JPS60192767A - フエノ−ルスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシド，その製法及び該化合物を含有するβ−Ｄ−ガラクトシダ−ゼを検出するための診断剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、フェノールスルホンフタレイニル−β−Ｄ−
ガラクトシド、その製法及び該化合物を含有するβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼを検出するための診断剤に関する。

従来の技術 β−グリコシド結合な有するＤ−ガラクトースを含有す
るオリゴ−又はポリサツカリドは殆んどすべての生物体
中に産生ずる。それ故、相応するβ−Ｄ−がラクトシダ
ーゼ（ＫＯ５，２，１，２３）も広く分布しており、多
数の微生物、動物及び植物中で検出することができる。

β−Ｄ−ガシクトシダーゼは哺乳動物で多様な生理学的
機能を果す。ラクトースの加水分解がそれにより行なわ
れるので炭水化物代謝で重要な働きをする。更に、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼは糖脂質、ムコポリサツカリド及
び糖蛋白質が分解する際のキ・−酵素である。

その生理学的有用性に加えて、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼは最近診断分野で重要になった。

例えばこの酵素は酵素イムノアッセイの指示薬酵素とし
て次舘に多く使われている〔例えば”　Ａｎｎａｌｓ　
ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
”、１６巻、２２１〜２４０貝（１９７９年）参照〕。

それ故、β−Ｄ−ガラクトシダーゼは活性の測定は臨床
化学でかつまた診断学で重要になっている。その際に、
全く一般的にはガラクトシダーゼ含有試料に好適なβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ基質を加える。この基質は酵素に
より分解される。分解生成物の１つを好適な方法で検出
する。酵素の作用により遊離したグリコン又はアグリコ
ンを測定することができる。一般には後者を測定する。

基質としては天然の基質ラクトース並びに特に色原体ガ
ラクトシドが好適である。

フェニル−β−Ｄ−ガラクトシド並びに芳香族環で置換
されている若干の他の銹導体（例えば０−ニトロフェニ
ル−及びｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド）
がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質として記載されてい
る［：　”　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｚ、　”、６６３巻、２
０９頁（１９６０年）〕。加水分解により遊離したフェ
ノールを光度測定によりＵＶ範囲でもしくはニトロフェ
ノールでは短い可視波長範囲で測定する。

続いて、指示薬反応として、アミノアンチピリンとの酸
化的結合を行なうこともできる〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
　Ｂｉｏｃｈａｍ、”、４０巻、２８１頁（１９７１年
）〕。

組織化学的実験では、一方で眸ナフチルーβ−Ｄ−ガラ
クトシドが使われ、例えば１−ナフチル化合物（”　Ｉ
（１ｓｔｏｃｈｅｍｉ”、３５巻、１９９頁（１９７６
年）〕、〕６−ブロムー２−ナフチル誘導体：　”　Ｊ
、Ｂｉｏｌ、　Ｏｈｅｍ、　”、１９５巻、２３９頁（
１９５２年）〕又は〕ナフトールーＡｓ−Ｂニーβ−Ｄ
ガラクトシドＣ”　Ｈｌｓｔｏ　−ｃｈｅｍｉｅ”、３
７巻、８９頁（１９７３年）〕である。その場合、生成
するナフトールを種々のシアゾニウム塩と反応させてア
ゾ色素に変換して可視化する。

更Ｋ、５−ブロム−４−クロル−インドキシル−β−Ｄ
−ガ２り：・シトがβ−ガラクトシダーゼの基質として
公知である。この場合には、指示薬反応は生成するイン
ドキシルのインジゴへの酸化的二量化である〔Ｈ１ｅｔ
ｏｃｈ０ｍｉｅ”、２６巻、２６６頁（１９７０年）〕
か又はジアゾニウム塩とカップリングさせてインドキジ
ルーアシー色素を形成すル（”　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉ
ｅｔｒｙ：５７巻、６２３頁（１９７８年）〕。

前記の測定法は顕著な欠点を有し、１コはそれが敏感で
ないことであり、更に組織化学的検出で使用される基質
の溶解性が非常に不良なことである。

アグリコンを螢光測定により検出することのできるガラ
クトシドを基質として使用する場合に、本質的により敏
感な試験法が得られる：例えば”プロシー−ジンゲス・
オプ・ず・ナショナル・アカデミ・オプ・サイエンシズ
・オプ・ザ・ユーナイテツド・スティソ・オプ・アメリ
カ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａａ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
、８．　）”、４７巻、１９８１頁（１９６１年）ＶＣ
螢光−ジーβ−Ｄ−ガラクトシドが基質として記載され
ている。更に、２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトシド（
”　Ａｎｇｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、”、４２
巻、２７５頁（１９７１年）〕又は〕４−メチルーウン
ベリフェリルーβＤ−ガラクトシド（：　”Ｊｏｃｈｅ
ｍ。

Ｊ、”、１０２巻、５２５頁（１９６７年）〕が使われ
る。

螢光測定法の欠点は、著しい装置上の経費を必要とする
ことである。

発明が解決しようとする問題点 それ故、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを簡単で迅速なかつ
信頼できる方法で測定することのできる基質に対する要
求が生じた。この要求を解決することが課題であった。

問題点を解決するための手段 ところで、スルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ドを基質として使用する場合に、β−Ｄ−、Ｉ！ｌ’ラ
クトシダーゼを非常に敏感に可視スペクトル領域で視覚
的に又は簡単な分光測光器で検出し得ることが判明した
。更に、この化合は極めて容易に水に溶けるという利点
を有する。

従って、本発明の目的は、一般式Ｉ： 〔式中Ｒ１−Ｒ４は同じか又は異なっていてよく、そ４
ぞれ〔式中Ｒ１％　Ｒ４は同じか又は異なっていてよく
、水素、ハロゲン、ニトロ基又はアミノ基を表わし、 Ｒ５−Ｒ１２は同じか又は異なっていてよく、水素、ハ
ロゲン、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキ
シ基、カルボキシル基又はニトロ基を表わし、 Ｍ＋はプロトン、アルカリイオン、アルカリ土類イオン
又はアンモニウムイオンを表わす〕のフェノールスルホ
ンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシｒである。

一般式■による全スルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラ
クトシドは新規化合物である。これらは炭水化物化学で
公知の方法により製造することができる。

殊に、公知方法で一般弐Ｈ： ２ 〔式中Ｒ１〜Ｒ１２は前記のものを表わす〕のフェノー
ルスルホンフタレインを一般弐ｉ：ＯＲユ３ 〔式中Ｘはハロゲンを表わしかつＲ１３は炭水化物化学
で常用の保護基を表わす〕のペルー０−置換１−ハロゲ
ノ−α−Ｄ−がラクトースと糖残基のｃ−１原子でワル
デン反転下に反応させて一般式１ｖ： ２ 〔式中Ｒ１，Ｒ１３及びＭ＋は前記のものを表わす〕の
ペルー〇−１ｆ換スルホンフタレイモル−β−Ｄ−ガラ
クトシドに変換しかつこのガラクトシドから公知の方法
で保静基Ｒ１３を脱離する。

式■とＩの化合物の一般式■のガラクトシドへの変換は
、水性アセトン中で又は水／ベンゼン−又は水／クロロ
ホルム混合物中で（相移動条件下ＶＣ）水際化アルカリ
又は炭酸アルカリのような酸受容体の存在において行な
うと有利である。

