JPH02160771A - レゾルフイン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 グリコシダーゼは人間及び動物組織中で多くの生理学的
なはたらきをする。すなわち例えばβ−Ｄ−がラクトシ
ダーゼに炭水化物代謝において、乳糖の加水分解を行な
うので、ｉ＊な役割をする。更にβ−〇−ガラクトシダ
ーゼは糖脂質、ムコ多種類及び糖蛋白質の分解の際の鍵
酵素である。その他の生理学的に重要なグリコシダーゼ
としては次のものが挙げられる：α−Ｄ−がラクトシダ
ーゼ、α−Ｄ−及びβ−Ｄ−グルコシダーゼ並びにα−
Ｄ−マンノシダーぜ。

グリコシダーゼはその生理的な重要な働らきの他に近年
は診断的並びに生物工学的範囲で重要になって来た。す
なわち例えばこれらの酵素は増々酵素免疫分析のための
指示−酵素として使用される。このμ係ではβ−Ｄ−ガ
２クトシダーゼが特に有利である〔例えばアナルス　オ
プ　クリニカル　ビオケｔストリイ　＊ｎｎａ１ｓｏｆ
　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第１６
巻、￥２２１−第２４０頁（１９７９年）＃照〕。

従ってグリコシダーゼの活性の測定は、臨床化学におい
て、並びに診断学において増々Ｉ！要である。そのため
に極めて一般的にはグリコシダーゼ含有の試料に適当な
基質を混合する口基質は酵素により分解される。分屏生
底物の１穐を適白な方法で検出する。ｅ素の作用により
遊離したグリコン又はアグリコンを測定することができ
る。普通は後者が測定される。

基質としては屡々検出すべき酵素の天然基質が適する。

しかしながらそれにおけるアグリコンが分光的に容易に
検出可能な基であるグリコシドを特に有利に使用する。

本発明はこのグリコシド製造用の出発物質に関する。

従来の技術 グリコシダーゼによる分解後に、アグリコンを分光的に
可視又は同様に紫外線−範囲で、並びに螢光分析的に測
定することができ、る一連のグリコシダーゼ−基質が公
知である。

すなわち、ビオケム（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｚ、　）第３
３３巻、２０９頁（１９６０年）に、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼの基質として、フェニル−β−Ｄ−ガツクトシ
ド並びに若干のその他の芳香族環に置換した誘導体（例
えばＯ−ニトロフェニル−及びｐ−ニトロフェニル−β
−Ｄ−がラクトシト）が記載嘔れている。加水分解によ
り遊離されるフェノールは測定的に紫外線範囲で、もし
くはニトロフェノールを蛇波の可視波長範囲で測定する
。指示反応として酸化縮合をアミノアンチピリンで接触
させることもできる〔アナリテイカル　ビオケム（Ａ’
ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）第４０巻、
第２８１頁（１９７１年）〕。

組織化学的検査にナツチルーβ−〇−ガラクトシドを使
用する、すなわち例えばヒストケミイ（Ｈｌｓｔｏｃｈ
ｅｍｉｅ　）第３５巻、第１９９頁（１９７５年）では
１−ナフチル−化合物、ジエイ、ビオル、ケＡ、（Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　）第１９５巻、第２３９頁
（１９５２年）では６−プロムー２−ナフチル−誘導体
又はヒストケミイ（Ｈｌｓｔｏｃｈｅｍｉｓ　）第３７
巻、第８９頁（１９７３年）ではナフトール−β−〇−
が２クトシドである。可視化のためにその際生成するナ
フトールを種々のジアゾニウム塩と反応させてアゾ−色
素にする。

発螢光基質での酵素活性測定は、測光的方法に比して螢
光計測定の感度が屡々数１０悌租増加しているので普及
している。多くの場合に、例えば細胞分化の九めに自動
装置を用いて細胞中の酵素活性を検査する際に（細胞螢
光法）、並びに流過微螢光法での非可動酵素の分析の際
に発螢光基質で処理すべきである。その他の場合Ｉハ例
えば試験系の酵素的標識付けを定める際に＜ｖｐ素免疫
分析）、発螢光基質の使用により酵素触媒の相乗効果が
著しく強化される。

従来公知のβ−Ｄ−ガラクトシダーぜ及びその他のグリ
コシダーぜのための発螢光基質は発螢光団としてフルオ
レセイン、インドキシル又はメチルウンベリフェロンの
誘導体を有する。

しかしながら複合体の動的分析のためにこれらの化合物
は重大な欠点を有する。フルオレセインの二置換誘導体
は多段階の反応経過で加水分解される。−置換フルオレ
セイン−グリコシドはすでに自ら螢光を発する。インド
キシル−誘導体はその酵素的分解後、同様に動的分析を
複雑にする一連の化学的変換物の基になる。メチルウン
ベリフェロンの誘導体は、紫外線で励起させなければな
らない。この際生物学的又は合成の物質の固有螢光が妨
害し得る。更に紫外線−励起は、特にレーデ−光学にお
いて、経費がかかる。殆んどの発螢光基質は、極めてわ
ずかな溶解性を示す反応生成物になり、従って酵素活性
の動的分析には（それには基質及び生成物の全く良好な
溶解性が必要である）適さない。

