JPS60218397A - レゾルフイン誘導体のグリコシド、その製法及びこれを含有するグリコシダーゼ検出のための診断剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グリコシダーゼは人間及び動物組舐中で多（の生理学的
なはたらきをする。すなわち例えばβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼは炭水化物代謝において、乳糖の加水分解を行な
うので、重装な役割をする。更にβ−Ｄ−がラクトシダ
ーゼは棚１Ｊｌｒ質、ムコ多植類及びＪ蛋白質の分解の
際の鍵酵素である。その他の生理学的に嵐安なグリコシ
ダーゼとしては次のものが挙げられる：α−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、α−り一及びβ−Ｄ−グルコゾダーゼ並び
にα−Ｄ−マンノシダーゼ。

グリコシダーゼ昏工その生理的な重弱な鋤らきの他に近
年は診帖的並びに生物工学的範囲で車装になって釆だ。

すなわち例えばこれらの酵素は増々酵素免疫分析のため
の指示−酵素として使用される。この関係ではβ−Ｄ−
ガラクトシ利 ダーゼが特に有理である〔Ｖ／ＩＩえばアナルス　オブ
　クリニカル　ビオケミストリイ　Ａｎｎａｌｓｏｆ　
Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｍ　１
６巻、第２２１〜第２４０頁（１９７９年）参照〕。

従ってグリコシダーゼの活性の測定は、臨床化学におい
て、並びに診断学において増々車装である。そのために
極めて一般的にはグリコクダーゼ含有の試料に適当な基
質を混合する。基質は酵素により分解される。分解生成
物の１４重を適当な方法で検出する。酵素の作用により
遊離したグリコン又はアグリコンを測定することができ
る。普通は後者が測定される。

基質としては屡々検出すべき酵素の天然基質が適する。

しかしながらそれにおけるアグリコンが分光的に容易に
検出可能な基であるグリコシドを特に有利に使用する。

従来の技術 グリコクダーゼによる分解後に、アグリコンを分光的に
ＩｊＪ視又は同様に紫外機−範囲で、並びに螢光分析的
に測定することができる一連のグリコシダーゼ−基質が
公知である。

すなわち、ビオケム（ＢＬｏｃｂ’ｅｍ、　Ｚ、　）第
６６６巻、２０９頁（１９６０年）に、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼの基質として、フェニル−β−Ｄ−ガ２クト
シド並びに若干のその他の芳香族環に置換したー導体（
例えば０−二トロフェニル−及びｐ−二トロフェニルー
β−Ｄ−ガラクトクド）が記載されている。加水分解に
より遊離されるフェノールは測定的に紫外線範囲で、も
しくはニトロフェノールを短波の可視波長範囲で測定す
る。指示反応として酸化縮合をアミノアンチピリンで接
触させることもできる〔アナリテイカル　ビオケム（八
ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第４０巻、第
２８１頁（１９７１年）〕。

組峨化学的検査にナフチル−β−〇−ガラクトシドを使
用する、すなわち例えばヒストケミイ（Ｈｔｓｔ、ｏｃ
ｈｅｍｉｅ　）　！　５５巻、第１９９貞（１’／７３
年）では１−す７チル一化合物、ゾエイ、ビオル、ケム
、　（Ｊ、　ＢＬｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、）第１９５巻、
第２６９頁（１９５２年）では６−ブロム−２−す７チ
ル一紡導体又はヒストケミイ（Ｈｌｓｔ、ｏｃｈｅｍｉ
ｅ　）第６７巻、第８９頁＜１９７５年）ではナフトー
ル−β−Ｄ−ガラクト７ドであや。可視化のためにその
際生成するす７トールを檎々のジアゾニウム塩と反応さ
せてアゾ−色素にする。

一発螢光基質での酵素活性測定は、測光的方法に比して
螢光計測定の感度が屡々数１０％程増加しているので普
及している。多（の場合に、例えば細胞分化のために自
動装置を用いて＃ｌ＠中の酵素活性を検査する際に（細
胞螢光法）、並びに流過微螢光法での非可動酵素の分析
の際に発蛍光基質で処理すべきである。その他の場合に
は、例えば試験系の酵素的４７ｉ付けを定める際に（酵
素免役分子ｒ）、発蛍光基質の使用により酵素触媒の相
乗効果が著しく強化される。

従来公知のβ−Ｄ−ガラクト７ダーゼ及びその他のグリ
コ７ダーゼのための発蛍光基質は元螢光団としてフルオ
レセイン、インドキクル又の化合物は重大な欠点を何す
る。フルオレセインの二置換−導体は多段階の反応経過
で加水分離される。−置換フルオレセインーグリコシド
雑にする一連の化学的変換物の基になる。メチルウンベ
リフェロンの誘導体は、紫外線で励起させなければなら
ない。この隙生物学的又は合成の物質の固何−元か妨イ
し潜る。更に紫外線−励趙は、特にレーず一元学におい
て、経費がかかる。殆んどの発螢元基質は、極めてわず
かの全く良好な浴屏注が必要である）適さない。

従って更に、基質を用φて個々のグリコクダーゼを間車
で、速やかなかつ嬶実は方法で測定することができかつ
できれば副光的にも並びに螢光分析的ｌよ一１］定方法
でも使用出来る基質への必装註が生じてきた。本発明の
課題はこの訣求を一足させることにある。

この課題は、グリコ７ダーゼにより棚成分及びレゾ曳フ
ィンー誘導体に分離することができる１ｒ風のレゾルフ
ィン−誘導体のグリコシドにより解明される。後者は良
好に水―注の化合物であり、これは可視範囲で良好に測
定６丁能な吸収を示し、かつ更に容易に励起して螢光を
発する。

従って本＠明の目的は、一般式１ａもしくは１ｂ： 〔式中Ｒ１は水素原子を茨わし　ＲＦ　、Ｒ３及びＲ５
は同じか又は異なっていて良（、水素原子、ハロゲン原
子又は低級アル中ル基な表わし、Ｒ′及びＲ６は同じか
又は異ｌよっていて艮（、水素原子、へ口ｌ’ｙ原子、
レアノ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボ
キシ基、低級アルコキクカルボニル基、カルボキシ低級
アルキル基、低級アルコキク力ルボニルー低級アルキル
基又は場合により一置侯又は二置換のカルホキ丈ミド基
又は基ニ ーＣＯＯ−（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ−Ｒ’（基或中Ｒ７は
水素原子又は低級アルキル基を表わし、かつｎは１〜４
０′４数を表わす）を表わし、このＩＩＡ　Ｒ’は付加
的にスルホニル基又はニトロ晶であって良く、かつＹは
ｄＸｋ子又は基：Ｎ→０を表わす〕のレゾルフィン−妨
導体のグリコシげである。

一般式Ｉのレゾルフィン−ｖ；導体のグリコシドは新規
の化合物である。これは炭水化物化学から自体公知の方
法により装造することができるＯ 殊に旬体公知の方法で互変異性の一般式１ａ及びＩｂ： 〔式中Ｒ１〜Ｒ６及びＹは前記のものである〕のレゾル
フインーー導体を１単楯褪又は少ａｉ斌又はその１−ハ
ロケ９ノー＃尋体（この際そのつと竺てのヒドロキシ基
は炭水化物化学で常用の保−基で直侯されている）と反
応させて、過−〇−直爽のグリコ７ドにし、これから自
体公知の方法で保−基を離脱することにより一般式Ｉの
レゾルフィン−妨導体のグリコ７ドを潜る。

弐Ｂの化合物と過−〇−直侯の１−７１０グツ　へ−ｆ
＠類との反応は殊に咳受答体、例えばアルカリ金属水醒
化吻又はアルカリ並属炭咳塩の存在で、水性アセトン中
又は（４ｕ＄’行条件下で）水／ベンゾールー混合物又
は水／クロロホルムー混合物中で行なう。

更にこの方法は、一般式Ｂのレゾルフインーー導体を先
ずアルカリ金椙水酸化物又はアルカリ金属アルコラード
を用いてアルカリ金ｆ４塩に変えるかもしくは場合によ
り置換したアミンを用いてアンモニウム塩に変え、かつ
これを次いで双極性の中性浴剤、囲えばアセトン、ジメ
チルスルホキシド、ジクロルメタン、テトラヒドロフラ
ン又はジメチルホルムアミド中テ過−０−置埃の１−へ
ロｒノー砧−と反応させることにより実施することがで
きる。

更に、一般式Ｈのレゾルフィン−＠導体及び過−〇−眠
咲の１−ハロク４ノーｍ胡からの過−〇−匝良のグリコ
７ドの合成の際に、単一の訳塩又は−塩の混合物（赦化
鐵、戻改訣、セライ）　（Ｃｅ１ｉｔ、ｅ　）上の戻酸
赦、シルパートリル−ト（−とｒｔｆｌａｔ　）、テリ
チルば故）及び／又は単一の水駅塩又は水銀基の混合’
１ｍ（共化水舐１７アン化水銀、酢酸水銀、酸化水銀）
の自加が、場合により乾燥剤、■えば塩化カルシウム、
分子ふるい又は無水威濯カルシウムの使用下で、浴剤、
例えば塩化メチレン、クロロホルム、ペンゾール、ドル
オール又はゾオキテｙ中で、適切であることが判明した
。α−１畝合のグリコ７ドの合成には有利に一般式Ｂの
化合物を、そのヒドロキシ基が保−基で、特に有利にア
セチル基で置換されている４１ｉ＃Ｉと、ルュイス酸、
例えば西塩化錫、塩化アルミニウム、殊に塩化亜鉛の存
在で溶融させる〔ケミ、ベル、　（Ｃｈｅｍ。

Ｂｅｒ、　）　第６６巻第３７８〜３８３貞［：１９３
３手］及びメリーズ　イン　カルボヒドル、ケム。

（Ａｖｅｒ、ｈｏｄｓ　ｔｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　
Ｃｈｅｍ、　）　第２巻、第２巻、第６４５〜６４７貝
〔１ソロ７年〕参照〕。