更に、一般式■のがラクトシトは、初めに−ｆｆ式１１
のフェノールスルホンフタレインヲ水酸化アルカリ又は
アルカリアルコラードによりシアルカリ塩；でもしくは
場合：ｔζより置換されているアミンによりアンモニウ
ム塩に変換しかつこれをアセトン、ジメチルスルホキシ
ド、ジクロルメタン、テトラヒドロフラン又はジメチル
ポルムアミドのような双極性中性溶剤中で一般式Ｉのペ
ルー〇−置換１−ハロｒノーガラクトースと反応させて
製造することができる。

一般式Ｈのフェノールスルホンフタレインと一般式ｌの
１−へローノーがラクトースとから一般式■のガラクシ
ドを合成する際に、塩化メチレン、クロロホルム、ベン
ゼン、トルエン又はジオキサンのような溶剤中、場合に
より塩化カルシウム又はドリエリット（Ｄｒｉｅｒｉｔ
　）のような乾燥剤の使用下に単独の銀塩又は銀塩の混
合物（酸化銀、炭酸銀、セライト上の炭酸銀、銀トリフ
ラート、サリグール酸銀）及び／又は単独の水銀塩又は
水銀塩の混合物（臭化水銀、シアン化水銀、酢酸水銀、
酸化水銀）の添加が有効であることが明らかになった。

このようにして得られた一般式■のペルー〇−置換スル
ホンフタレイ丑ルーβ−Ｄ−ガラクトシドもまたオ規化
合物である。

一般式■のペルー〇−置換スルホンフタレイニルーβ−
Ｄ−ガラクトシドを一般式Ｉのスルホンフタレイニル−
β−Ｄ−ガラクトシドに変換するための保護基Ｒ１３の
脱離は炭水化物化学でｎ用の方法〔例えば”　Ａｄｒａ
ｎｃｅｓ　Ｃａｒｂｏｈ％ｒａｔｅｃｈｅｍ、　”　、
　１２巻、１５７頁（１９５７年）〕により、例えばア
シル保腰革ではナトリウムメチラート又はバリウムメチ
ラート又はメタノール中のアンそニアにより実施する。

一般式ｎ　ノフェノールスルホンスタレインは周知の市
販されている物質であるか、あるいは公知方法により相
応するフェノールと相応する珂０−スルホン安息香酸と
から製造する〔例えばり、Ｅｌ、　Ｂｒｅｓｌｏｗ及び
Ｈ，［Ｈｃｏｌｎｉｋ共著、Ａ。

ｗｅ１ｓｇｂｅｒｇｅｒ編集”　Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ
ｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ″１２１巻、１１８頁（１９
６６年）工ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ−Ｐｕｂｌｉｓｈｅ
ｒｓ　、　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ在）参照〕か又は公知ノ
スルホンフタレインから出発して後からハロゲン化又は
ニトロ化して誘尋する〔例えばＤ−８，Ｅ３ｒｅｓ１ｏ
ｗ及びＨ，５ｋｏｌｎｉｋ共著、前記文献、１４１頁、
１４４頁診照〕。

出発物質として使用した一般式ｌのペルー〇−置換１−
ハロｒノーα−Ｄ−ガラクトースも公知の化合物である
〔例えば”Ｏｈｅｍ、Ｂｅｒ、　”、６５巻、８３６頁
（１９０２年）；Ｍａｔｕｒｅ”、１６５巻、６６９頁
（１９５０４）；Ａｃｔａｃｈｅｍ、　５ａａｎｄ、　
、　ａａｎｕ＋　Ｂ”、６３巻、１１６頁（１９７９年
）；Ｊ、　Ｃｈｅｍ、Ｂｏａ、　”、１４１９頁（１９
６５年）　；　”　０ａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、”
、１１巻、８５頁（１９６９年）〕。

Ｒ１，Ｒ１２及びＸの定義におけるハロゲンとは弗素、
塩素、臭素及び沃素で麦、リ　Ｒ１−Ｒ１２では有利に
弗素、塩素及び臭素でありかつＸでは有利に塩素及び臭
素である。

Ｒ６−Ｒ１２の定義における低級アルキル基は炭素原子
１〜５個、殊に１〜５個を含有し、メトキシ基が特に優
れている。

Ｍ＋の定義におけるアルカリ金属イオンとはリチウム−
、ナトリウム−及びカリウムイオンであり、リチウムイ
オン及びナトリウムイオンが優れている。

Ｍ＋の定義におけるアルカリ土類イオンはマグネシウム
−、カルシウム−及びバリウムイオンを表わし、カルシ
ウムイオンが優れている。

Ｍ＋の定義におけるアンモニウムイオンは［１１１１４
Ｈ１５Ｈ１６Ｈ１７〕十であり、その際Ｒ１４Ａ−Ｒ１
フは同じか又は異なっていてよく、それぞれ水素、炭素
原子１〜４個、殊に１又は２個の低級アルキル基か又は
ベンジル基を表わす。

炭水化物化学で常用の保−基Ｒ１３としては特にアセチ
ル基、ベンゾイル基、ベンジル基又はトリメチルシリル
基が好適である。

本発明の他の目的は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性
を測定するために一般式■の新規のスルホンフタレイニ
ル−β−ガラクトシドを含有する診断剤である。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としてスルホンフタレ
イニル−β−Ｄ−ガラクトシドを使用することにより従
来知られていたよりも明らかに敏感なβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ試験試験数らする。新規基質はβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼの活性を測定するには生化学的分野でかつま
た臨床化学的分野で使用することができる。それは敏感
である。それ故いくつかの利点が得られる： ａ）低いβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定すること
ができる、 ｂ）少量の試料を使用することができる、Ｃ）β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ活性の測定な極めて短時間で行なうこ
とができる、 ｄ）低い試料使用量及び有利な波長領域が他の試料成分
による方法の妨害を減少させる。

本発明による基質は、最適−値の点で全く異なっていて
よい種々の由来のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性の測
定に好適である。そのような場合でも一般式■の基質を
含有する診断剤は明らかに従来公知の試験剤よりも敏感
に反応する。

一般式Ｉのスルホンフクレイニルーβ−Ｄ−ガ２クトシ
ドは、免疫反応後にその活性度を測定すべき指示薬酵素
としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを使用する免疫学的測
定法にも好適である。酵素指示薬反応によりそのような
免疫学的測定法は当業者に酵素イムノアッセイとして知
られている。この方法は、範囲１０−５〜ＩＱ−１２モ
ル／ｌの蛋白質、ポリサツカリド、ホルモン、医薬及び
他の低分子物質の濃度の測定に使われる。相分離工程の
必要性に応じて均質−及び異質試験操作を区別する。拮
抗及び非拮抗試験原理で更に分けることができる。

しかしすべての試験原理は酵素−抗原−もしくは酵素−
抗体一接合体により行なう。酵素指示薬反応はすべての
酵素イムノアッセイに共通している。

そのような目的に好適な指示薬酵素はβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼである。酵素イムノアッセイにおけるβ−Ｄ−
がラクトシダーゼの測定は常法で、つまり好適なβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼ基質を添加し、これを酵素により分
解しか４つ常法で光度測定法で測定する。

それ故、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ試験試験数良により
酵素イムノアッセイでも顕著な利点が得られる： １、　この場合にも、より高い感度が検出限界の一層の
低下、短い反応時間及び低い試料使用量それ故地の試料
成分による低い妨害を可能にする。

２、有利な測定波長が一定の反応操作で不溶成分、例え
ば混濁による方法の妨害を低減する。

診断剤は一紗式■の本発明による基質１種又は１種と共
に好適な緩衝系並びに場合によりそのような診断剤に一
般に使われる他の好適な添加物、例えば浸潤剤、安定剤
等を含有する。診断剤は溶液の形で、凍結乾燥体、粉末
混合物、試薬錠剤として又は吸収性担体上に吸収させて
存在してよい。

溶液の形の本発明による診断剤は試験に必要な全試薬を
含有すると有利である。溶剤としては水か又は水と水溶
性有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、アセトン
又はジメチルホルムアミドとの混合物が該当する。保存
性という理由から、試験に必要な試薬を２種以上の溶液
に分けておき、それらを本来の実験の際に初めて混合す
ると有利である。

それぞれ全重量約５〜２０ダ、殊に約ｉｏｍｇの凍結乾
燥体形の診断剤の製造に当り、試験に必要な全試薬と共
に常用の骨格ビルダー、例えばポリビニルピロリドン及
び場合により他の充填剤、例えばマンニット、ソルビッ
ト又はキシリットを含有する溶液を乾燥させる。

粉末混合物又は試薬錠剤形の診断剤は、試験用成分に常
用のガーレン式添加物を混合しかつ造粒して製造する。

この種の添加物は例えば七ノー、オリゴ−又はポリサツ
カリドのような炭水化物、又はマンニット、ソルビット
又はキシリットのような糖アルコールもしくはポリエチ
レングリコール又はポリビニルピロリドンのような他の
可溶性不活性化合物である。一般に、粉末混合物又は試
薬錠剤は最終重量約５０〜２００１ｎｇ、殊に５０〜８
０〜を有する。

試験片としての診断剤の製造に当り、吸収性担体、殊に
Ｆ紙、セルロース又は合成繊維フリースを例えば水、メ
タノール、エタノール又はアセトンのような易揮発性溶
剤中の試験片の製造に常用の必要試薬の溶液で含浸する
。これは−含浸工程で行なうことができる。しかし含浸
を数工程で実施するとしばしば有利であり、その際に診
断剤成分の一部をそれぞれ含有する溶液を使用する。例
えば、第一工程で緩衝物質及び他の水溶性添加物を含有
する水溶液で、次に第二工程でβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ基質を含有する溶液で含浸することができる。調製し
た試験紙をそのままで使用するか又は公知のようにグリ
ップに接着するか又は有利に西ドイツ国特許第２１１８
４５５号明細書によりプラスチックと細目メツシュ材と
の間に封入することができる。

次の実施例により、本発明による化合物の合成に適用す
ることのできる多くの別法のうちのいくつかを並びに新
規なスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドのβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性測定への使用について詳説
する。ただし、本発明の目的は実施例により限定される
ものではない。

次の略語を使用する： ａｉｅｐｇｓ　２−　（４＋　（２−ヒドロキシエチル
）−１−ｔペラジニル〕−エタンスル ン酸 ＢＳＡ　牛血清アルブミン Ｔｗｅｅｎ　−２Ｑ　ポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノラウレート Ｔｒｉｃｉｎ　［Ｎ　−）リス（ヒドロキシメチル）〕
〕メチルーグリシ ン　１ ５．５’−ジクロルーフェノールスルホンフタレａ）ク
ロロホルム４５０１中の２．５，４゜６−テトラ−０−
アセチルーα−Ｄ−ガラクトピラノシルプロミド４５　
ｇ（０，１１モル）の溶液を６０℃に加熱する。撹拌下
にこの温度で１．２５　Ｎ−カセイソーダ水（０，１４
２−Ｅル）１１４ｍｌ中のベンジルトリエチルアンモニ
ウムプロミド２９．９８　（０，１１モル）の溶液を、
次に６．３′−ジクロル−フェノールスルホンフタレイ
ン（クロルフェノールレッド＞　４６．５．９（０，１
１モル）を添加する。色素残分は容器壁から少量の水と
１．２５　Ｎ−カセイソーダ水１１４獣で洗い落とす。

反応混合物を１２時間還流沸騰させ、その後室温で８時
間放置する。有機相を分離し、水相す数回クロロホルム
で振盪する。

なお存在する出発物質を除去するために、合した有機相
を０．１Ｎ−カセイソーダ水で数回振盪する。

クロロホルム相を水洗しかつ硫酸ナトリウムで乾燥後、
有機溶剤を濃縮する。残渣をエーテルテ擦６ト、３　、
６’−ジクロル−フェノールスルホンフタレイニル−２
１３Ｔ４．６−チトラーＯ−アセチルーβ−Ｄ−ガラク
トシド−ナトリウム塩４６．９が得られる。

黄色無定形物質（収率：理論量の５４％）融　点　１９
０６Ｃ（分解） ＮＭＲ：　（ＤＭＳＯ−ｄ６）　：　１．９５　（ｓ、
、５Ｈ）　、１．９９（ｓ１３Ｂ）　、２．０２（８１
３Ｈ）、２．１２ＣＢ、５Ｈ）　、４．０−４．６（ｍ
１４Ｈ）　、５．１−５．７ （ｍ、５Ｈ）　、６．１−６．８ （ｍｓＩＨ）　、６−９−７７− ７（，８Ｈ）　、７．８−８．０ （ｍ、ＩＨ） ｂ）無水メタノール２７０１中のａ）により製造したテ
トラアセチルガラクトシド２８＆（０，０３６モル）の
溶液を０〜５℃に冷却する。

脱アセチルするためにこの湿度でれ押下にメタノール中
の１モル（０，０７２モル）−ナトリウムメチラート溶
液７２１を添加する。

０〜５６０で１５分後に、過剰のナトリウムイオンを除
去するためにこの溶液にアンバーライ）　（Ａｍｂｅｒ
ｌｉｔｅ　）工Ｒｅ　５　［１約３［］Ｑｍ／’を加え
、混合物を５°Ｃで２時間指押する。イオン交換体によ
る吸引後に、これを数回メタノールで洗う。

合したＰ液の微細後、残渣をカラムクロマドグ２フイ法
により塩化メチレン／メタノール＝５／１を用いて珪酸
ｒルで精製する。６．５’−ジクロル−フェノールスル
ホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドーナトリウム
塩１２．９が得られる。

黄色無定形粉末（収率：理論量の５５チ）融　点　２１
０°Ｃ（分解） ＮＭＲ：　（ｐｕｓｏ−ａ６）　：　３．５−３．７（
ｍ＋６Ｈ）　ｊ−９−５，０（ｍ、４Ｈ）　、Ｅｌ、ｉ
　（（１，Ｊ　＝７Ｈｚ、ＩＨ）　、６．１−６．８（
ｍ。

ＩＨ）　、６．９−７．６（ｍ、８Ｈ）、７．８−ｆ３
．０（ｍ、ＩＨ）。

例　２ 例１と同様にして、２．３．４．６−テトラ−０−アセ
チルーα−Ｄ−ガラクトピラノシルプロミドを下記の出
発物質の掴に記載のフェノールスルホンフタレインと反
応させ、相応するベルアセチル化ガラクトシドを介して
最終生成物の枕に挙げたβ−Ｄ−ガラクトシドを製造す
る。

１）フェノール　フェノールスルホンフタレイニル　２
１８〜２２０レツド　−β−Ｄ−ガラクトシドーナトリ
ウム１ ２）フルオルフエ　３，６′−ジフルオルフェノールス
　ガラス様ノールレッド　ルホンフタレイニルーβ−Ｄ
−ガラクトシド−ナトリウム塩 ６）クロルフェノ−ｓ、６′、ｓ、ｓ’−テトラクロル
フエ　１４チー１５０ルブ九−ノールスルホンフタレイ
ニル−β−Ｄ−ガラクトシドーナトリウム塩 ４）ブレンツカテキ　６．６フージヒドロキシフエノー
ルス　１１５〜１２０ンバイオレツト　ルホンフタレイ
ちルーβ−ツーガラクトシド−ナトリウム１ ５）ヨードフェノ　６．３′、ｓ、ｓ’−テトラヨード
フエ　２１０〜２１５−ルブルー　ノ〜ルスルホンフタ
レイニルーβ−Ｄ〜ガラクトシド−ナトリウム塩 ６）ｍ−フレｆ−２，クージメチルフェノールスルホ　
２０５〜２０９ルバープル　ンフタレイちルーβ−シー
ガラクトシド−ナトリウム塩 ７）プロムクレゾ　６，６′−ジブロム−５，５′−シ
メチ　２０　ト２０３−ルバープル　ルフェノールスル
ホンフタレイニルーβ−Ｄ−ガラクトシド−ナトリウ ム塩 ８）０−フレジー　６．３′−ジメチルフェノールスル
ホ　２０　ト２０４ルレツド　ンフタレイニルーβ−Ｄ
−ガラクトシドーナトリウ４ ９）チモールプル　６，６′−ジインプロピル−６，６
′−２０５〜２０９−　ジメチルフェノールスルホンフ
タレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドーナ トリウム塙 １０）プロムチモー　６，６′−ジブロム−５，５乙ジ
イソ　１９　ト１９５ルプルー　プロピル−２，ｚ−ジ
メチルフェノールスルホンフタレイニル−β−り 一ガラクトシドーナトリウム用 １１）サリチルレ　６，６′−シカルボキシフェノール
ス　１７８−１８０ツド　ルホンフタレイニルーβ−Ｄ
−ガラクトシドーナ、トリウム塩 １２）５　、に、５．５’　５．３’、５．５’−テト
ラブロム−２，１０ト１０３プ戸トカ〜ムー　ｚ−７メ
チルフエノールスルホンフ２、’；！４）ｔチル　タレ
イニル−β−Ｄ−ガラクトシドフエノゴク〃示ン　−ナ
トリウム塩 フタレイン １３）３．６’９−）口　６，６′−ジニトロフェノー
ルスルホ　１６７〜１７０７Ｍプクルホ　ン７タレイニ
ルーβ−Ｄ−ガラクトンフタレイン　シト−ナトリウム
塩 １４）５．３’プクロ　６，６′−ジクロル−５，ゴー
ジニド　１１５−１１８ルー５，５　ツニ　ロフェノー
ルースルホンフタレイニトロフ２−−ルスル　ルーβ−
Ｄ−ガラクトシドーナトリホンフタレイン　ラム塩 １５）３．３′−ジメチル−６，６′−ジメチル−５，
５′−ジニト　１５５〜５．５”９＝トロフエノ　ロフ
ェノールスルホンフタレイ＝＝ｘ　１５８１ルスルホン
７タレイン　−β−Ｄ−ガラクトシドーナトリウム堪 １６）３．３Ｌジメトキシ−６，３′−ジメトキシフェ
ノールスルフエｔ１す々閣つクタ　ホンフタレイ；ル−
β−Ｄ−ガラクレイン　トシド １７）３．３’うわｆ彷ル　６，６′−ジフルオルフェ
ニル−３〃。

フェニル−６“、Ｃ５／冨′４″、５″、６／Ｌテトラ
ブロムスルホンブ戸トラフｂ、にｖホン　フタレイーレ
ーβ−Ｄ−ガラクトシフタレイン　ド １８）２．２仁ジメチル−３，２，２’７メプシレー６
．３′乙ゾニトロ６乙ジニトロフェノ−用スル　フェノ
ールスルホンフタレイニルホンフタレイン　−β−Ｄ−
ガラクトシド１９）２．２−ノメブ８−ｓ、　２．２′
−ジメチル−５，５′−シュ５′４−ドロア毛ト嘆ス　
トローフェノールスルホンフタレルホｌタレイン　イニ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド２０）フ鳳ノール→ｒにト　
フェノール−４′乙二トロスルホンン　３００ロスル巾
ンフタレイン　タレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドーナ
トリウム塩 ２１）フェノールーチ仁ニド　フェノール−５′Ｌニト
ロスルホンロ刃圀ウクターン　フタレイニル−β−Ｄ−
ガラクトシド ２２）　６．５’Ｐ／ｃｔｚｂ７　６．５仁シクロｈ７
エ／−に−４’　１６Ｖ入ｈプレー４′仁ニドロス　−
二トロスルホンフタレイちルー　３００ｈホンフタレイ
ン　β−Ｄ−ガラクトシドーナトリウム塩 ２６）３．３／づわ〃体ル　６．３′−ジフルオルフェ
ノールーフエノールーｌ炬トロ　４′仁二トロスルホン
フタレイニルス副ウクルイン　−β〜Ｄ−ガラクトシド
２４）６，６′、４′Ｌトリニ　６，５′、４＃−トリ
ニトロフェノ−６００トロフエノールスルｔン　ルスル
ホンフタレイニルーβ−Ｄフタレイン　−ガシクトシド
ーナトリウム塩２５）フ坊ルー４′乙ア　フェノール−
４／Ｌアミノスルホン　無定形ミノ弓功羽りフタレイ　
フタレイニル−β−Ｄ−ガラクトン　シトーナトリウム
堪 例　６ ６．３′−ジフルオルーフェノールスルホンフタレイニ
ルーβ−Ｄ−ガラクトシド−ナトリウム塩 ａ）５．３’−ジフルオルーフェノールスルポンフタレ
イン（フルオルフェノールレッド）６．２ｇ　（０，０
１６モル）　ヲ無水Ｊり／−＃１７Ｑｍｌ中に溶解する
。ジトリラム塩の形成のために、メタノール中の１千ル
ーナトリウムメチラート溶液３２１ｄ（Ｄ、ＣＩ２モル
）を添加する。この溶液を濃縮乾固する。無水ジメチル
ホルムアミド１４０威中の該残渣の溶液に２．３，４．
６−テトラ−０−アセチルーα−Ｄ−ガラクトピラノシ
ルゾロミド７．５ｇ（０，０１７６モル）を添加しかつ
室温で６時間撹拌する。吸引濾過後、Ｆ液を室温でオイ
ルボンゾ真空中で濃縮する。

残渣をエーテルで擦り、吸引濾過しかつ乾燥させると、
３．３’−ジフルオルーフェノールスルホンフタレイニ
ル−２，３，４，６−テトラ−０−アセチルーβ−Ｄ−
ガラクトシド−ナトリウム塩６．９ｇが得られる。

橙色無定形物質（収率：理論量の６３チ）融　点　２１
５°Ｃ（分解） ＮＭＲ：　（ＤＭＳＯ−＋１６）　：　１．９４（ｓ、
５Ｈ）　、１．９６Ｃθ、６Ｈ）、１．９９（ｓ、３Ｈ
）　、２−１５（８１３Ｈ）　、５．９９−４−７（，
４”）、５．０−５．＋Ｓ（ｍ、６Ｈ）　、６．２−６
．６（ｍ、ＩＨ）　、７．０−７．６（ｍ、８Ｈ）　、
７．９−８．２（ｍ、ＩＨ）ｂ）無水メタノール７５０
Ｍ中のａ）より製造したテトラアセチルガラクトシド３
．５．？（０゜００５モル）の溶液に室温でメタノール
中の１モル−ナトリウムメチラート溶液１．５　ｍｌ（
０，００１５モル）を加える。−晩放置後、溶液を濃縮
する。残渣をカラムクロマトグラフィ処理により塩化メ
チレン／メタノール＝５／１を用いて珪酸ゲルで精製す
る。６，６′−ゾフルオルーフェノールスルホンフタレ
イニルーβ−Ｄ−ガラクトシド−ナトリウム塩１．２ｇ
が得られる。

橙赤色吸湿性無定形粉末（収率：理論量の４１％） ＮＭＲ：　（ＤＭＳＯ−ｄ６）：　３．１−３．９（ｍ
、６Ｈ）　、４．１−５．３１（ｍ、４Ｈ）　、４．９
５（ａ、Ｊ＝７Ｈｚ　、ｉＨ）。

６．２−６．６（ｍ、ＩＨ）　、６．８−７．６（ｍ、
８Ｈ）　、７．８−８．０（ｍ、ＩＨ）。

例　４ 例６に記載したようにして、２，３，４．６−テトラ−
０−アセチルーα−Ｄ−ガラクトピラノシルプロミド及
び下記の出発物質の欄に挙ケタフェノールスルホンフタ
レインから最終生成物の欄に挙げたβ−Ｄ−ガラクトシ
ドを生成する。

出発物質　最終生成物　融点０Ｃ １）フタｈし　フェノールスルホンフタレイニル−β　
２０＆〜２１２レツド　−Ｄ−ガラクトシドーナトリウ
ム塩２）　ｏ−／ＬＡＰ−６，５’ジメチルフェノール
スルホン　２０２〜２０５ルＷド　フタレイニル−β−
Ｄ−ガラクトシドーナトリウ入盆 ３）プ５ムクレ　６，３乙ジブｂム−５，５′−ジメチ
ル　１９ト２０２φ１脅←プ　フェノールスルホンフタ
レイニルーβル　−Ｄ−ガラクトシドーナトリウム塩例
　５ ５．６′−ジブロム−５，５′−ジメチルフェノールス
ルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシａ）ジクロル
メタン６０１ｒＬＩＩ中の２．３，４゜６−チトラーＯ
−アセチルーα−Ｄ−ガラクトピラノシルプロミド１１
．０３ｇ（０，０２７モル）及びブロムクレゾールパー
ゾル−トリペンシルアンモニウム！　５．６　ｇ（０，
００７モル）の溶液に酸化銀３．１　ｇ（０，０１３モ
ル）及び炭酸銀３．７ｇ（０，０１３モル）を加えかつ
室温で１２時間攪拌する。沈殿のＦ別後、Ｆ液を濃縮し
かつ残渣をカラムクロマトグラフィによりトルエン／酢
酸エステル／メタノール＝１／１１０．２を用いて珪酸
ゲルで精製する。相応する両分の濃縮により６，６′−
ジブロム−５，５′−ジメチルフエノールスルホンフタ
レイニル−２，３゜４．６−テトラ−０−アセチルーβ
−Ｄ−ガラクトシド−トリベンジルアンモニウム塩４．
４ｇが得られる。

黄色無定形物質（収率：理論量５４チ）ＮＭＲ：　（Ｄ
ＭＳＯ−（１，）　：１．８−２．３（ｍ、１８Ｂ）　
、３．８−４．４（ｍ１４Ｈ）　、５．２−５．６（ｍ
、９Ｈ）、６．６−８．１　（ｍ、２５Ｈ）。

無水メタノール４０ｍＡ中のａ）により製造したテトラ
アセチルガラクトシド４　ｇ（０，００３５モル）の溶
液を一４０°ＣＶＣ冷却しかつ脱アセチルのために１モ
ルナトリウムメチラート溶液１５．５ｍＡ（０，０１５
モル）を加える。１時間後に溶液をアンバーライトエＲ
Ｏ５［］（Ｈ型）約３０鮎で処理することにより中和し
かつ濃縮する。残渣をカラムクロマトグラフィにより塩
化メチレン／メタノール／アセトン＝６／２／１を用い
て珪酸ゲルで精製すると、１．３’−ジブロム−５，５
′−ジメチルフェノールスルホンフタレイニル−β−Ｄ
−ガラクトシドーナトリウム塩２ｇが得られる。

黄色の無定形粉末（収率ユ理論量の６２ｑＩｂ）融点　
２００〜２０３°Ｃ（分解） ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１．９−２−４９−２−
４（，３−２−４−０（ｍ、６Ｈ）　、４．４（ｍ、２
Ｈ）　、４４−８（＋２”） ｌ水素交換後：　４．９（ａｔＪ＝７ａｚｓＩＨ）”ｌ
　、６．７−８．１（ｍ、８）１）。

例　６ 前記の例５に記載したようにして、２．ろ。

４．６−チトラーＯ−アセチルーα−Ｄ−ガラクトピラ
ノシルプロミドと次に記載のそれぞれの出発物質から下
線を引いた化合物を製造する：１）フルオルフェノール
レッド 塩、吸湿性ガラス様物質 ２）フェノール−５’　ｌ　７１ｒ’　ｌぢ／　、　６
／／−テトラブロムスルホンフタレイン ３）５．５’、５，５’−テトラクロルフェノール−６
“　４／／　、　ｓ／／　、　６／／−テトラゾロムス
ルホンフタレイン 融点１５０°Ｃ（分解） ４）フェノール−４“−二トロスルホンフタレイン 点〉３００°Ｃ ３）５．５’−ジクロルフェノール−４“−ニトロスル
ホンフタレイン 複融点１６０°Ｃ／’）３００’０ ６）５．５’−ジメチルフェノール−４′−二トロスル
ホンフタレイン ３　、３’−ジメチルフェノール−４″−ニド算スルホ
ンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシド−ナトリウム塩
、 融点２１０〜２２０℃ ７）　５　、５’、　４”−）リニトロフェノールスル
ホンフタレイン ラム塩、融点〉３００°Ｇ ８）フェノール−４′−アミノスルホンフタレイン 結乾燥体（無定形） 例　７ ３．６′−ジフルオルフェノールスルホンフタレイニル
ーβ−Ｄ−ガラクトシド−トリベンジルアンモニウム塩 ジクロルメタン７０１中のフルオルフェノールレッド−
トリベンジルアンモニウム［６，７７、！ｉ’　（０，
０１モル）及びペルー〇−トリメチルシリル−α−Ｄ−
ガラクトピラノシルプロミド５．５　＆　（０，０１モ
ル）の溶液に酸化銀１．１５ｇ（０，００５モル）及び
炭酸銀１．４ｇ（０，００５モル）を加えかつ漫分遮断
下に１８時間攪拌する。沈殿のｐ別後、ｐ液を濃縮し、
保膿基の脱離のためにメタノール６０ＷＬｌ中に取りか
つ室温で１２時間貯蔵する。精製に当り、ジクロルメタ
ン／メタノール＝５／１を用いて珪酸ゲルを介してクロ
マトグラフィ処理する。

３．３’−ジフルオルフェノールスルホンフタレイニル
ーβ−Ｄ−ガラクトシド−トリベンジルアンモニウム塩
１．２ｇが得られる。

橙色の無定形粉末（収率：理論量の１４％）融点１５７
〜１６５°Ｇ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ６）二３．１−３．９（ｍ、６
１　．４．２−５．２（ｍ＋１１１（）　、６．３（ｍ
、ＩＨ）　、６．８−７．６＜ｍ、２５Ｈ）　、７．９
（ｍ、ＩＨ）。

例　８ ６．６′−ジクロル−フェノールスルホンフタレイニル
−β−Ｄ−ガラクトシＶ−リチウム塩例１により製造し
た６、６′−ジクロルーフエノールスルホンフタレイニ
ル−β−Ｄ−ガラクトシドーナトリウム塩１．！Ｍ（０
，００２５モル）を少量の水中に溶かす。溶液をアンバ
ーライトエＲ１２０（Ｌｉ型）を充填したカラムに装入
する。

溶出液の凍結乾燥により３，６′−ジクロル−フェノー
ルスルホンフタレイニル−β−Ｄ　−カラクトシドーリ
チウム塩１．４ｇが得られる。

橙色の無定形粉末（収率：理論量の９６％）融　点　１
９０°Ｃ（分解） Ｆｐ、１　９　０　°Ｑ　（Ｚｅｒｓ、）ＮＭＲ：　（
ＤＭＳＯ−ａ６）　：３．３−３．８（ｍ　、６Ｈ）　
、４．３−４．９（ｍ、４Ｈ）　、５．０７（ｓ、Ｊ＝
７Ｈ２，ＩＨ）、６．１−７．７（ｍ、９ＥＩ）　、７
．８−８．１例９　（ｍ　、１Ｈ）。

例８に詳説したようにして、３　、５’−ジクロルフェ
ノールスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドー
ナトリウム塙（例１参照）からそれぞれ次の方法で下線
の化合物を製造する二ａ）　（１！ａ型のアンバーライ
トエＲ１２０を用いて交換クロマトグラフィにより 塩 橙赤色、熱定形生成物（収率：理論量の７８％）融　点
　２５０°Ｃ（分解） ＮＭＲ：　（ＤＭＢ　０−ｄ６）　：　３．２３−８　
（ｍ　１６　Ｈ）　、４．４−５−１（ｍ　、４”）　
、５．１　（ｓ　、Ｊ＝７Ｈｚ　、Ｉ　Ｈ）、６．２−
７．６（ｍ　、９Ｈ）　、７．８−８．０（ｍ、ＩＨ）
。

ｂ）　（Ｈ２Ｏり４Ｎ型アンバーライトエＲ１２０を用
いて交換クロマトグラフィにより 黄色無定形生成物（収率：理論量の８５％）融　点　１
９０〜１９５８Ｃ ＮＭＲ：　（ｎＭｓｏ−ａ、、）：３．２（ｓ　、１２
Ｈ）、３．３−４．０（ｍ、６Ｈ）、４．１−５．３（
ｍ、４Ｈ）　、５．１（ａ、Ｊ　＝７Ｈｚ、ＩＨ）　、
６．４（ｍ、Ｉ　Ｈ）　、７．０−７．７（ｍ、８Ｈ）
　、７．９（ｍ、ＩＨ）例１０ ６．３′−ジクロルフェノールスルホンフタレイニル−
β−Ｄ−ガラクトシドートリベンジルア３．３’−ジク
ロルフェノールスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラク
トシド−ナトリウム塩（例１参照）１．５ｇ（０，００
２詐ル）を少量の水中に溶かしかつアンバーライト、工
Ｒ１２０（Ｈ型）を充填したカラム中を通す。この溶離
液にエタノール１５ｍ１中に溶解した化学量論的（０，
７２Ｆ）ｆｔのトリベンジルアミンを加えかつ濃縮スる
。６，６′−ジクロルフェノールスルホンフタレイニル
−β−Ｄ−ガラクトシドートリペンシルア〜ンモニウム
塩１．７ｇが得られる。

黄色の無定形物質（収率：理論量の７８％）融　点　１
４０〜１５０°Ｇ 例１１ 例１０に記載したように、５．５’−ジクロルフェノー
ルスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドーナト
リウム塩（例１参照）からペンシルジエチルアミンの使
用下に相応する６゜６′−ジクロルフェノールスルホン
フタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドーペンシルジエチ
ルアンモニウム塩を製造する。

黄色の無定形粉末（収率：理論量の６９％）融　点　２
４５〜２４８°Ｃ 例１２ 緩衝溶液： ｕｇｐｚｓ　１００ミリモル／ｌ 壌化ナトリウム　１５４ミリ伏／ｌ Ｌ−アスパラギン酸ナト　２ミリ％に／ｌリウム Ｂ８Ａ　１０１１／Ｉ Ｔｗｅｅｎ　−２Ｑ　Ｏ，５ｆ／／１ −値（カセイソーダで調節）　７．５　（３７℃）前記
の緩衝溶液中に６，３′−ジーフルオルーフェノールス
ルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドーナトリウ
ム塩５ミリモル／ｌを溶解する。…値をカセイソーダで
…７．５（３７°Ｃ）に調節する。

試記の緩衝溶液中に３，６′−シーフルオル−フェノー
ルスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドーナト
リウム場５ミリモル／ｌを溶解する。ＦＪＩ値をカセイ
ソーダでｐ）１７．５（３７°Ｃ）に調節する。

試薬溶液６： 前記の緩衝溶液中に６，６′−ジクロルフェノールスル
ホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシド−ナトリウム
地５ミリモル／ｌを溶かす。

緩衝溶液のβ値７．５　（５７℃）を保持する。

試薬溶液４： 前記の緩衝溶液中に３　、３’　、　５　、５’−テト
ラクロルフェノール−５’、４“　ｒｆ　、　６／／−
テトラブロムスルホンフタレイニル−β−Ｄ−カラクト
シドーナトリウム塩５ミリモル／ノを溶解する。

緩衝溶液の一値７．３　（３７°Ｃ）を保持する。

基質濃度及びＰＨ値は使用するそｔぞれの基質に適合さ
せる。それ故、個々の試薬溶液で基質濃度ないしはｐ＋
（値に関して全く意識的に種々の数値が得られる。

酵素溶液： エシェリキア・コリ（ｌ１ｉｉｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ　）から市販のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを前
記の緩衝溶液中に溶かす。この溶液の活性は約０．０８
Ｕ／ｍｌである（製造業者報告による）。

ｂ）測定の実施 測定は光度測定法によりその都度下記の波長で行なう。

１ｃ１ｒＬ−キュベツト中で試薬９５０　ｔＪに３７°
Ｃで酵素溶液５０μｌを混合する。反応の尺度としては
単位時間当りの吸光度上昇［ｒｎＥｒｔ１分〕を確定す
る。測定した吸光度から反応時間で除することにより計
算する。