発明が解決しようとする問題点 従って更に、基質を用いて糧々のグリコシダーゼを簡単
で、速やかなかつ確実な方法で測定することができかつ
できれば測光的にも並びに電光分析的な測定方法でも使
用出来る基質への必要性が生じてきた。

グリコシダーゼにより糖成分及びレゾルフィン−誘導体
に分離することができる新規のレゾルフィン−誘導体の
グリコシドにより解明される。後者は良好に水溶性の化
合物であり、これは可視範囲で良好に測定可能な吸収を
示し、かつ更に容易に励起して螢光を発する。

一般式１ａもしくはＩｂ： 〔式中Ｒ”ｒＬ＊素原子を表わし、Ｒ２、Ｒ５及びＲａ
は同じか又探異なっていて良く、水素原子、ハロゲン原
子又は低級アル中ル基を表わし、Ｒ４及びＲ’　ｒＬ同
じか又は異なっていて良く、水素原子、ハロゲン原子、
シアノ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボ
キシ基、低級アルコキシカルボニル基、カルボキシ低級
アルボキサミド基又は基ニ ーＣｏｏ−（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ−Ｒフ（基式中Ｒマは
水素原子又は低級アルキル基を表わし、かつｎは１−４
の整数を宍わ丁）を我わし、この際Ｒ６は付加的にスル
ホニル基又はニトロ基であって良く、かつＹに窒素原子
又は基：Ｎ−４０を表わし、グリコシドはモノ−又はオ
リデーサツカリド基である〕のレゾルフィン−誘導体の
グリコシドが使用される。

一般式Ｉのレゾルフィン−誘導体のグリコシドは新規の
化合物である。これは炭水化物化学から自体公知の方法
により製造することができる。

殊に自体公知の方法で、互変異性の一般式■ａ及びＩｌ
ｂ： 〔式中Ｒ１〜ｎ６及びＹは前記のものである〕のレゾル
フィン−誘導体を、単糖類又は少種類又はその１−ハロ
デノー誘導体（この吸上〇りと全てのヒドロキシ基は炭
水化物化学で常用の保謹基で置換されている）と反応さ
せて、過−０−置換のグリコシドにし、これから自体公
知の方法で保護基を離脱することにより一般式Ｉのレゾ
ルフィン−誘導体のグリコシドが得られる。

式■の化合物と過−〇−置換の１−ハロゲノ−糖類との
反応は殊に酸受容体、例えばアルカリ金属水酸化物又は
アルカリ金属炭酸塩の存在で、水性アセトン中又は（相
移行条件下で）水／ベンゾールー混合物又は７ｙ：／ク
ロロホルムー混合物中で行なう。

更にこの方法は、一般式■のレゾルフィン−誘導体を先
ずアルカリ金ｌ１４７に酸化物又はアルカリ曹属アルコ
ラードを用いてアルカリ金属塩に変えるかもしくに場合
により置換したアミノを用いてアンモニウム壇に変え、
かつこれを次いで双極性の中性溶剤、例えばアセトン、
ジメチルスルホキシド、ジクロルメタン、テトラヒドロ
フラン又はジメチルホルムアはド中で過−〇−置換の１
−ハロデノー糖類と反応させることにより実施すること
ができる。

更に、一般式Ｈのレゾルフィン−誘導体及び過−〇−置
換の１−ハロゲノ−糖類からの過−〇−置換のグリコシ
ドの合成の際に、単一の銀塩又は銀塩の混合物（酸化銀
、炭酸銀、セライ）　（Ｃｅ１ｉｔ・）上の炭酸銀、シ
ルパートリフレー　）　（−ｚｒｉｆｌａｚ　）、サリ
チル酸銀）及び／又は単一の水銀塩又は水銀塩の混合物
（臭化水銀、シアン化水銀、酢酸水銀、酸化水銀）の添
加が、場合により乾燥剤、例えば塩化カルシウム、分子
ふるい又は無水硫酸カルシウムの使用下テ、溶剤、例え
ば塩化メチレン、クロロホルム、ベンテール、ドルオー
ル又はジオΦサン中で、適切であることが判明し比。α
−結合のグリコシドの合成には有利に一般式■の化合物
を、そのヒドロ中シ基が保護基で、時に有利にアセチル
基で置換されている糖類と、ルュイス酸、例えば四塩化
錫、塩化アルミニウム、殊に塩化亜鉛の存在で熔融させ
る〔ケイ。ベル、（Ｃｈｅｍ。

