (da)
DD (1) DD234432A5 (da)
DE (2) DE3345748A1 (da)
DK (1) DK162231C (da)
ES (1) ES8600777A1 (da)
SU (1) SU1393322A3 (da)
YU (1) YU43390B (da)
ZA (1) ZA849747B (da)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0494704A3 (en) 1987-04-10 1992-09-02 The Flinders University Of South Australia Method and composition for the determination of calcium ions in fluids
DE3714147A1 (de) * 1987-04-28 1988-11-17 Boehringer Mannheim Gmbh Immunchemisches verfahren und reagenz zur bestimmung eines polyvalenten antigens in einer fluessigen probe
US5068180A (en) * 1987-05-21 1991-11-26 Technicon Instruments Corporation Substrates for β-galactosidase
IL85581A (en) * 1987-05-21 1992-05-25 Technicon Instr Substrate for beta-galactosidase comprising derivatives of 4-nitrophenyl-beta-d-galactopyranoside and beta-galactosidase immunoassay containing said substrate
JPH0650991B2 (ja) * 1987-06-11 1994-07-06 塩野義製薬株式会社 NAGase活性測定用試薬および測定方法
US5151348A (en) * 1988-12-23 1992-09-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Enzyme-linked immunoassay for measurement of cyclosporin a levels in whole blood samples
US5122602A (en) * 1989-02-13 1992-06-16 Miles Inc. Chromogenic merocyanine enzyme substrates
US5191073A (en) * 1989-02-13 1993-03-02 Miles Inc. Chromogenic merocyanine enzyme substrates
US5444161A (en) * 1989-08-16 1995-08-22 Microgenics Corporation Substrates for β-galactosidase
WO1991009971A1 (en) * 1990-01-05 1991-07-11 Symex Corp. Chromogenic 5-position modified neuraminic acid substrates and methods for diagnosing human influenza therewith
WO1991010744A1 (en) * 1990-01-10 1991-07-25 Symex Corp. Chromogenic 9-position modified n-acetylneuraminic acid substrates and methods for diagnosing human influenza therewith
US5210022A (en) * 1990-04-20 1993-05-11 Rcr Scientific, Inc. Method test media and chromogenic compounds for identifying and differentiating general coliforms and Escherichia coli bacteria
DE4217474A1 (de) * 1992-05-27 1993-12-02 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und Mittel zur Bestimmung eines Analyts
NL9300829A (nl) * 1993-05-13 1994-12-01 Netagco Holding Bv Werkwijze voor het besturen van een landbouwmachine alsmede een landbouwmachine.
US6262674B1 (en) * 2000-08-10 2001-07-17 Honeywell International Inc. Aircraft display with potential thrust indicator
US6534637B2 (en) 2001-02-12 2003-03-18 Beckman Coulter, Inc. Synthesis of chlorophenol red glucuronic acid
KR101259452B1 (ko) * 2010-10-18 2013-04-29 (주) 바이오앤텍 나노에멀젼 유화제 및 이를 함유하는 화장료 조성물

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3953422A (en) * 1973-08-17 1976-04-27 Smithkline Corporation Deoxyglucose derivatives
JPS5163826A (en) * 1974-07-10 1976-06-02 Iatron Lab Fuenoorufutarein beeta dd monogurukuronidonatoriumuenno goseihoho
DE2453069A1 (de) * 1974-11-06 1976-05-13 Schering Ag Neue glykoside
DE2510633C3 (de) * 1975-03-12 1978-07-13 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Eiweiß in Körperflüssigkeiten und dafür geeignete Indikatorfarbstoffe
JPS51114990A (en) * 1975-03-31 1976-10-09 Alza Corp Instruments of colorimetric determination of enzyme and testing method of the same
JPS58994A (ja) * 1981-03-17 1983-01-06 Shionogi & Co Ltd 新規N−アセチル−β−D−グルコサミン誘導体およびこれを基質として用いるN−アセチル−β−D−グルコサミニダ−ゼ活性測定法
CA1219201A (en) * 1983-03-07 1987-03-17 Albert E. Chu Microorganism detection test
JPH0650991B2 (ja) * 1987-06-11 1994-07-06 塩野義製薬株式会社 NAGase活性測定用試薬および測定方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPS621978B2 (da) 1987-01-17
ATE64600T1 (de) 1991-07-15
YU43390B (en) 1989-06-30
CS268664B2 (en) 1990-04-11
DK604184D0 (da) 1984-12-17
CA1242707A (en) 1988-10-04
EP0146866B1 (de) 1991-06-19
YU213084A (en) 1986-12-31
ZA849747B (en) 1985-08-28
DD234432A5 (de) 1986-04-02
AR240606A1 (es) 1990-06-30
DE3345748C2 (da) 1992-02-13
AU3684284A (en) 1985-07-04
DK162231C (da) 1992-03-16
CS987784A2 (en) 1989-07-12
DK604184A (da) 1985-06-18
EP0146866A2 (de) 1985-07-03
AU549177B2 (en) 1986-01-16
US4668622A (en) 1987-05-26
ES538621A0 (es) 1985-11-01
DE3484735D1 (de) 1991-07-25
EP0146866A3 (en) 1987-05-13
DE3345748A1 (de) 1985-08-29
JPS60192767A (ja) 1985-10-01
ES8600777A1 (es) 1985-11-01
SU1393322A3 (ru) 1988-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK162231B (da) Phenolsulfonphthaleinyl-beta-d-galactosider, fremgangsmaade til deres fremstilling, anvendelse heraf til bestemmelse af beta-d-galactosidase samt et diagnostisk middel indeholdende disse
US4544631A (en) Process and reagent for the determination of α-amylase
EP0270946B1 (en) Chromogenic acridinone enzyme substrates
FI81359C (fi) Glykosider av resorufin-derivat, foerfarande foer framstaellning daerav samt deras anvaendning foer bestaemning av aktiviteten av glykosidaser.
US4716222A (en) Substrates for hydrolases
DK160948B (da) Middel, testmateriale og fremgangsmaade til bestemmelse af tilstedevaerelsen af leukocyter, esterase eller protease
US4754025A (en) Glucosamine derivatives and reagent for assaying N-acetyl-β-D-glucosaminidase using the same as substrate
US5399488A (en) Method for assaying enzyme activity using N-acetyl-β-D-glucosamine derivatives
JPS58994A (ja) 新規N−アセチル−β−D−グルコサミン誘導体およびこれを基質として用いるN−アセチル−β−D−グルコサミニダ−ゼ活性測定法
US5126329A (en) Glucosamine derivatives and compositions reagents and containing the same
EP0411159B1 (en) Method for determining enzymatic activity
EP0459536A1 (en) Chromogenic acridinone enzyme substrates
US5792619A (en) Assay using oxidative chromogenic reagent
US5350677A (en) Method of assaying phosphatase with 3,4-dinitrophenylphosphate
CS236758B2 (en) Method of determining of alpha-amylase
JPS6317895A (ja) 新規なオリゴサツカライド誘導体、及びこれを用いるα−アミラ−ゼ活性測定法
CS268700B2 (en) Means for beta-d-galacosidase determination
CS273184B2 (en) Method of resorufin&#39;s derivative glycoside production
JPH08291A (ja) α−アミラーゼ活性の測定方法及びα−アミラーゼ活性測定用試薬

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed