JPH02226067A - 全血サンプル中のシクロスポリンａ濃度を測定するための酵素免疫検定法 - Google Patents

全血サンプル中のシクロスポリンａ濃度を測定するための酵素免疫検定法

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JPH02226067A JP89331489A JP33148989A JPH02226067A JP H02226067 A JPH02226067 A JP H02226067A JP 89331489 A JP89331489 A JP 89331489A JP 33148989 A JP33148989 A JP 33148989A JP H02226067 A JPH02226067 A JP H02226067A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は全血サンプル中のシクロスポリンＡ濃度の測定
に関する。
〔背景技術〕
シクロスポリンＡは強力な免疫抑制剤であり、ヒトでの
腎臓、肝臓および心臓同種移植片の生存の延長に好結果
をもたらす。シクロスポリンＡはある種の体液性免疫を
抑制するが、それ以上Ｋｍ！ｉＡで仲介された反応たと
えば同種移植（ａｌ、１ｏｇｒａｆｔ）拒絶反応および
遅延型過敏症を抑制することが知られている。他のシク
ロスポリンたとえばシクロスポリンＧも免疫抑制剤とし
て使用されているが、シクロスポリン人はどは広く使わ
れていない。高用量のシクロスポリン人は肝毒性および
腎毒性を生じることがあり、一方低用量では臓器拒絶を
招く可能性がある。
これらの理由から、シクロスポリンＡの投与を受けてい
る患者については反復して血中シクロスポリンＡ１１度
を監視し、以後の用量調整を行わなければならない。
血中ではシクロスポリンＡは赤血球内に分配される。シ
クロスポリンＡの分配は、血液の温度が体温から室温忙
低下すると上昇する。したがって時間や温度平衡による
分析的変動をなくすためには、シクロスポリンＡの血中
濃度の定量な全血サンプル九ついて行うのが有利である
。
現在、シクロスポリン人の全血サンプル中の濃度は放射
免疫検定法および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）を用いて定量されている。放射免疫検定法は他の免
疫検定法たとえば酵素免疫検定法に比べて取扱い、保存
および廃棄に伴う多くの問題がある放射性同位元素の使
用を必要とするので不利である。ＨＰＬＣはシクロスポ
リン人の溶媒抽出のような労力を要する操作を必要とす
るので、他の検定法に比べて不利である。
これまで全血サンプルについて直接実施できる、放射測
定法によらない、シクロスポリンＡの免疫検定法はなか
った。
酵素免疫検定法は臨床的Ｋｌｉ’な分析対象の測定に広
く使用されている。サンドイッチ免疫検定法ならびに競
合および非競合不均−系免疫検定法のよ５に、多くの様
々な酵素免疫検定法が知られている。酵素免疫検定法は
１問題の分析対象に特異的な酵素標識抗体を利用する場
合が多い。酵素標識抗体をサンプル中の問題の分析対象
と結合させ、結合酵素標識抗体または遊離酵素標識抗体
のいずれかの酵素活性を、酵素と検出可能な発色団を生
成する基質を反応させることによって測定する。結合標
識抗体から遊離標識抗体を分離して結合標識抗体の酵素
活性の測定を可能にするためには固定化された分析対象
を含有するアフィニティーカラムがしばしば使用される
。実際、抗体とのカップリングが可能で基質と反応して
検出可能な発色団を生成できる任意の酵素が酵素免疫検
定法に使用できる。
全血サンダルに対して行われる酵素免疫検定法では酵素
標識と酵素基質の選択に独特の要求がある。全血サンプ
ルは溶解した赤血球を含有するので、全血サンプルにつ
いて行われる酵素免疫検定法に用いられる酵素標識は赤
血球に対し内因性であってはならない。酵素β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼは赤血球に対し内因性ではなく。
全血サンプルについて行われる酵素免疫検定法に適当な
酵素標識である。
赤血球はソーレー帯として知られる４０５ｎｍの強力な
吸収極大を有するヘムを含有する。この４０５　ｎｍの
吸収極大はきわめて強いので５ｏｏ倍に希釈した全血サ
ンゾル１０μノの吸収の測定でも慣用の分光光度計の能
力を越えてしまう。したがって、全血サンプルに対して
行う酵素免疫検定法に使用するβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ基質は、ソーレー帯からの干渉が大きすぎるので、４
０５　ｎｍまたはその付近に吸収をもたない発色団を生
成するものでなければならない。＃素免疫検定法に最も
一般に使用されるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ基質は０−
ニトロフェニル−β−Ｄ−がラクトピラノシｒ　（ＯＮ
ＰＧ）である。しかしながら０ＮＰＧは４０５　ｎｍに
吸収がある発色団を生成し、全血サンプル釦対して行わ
れるｍ素免疫検定法に用いられる適当なβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ基質ではない。
可視領域的５６０　ｍｍ−５９０ｎｍに吸収をもつ発色
団を生成する２種類のβ−Ｄ−がラクトシダーゼ基質に
はフェノールスルホナフタレイニル−β−Ｄ−ガラクト
シ）’　（ｘｕｂｒら：米国特許嬉４．８８へ６２２号
、１９８７年５月２６日発行）およびレゾルフィン誘導
体のグリコシ）”　（ＤＫ　３４１１５７４号、１９８
５年１０月３日発行）がある。これらの基質はβ−ガラ
クトシダーゼを指示酵素として使用する酵素免疫検定法
に有用である旨記載されている。吸収の測定への干渉は
ソーレーＷＫよっては起こらないが、赤血球の他の構成
成分であるオキシヘモグロビンが５７７　ｎｍ　Ｋ吸収
極大を有する。したがって、上述の２種類のβ−Ｄ−ガ
ラクトシグーゼ基質は、オキシヘモグロビンからの干渉
により、全血サンプルに対して行われる酵素免疫検定法
に適当であるとは期待できない。
全血サンプル中のシクロスポリンＡ濃度を直接かつ迅速
に測定するための酵素免疫検定法の要求は解決されてい
ない。
〔発明の要約〕
本発明は（ａ）シクロスポリン人含有全血サンダル中の
赤血球を溶解し、（ｂ）溶血全血サンプルを過剰のβ−
Ｄ−ｆラクトシダーゼｌＩ識抗−シクロスポリン抗体と
接触させて標識抗体−シクロスポリンＡ複合体を形成さ
せ、（ｃ）工程（ｂｌで生成した混合物を固体支持体上
にシクロスポリンを固定化した固相と接触させて複合体
から非結合抗体を分離し、（ｄ）クロロフェノールレッ
Ｐ−β−Ｄ−４ラクトピラノシドおよびレゾルフイン−
β−〇−ガラクトピラノシドからなる群より選ばれるβ
−Ｄ−４ラクトシダーゼ基質を添加することによって複
合体中のβ−〇−ガラクトシダーゼ標識の量をシクロス
ポリンＡの指標として測定する各工程からなる全血サン
プル中のシクロスポリンＡ濃度を測定するための酵素免
疫検定法である。
〔発明の説明〕
本発明の酵素免疫検定法は、シクロスポリンＡの投与を
受けている患者の全血サンプル中の７クロスボリンＡ濃
度の測定に有用である。シクロスポリンＡの血中濃度の
監視およびそれに続くシクロスポリンＡ投与量の調整は
高いシクロスポリン人血中濃度によって生じる毒性作用
の防止、および低いシクロスポリン人血中濃度によって
生じる臓器拒絶の防止に必須である。
本発明は、全血サンプル中のシクロスポリンＡを測定す
るための酵素免疫検定法が予期に反して、酵素標識とし
てβ−〇−がラクトシダ−ゼをβ−〇−がラクトシ！−
ゼ基質としてクロロフェノールレツｒ−β−Ｄ−がラク
トピラノシ）’　（ｃＰＲ（））　ｔたはレゾルフイン
−β−Ｄ−がラクトピラノシｒ　（ＲｅＧ）を用いるこ
とＫよって実施できることを発見して完成されたもので
ある。
これらの２種類の基質は感度がきわめて高いので免疫検
定法にサンプルとして使用する全血の容量を著しく減ら
してもなお許容できる精密度と正確度が維持されること
が明らか忙された。
したがって、これらの基質はオキシヘモグロブリンと同
じ波長に吸収を有する発色団を生成するものの、オキシ
ヘモグロブリン吸収の干渉を最小限にするのく十分なま
でサングル容量を減少させることができる。
ＣＰＲＣ）およびＲｅ（）は多くのβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ基質のひとつとしてそれぞれ米国特許第４．６６
８，６２２号、　ＤＩｅ　３４１１５７４号中に開示さ
れている。しかしながら、上述の２つの特許に開示され
ている他のβ−Ｄ−がラクトシダーゼ基質はＣＰＲＧお
よびＲｓ（）はど感度がよくないと思われ。
このような基質を用いての全血サンプルに対する酵素免
疫検定法ではより多量の全血サンプルが必要である。サ
ンプル量が多いほどオキシヘモグロブリンからの吸収干
渉が大きくなるので。
このような吸収干渉を低減させるための手段を講じるこ
となしＫは正確忙免疫検定法を実施することはできない
。吸収干渉を低減させる一手段としては免疫検定法に際
してフェリシアン化カリクムを用い、オキシヘモグロビ
ンを、低い幅広い極大吸収を５５０〜１５００　ｎｍに
有するメトヘモグロブリンに変換する方法がある。β−
〇−ｊラクトシ！−ゼ基質としてＣＰＲＧまたはＲｅＧ
を用いる本発明の酵素免疫検定法の利点は１両基質とも
十分な感度を有し少ないサンプル容量の使用が可能で７
エリシアン化カリウムの使用を必要としないことがある
。
本発明の酵素免疫検定法は、シクロスポリンＡを含有す
る溶血全血サンプルを過剰のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
ｌｊｉｍ抗−シクロスポリン抗体と接触させて、シクロ
スポリンＡのｓｗ＆抗体との複合体および遊離標識抗体
を含有する混合物を生成させ、反応混合物を固体支持体
上にシクロスポリンを固定化した固相と接触させて反応
混合物から遊離抗体を分離し、固相を液相から分離し、
液相にβ−Ｄ−がラクトシダーゼ基質としてＣＰＲＧま
たはＲｅＧを添加して液相中の結合β−Ｄ−ゴラクトシ
ダーゼ標識の量を測定することによって実施される。
とくにシクロスポリン人を含有する全血サンプルの赤血
球は溶解してシクロスポリンＡを放出させなければなら
ない。赤血球の溶解は超音波処理、界面活性剤溶血およ
び蒸留水溶血のような多くの方法で達成できる。選択さ
れる溶血剤はβ−Ｄ−がラクトシダーゼ標識抗−シクロ
スポリン抗体と適合性のあるものでなければならない。
ある種の界面活性剤はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを変性
させるがβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ基質としてＣＰＲＧ
およびＲｅＧを用いることＫより、サングル容量を十分
に小さくできるので、界面活性剤の変性作用は最小限に
なることが明らかＫされている。好ましい溶血法では蒸
留水を使用する。
溶血後、溶血全血サンプルを過剰の／−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ標識抗−シクロスボリン抗体と接触させ、サンプ
ル中のすべてのシクロスポリンＡと標識抗体が複合体を
生成するのに十分な時間、十分な温度で反応混合物をイ
ンキュベートし【反応混合物を生成させる。これＫは室
温で通常１０〜３０分を要する。抗−シクロスポリン抗
体は市販品を入手できるかまたは公知方法で製造できる
。抗〜シクロスポリン抗体はポリクローナルでもモノク
ローナル抗体でもよい。シクロスポリン大忙特異的なモ
ノクローナル抗−シクロスボリン抗体が好ましい。抗−
シクロスポリン抗体は標準的な接合技術により、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼで標識される。
反応混合物を固体支持体上忙シクロスポリンを固定化し
た固相と、非結合標識抗体が固定化されたシクロスポリ
ンと複合体を生成するのに十分な時間接触させることＫ
より、反応混合物から非結合β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
標識抗−シクロスポリン抗体を分離する。これは通常、
約１分で起こる。固体支持体上に固定化できるシクロス
ポリンは、抗−シクロスポリン抗体と複合体を形成する
ことができる限り、本発明の酵素免疫検定法に使用可能
である。固体支持体上に固定化するのが容易なことから
シクロスポリンＣが好ましい。
シクロスポリンの固定化は多くの固定化技術によって実
施できる。固体支持体はその流動特性で選択され、ビー
ズ化デキストラン、ビーズ化アガロース、ポリアクリル
アミドまたはプラスが使用できる。本発明の酵素免疫検
定法に有用な好ましい固体支持体はＬｌ、　ｄｕ　Ｆｏ
ｎｔ　ｄｏ　Ｎｅｍｏｕｒｅａｎｄ　ｃｏｍｐａｎｙの
係属中の特許出願８Ｎ　０７１０７４，２４２号（１９
８７年７月１６日出願）に記載されている。
この出願の記載を参考として本明細書に導入する。
好ましい固体支持体は、固定化された凝集剤全含有する
ビーズ化したデキストランのクロマトグラフィーカラム
に表面にシクロスポリンを結合させた安定化二酸化クロ
ム粒子を捕捉させたものである。任意の凝集剤を使用で
きるがポリエチレンイミン（ＰＨＩ）が好ましい。ＰＨ
Ｉは約４０〜１２０ミクロンの粒子径を有するビーズ化
したデキストラン、たとえば８ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−Ｉ
Ｑ樹脂に、単純な吸着によって付着させることができる
。これは５ｅｐｈａｄａｘ　Ｇ−１０樹脂を０．１５Ｍ
リン酸す）　ＩＪウム緩衝液中ＰＥＩ　１％溶液に浸漬
させることによって達成できる。
好ましい固体支持体に有用な安定化二酸化クロム粒子は
米国特許第４．６６’Ｉ、４０８号（１９８７年４月２
８日発行）Ｋ記載されている。この記載を参考文献とし
て本明細書に加入する。これらの粒子は予め著しく表面
を縮小させたルチル型の二酸化クロムの核からなり、ア
ルミナで被覆され、さらにホウ酸塩含有シリカで被覆さ
れ、またさらにシランで被覆されていてこれにシクロス
ポリンが付着している。これらの粒子は４０〜１００ｍ
２／ｆの大きな表面積を有し、水溶液中で安定でシクロ
スポリンと容易にカップリングできる。シクロスポリン
にカップリングさせた粒子を固定化された凝集剤を含有
するビーズ化したデキストランのクロマトグラフィーカ
ラムに通し、カラム内に捕捉させる。本発明の酵素免疫
検定法における好ましい固体支持体を用いることにより
非結合標繊抗−シクロスボリンノ除去に必要なシフロス
ポリ／の量は固体支持体としてビーズ化デキストクン単
独を使用した場合の必要量に比べて３００分の１以下に
減少する。
固相を標準的な分離技術忙よって液相から分離する。好
ましい分離技術は液相な上述の好ましい固体支持体く通
して溶出する方法である。
液相中の結合β−Ｄ−ガラクトシダーヤ標識の量を測定
することによってシクロスポリンＡの量が定量される。
結合β−Ｄ−ガラクトシ！−ゼの量は、液相にβ−〇−
ｆラクトシダーゼ基質としてＣＰＲＧまたはＲｅＧのい
ずれかを添加し。
生成した発色団の量を分光測光法により５７７　ｎｍに
おいて測定することにより定量される。
本発明の酵素免疫検定法は手動で行うこともできるし、
また様々の自動化もしぐは半自動化装置、たとえばａＣ
−個別臨床分析計（Ｅ、１．　ｄｕＦｏｎｔ　　ｄｅ　
　Ｎｅｍｏｕｒａ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ、
、Ｗｉｌａｉｉｑ−Ｌｏｎ、　Ｄｅの登録商標）に適用
することもできる。
ａｅ−分析計で検定を実施する場合には装置外で全血サ
ンプルをまず溶血させ、過剰のβ−Ｄ−ガラクトシメー
ゼ標識標識シーシクロスポリン抗体レインキエベートす
る。この混合物の既知容量を装置の充填部の分析テスト
パック内に自動的に注入しくＪｏｈｎｓｏｎら：米国再
特許第２９，７２５号、１９７８年８月８日再発行：参
考文献としてこの記載を本明細書に加入する）、ついで
最ＨＡツク内容量を約５ｄにするのに十分な容量の緩衝
液を注入する。サンプル混合物を多孔性支持体上にシク
ロスポリンが固定化されている、・ぞツクヘッダー内に
配置されたカラムを通して濾過し、直接パック中に溶出
させる。溶出された分画は、全血サンプルからのシクロ
スポリンＡと複合体を形成したβ−Ｄ−ｆｆラクトシダ
ーゼ標識抗−シクロスポリン抗体を含有する。・ぞツク
には自動的に３７℃でＣＰＲＧ　４たはＲｅＧの添加、
処理が行われ、直ちに５７７　ｎｍでの吸収の測定が行
われる。
実施例 全血サンプル中のシクロスポリンＡの測定幻　固体支持
体上へのシクロスポリンの固定化シクロスポリンＣ（Ｓ
ａｎｄｏｚ　Ｌもｄ）　２５０　ｍｌＦ、４−ジメチル
アミノビリジン１４４りおよび無水コノ・り酸７０■を
無水ビリ・ジン０．８　Ｗｌｌ中に混合した。
この混合物を約７５℃に４時間加熱し、ついで混合物に
メチレンクロリＰ約′５０ｄを加えた。
生成した混合物を各回１５ｗ１ｔの１Ｎ塩酸で３回洗浄
し、ついで各回２０ｄの水で２回洗浄した。
有機層を取り、無水硫酸ナトリウム５ｆと混合し、蒸発
乾固した。得られた固体２５０りを無水アセトニトリル
１２．５−に溶解すると２０　Ｗｈ９／ｙｄのシクロス
ポリンＣ−ヘミスクシネート溶液が生成した。
上に生成したシクロスポリンＣ−ヘミスクシネート溶液
２−に２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン
−４−スルホネート（ＡｌｄｒＩＣｈＣｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）　１４　ｑおよびトリエチルアミン８μｊを加えた
。生成した混合物を室温で１時間インキュベートし、α
１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（Ｐ！（９，５）５０ｄ中ウ
シグロブリン２００りを加えると、白濁した溶液が生成
した。この溶液を電磁攪拌プレート上、室温で約１８時
間攪拌した。
溶液をリン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ　、　１０　ｍＭ　
ＩＪン酸ナトリウム、α９％食塩、ｐＨ７，０）Ｉｃ対
して透析し、出発のウシグロブリン濃度２００１１９１
５２ｇＪ？に基づいてＰＢＳでウシグロブリンα３■／
ｄに希釈した。
二酸化クロム粒子は米国特許第４．６６１４０８号の記
載に従って製造した。二酸化クロム粒子懸濁液（１０ｍ
ＭＩＪン酸緩衝液中二酸化クロム粒子５％Ｗ／ｖ−）　
２５０　ｄＫ　、上に製造したシクロスポリンＣ−ヘミ
スクシネート−グロブリン溶液２５０　Ｗｌｌを加えた
。混合物を約１８時間攪拌し。
洗浄緩衝液（１ｏ　ｍＭ　ＴＲｌ５．１５０ｍＭ食塩、
０．０５％Ｔｗａ８ｎ　２０および０．５％クロロアセ
トアミＰ）各回１１で８回、１１０１ｎリン酸緩衝液中
α１％ＢＳＡ溶液各回１１で２回洗浄した。
５ｓｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　
Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）１００ｆをＰｇＩ　５
　Ｆを含有する０゜１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
）１７．８）５００−と室温で約１８時間混合した。混
合物を各回５００−の蒸留水で５回、各回５００ｄのα
１５Ｍリン酸ナトリウムで２回洗浄して非結合ＰＥＩを
除去した。
上に製造したシクロスポリンＣ−ヘミスクシネート−グ
ロブリン−二酸化クロム粒子混合物２５ｄをＰＥＩ　−
８ｅｐｈａｃｌｅｘ　（）−Ｉ　Ｃ１（１００ｍ１）お
よびα１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１００ｄと完全に
混合した。この混合物をａｃａ＠個別臨床分析計の分析
カラム（０，５×８ｃ！ｎ、カラムあたりｔ８ｄ）に充
填した。このカラムを、ＣＰＲＧの１ｓｏ＊／ｄ水溶液
１００μ！または別法としてＲｅＧの１６〜／４ｎ−メ
チルピロリドン中溶液１８０μｌを予め水でｉ：２に希
釈して含有するａｃ−個別臨床分析計テストノｅツクの
ヘッダー内に配置した。
Ｂ）　β−ｆラクトシダーゼ基質としてＣＰＲＧおよび
ＲｅＧを使用する全血サンプル中シクロスポリンＡの測
定のための酵素免疫検定法全血にシクロスポリンＡ　（
８ａｎｄｏｚ　Ｌｔｃｌ、）を加えてシクロスポリンＡ
濃度を０．１００．３００．５００および１．　ＯＯＯ
ｎｔ／−とすることにより、様様な濃度の全血シクロス
ポリンＡサンプルを調製した。これらのサンプルを２セ
ツトに分け、ＣＰＲＧおよびＲａＧの一方を用いて以下
のように処理した。各サンプル５０μｊに蒸留水２００
μｌを加えて赤血球を分解した。各溶血サンプルの５０
μｌを取り、ついでβ−Ｄ−ゴラクトシダーゼ標識抗−
シクロスボリン抗体接合体試薬（８ａｎｄｏｚＬｔａ、
）　５　ｏμｌを加え、室温で２０分間インキュベート
した。インキュベートしたのち各溶血サンプル−抗体混
合物をａＣａ０個別臨床分析計分析テストパックに自動
的に注入し、パックヘッダー内のカラムを通して溶出さ
せた。各サンプルに続き１１５Ｍリン醗ナトリウム（ｐ
Ｈ７，８）２ｇｊを加えた。カラム流速は５４μ仲とし
た。ノぜツクについで注入針位置２（これはカラムの副
路を通る）Ｋさらに水２．９Ｒ１を充填した。基質（ｃ
ＰＲＧまたはＲｅＧのいずれか）はプレーから／ミキサ
ー■から約五７分後に放出した。基質の添加後２９秒お
よび４６秒Ｋ　５７７　ｎｍで吸収を測定した。全血中
の各シクロスポリンＡ濃度についてｍＡ／分で示した吸
収速度を表に示す。
表 表から明らかなようにβ−Ｄ−がラクトシダーゼ基質と
してＣＰＲＧおよびＲｅＧを用いた場合吸収速度ＣＤ）
Ａ／分）は全血中のシクロスポリンＡ濃度比例した。シ
クロスポリンＡｌｎνｄあたりの吸収速度が大きいこと
から明らかなようＫ、ＣＰＲＣ）の方が感度は高いが両
基質とも慣用の分光光度計を用いた全血サンプル中のシ
クロスポリンＡ１１度の精密かつ正確な測定に適当な感
度を示す。
以上１本発明の詳細な説明したが、本発明はさらに次の
実施態様によってこれを要約して示すことができる。
（１）　　（ａ）シクロスポリンＡ含有全血サンプル中
の赤血球を溶解し、（ｂ）溶血全血サンプルを過剰のβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗−シクロスボリン抗体と
接触させて標識抗体−シクロスポリンＡ複合体を形成さ
せ、（ｃ）工程（ｂ）で生成した混合物を固体支持体上
にシクロスポリンを固定化した固相と接触させて複合体
から非結合抗体を分離し、（ｄｌクロロフエノールレツ
ド−β−Ｄ−ガラクトピラノシｒおよびレゾルフイン−
β−Ｄ−がラクトピラノシＰからなる群より選ばれるβ
−Ｄ−ｆｆラクトシダーゼ基質を添加することＫよって
複合体中のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識の量をシクロ
スポリン人の指標として測定する各工程から構成される
全血サンプル中のシクロスポリンＡ濃度を測定するため
の酵素免疫検定法。
（２）固定化されたシクロスポリンはシクロスポリンＣ
である前項（１）記載の免疫検定法。
（３）固相は固定化された凝集剤を含有するビーズ化デ
キストランであり５表ＷＩ＃ｃシクロスポリンが結合し
た安定化二酸化クロム粒子が捕捉されている前項（１）
記載の免疫検定法。
凝集剤はポリエチレンイ ンである前項（２） 記載の免疫検定法。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. （ａ）シクロスポリンＡ含有全血サンプル中の赤血球を
    溶解し、（ｂ）溶血全血サンプルを過剰のβ−Ｄ−ガラ
    クトシダーゼ標識抗−シクロスポリン抗体と接触させて
    標識抗体−シクロスポリンＡ複合体を形成させ、（ｃ）
    工程（ｂ）で生成した混合物を、固体支持体上にシクロ
    スポリンを固定化した固相と接触させて複合体から非結
    合抗体を分離し、（ｄ）クロロフエノールレツド−β−
    Ｄ−ガラクトピラノシドおよびレゾルフイン−β−Ｄ−
    ガラクトピラノシドからなる群より選ばれるβ−Ｄ−ガ
    ラクトシダーゼ基質を添加することによつて複合体中の
    β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識の量をシクロスポリンＡ
    の指標として測定する各工程から構成される全血サンプ
    ル中のシクロスポリンＡ濃度を測定するための酵素免疫
    検定法。
JP1331489A 1988-12-23 1989-12-22 全血サンプル中のシクロスポリンａ濃度を測定するための酵素免疫検定法 Expired - Fee Related JPH0737983B2 (ja)

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