Ｂｅｒ、　）第６６巻第３７８−３８３頁（１９３３年
〕及びメソーズ　イン　カルボヒドル、ケム。

（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｃｈ
ｅｍｓ　）第２巻、第２巻、第３４５〜３４７頁（１９
６７年〕参照〕。

この際温度は８０℃〜１５０’Ｏ１有利に１１０’０〜
１３０℃で選択される。

こうして得られる一般式■のレゾルフィン−誘導体の過
−〇−置換のグリコシドは同様に新規の化合物である。

過−〇−置換のグリコシドの保護基を分離して一般式■
のグリコシド匝することは炭水化物化学において慣例の
方法により〔例えばアトパンセス　カルボヒトレート　
ヶム（ＡｄｖａｎｃｅｓＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃ
ｈｅｍ、　）第１２巻、第１５７頁（１９７５年）！＃
照〕、例えばアシル−保護基の場合にはナトリウムメチ
ラート又はバリウムメチラート又はメタノール中のアン
そニアを用いて実施する。

Ｒ１−Ｒ’ｌの定義におけるハロゲンとに、弗素、塩素
、臭素及び沃素、殊に塩素及び臭素である。

Ｒ１ａｍ　Ｒ６の定義における１低級アルキル基”は炭
素原子１〜５個、殊に１〜６個有し、この際メチル基が
特に有利である。

Ｒ４及びＲ６の定義における°低級アルコキシ基”は炭
素原子１〜５個、殊に１〜３個有し、この際メトキシ基
が特に有利である。

置換基Ｒ４及びＲ６の定義における低級アルコキシカル
ボニル−、カルボキシ−低級アルキル−並びに低級アル
コキシカルボニル−低級アルキル−基の１低級アルコキ
シー”もｔ、＜ｉ＝低級アルキル−”基は同様に炭素原
子１〜５個、殊に１〜３個有し、この際メトキシ−基も
しくはメチレン−基が特に有利である。

１炭水化物化学で常用の保護基”として、特にアセチル
−、ベンゾイル−、ベンジル−又ｈトリメチルシリルー
基が適する。

カルボキサミド基の置換基として、アルキル−、アルコ
キシアルキル−、カルボキシアル中ルー及ヒアルコキシ
カルボニルアル中ル基がこれに該当し、この際アルキル
基はそのりと炭素原子１〜５個、殊に１〜３個有する。

二重換のカルボキサミド官能基においてハ、閘置換基が
閉環して、ヘテロ原子、例えば酸素原子、窒素原子及び
硫黄原子で遮断されて良い環を形成し得る。

一般式■のレゾルフィン−誘導体で一般式■のグリコシ
ドに結合しているグリコシド基としては、相応するグリ
コシダーゼにより再びレゾルフィン−基礎構造から分離
される全ての単糖類及び少塘類が適する。本発明による
グリコシドの例としては次のものが挙げられる：β−Ｄ
−が２クトぎ２ノシド、α−Ｄ−がラクトピラノシト、
β−〇−グルコぎラノシド、α−Ｄ−グルコぎラノシド
並びにα−Ｄ−マンノピラノシド。

グリコシド基としては、サツカリド鎖を分離する酵素に
より単一もしくは少−糖類の段階にまで分解されるオリ
デー糖鎖も適し、その単一もしくに少−塘類鑞七の側で
相応するグリコシドと共に、直接レゾルフィン−基ｖｌ
構造から分離することができる。かかるオリイー糖鎖と
しては特に単簡−率位２−１０、特に２〜７から構成さ
れている鎖である。

本発明の目的は互変異性の一般式１／　ａ及びｎ′ｂ： 〔式中Ｒ１／　〜Ｒ６／は置換基Ｒ１−Ｒ６と同じもの
であり、この際Ｒ１′〜ｕ５／は全てが同時に７に素原
子を費わ丁ことは出来ず、かつＹは前記のものである〕
の新規の化合物である。

問題点を解決するための手段 この化合物に新規である。これは一般式■のレゾルフィ
ン−誘導体のグリコシドの製造のための中間生成物とし
て特に適する。

一般式■′の化合物は、公知のレゾルフィン（式中Ｈ１
−Ｒ’がそれぞれ水素原子を表わす一般式■の化合物）
の製造に適している方法と同様にして製造される。

一般式ｎ′の化合物は有利な方法で、一般式■、：〔式
中Ｒ１′〜Ｒ”ｕ前記のものである〕のニトロソレゾル
シン−誘導体を、一般式■： 〔式中Ｒ４／〜Ｒ６７に前記のものである〕のレゾルシ
ン−誘導体とパイロルース鉱及び硫酸の存在で低温で反
応させることにより製造する。その際、先ず、式中Ｙが
Ｎ−０−基である一般式Ｂ′の化合物が生成する。この
物質はアンモニアの存在で亜鉛末を用いて容易に式中Ｙ
が窒素原子を表わす一般式り′の化合物に変換すること
ができる。

一般弐■の化合物と一般式■の化合物との反応は通例は
一１０℃〜５０℃、殊に０℃〜３０°Ｃの温度で実施す
る。一般式■及び一般式■の物質を約０℃で混合し、か
つ反応混合物を引続き室温に加熱する場合に、反応は特
に穏やかに経過する。パイロルース鉱の濃度は有利に０
．５〜５、殊に１〜２七ル／ｊでなげればならない。

硫酸濃度は０．５〜５、殊に１〜３七ル／ｊでなければ
ならない。

式中ＹがＮ−４０−基である一般式ｎ′の化合物の、式
中Ｙが窒素原子を表わす一般式■′の化合物への還元は
殊にアンモニア性溶液中で亜鉛末を用いて実施するにエ
ツキ等著、（Ｎ１ｅｔｚｋｉ　）、ベル、ドイチュ、ケ
ム、ｒス、　　（Ｂｅｒ、　Ｄｔｓｃｈ。

Ｃｂ＠ｍ、　Ｇｏｓ、　）第２２巻、第３０２０頁（１
８８９年〕参＠）。溶剤として有利に水−アルコール−
混合物、殊にメタノール０〜４部と共に水１部よりなる
混合物を使用する。還元すべき物質１モルにつき亜鉛末
１〜２０、殊に１〜５モルを少量ずつ加える。この際反
応溶液の温度は−１′０℃〜＋６５℃、殊に＋５°Ｃ〜
＋１０℃で保つ。温度範囲を正確に保持することに明白
な反応経過に不可欠なことであると判明した。冷却なし
では発熱反応が起り、分離し難い副生成物が生じる。

選択された穏和な条件下で、一般弐■及び−般式■の物
質の間の反応は明白に、かつ良好な収率で経過する。選
択された合成方法は変えることができる。これは特に非
対称に置換したレゾルフィン−もしくは同様にレゾアズ
リン−誘導体の製造に関して数多くの合成可能性をもた
らす・ 式中Ｒ４／又は／及びＲ６′が低級アルコキシカー個又
は２個の置換基を有していてよいルホニル基、　ｒＦ／
’Ｊ’７Ｆ倉７７７Ｆｉ’Ｆカルボキサミド基、又は基
−ＣＯＯ−（Ｃ１（、ＣＦＩ２０）ｎ−’Ｒ′Ｆｔ−ｉ
わす式■′のし・戸ルフィンー誘導体は有利に一般式■
： Ｒ７“ 〔式中Ｂｉ　、　Ｂａ　、　Ｒ３及びＲＩＢ前記のもの
であり　Ｒ４“及びＲ６“はカルボ中シ基ｔ−表わし、
かつＲ？“は水素原子又は低級アルキル基金表わ丁〕の
トリアジル化ジヒドロレゾルフィンを介して製造される
。

カルボン酸−官能に文献で公知の方法によフ、例えば塩
化オキサリル／λＦ又は塩化チオニル／　ＤＭＦ　ｔ−
用いて酸塩化物に変換し、これから任意のアルコール及
びアミンとの反応により相応の置換したカルボン酸エス
テル−もしくはカルボキサミド−誘導体が得られる。

こうして得た一般弐■のアセチル化誘導体を苛性アルカ
リ溶液、有利に苛性ソーダ溶液又は苛性カリ溶液０．１
〜５Ｍで、又はアンモニア水１〜１５Ｍ及び酸化剤、有
利にヘキナシアノ鉄（（［Ｉ）　ｆｆｉカリウムで、水
溶性の有機溶剤、例えば１．４−ジオキサン又はメタノ
ールの添加下に処理することにより相応する一般式■の
レゾルフィン−誘導体が得られる。

アルコール成分としては原則的に全ての可能なアルコー
ルが適する。特にジエチレングリコール−モノエチル−
エーテル、トリエチレングリコール−モノエテル−エー
テル又ハ間単なアルコール、例えばメタノール又はエタ
ノールが有利である。アミン−成分は同様に全ての可能
なアミンから選択逼れて良い。特に極性基含有するアミ
ノ、例えばモルホリン、メト中ジエチルアミン又はグリ
シンアミド又はアンモニア、−級又は二級低級アルキル
アｉｙが有利である。

更に、常法で保１され九カルボキシルー官能ｔ−有する
アミノカルボン酸、例えばグリシン−第＝ブチルーエス
テル、グリシンベンジルエステル又ｒＬＮａ−ＢＯＣ−
リジンメチルエステルヲ使用することができる。こうし
て保護基の分離後、脂肪族カルボン酸−官能を有するレ
ゾルフィン■もしくはし１戸ルフィン−グリコシド■が
得られる。

一般式Ｖのアセチル化ジヒドロレゾルフィンは、相応す
るし・ｔルフィン又扛レゾアズリンから、強還元剤、例
えば塩化錫（ｎ）又は酢酸クロム（Ｕ）との反応により
、又は電気化学的還元及び引続いてのアセチル化により
得られる。還元のためにレゾルツイン又はレゾアズリン
を５〜３５％の水性塩酸中塩化錫（Ｉｌ）　２〜１０百
貴、有利に２〜６当量と共に１０分間〜１時間加熱する
。冷却するとジヒドロ化合物が析出する。

アセチル化は常法で無水酢酸で行なう。一般式Ｖの化合
物は一容器方法で還元的アセチル化により有利に製造さ
れる。相応するレデルフイン又はレゾアズリンは塩化錫
（ＩＩ）　２〜６当量と共に５分間〜５時間、有利に１
０分間〜３時間無水酢酸中還流下に加熱するか、又は室
＠（Ｒ’ｒ）において４〜１６時間撹拌する。

一般式ｎのしψルフィンー誘導体のグリコシドの合成の
際に４、非−螢光化合物が生成し、これから相応するグ
リコシダーゼを用いて酵素的分解により再び４１元のレ
ゾルフィン−誘導体が遊離する。ｌａもしくｒＬＩｂ式
の発螢光団のし１戸ルフィン−誘導体は従来公知のその
他の発色団もしくは発螢光団の基のグリコシドに比較し
て極めて有利な特性を示す。−置換誘導体としてこれは
酵素的加水分解の動力学を示し、これは極めて簡単にミ
バエリス−メンテン−式により記載され得る。レゾルフ
ィン−β−〇−がラクトピラノシドには例えばミバエリ
ス一定数ＫＭ　−０，３８はす毫ル／ｊがあてはまる。

天然の基質花種によりこの加水分解の阻害は競争であり
、従って一定の検査にはレゾルフィン−誘導体のグリコ
シドの天然グリコシド、例えばβ−Ｄ−がラクトシダー
ゼの場合にヰ乳糖の添加による轡別な変換が限定されか
・り可逆的に変化嘔れ得る。

ｉａもしくはＩｂ式のレゾルフィン−誘導体のグリコシ
ドに水溶液中で＋４℃で実温に無限に安定である。レゾ
ルフィン−基礎構造のグリコシドの溶解性はすでに殆ん
どの動力学的目的に十分間に合う。カルボン酸エステル
、極性基もしくはスルホンｌ！！２基を有するカルボン
酸−誘導体に相応するグリコシドの溶解性をなお実際に
改良嘔せる。

ｉａもしくはＩｂ式の生成物の励起及び放射は可視スペ
クトル範囲で十分な量子収量である。

レゾルフィンの最高螢光強度は一一値７．０以上で達し
、よジ低い一一値については少しずつ降下する。レゾル
フィンのグリコシドは水溶液中で殆んど帯黄色である（
約４７０　ｎｍでλｍ＆工）。

酵素反応の後に生成物は赤色を示しく約５７０ｎｍでλ
ｍ＆工）、従って物質ｔＢ：度測定及び非−器械的な視
覚的方法に同様に卓越的に適している。

新規の一般式ｌのレゾルフィン−誘導体のグリコシドは
相応するグリコシダーゼ、例えばα−り一及びβ−Ｄ−
力２クトシダーゼ、α−Ｄ−及びβ−Ｄ−グルコ７ダー
ゼ並びにα−り一マンノシダーゼの活性の測定のために
使用することができる。

式中グリコシド−基がオリブー塘−鎖である一般式ｌの
レゾルフィン−誘導体は、糖鎖を分離する酵素、例えば
α−アミ２−ゼの検知にも特に適する。この際オリゴー
Ｗ＋鎖は検知すべき＃素により特有の方法で殊に単糖類
の段階にまで分離嘔れ、その際必要の場合にはその他の
補助酵素を便用することができる。次いでこれ隘相応す
るグリコシダーゼにより前記の方法でし・戸ルフィンー
基ｌＩ構造及び率１１！類に分Ｓされる。

更に、新規の一般式１のレゾルフィン−誘導体のグリコ
シドを含有するグリコシダーゼ活性測定の丸めの診断剤
が特許請求される。グリコシダーゼのための基質として
一般式Ｉのレールフィン−誘導体のグリコシドの使用は
明らかに従来公知であるそれよりも精密な試験方式であ
る。新規の基質はグリフジダーゼの活性測定のために有
利に生物化学的、生物工学的並びに臨床−化学的領域で
使用され得る。これはより精密である。それから多くの
利点が生じる：ａ）より少ない酵素−活性を測定するこ
とがでさる。

ｂ）より少ない量の試料を使用することができる。

Ｃ）活性の測定は著しくより短時間で行なうことができ
る。

ｄ）少ない試料装入及び万利な測定波長社更にその他の
試料成分による方法の妨害感受性を減少させる。

ｅ）担体母体中の変換を非可動酵素で測定することがで
きる。

一製０ ｖ　　　ｙｗｙ基質は各素性のグリコシダーゼの活性を
測定するのに適していることが示嘔れた。Ｐ％’７Ｆ／
＊一般式ｌの基質を有する診断剤は従来公知の試験剤よ
りも明らかに精密に反応する。