次表に測定値を記載する。

試薬番号　測定波長（ｎｍ〕　反応［ｍｍｘｔ％分］５
６０９ ２　５７８　７１ ３　５７８　１２３ ４　５７８　１２１ 例１３ 緩衝溶液： ＨＫＰＥＳ　５０ミリモル／ｌ クエン酸　５０ミリモル／ｅ Ｔｒｉａｉｎ　５０ミリモル／ｌ 塩化ナトリウム　１５４ミリモル／ｌ Ｌ−アスパラギン酸マグネ　１ミリモル／ｌシウム ＢＳＡ　１Ｕ／ｉｔ −値（カセイソーダで調節）　６．９　（３７℃）試薬
溶液１； 前記の緩衝溶液中に６．６′−ジ−メチル−フェノール
スルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシド５ミリモ
ル／ｌｋ溶解する。

試薬溶液２： 前記の緩衝溶液中に６，６′−ジ−ヒドロキシ−フェノ
ールスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシド５ミ
リモル／ｌを溶解する。

酵素溶液： エシェリキア・コリからの市販のβ−Ｄ−がラクトシダ
ーゼを前記の緩衝液中に溶解する。

この溶液の活性は約０．０８　Ｕ　／ｍｌである（Ｍ造
業者報告に関して）。

ｂ）測定の実施 １ｃｆｒＬ−キュベツト中で試薬９５０μｌに６７°Ｃ
で酵素溶液５０μｌな混合する。反応時間１０分後に、
カセイソーダによりｐＨ１０に調節しかつ吸光度を測定
する。酵素溶液の代りに緩衝液を含有するブランク試料
を使って同様に行なう。

温度は反応の凪１及び測定の間６７６Ｃに保持する。

酵素を含有する及び含有しないバッチの吸光度から吸光
度差ケ計算する。この吸光度差を反応時間で除すること
により反応の尺度としての単位時間当りの吸光度上昇［
：ｍＫｘｔ／分〕が得られる。

次表に測定値を記載する。

試薬番号　測定波長［ｎｍ〕　反応［ｍＥｘｔ／分〕１
　５７８　９８ ２　５９５　６ 例１４ 様々な由来のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性の測定 市販されている様々な由来のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を使用する。これらのガラクトシダーゼは特徴としてそ
の最大活性を異なるｐＨ値で展開する。

製造業者による記載事項： ナタマメ（、Ｔａｃｋ　Ｂｅａｎｓ）から　…６．５ア
スペルギルス・二〜ガーから　ｐ）１４．０（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）エシエリキ・コリから　
ｐｉ−１６，９牛肝から　ｌｌＪ′１７．６ ａ）使用する溶液の製造： 緩衝溶液： Ｈｇｐｇｓ　５０ミリモル／ｌ クエン酸　５０ミリモル／１ Ｔｒｔｃｉｎ　５０ミリ七し／ｌ 塩化ナトリウム　１５４ミリモル／ｌ Ｌ−アスパラギン酸　１ミリモル／ｌ マグネシウム ＢＳＡ　１０１１／１ β−Ｄ−ガラクトシダーゼの…最適値により異なる両値
を有する前記の組成の溶液を製造する（ｐＨ５，５７４
，ＣＪ／６．９／７．５　）。ＰＨ値調節はＮ　ａｏｕ
もしくはＨＣＪ、で６７℃で行なう。

試薬溶液： 異なるＰＨ値３．５　／　４．０　／　６．９　／　７
．３を有する前記の緩衝溶液中にそれぞれ６，６′−ジ
クロル−フェノールスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシドーナトリウム塩５ミリモル／ｌシ溶かす。

酵素溶液 β−Ｄ−ガラクトシダーゼをそれぞ４最適な両値を有す
る緩衝液中に溶かす。

ナタマトから　緩Ｖｌｉ液…６．５中にアスペルギルス
・ニーガーから　〃尚・４．０中にエシェリキア・コリ
から　ｌｌ　ｔＪ１６．９中に生肝から　／Ｉ　ＰＨ７
，５中に こ４らの溶液の活性は約０−０８　Ｕ　／　ｍＡである
（製造業者詳報）。

ｂ）測定の実施： 酵素反応をそれぞれの酵素に最適なｐＨ値で一定反応時
間行なう。１ｃＴＬ−キュベツト中で試薬１０００μｌ
に６７℃で酵素浴液６０μｌを混合する。反応時間１５
分後にカセイソーダでＰＩＪ８．５に調節しかつ吸光度
を５７８　ｎｍで測定する。温度は反応及び測定の間６
７℃で一定に保持する。各測定に対して同様にして空試
験を実施する。この際、酵素溶液の代りに緩衝溶液６０
μノを使用する。

Ｃ）評　佃ド 酵素による測定値とブラングによる測定値との間の差な
初めにめる。この差を反応時間で除することにより反応
の尺度として単位時間当りの吸光度上昇［ｍＫｚｔ　／
分〕を計算する。

酵素による測定値−ブラングによる測定値＝△−測定値 反応時間 各々の酵素の反応に関して得ら４た測定値は次の表から
明らかである。

酵　素　ＰＨ反応速度 ナタマメ　３．５　７１ アスペルギルス・ニーガー　４．０　１１２エシエリキ
ア・コリ　６．９　７４ 牛肝　７．５　３２ 前記″の実験結果から、スルホンフタレイニル−β−Ｄ
−ガラクトシドが各々の由来のβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼの基質とに好適であることが認められる。

例１５ 遊離及び接合β−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性緩衝溶液
： ＨＫＰＫ８　１００ミリモル／ｌ 塩化ナトリウム　１５４ミリモル／ｌ Ｌ−アスパラギン酸　２ミリモル／ｌ マグネシウム ＢＥＴＡ　１０！ｉ／Ａ Ｔｗｅｅｎ　−２００，５ｇ／　Ｉ ＰＨ値（カセイソーダ　７．５＜５７℃）により調節） 試薬溶液： 前記の緩衝溶液中に６，６′−ジクロル−フェノールス
ルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドーナトリウ
ム塩５ミリモル／ｌを溶解する。緩衝溶液のｐＨ値は７
．６に保持する。

酵素溶液： エシェリキア・コリからの市販のβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼを緩衝液中に溶かす。この溶液の活性は約０．０８
Ｕ／σである（製造業者詳報）。

酵素接合体溶液 β−Ｄ−ガラクトシダーゼー抗体−製剤を使用する。そ
のような酵素−抗体一接合体の製造は公知である。例え
ば”ビオキミカ・エト・ビオフイズイカ・アクタ（Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｅ。

Ａｃｔａ　）″、６１２巻、４０〜４９頁（１９８０年
）に記載されている。この製剤を、前記の酵素溶液とほ
ぼ比較し得る活性が得られるように緩衝溶液で稀釈する
。

ｂ）測定の実施： 測定は光度測定法により５７８　ｎｍで行なう。

試薬溶液９５０μｌにそれぞれ１ｃＴＬ−キュベツト中
で酵素溶液５０μｌもしくは酵素接合体溶液５０μｌを
３７℃で混合する。反応の尺度として単位時間当りの吸
光度上昇［ｎｅｘｔ　／分〕を確定する。

遊離β−Ｄ−ガラクトシダーゼとの反応には１２４　ｎ
ｅｘｔ　／分；β−Ｄ−ガラクトシダーゼー抗体−接合
体との反応には１２３　ｍＥｘｔ　７分である。

両方の測定値から、遊離−及び接合したβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼによって非常に良好に測定し得る吸光度差が
得られることが認められる。