この際１度は８０℃〜１５０’（３，有利に１１０°Ｃ
〜１６０Ｇで選択される。

こうして優られる一般式Ｕのレゾルフィンーー導体の過
−ｏ−ｔｉｎｓのグリコシドは同様に新規の化合物であ
る。

過−〇−一置のグリコシドの保護基を分離して一般式１
のグリコ７ドにすることは炭水化物化学において慣例の
方法により〔例えばアトパンセス　カルボヒトレート　
ケム（Ａｌｖａｎｃθ５Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃ
ｈｅｍ、　）　第１２巻、第１５７頁（１９７５年）参
照）、例えばアクルー保譲基の場合にはナトリウムメチ
ラート又はバリウムメチラート又はメタノール中のアン
モニアを用いて実施する口 Ｒ１、、Ｒ７の定義におけるハロゲノとは、％素、塩素
、臭素及び沃素、殊に塩素及び臭素である。

Ｒ１−Ｒ６の定義における”低級アルキル基１は炭素原
子１〜５個、妹に１〜６個有し、との猷メチル基が特に
有利である。

Ｒ４及びＲ６のに義における″低級アルコキク基１は炭
素原子１〜５１固、殊に１〜３１ｔ！Ｉ有し、この際メ
トキシ基が特に有利である。

直換：４Ｒ４及びＲ６の定義における低級アルコキク力
次ボニル−、カルボキク−低級アルキル−並びに低級ア
ルコキシカルボニル−低級アルキル−基の１低級アルコ
キシー“もしくは１低級アルキルー１基は同様に炭素原
子１〜５１固、殊に１〜６個有し、この際メトキクー基
もしくはメチレン−基が特に有利である。

“炭水化物化学で常用の保護基“として、ノ侍にアセチ
ル−、ベンゾイル−、ペンシル−又はトリメチルクリル
−基が適する。

カルボキサミド基のｉｔ換基として、アルキル−、アル
コキシアルキル−、カルボキンアルキル−及びアルコキ
シカルボニルアルキル基がこれに該当し、この縁アルキ
ル基はそのつと炭素原子１〜５１ｔＡ、殊に１〜６−何
する。二置換のカルボキサミド官能基においては、両ｋ
ｆｉ基が閉域して、ヘテロ原子、例えば酸素原子、望素
原子及び眺黄Ｍ”ｌ’；で遮断されて良い環を形成し優
る。

一般武田のレゾルフィン−誘導体で一般式Ｉのグリコシ
ドに結合しているグリコシド基としては、相応するグリ
コシダーゼにより再びレゾルフィン−基礎構造から分離
される全ての単棚頒及び少４Ｍ類が適する。本発明によ
るグリコシドの例としては次のものが挙げられる：β−
Ｄ−ガラクトビラノ７ド、α−Ｄ−ガラクトピラノシド
、β−〇−グルコピラノ７ド、α−Ｄ−ゲルコピ２ノシ
ド並びにα−Ｄ−マンノピラノシド。

グリコシド基としては、サツカリド鎖を分離する酵系に
より単一もしくは少−書類の段階にまで分解されるオリ
ゴ−瑚鎖も通し、その単一もしくは少−循膿はその側で
相応するグリコシドと共に、＠厳しゾルフィンー基礎構
造から分離することができる。かかるオリゴ−砧鎖とし
ては物に単楯−単泣２〜１０．特に２〜７から構成され
ている鎖である。

もう１つの本発明の目的は互変異性の一般式ｎ／ａ及び
川′ｂ＝ 〔式中Ｒν〜Ｒ６／は１直換基Ｒ１〜Ｒ６と同じもので
あり、この際Ｒ”〜Ｒ６′は全てが同時に水素原子を表
わすことは出来ず、かつＹは前記のものである〕のｌＲ
ｍの化合物である。

この化合物はＩｒ規である。これは本発明による一般式
１のレゾルフィン−誘導体のグリコンドの製造のための
中間生成物として特にＡｉ−る。

一般式Ｂ′の化合物は、公知のレゾルフィン（式中Ｒ１
〜Ｒ６がそのつど水素原子な表わ丁一般式Ｈの化合物）
の製造に適している方法と同様にして製造される。

一般式Ｂ′の化合物は有利な方法で、一般式ｍ：〔式中
ＲＪ／〜Ｒ３／は前記のものである〕のニトロソレゾル
シン−誘導体を、一般式ＩＶ：Ｒ′ ［式ｃｐ　Ｒ”〜Ｒ５／は前記のものである〕のレゾル
シン−誘導体とパイロルース鉱及び誠厳の存在で低温で
反応させることにより製造する。その際先ず、式中Ｙが
Ｎ→〇−基である一般式Ｂ′の化合物が生成する。この
物質はアンモニアの存在で亜珀、末を用いて容易に式中
Ｙが堅木原子を表わす一般式田′の化合物に変換するこ
とができる。

一般式■の化合物と一般式１ｖの化合物との反応は通例
１ｓ−１０’Ｄ　〜５００ｓ　殊ニ０’Ｏ〜３０℃の一
度で実施する。一般式ｍ及び一般式■の物質を約０℃で
混合し、かつ反応混合物を引続き至温に加熱する場合に
、反応は特に欅やかに経過する。パイロルース鉱の濃度
は有利に０．５〜５、殊に１〜２モル／ｌでなければな
らない。

眺酸磯夏は０．５〜５、殊に１〜６モル／ｌでなければ
ならない。

式中ＹかＮ→〇−基である一般式ｌ′の化合物の一式中
Ｙが鼠疾原子を表わ１−一般式１′の化合物への還元は
妹にアンモニア注ｍ液中で亜鉛末？用いて実施するにエ
ッキ寺著、（Ｎｉθｚｚｋｉ）、ベル、ドイチュ、ケム
、ｒス、　（Ｂｅｒ、　Ｄｔｓｃｈ。

Ｃｈｅｍ、　Ｇｅｓ、　）　ｊａ　２２巻、１Ｉ３０２
０貞［：１８８９年コ参照）０ｍ剤として有利に水−ア
ルコール−混合物、殊にメタノール０〜４部と共に水１
　１都よりなる混＠ｒ物を使用する。還元すべき物質１
モルにつき亜鉛末１〜２０．妹に１〜５モルを少巌ずつ
カロえる。この際反応耐液の一度は−ｉｏ’ｃ〜＋３５
’Ｏ，殊に＋５℃〜＋１０°Ｃで保つ。温度範囲を正確
に保持することは明白な反応経過に不ｔｊ（矢なことで
あると判明した。冷却なしでは発熱反応が起り、分離し
難い副生成物が生じる。

選択された穏和な条件下で、一般式■及び一般式１ｖの
吻貞の同の反応は明白に、かつ良好な収率で経過１−る
。Ｊ７！Ｓ択された合成方法は変えることができる。こ
れは特に非対称に置換したレゾルフィン−もしくは同様
にレゾアズリン−誘導体の装逍に１先して数多くの合成
ｏ）面性をもたら′丁。

式中Ｒ４／又は／及びＲ６′が低級アルコキクカルボニ
ル基、場合により一置換又は二置換のカルボキサミド基
、又は基−ＣＯＯ−（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ−Ｒ’を表わ
丁式ｌ′のレゾルフィン−誘導体は有利に一般式Ｖ： 〔式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ５は前記のものであり、
Ｒ″′及びＲ６“はカルボキシ基を表わし、かつＲγ“
は水素原子又は低級アルキル基な表わす〕のトリアクル
化ジヒドロレゾルフィンを介してＪＡ造される。

カルボン酸−１能は文献で公知の方法により、例えば塩
化オキチリル／　ＤＭＦ　Ｘは塩化チオニル／　ＤＭＦ
をｍ９て数基化物に変換し、これから任意のアルコール
及びアミンとの反応により相応の置換したカルボン酸エ
ステル−もしくはカルボキサミド−誘導体が優られる。

こうして潜だ一般式ｍのアセチル化誘尋体を可曲アルカ
リｍ液、有利に苛性ソーダｍ′ｌｆｉ、又は苛性カリｓ
ａｏ、ｉ〜５Ｍで、又はアンモニア水１〜１５Ｍ及び酸
化剤、有利にヘキサクアノ鉄（１）　ｆｉカリウムで、
水浴性の有機溶剤、゛例えば１．４−ジオキサン又はメ
タノールの添〃ａ下に処理することにより相応する一般
式Ｂのレゾルフィン−誘導体が痔られる。

アルコール成分としては原則的に全ての可能なアルコー
ルが適する。特にジエチレングリコール−モノエチル−
エーテル、トリエチレングリコール−モノエチル−エー
テル又は間車なアルコール、例えばメタノール又はエタ
ノールが有利である。アミン−成分は同様に全ての可能
なアミンから選択されて良匹。特に極性基を有するアミ
ン、例えばモルホリン、メトキクエチルアミン又はグリ
シンアミド又はアンモニア、−級又は二級低級アル中ル
アミンが蕾利である。

更に、常法で保−されたカルボキシル−官能を有するア
ミノカルボン酸、囲えばグリシン−第三ブチル−エステ
ル、グリシンペンシルエステル又はＮａ−ＢＯＣ−リジ
ンメチルエステルを使用することかできる。こうして保
譲基の分ｓｍ。

脂肪族カルボン戚−官能を有するレゾルフィン襲もしく
はレゾルフィン−グリコンドｌが潜られる。

一般式量のアセチル化ゾヒドロレゾルフインは、相応す
るレゾルフィン又はレゾアズリンから、強還元剤、例え
ば塩化錫（ｆｌ）又は酢酸クロム（１）との反応により
、又は電気化学的還元及び引＠φてのアセチル化により
帰られる。還元のためにレゾルフイ／又はレゾアズリン
を５〜３５％の水性塩酸中塩化錫（朋）２〜１０当磁、
有利に２〜６当瀘と共に１０分間〜１時間加熱する。冷
却するとジヒドロ化合物が析出する。

アセチル化は常法で無水酢酸で行なう〇一般般式の化合
物は−ｄ器方法で還元的アセチル化により有利に製造さ
れる。相応するレゾルフィン又はレゾアズリンは塩化１
ｍ（ｎ）２〜６当皺と共に５分間〜５時間、有利に１０
分間〜６時間無水酢酸中還流下に〃０熱するか、又は塞
謳（ＲＴ）におｉて４〜１６時間攪袢する〇 一般式量のレゾルフィン−誘導体のグリコシドの合成の
除には、非−螢光化合物が生、成１、これから相応する
グリコシダーゼを用−て１ｍ素的分解により再び螢光の
レゾルフィン−騨６体が遊離す６６本本発明よる＠螢光
団のレゾルフィン−誘導体は従来公矧のその他の発色団
もしくは発蛍光団の基のグリコ７ドに比較して極めて有
利な特注を示す。−置美鱒４体としてこれは酵率的〃口
水分解の動力学を示し、これは極めチー単にミバエリス
−メンテン一式により記載され帰る。レゾルフィン−β
−Ｄ−ガラクトピラノシドには例えばミノ１エリスー２
ａｘＭ＝Ｌ１．３８ミリモル／！があてはまる。天然の
基・貨乳糖によりこのカロ水分解の阻ｇは韓争であり一
従って−ｉの横置にはレゾルフィン−肪辱体のグリコ７
ドの天然グリコシド、例えばβ−〇−ガラクトクダーゼ
の場合には乳糖の冷加による特別な変臭か限定されかつ
−Ｉ逆的に変化され優る。

本発明によるレゾルフィン−誘導体のグリコシドは水、
酸液中で＋４０で実画に無限に安定である。レゾルフィ
ン−基社構造のグリコシドの溶解性はずでに殆んどの動
力学的目的に十分間に合う。カルボン酸エステル、惨注
基もしくはスルホン酸基を有するカルボｙｖ−−導体は
相応するグリコシドの餅Ｊ拌註をなお実際に改良させる
。

本発明による生成物のｗＪ起及び放射はＨ７視スペクト
ル屹囲で十分な繊子収針である。レゾルフィンの最嶋螢
光圃匿は…−匝７．０以上で達し、より低−一一直につ
いては少し１゛つ降ドする。

レゾルフィンのグリコシドは水ｒｆｌ　Ｍ、中で殆んど
帝藏色である（約４７０　ｎｍでλｍａＸ　）。＃素反
応の後に生成物はポ色を示しく約５７０　ｎｍでλｍａ
Ｘ　）　、従って物置は元度副定及び非−′ａ械的な視
覚的方法に同様に卓越的に適している。

本発明りもう１つの目的はＪｔｈｒ規の一般式１のレゾ
ルフィン−＠４体のグリコ７ドを相応するグリコ７ダー
ゼ、例えばα−Ｄ−及びβ−Ｄ−カラクトシダーゼ、α
−Ｄ・−及びＩ−Ｄ−グルコ７ダーゼ並びにα−Ｄ−マ
／ノシダーゼの活性の測定のため罠使用することである
。

式甲グリコシドー基がオリゴーーー咽である一般式１の
レゾルフィン−騨導体は、糖鎖を分離する＃累、同えば
α−アばラーゼの横細にも特に適する。この猷オリゴー
瑚顧は横矧すべき酵素により特有の方法で妹に単楯類の
段階にまで分ｔｍされ、その際必較の揚台にはその池の
補助酵索を使用することができる。次いでこれは相応す
るグリコ７ダーゼにより前記の方法でレー解 ゾルフィン−基礎構造及び車楯譲に分崎される。

更に、府ｒ規の一般式Ｉのレゾルフィン−−４体のグリ
コシドをざ有するグリコクダーゼ活注測定のための診−
を剤か待針請求される。グリコシダーゼのための基質と
して一般式１のレゾルフインーー導体のグリコ７ドの使
用は明らかに従来公知であるそれよりも梢ＷＩな試験方
式である。ｌｒ規の基質はグリコシダーゼの活性−足の
ために有利に生物化学的、生物工学的並びに４床−化宇
的頂域で使用され得る。これはより精密であ句。それか
ら多くの利点か生じる＝ａ）より少ない酵素−１古性を
測定することができるＯ ｂ）より少ない址の試料を使用することができるＯ Ｃ）曲性の測定は著しくより短時間で行なうことができ
る。

ｄ）少ない試料装入及び有利な測だ波長は更にその他の
試料成分による方法の妨吾感受注を減少させる。

ｅ）也体母体中の菱侠を非ｏＪ動醇素で伸ｊ定すること
かできる◎ ％　ｆｆ　請求した基質は各素性のグリコシダーゼの油
性を測定するのに適していることが示された。本発明に
よる一般式１１７）基質を有する診断剤Ｖ工従来公知の
試験剤よりも明らかに精密に反応する◎ 一般式１のレゾルフィン−ｖ／ｊ４体のグリコシドは免
便学的測矩法にも通し、その際グリコクダーゼは１目示
−酵素として使用され、そのＩ古注　へは免投学的反応
の実施により罐められねばならない・かかるｈｌ　ｇ　
ｉｄ示反応での免役学的測定方法は、当業者には酵素免
役分析として仰られている。この方法は蛋白質、多糖類
、ホルモン、医薬品及びその他の低分子物質の濃度を１
０−５〜１ｏ−１８モル／ｌの範囲で測定するために用
いる。相分離処理の必映に応じて均質及び不均質試験操
作の区別をする。もう１つの分層は競争及び非韓す試験
原理において行ない潜る。

しかしながら全ての試ｌ！ＩＩｔ原理は酵素−机原一も
しくは酵素−抗体一歳合体で操作する。酵素指示反応は
全ての酵素免役分析に共通である。

かかる目的に適当な指示酵素は丙えはグリコ７ダーゼ、
時にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである。

かかる酵素免役分析におけるグリコシダーゼの測定は通
しリ、適当な基質を１１Ａ７１Ｉ］シ、酵素的に分解し
１かつ常法で測光的に又は同様に螢光測定することによ
り行なわれる。

従ってグリコシダーゼ−試験系の教書はかかる酵素免役
分析における著し一利点にもつながる： １、　より尚い梢密注はこの場合も更に検出限界の低下
、より短かい反応時間及びより少ない試料装入及びそれ
によりその他の試料成分によるより少ない妨害なり能に
する。

２、　より有利な測定波長は一定の反ＬＦＳ実施におい
て不溶性の成分による、例えば懸濁による方法の妨曹感
受注を減少させる。

診断剤は本発明による一般式ｌの基質１楯又はそれ以上
の他に、適当な緩＃敢系並びに場合によりその池の適当
ながかる診断剤に常用の皐加物、例えば湿潤剤、安定剤
寺を含有する。診ＶＩＩｉ剤はｍ液の形で、凍結乾譲物
として、粉末混合物として、試薬錠剤又は奴収Ｊ能な支
持体上に付層されて存在して良い。

耐液や形の本発明による診−ｉ剤は殊に試験に必敦な全
ての試薬を含有する。ｍ剤としては水又は水溶性の有機
浴剤、例えばメタノール、エタノール、アセトン又はジ
メチルホルムアミドと水の混合物がこれに該当する０女
定注の理由から、試験に必装な試薬を２橿又はそれ以上
の醗液に分配することが有利であり、これらのｍ液は実
際の横歪の原にはじめて混合される。

そのつと約５〜２０ダ、殊に約１０Ｉ１１ｙの総亀蓋で
凍結乾燥物の形の診断剤を製造するために、試験に必決
な全試薬の他に常用の賦形剤、例えばポリビニルピロリ
ドン、及び場合によりその他の充科、飼えばマンニット
、ンルビツ）Ｒはキシリットをｔ何する溶液を乾燥する
。

粉末混合物又は試４錠剤の形の診断剤は、試験成分を常
用のガレヌス添加物と混合し、積粒化することＫよって
ｄ造することができる。この種類の添加物は例えば抛ア
ルコール、例えばマンニット、ソルビット又は′キシリ
ット又はその他の的注の不活性化合物、例えばポリエチ
レングリコール又はポリビニルピロリドンである。

粉末混合物又は試乗錠剤は一般にＭ終慮敏約６０１１１
＆　〜２００ｍｙ％　ｄＫ５０１１ｆ　〜８０ｍ＆であ
る。

試験チーブの形の診断剤の製造には、吸収ｏＪ能な支持
体、殊に繊紙、愼維素又は合成愼維フリースをい、易揮
発性の浴剤、例えは水、メタノール、エタノール又はア
セトン中の、試験チーｆ−の製造に常用の必要な試薬の
溶液で、牙反させる。これは１含浸工程で行なわれてよ
＾。しかしながら屡々、言浸を数工程で実施することが
有利であり、この際そのつど診向剤成分の一部分な含有
する溶液を使用する。すなわち例えば第１工程では緩衝
板及びその他の水浴性の麻〃口物を含有する水溶液で言
浸し、次いで第２工楊でグリコクダーゼ−基質を含有す
る浴液で含有することができる。完成試験紙はそのもの
として使用する又は自体公知の方法で悄仏物に接層させ
るか、又は殊に西ドイツ国特ｆｆ　＠２１１８４５５号
明細簀に依るグラスチック及び目のつんだ網状物の間に
ｗ、膚させることができる。

本発明による化付物の合成のために実施することができ
る数掻くの植々の方法の若干、並びに実例としてグリコ
シダーゼｒｔ３注測定のための新規のレゾルフィン−ｄ
４体のグリコシドの使用を次の実施例につき示す。しか
しながらそれらは本発明の目的の限定を意味す金もので
はな一〇 実施例 同　１ ａ）レゾルフィンの製造 レゾルフィンを、良好な純度で市販で潜られるその酸化
生成物レゾアズリンから、二二ッキ（Ｎ１ｅｔｚｋｉ　
）咎の記載に依り〔〜リヒト・デル・ドイチェン・ケミ
カル　ｒゼルゾヤフト（Ｂｅｒ。

Ｄｉ、ｃｈ、　Ｃｈｅｍ、　Ｇｅｓ、　）　第２２　舎
（１８８９年）第６０２０〜６０６８貞〕−造する。こ
のためにレゾアズリン（フル力（Ｆｌｕｋａ　）　、７
’ツハス（Ｂｕｃｈｓ　）、スイス（ＳｃｈｗｅＬｚ　
）　）　Ｉ　Ｌｌ　１１　（４３ミリモル）ヲビーカー
中で２５％のアンモニア溶液５０！ＩＬｌ、６７％の亜
硫酸水系ナトリウムー俗ｅ、２５　ｄ及び水５０ｍと共
に３０分間沸騰水ｆ合上で加熱する。再びアンモニアｍ
液２０ＩＩＬｌ。

亜滅鍍水系播−浴液７　ｕｒｌ及び水２０１１Ｌｌを礒
加し、更咥６０分間加熱する。変換は青色から赤色への
変色で、又は薄層−クロマトグラフィーな介して一＠す
ることができる。反応が完全に梃子した後に、６２％の
ｆ４ｍ液ＩＱｍＪを加え、−５にする。反応浴液を１日
冷献庫中に放置する。

その後に褐色の沈殿を吸引濾過し、水冷の塩酸ｍ液でｐ
Ｈ４にし、洗浄し、１１０’Ｏで乾燥する。

収激７−８．９　（５６，７ミリモル；埋ｌ！１ｉ１１
［の８５％）。

ｂ）　レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドへの
レゾルフィンのグリコジル化 テトラアセテートの中間段階を介してフェノール性ヒド
ロキシル基へのグリコクル化は欠の方法により成功した
。倣扮木のレゾルフィン２．１３＃（１０ミリモル）、
アセトプロモーα−ローガラクトース〔シグマ（Ｓｉｇ
ｍａ　）ミュンヘン］　４．１２１１Ｊ　（１０ミリモ
ル）、酸化銀（１）〔フル力（Ｆｌｕｋａ　）、ブッハ
ス（Ｂｕｃｈｓ　）　、スイス］１．１６．９（５ミリ
モル）、眺酸カルシウム（ＣａＳＯ４・”Ａ　Ｈ２Ｏ”
無水ｍｌＣ酸カルクウム）５ｙ５粒状沃系若干址及びキ
ノリン５０μｌを塩化メチレン５０ｍ１中で室温で４０
分間撹拌する。

この際レゾルフィンの４０％がレゾルフィン−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドーテトラーアセテ−トに変換する。

反応のｔＡ整は再び薄層−クロマトグラフィーに依り実
施されてよい。固体成分を襞付きｌ１Ｍ過器及び遠心分
離を介して分離した後に塩化メチレンを回転蒸発器中で
除去する。

レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド−テトラ−
アセテートは褐黄色のシロラグ状物として残留する。収
量約２ｇ（理論値の６５％）。

レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド−テトラ−
アセテート２Ｉをそれ以上の梢裏なしに無水メタノール
ＢＱｍ中に収り込む。ナトリウム０．５Ｉを小片ずつ、
水浴中で無水メタノール２Ｕｔｎｌ中に溶解する。水浴
中で攪拌下でメトキシド溶成６〜８ｄを６０分＋ＩｊＪ
以内に１ｄずつレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトビラノ
クドーテトラーアセテート−Ｍ液に加え、かつ脱アセチ
ル化を薄層クロマドグシフイーを介して観察すり。生成
した燈色のレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトビラノクド
を吸引濾過し、かつ水冷のメタノール少量で洗浄する。

収ｊｉｔ？ＦＪ１＃祖物減（理請櫃の７０％）。メタノ
ールから再結晶させ、次いで乾燥（６０”０以上になら
ない）して純粋な生成物０．２ｇが得られる。

反応経過の―整のための全薄ｈ４−クロマトゲランイー
検査はＭｌケ９ル６０（メルクＭｅｒｃｋ社、ダルムス
タット）糸及び展開剤塩化メチレン／メタノール（９／
１）を用いて行なうことかできる。この糸のために矢の
Ｒｆ−１区があてはまるニ レゾルフィン　０・４ レゾアズリン　０．６５ 例　２ レゾルフィン（Ｎ　１　ａに虞り一通した）２．１３．
９（１０ミリモルン、アセトグロモーα−Ｄ−グルコー
ス４．１１　＃　（１０ミリモル）及びヘキ　吃すデク
ルトリメテルアンモニウムゾロミド６．６４ｇ（１０ミ
リモル）をＩＮＶＩｉ注ソーダ酌液１１．５−及びクロ
ロホルム５０ｄの混合物中で４時間ｊｔ流加熱した。そ
の後＃発乾固させ、酢酸エステルで浸出する。酢酸エス
テルｍ液を新たに蒸発乾固する。エタノール２０ｍで収
り込む。この浴液から生成するテトラアセチルレゾルフ
ィン−β−Ｄ−グルコシドを活性炭の６≦加下にメタノ
ールから舟結晶させる。

脱アセチル化のために、メタノール１０Ｍで収り込む。

室温で２時間攪拌後、排出した生成物を吸引ａは過し、
乾燥する。収滅：　５１　＃％＋１　Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ
）ａ−ＤＭＳＯ）　：δ＝　６．１５−６．８０（ｍ、
６Ｈ）；４．５−６．５（広＋１３　、４　Ｈ）　；５
−１２　（ｄ　、　Ｊ　＝６．９　Ｅ（ｚ　−Ｉ　Ｈ）
　ｐ　６−２９　（ｄ。

Ｊ　＝　２．ＬＩＨｚ　、Ｉ　Ｈ）　ｙ　６．８０　（
ｄｄ　、　Ｊ　＝　２．６及び２．υＨｚ１１Ｈ）；７
．１２（ｄ４．Ｊ＝８．５及び２−Ｌ）　Ｈｚ　、Ｉ　
Ｈ）　ｐ　７．１６　（ｄ　−Ｊ　＝２．ＯＨｚ　＃　
Ｉ　Ｈ）　；　７．５５　（ｄ　、　Ｊ　＝　９．６　
Ｈｚ　、　Ｉ　Ｈ）；７．８０（ｄ、Ｊ＝　８．５８Ｚ
、ＩＨ）。

例　６　。

エト目ツレゾルクン５０ｇ、３．５−ジヒドロキク安息
香戚メチルエステル５６．５１及びパイロルース鉱２８
．０．９をメタノール５００ｄ中にｍかす、もしくは懸
濁させる。水冷下で５〜１０℃で濃硫＃３４．４ｍＪ１
に識別する。水浴の除去後、更に２時間攪拌する。その
後に冷却下でアンモニア水浴Ｍ２Ｏ０＋ｍを加える。生
成する沈殿をガラス繊維濾過器を介して濾別する。鑵故
に５〜１０Ｃで亜鉛末１０．９′（ｌｌ′少址ずつ力口
える。還元が児ｒｆるまで（薄ノークロマトグラフィー
（ＤＣ）−調整、展開剤として酢葭エステル／メタノー
ル４：１、反応時間１７１．５時間）の間呈穏で攪拌す
る。回転、＠発器上で浴温２５°Ｃで容瀘の１４に濃縮
する０冷却下で磯Ｆ４酸で変色するまで酸性化すること
により、所望の生成物が生成する。′＃Ｊ塩酸で洗浄し
、塩化カルシウム上で真空中乾燥した陵にレゾルフィン
−１−カルボン酸メチルエステルが得られる。収緻：３
　０．９　．９　（埋−１直の６６　チ　）。

Ｉ　Ｈ−ＮＭＲ：　（［Ｄ］６−０Ｍ８０）　：δ＝５
．９８ＣＢ。

３Ｈ）；６．４７（（Ｌ、Ｊ＝２−２Ｈｚ、ＩＨ）；６
．８５−６．９５Ｃｍ　、２Ｈ）；７−０９Ｃ６，Ｊ＝
２．２Ｈｚ　−Ｉ　Ｈ）　；　７−６０　（ｄ　、　Ｊ
＝９−６Ｈｚ。

１　Ｈ）。

螢光：吸収：λｍａｘ＝　５７０　ｎｍ発光：λｍａｘ
　＝５８８　ｎｍ 同様の方法で、 ａ、）５．５−ジヒドロキシ安息香酸及びニトロソレゾ
ルシンから、レゾアズリン−１−カルボン酸を介して、 ｕｖ／ｖｉｓ　（ＬＪ、Ｉ　Ｍ　！ｌ＃ｍカリウムー稜
ｎｌｉ、ｔＪＩ７．５　）　：λｍａｘ＝　５６９　ｎ
ｍ。

ｂ）４−０−メチル−没食子慮メチルエステル及ヒニト
ロソレゾルシンから、４−メトキク−レゾアズリン−１
−カルボン酸メチルエステルを介して、 ｔｒｖ／ｖＩＳ　（０，Ｉ　Ｍ燐酸カリウム−緩衝液−
一７．５　）　：　λｍａｘ＝　５９２　ｎｍｃ）６．
５−ジヒドロキ７安患査酸メチルエステル及び４−クロ
ル−６−二トロンレゾルクンから、８−クロル−レゾア
ズリン−１−カルボン酸メチルエステルを介して、 ａ）４−ｏ−メチル没食子酸メチルエステル及ｖ４−ｙ
ロム−６−ニトロソレゾルシンから、８−ブロム−４−
メトキシ−レゾアズリン−１−カルボフ敗メチルエステ
ルなブｒして、ｅ）５−ニトロレゾル７ン及びニトロソ
レゾルシンから１−二トローレゾアズリンを介して、１
−ニトロ−レゾルフィン ｆ）レゾルシン−５−スルホン酸及びニトロソレゾルシ
ンかう、レゾアズリン−１−スルホン酸を介して、 が優られる。

例　４ に トロンレゾルクン１．６０　ＩＩ（Ｉ　Ｌｌ、５ミリモ
ル）、２．６−シヒドロキシ安息査酸１゜５５１？（１
０，０ミ！ｊモル）及びパイロルース鉱０．８６１１０
ミリモル）をメタノール２０属中に収り込み、０゛Ｃに
冷却する。これに＃硫酸１．０６ａ馨制加する。更に２
時間冷却なしに攪拌する沈殿する庁色生成物を濾別し、
メタノールで洗浄し、乾燥する。収ｔ　：　２．５．９
　（理論直の８５％） ＵＶ／　ＶＩＳ　（Ｕ、Ｉ　Ｍ燐酸カリウム緩向液、＋
ｔ　７．５　）　：λｍａｘ＝６１　４　ｎｍ　（ｇ＝
４８ｃｍ２％／ｌ／−１）酸性後λｍａｘ＝５２２　ｎ
ｍ　（ｇ＝３２ｃｍ２モルーり例　５ レゾアズリン−４−カルボンｌ！１２（ｙＩ１４に依り
Ｈａ　）　２．４５１を水２０＋ｄ及び２５慢のアンモ
ニア５ＩＬｅ中に俗かす。１色浴液に水冷下で亜珀木５
．９を加える。その後に水冷を除き、従ってｄ液は徐々
に室温に温（なる。還元は青色から暗紫色への変色で容
易に知るか、もしくは薄層−クロマトグランイー（展開
剤：メタノール／酢酸エステル１：１）に駆り赦祭され
る０過剰の亜鉛末は―別する。反応耐酸を氷酢酸５Ｍ及
び１！塩酸で酸比化する。沈殿する生成物を濾別し、布
塙酸で洗浄し、貞望中塩化カルシウム上で乾燥する。収
繊：１．８９（埋爾１直の８２％）。

ＵＶ／ＶＩＥＩ　：　（０，１Ｍｉ酸カリウム緩ｔｊＮ
１（Ｆ！′Ｉ７．５）：λｍａｘ　＝５７９．４　ｎｎ
ｎ　（ε＝　４８．６ｃｍ”。

モル′″１）； Ｖ注後　：　λｍａｘ　＝　４８５．９　ｎｍ　（ε＝
　、５４．７Ｃｍ２モルー１） 責　元　二吸収：　λｍａｘ＝５　７９　ｎｍ発光：λ
ｍａｘ＝５９３　ｎｍ 例　６ ２．６−シヒドロキシー４−メチル安息香酸８４０ａＱ
ｓ　二）ロソ１／ゾル：フィン７６０’ｖｘパイ０　／
Ｉ／−スｆ、　４３０　Ｉｖ及Ｕ　硫酸０．５３　ｒｕ
ｇを例４と同様に反Ｌ６させて１−メチルレゾアズリン
−４−カルボン酸にする。収ｉｔ　：　ｏ、ａ　ｙこう
して痔た１−メチルレゾアズリン−４−カルボン酸を例
５と同様に還元して１−メチルレゾルフィン−４−カル
ボン酸にする。収鍍：０．４　Ｉｉ Ｕ′ｖ／ｖ工ｓ　（０，１Ｍｍｕカリウム緩１＝　ｅ、
　ＰＨ７，５）：λｍａｘ＝５７１　ｎｍ 例　７ １）Ｎ、０．Ｏ−トリアセチルジヒドロレゾルフィン−
４−カルボンは 変法ａ） レゾルフィン−４−カルボン１ｆｆ５．？（１！、’、
４ミリモル）又はレゾアズリン−４−カルボン酸５．５
．９　（１９，４ミリモル）を１０％の塩醒１００ｄ　
中−ｔ’　Ｌｌ、５　時ＩＭｊ　４４化錫（ＩＩ）７＆
（３８ミ！Ｊモ／りと共に還、ηｔ　７Ｊｌｌ熱する。

この除浴液は緑色に変色する。冷却し、生成−４ｊ６ジ
ヒドロレゾルフインー４−カルボン酸を窒素下でＵ別し
、真空中五酸化虐上で乾燥する。こうして鍔た粗生成物
を６０分間無水酢Ｈ５０ｍｌ及び酢ばナトリウム２０ｎ
ｌと共に還流加熱する。反し６混合物を氷水２００ｍ１
に入れ、１４時間攪拌する。沈殿なエタノール／水から
再結晶させる。所望の化付物４．８．９（６５％）か潜
られり。

融点：１９７〜１９９℃ ＤＣ（Ｍ酸ｒル、肢開剤りロロホルム／メタノール／氷
酢改ゾ：　ｌ　：　０．１　）ａｆ＝ｔ１．３３ 変法ｂ） レゾルフィン−４−カルボン酸す、１．９　（２０ミリ
モル）を無水酢ば２Ｏａ中で塩化錫（…〕１１１１（６
Ｌｌミリモル）と共に１時間８０゛Ｃで攪拌する。氷水
２６０ｄに加え、１時＋ＭＪ攪拌し、赫過し、変法ａ）
の様に後処理１−る。

収蓋：５．４．？（７１１ｉ ２）Ｎ、Ｏ，Ｏ−トリアセチルジヒドロレゾル７（ノー
４−カルりン酸クロリド Ｎ、Ｏ，Ｏ−トリアセチルジヒドロレゾルフィン−４−
カルボンば３．８５．９　（１０ミリモル）に塩化オキ
ザリル５．４ｍ１（６０ミリモル）を混合し、−１０□
０に冷却する。これにジメチルホルムアミド１制を〃ｕ
え、反応混合物を（Ｉ押下で室温に己めΦ。この際遊離
物がガス発生下に溶解し、ガス発生の終ｆＥ＆、更に０
．５時間攪拌し、＃発させ、無水塩化メチレン２（Ｊｍ
ｌで谷６回収り込み、蒸発乾固する。こうして粗生成ｗ
Ｊ４ｇか潜られ、これ以上＃ｆ製することなく、更に処
理する。

ＤＣ（珪酸ｒル、展開ハリクロロホルム／メタノール／
氷酢酸９　：　１　：　Ｕ、１　）Ｒｆ＝０，４２； Ｗ１１５１Ｑのフレーク状物、これは畝時間段に赤色に
変わる。

６、）Ｎ、Ｏ，Ｏ−）リアセチルジヒドロレゾルフィン
−４−カルボン酸−モルホリド 粗製の酸基化ｗＪ１１．５　＃　（５１，４ミリモル）
を無水塩化メチレン１５０ｍ１中に浴か１−０これに、
トリエチルアミン８．７１ｍ（６３ミリモル）及び引続
きモルホリン３．５１ｕ　（３７，７ミリモル）をず′
岡加する。更に２時間攪拌し、溶液を１チのクエン酸、
炭酸水素ナトリウム浴液及び水で洗浄し、何機相を硫酸
マグネンクム上で乾燥させ、蒸発する。残渣をエタノー
ルから結晶化させる。

収址：８．１．９（６３％）、融点：１６６〜１６５’
Ｕ　（分解） ４）レゾルフィン−４−カルボン酸−モルホリド トリアセチルゾとドロレゾルフィン−４−カルボン酸−
モルホリド５．７　Ｆ　（９ミリモル）をメタノール２
５０ｄ及び水２５　Ｌｌ　ｍｌで取り込む。

これにｉｎ＠ａソーダ酊液６浴液１及びヘキサシアノ鉄
酸（ＩＩＩ）カリウム６．Ｌ］　、Ｆ　（１８ミリモル
）欠加え、１４時間室温で攪拌″″３−る。基板で…６
に咳注化後＃発乾固させ、アセトンで浸出する。

開 色料−浴ｅ、を珪酸ｒル５００ｄを介して展九剤として
アセトンを用いて濾過する。色科含有の溶離液を１＠発
した後に生成！１１＋！＋２．３．９（８０％）を優る
。

ＵＶ／ＶＩＳ　（０，１Ｍ燐酸カリウム緩衝液ＰＨ７，
５）：λｍａｘ＝５７５ｎｍ、ｇ−＝５５．Ｑ　Ｑ　Ｑ
ｃＴｎｚモル−１）ＤＣ（展開剤、２以下参照） Ｒｔ　＝　Ｌ］、５２ ”Ｈ−ＮＭＲ（［：Ｄ］６−ＤＭＳＯ）　：δ＝　５．
６−６．８　（ｍ　、　８Ｈ）；６−５０（ｄ、Ｊ＝２
Ｈｚ、ＩＨ）；６−６４（ｄ＃Ｊ＝１０ＨｚｉＨ）；６
．７６（ｄｄｌＪ＝１０及び２Ｈｚ　、　Ｉ　Ｈ）　ｔ
　７−４４及び７．５１（それぞれｄ　＃　Ｊ＝Ｉ　Ｑ
Ｈｚ　ｙ　２Ｈ）。

例　８ ンド レゾルフイン−１−カルボン噴メチルエステノ９（９１
１３に依り製造）　６．８　＃、酸化銀（Ｉ）５．７５
Ｉ炭酸絨６．７５ｊ９．分子ふるい４Ａ　１５．９及び
α−ブロムーテトラアセチルガ２クトース１０ｙ７ｋｇ
水クロロホルム２５０　ｍｌと共に４時間室温で攪拌す
る。史にα−ブロム−テトラアセテルーが２クトース５
Ｉを添〃ｕした後に一夜更に撹拌する。反応混合物をガ
ラス鐵維濾過器を介して濾過し、蒸発＃縮する。油状粗
生成物を珪酸ｒル２ノ上で俗離剤としてクロロホルム／
酢酸エステル２：１でクロマトグラフィーにかける。Ｒ
ｆ　＝　０．２８を何する賊色の溶離分２．５Ｉが痔ら
れる（　ＨＰＴＬＣ！　ｖＥ酸’７’ル、同一の俗離剤
）。

メタノールとの攪拌により、テトラアセテルー潜られる
。

収線１．５Ｉｉ ”Ｈ−ＮＭＲ（［：Ｄ］６−ＤＭＳＯン　：　δ　＝　
１．９　５　、　２．Ｕ　Ｓ　。

２、ｊｌ　４及び２−１４（ｊｅｓ、１２Ｈ）；３．８
８（ｓ、３Ｈ）；４．１１（ａ、、ｒ＝７　Ｈｚ、２　
Ｈ）ｐ４．ｂｌ　（ｔ＋Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）ｙ５−２４
（ｍｅ　′２Ｈ）ｙ５−３６（ｍ、ＩＨ）；ｂ、６９（
ｍ−ＩＨ）；６．３１　（ｄ、Ｊ＝２Ｈ２、ＩＨ）；６
．ソ７（ｄｔＪ＝２Ｆ（ｚ、ＩＨ）；７．０４（ａａ、
、ｒ＝８．８及び２．４１（ＺＩＩＨ）；７．１４（ｄ
、Ｊ＝２’、４Ｈｚｌ　１　Ｈ）；７．７８（ｄａ、Ｊ
＝８．８Ｈｚ。

Ｉ　Ｈ）。

その後、Ｒｒ＝０．２４′ｌｋ胃する同様に敗色のｍ離
分が借られる。メタノールから、テトラアセ品で晶出す
る。

収緻：１．２ｆ？ ＩＨ−ＮＭＲ（［：Ｄ）６−ＤＭＳＯ）　：　／Ｊ　＝
　１．’７’　５　、２．Ｌ＋　２　。

２．０４及び２．１４　（各ｓ　−１，２Ｈ）　’ｓ　
６−ゾ０（ｓ　＝　３Ｈ’）　ｐ　４−０９　（ｍ’−
２Ｈ）　ｔ　４．ｂ　ＩＣｍ　、　ＩＨ）　ｐ　ｂ−２
４（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ、Ｉ　Ｈ）；！：ｉ、２５（ｍ、Ｉ
Ｈ）；５．６６Ｃｍ、ＩＨ）；５−７１　（ｍ、ＩＨ）
　ｐ　６．５ＬＪ（ａ、Ｊ＝２Ｈｚ。

ＩＨに６．８３（ｄｄ、Ｊ＝１０及び２１（Ｚ　、　Ｉ
Ｈ）；７．２Ｌｌ及び７．２４　（谷ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ。

２Ｈ）ｔ　７−４７　（ｄ、Ｊ”ｌ　ＬＩＨｚｌＩ　Ｈ
）−純粋／、Ｃ生成慄の間でなお混合ｍ−分が優られ、
それからメタノールＤ・もの再結晶により、両異性体化
合物の混合物の結晶２．５ｇが得られる。

同僚の方法で、α−デロムーテトラアセチルガラクトー
ス及び ａ）４−メトキシ−レゾルフィン−１−カルボ−β−〇
−ガラクトピラノシド ｂ）　８−クロル−レゾルフィン−１−カルボンチルエ
ステル−β−〇−ガジクトビラノシドインーゾーカルボ
ン酸メチルエステル−２−Ｄ−ガラクトピラノシドか帰
られる。

例　？ テト２アセチルレゾルフィン−４−カルボン喰−モルホ
リド−β−Ｄ−が２クトピラノシド及レゾルンイン−４
−カルボン咳モルホリド６．２６．９　（１０ミリモル
）をり１１８と同様にしてガ′ラクトシト化する。粗生
成物を珪酸ｒル１ノ上で溶離剤として酢酸エステル／ア
セトン６：１でクロマトグラフィーにかける。こうして
テＤＣ（珪酸デル〜俗離剤ド１１７参照）Ｒｔ＝（Ｊ、
７１ ０．４ｇ ＤＣ（珪ばｒル、同一の溶離剤） Ｒｒ＝０．７６ 並びに肉、異性体よりなる混合的離分１．２Ｉが潜られ
る。

例１０ テトラアセチルレゾルフィン−？−カルボン戚メチルエ
ステルーβ−Ｄ−がラクトピラノクド１．２Ｉを１ｆｌ
Ｉ２と同様にしてナトリウムメチラート／メタノールで
脱アセチル化する。収蓋；０．８Ｉ ＵＶ／ＶＩＳ　（０，１Ｍ　１１　ｔｇ　力１）　ウＡ
緩衝ｒｆｆｌｐｔ４７．５）：λｍａｘ　＝　４６４　
ｎｍ　（ε＝　２１．８０１ｎ２％モルーリβ−がラク
ト／ダーゼでの分離後、レゾルフィン−１″−カルボン
酸メチルエステルの陰イオンが潜られる。λｍａｘ＝５
７２ｎｍ（ε＝　６５．４ｄモルー１　） ユＨ−ＮＭＲ（［Ｄ］６−ＤＭＳＯ）　：　δ　＝　３
．２　０　−　６．８　０（ｍ。

６　Ｈ）　；　５．９１　（ｓ　、　６　Ｈ）　；　５
．［Ｊ　９　（ａ　、　Ｊ＝７．５Ｈｚ　ｌ　ＩＨ）　
；　６．６０　（ａ、　Ｊ＝２．１　Ｈｚ。

ＩＨ）＄　６・８１　（（Ｌｄ・１＝ゾ・８及び２・Ｉ
　Ｈｚ・　ｊＩ　Ｈ）　；　７．３０　（ｍ、　２Ｈ）
　；　７．５１　（ａ　、、ｒ＝９−８　Ｈｚ　＃　Ｉ
　Ｈ）　ｓ　ＯＨ−Ｉｓ子　４ＪＴ’）テ巾広１ｎ約５
゜ 同様の方法で相応するテトラアセテートの脱。

アセチル化により区のものが優られる。

ａ）　レゾルフィン−１−カルボン酸メチルエステル−
β−Ｄ−がラクトピラノクド ”Ｈ−ＮＭＲ（［Ｄ］６−ＤＭＳＯ）　：　δ＝３．４
−５．７　（ｍ　。

６Ｈ）ｙ５−０９（ｄ、Ｊ＝７−５Ｈｚ　、１”）ｓ６
．３４　（６、Ｊ＝２Ｈｚ　、Ｉ　Ｈ）　；　６．９　
７　（ａ。

Ｊ＝２Ｈｚ、ＩＨ）；　７．０８−７．１７（ｍ、２Ｈ
）；７．７５（ｄｌＪ＝１ＤＩ（ＺＩ　ＩＨ）；ＯＨ：
極めて広巾、約５ｐｐｍ。

ｂ）　４−メトキノ−レゾルフィン−１−カルボン酸メ
チルエステル−β−Ｄ−ガラクトピラノ７ド Ｃ）　６−メドキクーレデルフインー９−カルボン戚メ
チルエステル−β−Ｄ−が２クトビラノシド ｄ）　８−クロル−レゾルフィン−１−カルボン戚メチ
ル、エステル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド ｅ）２−クロル−レゾルフィン−２−カルボン酸メチル
エステル−β−Ｄ−ガラクトピラノ７ド。

ｆ）　レゾルフィン−６−カルボン改モルホリドー／−
Ｄ−ガラクトピラノシド Ｒｆ（酢ｉ１１：エステル／イソゾロパノール／水ゾ：
４：２）＝Ｌ１．５　β−ガラクト７ダーゼでの分離後 ｕｖ／ｖｒｓ　（［Ｊ、Ｉ　Ｍｆｉｇカリウム綾１４ｆ
ｆｉ、ｐＨ／、５）：λｒ、Ｌｘ　＝　５７４．６　ｎ
ｍ 螢光発元：λｍａｘ”＝　５９３　ｎｍｇ）レゾルフィ
ン−４−カルボン戚モルホリドーβ−Ｄ−ガラクトピ２
ノシド Ｒｆ　（酢ポエステル／イソグロパノール／水９：４：
２Ｊ＝Ｌ］、５　β−ガラクトシダーゼでの分離後、 ＵＶ／ＶＨ８（Ｌｌ、１７　燐ｍカリ６　ムＭｉ、ｍＫ
ｐＨ７，ｂ）：λｍａｘ　＝　５７４．６　ｎｍ 螢光発元：λｍａｘ　＝５９３　ｎｍ 例１１ レゾルフィン−ジ−カルボン酸−β−Ｄ−が２レゾルフ
ィン−ジ−カルボン酸メチルエステル−β−Ｄ−ガラク
トピラノ７ド２６６ｔｖを水５０１ｎｔ及び１，４−ジ
オキサン２ＵＦｌｌ中に取り込む。これに０．１Ｎ苛性
ソ一ダＭ液５　ｍｌを０．５１１Ｌｌずつ添加し、この
際浴液のｐｌ（−値が１２．５以上に上らないようにす
る。反応混合物をｆｆＥｊＶ−セファデックス（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ、）、炭酸唱−形６ｄに装入し、水１８０＃
Ｉ／で洗浄する。

その後、生成’１Ｍ’ｋＯ，Ｉ　Ｍ　）　’）エチルア
ンモニウムカルボネート緩衝／［ｐｌ−１７，５’でｍ
離する。浴離物をＪｉｃ空中蒸発磯権させる。その後エ
タノールで数回蒸発させる。

収量：レゾルンインーシーカルヴン酸−β−Ｄ−ガラク
トビ２ノシドートリエチルアンモニウムｔａｉｉｏ雫 Ｕ’／／’ＶＩＳ　（Ｌｌ−Ｉ　Ｍ　ｌ＃ｈｋ　カリウ
ム緩衝液−７，５）：λｍａｘ　”’、４６５　ｎｍ β−ガラクト７ダーゼでの分離後：λｍａｘ＝５７０　
ｎｍ 列１２ レゾアズリン−ナトリウム塩１２．６．９を１Ｎ苛注ソ
ーダ浴液６５Ｒ１及び水８Ｑ　Ｒｔ中に浴か丁。

これにクロロホルム１５０ｄ中のアセトゾロムーα−Ｄ
−ガラクトース２０．６　ｇ及びヘキテデクルトリメチ
ルアンモニウムプロミド１８．２＃を〃■える。混会物
ン６時間還流〃■熱する。その後蒸発乾固させ、酢酸エ
ステルで浸出する０酢酸エステ／’　１１１　ａ　ｙｉ
１′再ＣＦ　ｍ　Ｍ　Ｌ　ｓ　珪ｎｌＲ”　ル５００ｇ
上でクロマトグラフィーにかける（醒離削：嘔化メチレ
ン／酢戚エステル６：１）。Ｒｆ＝ＩＪ、５　（ＨＰＴ
ＬＣ珪戚ｒル、同一の溶離剤ンを有するテトラアセチル
レゾアズリン−β−Ｄ−がラクトピラノクド２．１３＃
が得られる。

脱アセチル化には、テトラアセチルー−導体２．１３ｇ
Ｙナトリナトリウムメテラー、１　、？と共に無水メタ
ノールｌ　ＵＱ　ｒｔｔｌ中で１時１…室温で攪拌する
。沈殿する化成物を吸引濾過し、塩化カルゾクム上で真
空中乾燥する。

収量：１．０．９ Ｒｆ　＝　ｔＪ、６２　（ＨＰＴＬＣ珪酸ｃｈ、酢酸エ
ステＡ／／イソグロパノール／水９：４：２ン ”Ｈ−ＮＭＲ（ＣＣｌ２−ＤＭ８０）　：　ａ＝　５．
５０−３．９０　（ｍ１６Ｈ）；４．５４（広ｄ　、Ｊ
＝４−４Ｈｚ　−Ｉ　Ｈ）　ｙ４．６７　（広ｔ、　Ｊ
＝４．４Ｈｚ　、　ｉ　Ｈ）　；　５．［］　７（ｄ、
Ｊ＝７ＨｚｉＨ）；５−２７（広（１，Ｊ＝４．４Ｈｚ
Ｉ　ＩＨ）；６．１５（＋Ｌ、Ｊ＝２Ｈｚ、ＩＨ）　；
　６．６３　（ｄａ　、　、Ｔ＝９．６及び’ｌ　Ｈｚ
　、　Ｉ　Ｈ）；７．１０（ｃＬｃｌ、Ｊ＝９及び２Ｈ
ｚ、ＩＨ）；７７−２（，２Ｈ）　ｐ　７．９６　（ｄ
　、　Ｊ＝９，７５Ｈ２゜Ｉ　Ｈ）　ｙ　８−０７　（
ｄ　ｙ　Ｊ　＝９Ｈｚ　、ｌ　Ｈ）　。

例１６ ４−クロル−レゾル７ン４．５　＃　（５０ミリモル）
をエタノール２０７１１ｆｆｌ中に浴か丁。水酸化カリ
ウム２．４ｙの蘇〃口後５−′Ｃに冷却する。冷却下亜
硝戚インペ／チル２．８１　／／１７’ｋｒｌｌｌｌｌ
１丁Φ０その後室−で−佼攪丁子０゜沈殿奢濾別し、水
中に溶解し、酸性化する。ｋ色沈殿な新たに濾過し、４
０℃で真空中乾燥する。収縦：４−クロル−６−ニドロ
ソレデルクン２．５．９　（４８％）Ｒｔ　：　０．２
８　（ＨＰＴＬＣ、珪酸ｆル、ｍ離削：メタノール／酢
酸エステル１：３）。

４−クロル−６−ニトロソレゾルシン１．８３＃、２．
６−ゾヒドロキク安患香酸１．５５　ｇ、パイロルース
鉱Ｌ］、８６　＃及びｔｌｉｌｔば１．０６／ｍをメタ
ノール２０〃！中に装入し、２時間ｏ　’ｃで並びに１
４時間室温で攪拌する。赤色沈殿が侍られ、これを濾別
し、乾燥させる。

収ｊｉ：８−クロル−レゾアズリン−４−カルボン酸２
．４５１１（８０％） ＬＴＶ／ＶＨ８（０，１Ｍ燐酸カリウム緩函液−八５）
：λｍａｘ　＝６２１．５　ｎｍ 同様の方法で、 ａ）２−メチル−レゾル７ンから２−メチル−６−ニト
ロソレゾルシンを弁して ６−メチル−レゾアズリンー４−カルボン酸、 ｂ）　４−メチル−レゾルシンから、４−メチル−６−
ニトロソレゾルシンを介して、 ８−メチル−レゾアズリン−４−カルボン酸 Ｃ）４−ブロム−レゾル７ンから、４−ブロム−６−ニ
トロソレゾルシンを介して、 ８−ブロム−レゾアズリン−４−カルＢン威 が寿られる。

例１４ ８−／ロルーレデアズリンー４−カルざン藏（例１０に
依りＡ造）２．９に水２０ａＪ及び２５チのアンモニア
５ｄ中に溶かす。水冷下で亜鉛末を外−紫色へ完全に変
色するまで電力Ｕする。

過剰の亜鉛を濾別する。は注化匝、沈殿する生成物娶濾
別し、真空中４０“Ｃで塩化カリウム上で、乾燥する。

収ｊｍ：８−クロル−レゾルフィン−４−力、ルボ“／
酸１．５　Ｉｌ　（７９％　）。

ＵＶ／ＶＩＳ　（υ、Ｉ　Ｍ燐酸カリウム緩衝液−７，
５）　：λｍａ工＝　５８５．５　ｎｍ 同様の方法で、 ａ）６−メチル−レジアズリンー４−カルボ／酸から、
６−メチル−レゾルフィンー４−カルボン酸 ｂ）８−メチル−レゾアズリン−４−カルボン−から、
８−メチル−レゾルフィン−４−カルピン酸 Ｃ）’８−ｆロムーレゾアズリンー４−カルボン戚から
、８−ブｐムーレゾルフインー４−カルボン戚 が得られる。

ガ１５ ペンタアセテルガ２クトース５．９１１Ｃ黒水の権化亜
鉛Ｕ、１ｇを加え％１２５Ｌ）に加熱する。

２０分間ｉ　Ｑ　ｇｕｍ　Ｅｉｇで攪拌する。＃−物に
レゾ　１ルフィン−１−カルボン鐵メチルエステルＩＩ
を加える。混合物（＋−１時間４１υで撹拌し一七の後
例７に記載した方法で珪酸ゲル上でりは目ホルム／酢酸
エステル２：１でクロマトグラフィーにかける。

収緻：テト２アセチルーレゾルンインー？−カルビン酸
−メチルエステル−α−Ｄ−ｆｆラクトピラノシドｌｅ
色油秋物）２５雫 Ｒｆ　＝　０．２２　（ＨＰＴＬＣ、珪酸Ｉｆ　ル、同
一のｍ離削） レゾルフィン−？−カルギン酸メチルエステルーα−Ｄ
−ガラクトピラノシドへの脱アセチル化は例１０と同様
にして実施する。

例１６ トビラノシド テトラアセチルレデルフインーシーカルポン酸メチルエ
ステル−β−〇−がラクトピラノシＦＬ］、６１にジエ
チレンクリフールモノエテルエーテル５０１１Ｌｌ及び
テゾ先鎗の水素化ナトリウムｆｔ加え、１５分間厘温で
攪拌する。その後アセトノ１００ｄを加える。生成する
沈殿を濾別し一乾燥する。

収Ｊｌニレゾルフィンー９−カルボン酸−（３。

６−ジオキサオクチル）−エステル−β−Ｄ−が２クト
ビラノ７ド５６キ Ｒｒ＝０．５４（珪酸ｒル旺乳Ｃ％溶離削：酢酸エステ
ル／イソゾロパノール９：４）　・例１７ アミラーゼ（Ｌ　Ｃ，２，４，１，１９）、飼えばバチ
ルス　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎ
ｓ　）よりなるアミラーゼは〃０水分解作用及び環化作
用の他にグリコシルー転移特性を有し、これは少棚類及
び少４４！９１Ａ−ｉ！４体の合成のために利用するこ
とができる（メリーズ　イン　カルボヒＦＶ−）　ケミ
ストリー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏ−ｈｙｄ
ｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第１巻、ｍ３４７頁
）。

バチルスマセランスＤＡＭ　２４　（凍結乾燥物；υ、
４６Ｕ／正啄９；正 ｆｆ１）蛋ｆｌｌＪ１２８．５　％　）　６８［Ｊ　９
レゾルフィン−グルコシド　５ｏｏｏｖα−シクロデキ
ストリン　６・５ｇ 及び セレ７セ７　（５ｏｅｒｅｎｓｅｎ）燐ｆＲｔｌＡ稜衝
液（ｐｓＨ６，２、０，０１Ｍ　）　７０ｔｕｌを混合
する。装入物を２４時間３７′Ｃで培養する。次＾で後
槽製のためにα−及び生じたβ−７クロデキストリンを
先ずテトラクロルエチレンＭ鎖化合物を介して分離する
。網状化デキストラン〔セファデックス（５ｅｐｈａｄ
ｅｘ　）　ＬＨ２Ｌ］Ｊのクロマトグラフィーによりア
ミンーゼ試験で高活性のレゾルフィニルマルトへグタノ
シドの凍結乾燥物５Ｕすが潜られる。

例１８ ａ）使用する溶液の調製 酸４４液：　Ｈｌ［ＰＥｃ８　１ＬＩＯミｌル／Ａｌ塩
化ナトリウム　１５４ミリモル／１ＪＬ−アスパライン
戚マグ ネシウム　２ミリそル／ｌ Ｂ８　Ａ　１０１／１ トウイー７　（Ｔｗｅｅｎ）−２（Ｊ　ＩＪ、５１／Ｉ
ＩＰＩ−ｊ−１１ｉ！（苛性ソーダｍｅ、でａ１ｍ整）
　７．３　（３７′０） 試楽溶液１： 前記の緩衝溶液中にレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトビ
２ノシド０．８ミリモル／ｌを浴かす。

試楽溶液２： 前記の緩衝浴液にレゾルフィン−９−カルボｙｆｉ−β
−Ｄ−がラクトピラノシド６．５ミリモル／１７に浴か
丁。

試ａＩＩｆｎ液６： 前記の緩ｉ＃液中にレゾルフィン−ジ−カルボン酸メチ
ルエステル−！−〇−ガラクトビラノクド１．０ミリモ
ル／ｌを齢かす。

＃＊＃液 大腸＠　（ｍ５ｃｈｅｒＬｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　）より
なる市販の／−Ｄ−ガラクト７ダーゼを前記の緩衝＃ｉ
液液中俗か丁。この浩液の活性は約０．０８０／ｄ（ｄ
ｊｉ！首−データに対して）である。

測定の実施 測定は測光で５７９　ｎｍで行なう。

試楽９５０μｌを１１キユベツ）中”ｔ−３７’０で酵
１ｇ溶液５０μノと混合する。反応に対する尺度として
時間単位毎の消光上昇を［ｍＥｃｘｔ／分］で確かめる
。反応時間での除法により測定した消光から計算する。

欠の表に実測した測定値を挙げる： ８５ ４６ ７６ 例１９ 検出 均質の組成物のために次のものを施こす：Ｌ１．５　Ｍ
　ｇ４ばカリウム及び０．０５　Ｍ塩化マグネクラムを
有する水浴液、 ｐ？１７．３　５ｍｌ アルギンばナトリウム　０．１７１ ホリビニルグロビオネートの５０ −の分散物　８ｇ 珪酸ゲル　ｌ０ＩＩ 水　１２ｄ ト　リ　ト　７　（Ｔｒｉｔ、ｏｎ）　Ｘ−０１００，
４ｇレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクト ピラノミド　５０雫 をメタノール５−中に浴か丁。

この組成物を（］、１ｕ＋の厚さのポリカルボネー）７
−）（ボｈ　Ｐｏｋａｌｏｎ、ロンず社Ｆ’ａ、　Ｌｏ
ｎｚａ）上にＬｌ、２１Ｊｌのスリット巾で塗布する。

被榎を５０′Ｃで乾゛禮させ、その後に６枚に６Ｂで切
断する。これを接着データで４００μｍの厚さのポリス
チロール７−トにはりつける。

こうして漫た試験データを短時１ｉ４１　％試験すべき
、β−〇−ガラクトシダーゼ倉何のｍ液中に浸漬する。

呈温で２分間の待時間後に、赤色の反応色が発現し、そ
の一度は試験ｍ液中のβ−〇−がラクトクダーゼの濃度
にｅｏｏ一定の既知の富鎗の！−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を有する試験ｍｅ、に療り、色尺腿が優られ、これに基
づき試料中のβ−〇−ガラクトクダーゼの未知の合鍵が
確しかめられる。