一般式Ｉのレゾルフィン−誘導体のグリコシドは免使学
的測定法にも適し、その際グリコシダーゼは指示−酵素
として使用され、その活性は免疫学的反応の実施により
確められねばならない。かかる酵素指示反応での先染学
的測定方法な、半業者には酵素免疫分析として知られて
いる。この方法は蛋白質、多塘類、ホルモン、医薬品及
びその他の低分子物質の濃度を１０−”〜１０″″１２
モル／！の範囲で測定するなめに用いる。相分離処理の
必要に応じて均質及び不均質試験操作の区別をする。も
う１つの分＠は競争及び非競争試験厚埋において行ない
得る。

しかしながら全ての試験原理は酵素−抗原−もしくは酵
素−抗体−複合体で操作する。酵素指示反応は全ての酵
素免疫分析に共通である。

かかる目的に適当な指示酵ｘｈ例えばグリコシダーゼ、
特にβ−Ｄ−がラクトシダーゼである。

かかる＃素免疫分析におけるグリコシダーゼの測定は通
例、適当な基質を添加し、酵素的に分解し、かつ常法で
測光的に又は同様に螢光測定することにより行なわれる
。

従ってグリコシダーゼ−試験系の改善はかかる酵素免疫
分析における著しい利点にもつながる： １、　より高い精密性はこの場合も更に検出限界の低下
、より短かい反応時間及びより少ない試料装入及びそれ
によりその他の試料成分によるより少ない妨害を可能に
する。

２、　より有利な測定波長は一定の反応実施において不
溶性の成分による、例えば懸濁による方法の妨害感受性
を減少名セる。

診断剤に一般式■の基質１糖又はそれ以上の他に、適当
な緩衝液系並びに場合によりその他の適当なかかる診断
剤に常用の添加物、例えば湿潤剤、安定剤等を含有する
。診断剤μ浴液の形で、凍結乾燥物として、粉末混合物
として、試薬錠剤又は吸収可能な支持体上に付Ｎされて
存在して良い・ 溶液の形の診断剤は殊に試験に必要な全ての試薬を含有
する。溶剤としては水又は水溶性の有機溶剤、例えばメ
タノール、エタノール、アセトン又はジメチルホルムア
ミドと水の混合物がこれに該当する。安定性の理由から
、試験に必要な試薬を２種又はそれ以上の溶液に分配す
ることが有利であり、これらの溶液は実際の検査の際に
はじめて混合嘔れる。

そのつと約５〜２０■、殊に約１０ＩＩ９の龍重量で凍
結乾燥物の形の診断剤を製造するために、試験に必要な
全試薬の他に常用の賦形剤、例えばポリビニルぎロリド
ン、及び場合によりその鬼 他の充料、例えばマンニット、ノルビット又はキシリッ
トを含有する溶液を乾燥する。

粉末混合物又は試薬錠剤の形の診断剤扛、試験成分を常
用のがレヌス添加物と混合し、顆粒化することによって
製造することができる。この１類の添加物は例えば塘ア
ルコール、例えばマンニット、ンルビット又ハ中シリッ
ト又ａその他の溶性の不活性化合物、例えばポリエチレ
ングリコール又はポリビニルぎロリドンである。

粉末混合物又は試薬錠剤は一般に最終重量約３０ダ〜２
００■、殊に５０η〜８０！ＩＩｇである。

試験テープの形の診断剤の製造には、吸収可能な支持体
、殊に濾紙、繊維素又は合成繊維フリースを、易揮発性
の溶剤、例えば水、メタノール、エタノール又はアセト
ン中の、試験テープの製造に常用の必要な試薬の溶液で
、含浸させる。これｒＬ１含浸工糧で行なわれてよい。

しかしながら屡々、含Ｉ！！を数工穐で実施することが
有利であり、この際そのつと診断剤成分の一部分を含有
する溶液を使用する。すなわち例えば第１工程では緩衝
液及びその他の水溶性の添加物を含有する水溶液で含浸
し、次いで第２工糧でグリコシダーゼ−基質を含有する
溶液で含浸することができる。完成試験紙はそのものと
して使用する又は自体公知の方法で柄状物に接着させる
か、又は殊に西ドイツ国特許第２１１８４５５号明細書
に依るプラスチック及び目のつんだ網状物の間に接着嘔
ゼることができるＯ 本発明の化合物を合成する種々の方法、それを使用する
１式の化合物の製法、並びに実例としてグリコシダーゼ
活性測定のための新規のレゾルフィン−誘導体のグリコ
シドの使用を次の実施例につき示すＯしかしながらそれ
らは本発明の目的の限定を意味するものではないＯ実施
例 例　　１ ａ）レゾルフィンの製造 レゾルフィンを、良好な純度で市販で得られるその酸化
生成物レゾアズリンから、ニエツキ（Ｎ１ｅｔｚｋｉ　
）等の記載に依シ〔ペリヒト・デル・ドイチェンＯケミ
カル　デゼルシャフト（Ｂｅｒ。