これにより、スルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクト
シドが基質として、遊離β−Ｄ−ガラクトシダーゼにも
、β−Ｄ−ガラクトシダーゼー接合体にも同じように好
適であることが判明する。従って、この新規な基質は遊
離のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを測定するための診断剤
としてだけ使用されるのではない。有利に、β−Ｄ−ガ
ラクトシタ゛−ゼな指示薬酵素として使用する酵素イム
ノアッセイでも利用することができる。

手続、補正書（方式） 昭和６０年４月　２日 特許庁長官殿 １・　事件の表示　昭和５９年特許願第２６１９４９号
２、発明の名称 ガラクトシダーゼを検出するための診断剤３、補正をす
る者 事件との関係特許出願人 名　称　ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルンヤフト・
ミツト・ペンユレンクテル・ハフラング ４、代理人 明細書の発明の詳細な説明の欄（第１７頁、第１８頁）
フイエ。、、　、＜、、１−、、、Ｉ、：。ＩＩ　（Ｉ
ＩＩ：　、ｌ　Ｌ−Ｉｓ　７−ム０．八、’４ニーはジ
オキサンのような溶剤中、場合により塩化カルシウム又
はＰリエリソト（Ｄｒｉｅｒｉｔ　）のような乾燥剤の
使用下に単独の銀塩又は銀塩の混合物（酸化銀、炭酸銀
、セライト上の炭酸銀、銀トリフラート、サリチル酸銀
）及び／又は単独の水銀塩又は水銀塩の混合物（臭化水
銀、シアン化水銀、酢酸水銀、酸化水銀）の添加が有効
であることが明らかになった。

このようにして得られた一般式１ｖのにルーＯ−置換ス
ルボンフタレイニルーβ−Ｄ−ガラクト７Ｐも１だ新規
化合物である。

−般式＋ｖのペルー〇−置換スルポンフタレイニルーβ
−Ｄ−ガラクトンｐ２一般式ｌのスルホンフタレイニル
−β−Ｄ−ガラクトシＰに変換するための保護基Ｒ１５
の脱離は炭水化物化学で常用の方法〔例えば“′アトラ
ンセス　カルボヒトｖ−Ｉ−ケミ−（Ａｄｒａｎｃｅｓ
　ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｅｍ、　）　”、１２
巻、１５７頁（ＩＩ；１５７年）〕により、例えばアシ
ル保護基ではナトリウムメチラート又はノ々リウムメチ
ラート又はメタン−ル中のアンモニアにより実施する。

一般式■のフェノールスルホンスタレインは周知の市販
されている物質であるかあるいは公知方法により相応す
るフェノールと相応する。

０−スルホン安息香酸とから製造する〔例えばり、Ｓ、
プレスロウ（Ｂｒｅｓｌｏｗ　）及びＨ，スコルニツク
（５ｋｏｌｎｉｋ　）共著、Ａ、ノ々イスベルガ−（Ｗ
ｅｉｓｓｂｅｒｇｅｒ　）編集６ヘテロサイクリツクコ
ン、ａウンズ（Ｈｅｔｅｒｏｃｙｌｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕ
ｎｄｓ　）　”　。

２１巻、１１８頁（１９６６年）インターサイエンノξ
プリツシャース（ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ　）、にューヨーク（Ｎｅｗ　ｙｏｒｋ　）
在）参照〕か又は公知のスルホンフタレインから出発し
て後からハロゲン化又はニトロ化して誘導する〔例えば
り、Ｓ、プレスロウ（Ｂｒｅｓｌｏｗ　）及びＨ，スコ
ルニツク（５ｋｏｌｎｉｋ　）共著、前記文献、１４１
頁、１４４頁参照〕。

出発物質として使用した一般式ｍのペルー〇−ｉ換１−
・・ロゲノーα−Ｄ−ガラクトースも公知の化合物であ
る〔例えば”ヒエミツシエベリヒテ（Ｃｈｅｍ、　Ｂｅ
ｒ、）　”、３５巻、８３６頁（１９０２年）；”ネー
チャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　”、１６５巻、３６９頁（
１９５０年）；”アクタケミ力　スカンジナビ力（Ａｃ
ｔａ　ｃｈｅｍ、　５ｃａｎｄ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式■： ２ 〔式中Ｒ１、Ｒ４は同じか又は異なっていてよく、それ
   ぞれ水素、ハロゲン、ニトロ基又はアミノ基を表わし、 Ｒ５−Ｒ１２は同じか又は異なっていてよく、それぞれ
   水素、ハロゲン、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級
   アルコキシ基、カル？キシル基又はニトロ基を表わし、 Ｍ＋はプロトン、アルカリイオン、アルカリ土類イオン
   又はアンモニウムイオンを表わス〕のフェノールスルホ
   ンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシド。 ２、一般式Ｉ： Ｃ式中Ｒ１〜Ｒ′は同じか又は異なっていてよく、水素
   、ハロゲン、ニトロ基又はアミノ基を表わし、 Ｒ６〜Ｒ１２は同じか又は異なっていてよく、水素、ハ
   ロゲン、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキ
   シ基、カルボキシル基又はニトロ基を表わし、 Ｍ＋ハｒロトン、アルカリイオン、アルカリ土類イオン
   又はアンモニウムイオンを表わス〕のフェノールスルホ
   ンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドな製造する方法
   において、公知方法で一般式ＩＩ： 〔式中Ｒ１〜Ｒ１２は前記のものを表わす〕のｆヒ合物
   を一般式ｌ： 〔式中Ｘはハロゲ：７を表わしかつＲ１３は炭水化物化
   学で常用の保護基を表わす〕のペルー〇−置換１−ハｏ
   ）ｆノーα−Ｄ−ガラクトースと糖残基のｃ　−１ＬＡ
   子でワルデン反転下に反応させて一般式■： ２ 〔式中Ｉｔｌ−Ｒ１３及びＭ＋は前記のものを表わス〕
   のペルーＯ−置換スルホンフタレイニルーβ−Ｄ−ガラ
   クトシドに変換し、かつこのガラクトシドから公知方法
   で保護基Ｈ１４を脱離することを特徴とするフェノール
   スルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドの製法。 ６、　色原物質１種又は数種、好適な緩衝物質並びに場
   合により他の常用の助剤を含有するβ−Ｄ−ガラクトシ
   ダ・−ゼを検出するための診断剤において、色原物質と
   して一般式Ｉ：２ 〔式中Ｒ１−Ｒ４は同じか又は異なっていてよく、それ
   ぞれ水素、ハロゲン、ニトロ基又はアミノ基を表わし、 Ｒ５−Ｒ１２は同じか又は異なっていてよく、それぞれ
   水素、ハロゲン、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級
   アルコキシ基、カルボキシル基又はニトロ基を表わし、 Ｍ＋はプロトン、アルカリイオン、アルカリ土類イオン
   又はアンモニウムイオンを表わス〕ノフェノールスルホ
   ン７タレイニルーβ−Ｄ−ガラクトシドを含有すること
   を特徴とするβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを検出するため
   の診断剤。 ４、付加的な助剤として、湿潤剤、酸化剤、ガーレン式
   添加物及び／又は骨格ビルダーを含有する特許請求の範
   囲第３項記載の診断剤。