前ｆｅの試験チーブは、試料中に存在するβ−Ｄ−ガラ
クト７ダーゼの活！ｌ：を運動的に反＃ｇ測光で一１ｊ
定することに使用することもできる。これにも常法で既
知のβ−〇−がラクトシダーゼー泊注を有する試料に基
づき較正曲線をつ（す、それに依り試料の未凡のｐ−Ｄ
−ガ２クトシダーゼーｌ占囲を確かめることができる。

列２０ 活性測定 ａ）使用するｄ販の製造 緩衝Ｍ　（（１：　ＨＥＰＩＩＣ８１０Ｌ］ミリモル／
！塩化ナト　リ　クム　１５４ミリモル／ｌＬ−アスパ
：７ギン戚 マグネシウム　２ミリモル／！ ＢＡＡ　、１０Ｉ／１ トクイーン−２００，５１１７ＩＩ −一埴（苛性ソーダ耐液 で調整）　７．３　（３７”Ｏ） 試楽ｔ＃液二 前記の緩１１１ｍ液中にレゾルフィン−／−Ｄ−ガ２ク
トビラノシド０．８ミリモル／！をｍか丁。

酵素浴液： 市販の大腸−（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）
よりなるβ−〇−ガラクトシダーゼを酸＋１１Ｊ液中に
浴かす。この浴漱のず古註は約０．０８　Ｕ／Ｉｎ１（
裏遺者−データに対して）である。

β−〇−がラクトクダーゼー抗体−製剤な使用する０か
かる＃素−仇体−複合体の製造は公知である。これは列
えはビオケム、ビオフィス。

アクタ（ＢＬｏｃｈｅｍ、　ＢＬｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ
ａ　）　第６１２巻、第４０〜４９頁（１９８０手）に
記載されていΦ。製剤は緩爾液中で、前−〇の酵素浴液
と大凡比ｖＲムＪ能なｆ古註が生じるように、布択され
８゜　： 測定の実施 測定は測光的に５７８　ｎｍで行なわれる。試薬ｍ液９
５０μＥはそのつどｉ　ｃｍキュベツト中で６７℃で酵
素耐液５０　Ｂｌと、もしくは酵素−俵合体一溶液５０
μｌと混合する。反応のための尺度として時間単位毎の
消光上昇が［ｍＫｘ　ｔ／分］で曙かめられる。

遊離のβ−Ｄ−ガラクトクダーゼでの反応にはＢ　５　
ｍｇｘｔ　７分か、Ｉ”−Ｄ−がラクト７ダーゼー仇体
−俵合体での反応には９２ｍｈ：ｘｔ　７分が測定され
る。

両側定直は、遊離の／−Ｄ−がラクトクタゝ−ゼでも、
並びに複会のβ−〇−ガラクト７ダーゼでも極めて良好
に測定ＯＪ能な消光差異が判明されることを示す。

そのことから、前記の化合物は基質として遊離のグリ′
：１７ダーゼにも並びにグリコクダーゼ−複合体にも同
様の方法で通して−ることが明らかである。従って＃現
の基質は診断剤としてはかりで１よく遊離のグリコシダ
ーゼの一定のためにも使用することができる。これは何
利な方法で先便学的測定方法でも使用可能であり、その
場合グリコクダーゼは指示−＃系として使用される。

例２１ クエン酸塩緩衝液−６中に俗解したレゾルフインーマル
トヘプタノクドに濾紙を浸す。こうして得た試某紙を順
々にα−アミラーゼ含有の試料で、並びにα−及びβ−
ゲルコクダーゼで処理する。数分間後、明らかに目に見
える赤色を検出１金ことができ、試料中でその濃度又は
α−アミラーゼ−濃度は比例する。

既知のα−アミラーゼ−濃度を有する試料に依り較正曲
−が確認され、それに基づき試料の未知のα−アミラー
ゼ−ぼ駿を測定することができる。

前記の実施列では次の略語が使用された：Ｈｇｐｇｓ　
２−　［：　４−　（２−ヒドロキシエチル）−ｉ−ビ
ペラゾニル］−エタンースル ホンは ＢＳＡ　牛血７１　（Ｒｔｎａｅｒｓｅｒｕｎ　）−ア
ルブミン、（牛血４ｇ　（ｂｏｖｔｎｅｓｅｒｕｍ　）
−アルブミン） トクィーンポリオキ７エテレン（２０）ソルビタ０ ンモノラウレート

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式１ａもしくはＩｂ＝ 〔式中Ｒ１は水素原子を表わし　Ｂ、２　、Ｒ８及びＲ
   ５は同じか又は異なって良く、水素原子、ハロゲン原子
   又は低級アルキル基を表わし、Ｒ４及びＲ６は同じか又
   は異なっていてよく、水素原子、ハロゲン原子、シアノ
   基、低級アルキル基Ｓ低級アルコキシ基、カルボ中７基
   、低級アルコΦクカルボニル基、カルボキシ低級アルキ
   ル基、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル基又は
   場合により−ｔＩＬ換の又は二置換のカルボキサミド基
   又は基ニ ーＣＯＯ−（ＣＨｅＣＨ８Ｏ）ｎ−Ｒ’（基或中Ｒγは
   水素原子又は低級アルΦルー基を表わし、かつｎは１〜
   ４の喪数を表わす）を表わし、この際Ｒ６はｆｆ　１Ｊ
   ｒＪ的にスルホニル基又はニトロ基を表わして良く、か
   つＹは窒素原子又は基：Ｎ→０を表わ丁〕のレゾルフィ
   ン−誘導体のグリコシド。 ２、グリコンド−基がβ−Ｄ−ガラクトピラノシド基、
   α−Ｄ−が２クトビラノシ”ド基、β−Ｄ−グルコピラ
   ノシド基、α−Ｄ−グル；ピラノシド基又はα−Ｄ−マ
   ンノピラノ、シトＩＩｉを表わす特＃！Ｆ請求の範囲第
   １項記載のグリコシド。 ６、グルコクドー基が単棚頴一単位２〜１０ｍ有する少
   楯類を表わす％許請求の範囲第１項記載のグリコシド。 ４、一般式１ａもしくは１ｂ： 〔式中Ｒ１は水素原子を表わし　Ｒ２、Ｒ３及びＲ５は
   同じか又は異なっていて良（、水素原子、ハロゲン原子
   又は低級アルキル基を表わし　Ｒ４及びＲ６は同じか又
   は異なっていて良く、水素原子、ハロゲン原子、−シア
   ノ基、低級アールキル基、低級アルコキシ基、カルボキ
   ク基、低級アルコキクカルボニル基、カルボキク低級ア
   ルキル基、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル基
   又は場合により一置換の又は二置換のカルざキサミド基
   又は基ニーＣＯＯ−（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ−Ｒ’（基或
   中Ｒ７は水素原子又は低級アルキル−基を表わし、かつ
   ｎは１〜４の整数を表わす）を表わし、この際Ｒ６は付
   〃目的にスルホニル基又はニトロ基を表わして良（、か
   っＹは菫累原子又は基：Ｎ→０を表わす〕のレゾルフィ
   ン−誘導体のグリコシドを製造するに当り、自体公知の
   方法で、互変異性の一般式１１ａ及〔式中Ｒ五〜Ｒ６及
   びＹは前記のものである〕の化合物を単循頑又は少抛類
   又はそれの１一八ロケ９ノー誘導体（この除ぞのつど全
   てのヒドロキシ基は炭水化物化学で常用の保護基で！挨
   されている）と反応させて過−〇−一置換たグリコシド
   にし、それから自体公知の方法で保瞳基を分離すること
   を％敵とするレゾルフィン−訪導体のグリ；シトの製法
   。 ５．１種又はそれ以上の呈色又は／及び＠螢光基質１適
   合の緩＊物質、並びに場合によりその他の常用の助剤を
   含有するグリコ７ダーゼ険出のための診断剤にお４いて
   、呈色及び＠螢光基質として一般式１ａもしくはＩｂ：
   ２〔式中Ｈ２は水素原子を表わし、Ｒ２、Ｒ３及びＲ６
   は同じか又は異なって＾て良く、水素原子、ハロゲン原
   子又は低級アルキル基を表わし　１４及びＲ６は同じか
   又は異なっていてよ（、水素原子、ハロゲン原子、シア
   ノ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキク
   基、低級アルコキクカルボニル基、カルボキク低級アル
   キル基、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル基又
   は場合により一置換の又は二置換のカルホキ丈ミド基又
   は基ニーＣＯＯ−（ＣＨ，ＣＨ２０）ｎ−Ｒ７（基或中
   Ｒ７は水素原子又は低級アルキル−基を表わし、かつｎ
   は１〜４の整数を表わす）を表わし、この際Ｒ６は付加
   的にスルホニル基又はニトロ基を表わして良く、かっＹ
   は漬素原子又は基：Ｎ→０を表わ丁〕のレゾルフィン−
   誌導体のグリコシドを使用することを特徴とするグリフ
   ７ダーゼ庚出のための診断剤。 ６．１４１１又は数種の呈色又は／及び発螢元基賀、適
   当な緩衝？Ｉ質、場合によ′りその他の常用の助剤、過
   当なグリコシダーゼ並びに場合によりその他の補助酵素
   を含有する＊許請求の範囲第５項記載の８！鎖分解酵素
   の検出のための診断剤。 ｌ　麻〃口助剤として、湿潤剤、ガレヌス姫加剤又は／
   及び支持体形成物を使用する材許請求の範囲第５項又は
   第６項記載の診断剤。 ８、互変異性の一般式Ｂｌ　ａ及びｕ／ｂ：〔式中Ｒ１
   ′は水８原子を表わし、Ｒ２′、Ｒ３′及びＲｂ２は同
   じか又は異なっていてよ（、水素原子、ハロゲン原子又
   は低級アルキル基な表わし、Ｒ４′及びＲ５／は同じか
   又は異なっていてよく、水素原子、ハロゲン原子、クア
   ノ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキシ
   基、低級アルコキシカルボニル基、カルボキク低級アル
   キル基、低級アルコキクカルボニルーＵｓアルキル基又
   は場合により一置換の、又は二置換のカルボキサミド基
   又は基ニーＣｏｏ−（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ−Ｒ’（基或
   中Ｒ７は水素原子又は低級アルキル基を表わし、かつｎ
   は１〜４の整数を表わす）を表わし、この際ＲＩＩ〜Ｒ
   ６′は全てが同時に水素原子を表わすことはできず、か
   つＹは望索原子又は基：Ｎ−＋Ｏを表わす〕のレゾルフ
   インーー導体。