Ｄｔｃｈ、　Ｃｈｅｗ、　Ｇｅ１１．）第２２巻（１８
８９年）第３０２０〜５０６８頁〕製造する。このため
にレゾアズリン〔フル力（Ｆｌｕｋａ　）　、デツノ１
ス（ＢｕＣｈｊｉ　）　、スイス（８ｃｈｗｅｉｚ　）
）　１０　ｇ　（４３ミリモル）をビーカー中で２５％
Ｃ）アンモニア溶液５０−１３７％の亜硫酸水素ナトリ
ウム−溶液２５−及び水５０１Ｒ１と共に３０分間沸騰
水浴上で加熱する。再びアンモニア縛液２０−２亜硫酸
水素塩−溶液７―及び水２０ｄを添加し、更に３０分間
加熱する。変換は青色から赤色への変色で、又は薄層−
クロマトグラフィーを介して観察することができる。反
応が完全に終了した後に、５２６（Ｄ塩溶液ＩＱｄを加
え、ｐ）１５にする。反応溶液１に１日冷厳庫中に放置
する。

その後に褐色の沈殿を吸引濾過し、水冷の塩酸溶液でｐ
）ｉ　４１ＣＬ、洗浄し、１１０℃で乾燥する。

収量７．８ｇ（３６，７ミ１７モル；ｊ１Ｍ値（０８５
％）。

ｂ）レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドへのレ
ゾルフィンのグリコモル化 テト２アセテートの中間段階を介してフェノール性ヒド
ロキシル基へのグリコジル化ハ次Ｏ方法により成功した
。微粉末のレゾルフィン２．１３ｇ（１０ミリモル）、
アセトゾロモーα−ローガラクトース〔シグマ（８１ｇ
ｍａ　）ミュンヘン）４．１２ｇ（１０ミリモル）、酸
化銀（１）〔フル力（Ｆｌｕｋａ　）、デツノ１ス（Ｂ
ｕｃｈａ　）、スイス）１．１６ｇ（５ミリモル）、硫
酸カルシウム（Ｃａ８０４　・”／＠　Ｈ２Ｏ；無水硫
酸カルシウム）５ｇ１粒状沃素若干量及びキノリン５０
μｊを塩化メチレン５０−中で室温で４０分間攪拌する
。

この際レゾルフィンの４０％がレゾルフィン−β−〇−
ガラクトピラノシド−テトラ−アセテートに変換する。

反応の１１１４整は再び薄層−クロマトグラフィーに依
シ実施されてよい。固体成分を襞付き濾過器及び遠心分
離を介して分離した後に塩化メチレンを回転蒸発器中で
除去する。

レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド−テトラ−
アセテートは・喝黄色のシロップ状物として残留する。

収潰約２ｇ（理論値の３５％）。

レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド−テトラ−
アセテ−）２１Ｆをそれ以上の精製なしく無水メタノー
ル１３ＱａＪ中に取シ込む。ナトリウム０．５ｇを小片
ずつ、水浴中で無水メタノール２０ｄ中に溶解する。水
浴中で攪拌下でメトキシド溶液６〜８ｄを３０分間以内
に１−ずつレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
ーテトクーアセテートー溶液に加え、かつ脱アセチル化
を薄層クロマトグラフィーを介して観察する。生成した
橙色のレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを吸
引濾過し、かつ水冷のメタノール少量で洗浄する。収蓋
約１ｇ粗物質（理論値の７０％）。メタノールから再結
晶させ、久いて乾燥（６０℃以上にならない）して純粋
な生成物０．２Ｉが得られる。

反応経過のｖ４整のための全薄層−クロマトグツフィー
検査は珪Ｍ、デル６０（メルクＭｅｒｃｋ社、ダルムス
タット）系及び展開剤塩化メチレン／メタノール（９／
１）を用いて行なうことができる。この系のために次０
Ｒｆ−値があてはまるニ レゾルフィン　　　　　　　　　０．４レゾアズリン　
　　　　　　　　０．３５例　２（参考例） レゾルフィン−β−Ｄ　−！　１７コシ「レゾルフィン
（例１１！Ｌに依り製造した）　２．１３ｇ（１０ミリ
モル）、アセトゾロモーα−Ｄ−グルコース４．１　ｆ
　ｇ（ｆ　Ｏミリモル）及ヒヘキサデシルトリメチルア
ンモニウムデロミド３．６４１　（１０ミリ％、ｚ）を
１Ｎ苛性ソ一ダｍ液１１．５ｄ及びクロロホルム５Ｑｄ
Ｏ混合物中で４時間還流加熱した。そ（０４１ｋＭ発乾
固させ、酢酸ニスの溶液から生成するテトラアセチルレ
ゾルフィン−β−Ｄ−グリコシドを活性炭の添加下にメ
物を吸引濾過し、乾燥する。収ｉｉ：　ｓｏ■Ｉ　Ｈ−
ＮＭＲ（ＣＤＩｓ−ＤＭＳＯ）　：δ−５，１５−５，
８０（ｍ、６Ｈ）；４．５−＜５．５（広巾ｔ　４Ｈ）
；５−１２　（（１−Ｊ　＝６−９　Ｈｚ　、１Ｈ）　
ｓ　６−２９　（ｄ−Ｊ　＝２．０　Ｈｚ　、　Ｉ　Ｈ
）　；　６．８０　（ｄｄ　、　Ｊ　＝９．６及び２．
ＯＨｚ　−Ｉ　Ｈ）　；　Ｌｌ　２　（ｄ　ｄ　−Ｊ　
＝８−５及び２−ＯＨｚ　、Ｉ　Ｈ）　；　７，１６　
（ａ　−Ｊ　＝２．０Ｈｚ　、　Ｉ　Ｈ）　；　７．５
５（ｄ　、　Ｊ＝９．６！（ｚ　、ＩＨ）；７．８０　
（ｄ　、　Ｊ＝８．５！（ｚ　、　Ｉ　Ｈ）。

例　３ ニトロンレゾルシン５０ｇ、３．５−ジヒドロキシ安息
香酸メチルエステル５５．５１１及びイロルース鉱２８
．０　Ｅｌをメタノール５０〇−中に廖かす、もしくは
懸濁させる。水冷下で５〜１０℃で濃硫酸３４．４１７
を滴加する。水浴の除去後、更に２時間攪拌する。そ０
ｆｅＶｃ冷却下でアンモニア水！／１ｉ２００−を加え
る。生成する沈殿をガラス繊１Ｉａ１１１過器を介して
濾別する。濾液に５〜１０℃で亜鉛末１０１／を少量ず
つ加える。還元が完了するまで（薄層クロマトグラフィ
ー（ＤＣ）−調整、展開剤として酢酸エステル／メタノ
ール４：１、反応時間約１．５時間）の間室温で攪拌す
る。回転蒸発器上で浴ｍ２５℃で容蓋の１／３に譲゛縮
する。冷却下で濃塩酸で変色するまで酸性化することに
よｐ、所望の生成物が生成する。希堪酸で洗浄し、塩化
カルシウム上で真空中乾燥した後にレゾルフィン−１−
カルボン酸メチルエステルが得られる。収量二３０．９
　Ｆｌ　（理論値（Ｄ５６チ）。

Ｉ　Ｈ−ＮＭＲ：　（ＣＤ）ａ−ＤＭＳＯ）　：　ａ　
＝　５．９９　（ｓ　。

３Ｈ）；５．４７（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、ＩＨ）；６．
８５−６．９５ｔｍ、　　２ａ）；７．０９　（ａ、、
ｙ−２，２ｕｚ、１Ｈ）；　　７．６０　（ａ、ｓｓ９
，６Ｈｚ。

ＩＨ）。

螢光：吸収：λｍａｘ＝５７０　ｎｍ 発光：λｍａｘ　＝５８８　ｎｍ 同様の方法で、 ａ）３．５−ジヒドロキシ安息香酸及びニトロソレゾル
シンから、レゾアズリン−１−カルボン酸を経由して、 レゾルフィン−１−カルボン酸 ＴＪＶ／ｖＩ８　（０，ｆ　Ｍ燐酸カリウム−緩衝液、
…７．５　）　：λｍａｘ　＝５６９　ｎｍ　％ｂ）４
−ｏ−メチル−没食子酸メチルエステル及びニトロソレ
ゾルシンから、４−メトキシ−レゾアズリン−１−カル
ボン酸メチルエステルを経由して、 ＴＪＶ／ＶＩ８　（０，１Ｍ燐酸カリウム−緩衝液、−
７．５　）　：〜ａｘ＝５９２　ｎｍ Ｃ）３，５−ジヒＶロキシ安息香酸メチルエステル及Ｕ
４−／ロルー６−二トロンレゾルシンから、８−クロル
−レゾアズリン−１−カルボン酸メチルエステルを経由
して、 （１）４−０−メチル没食子酸メチルエステル及び４−
ブロム−６−ニトロソレゾルシンから、８−ブロム−４
−メトキシ−レゾアズリン−１−カルボン酸メチルエス
テルを経由して、ｅ）５−ニトロレゾルシン及ヒニトロ
ソレゾルシンから１−ニトロ−レゾアズリンを経由して
、 ｆ）　　レゾルシン−５−スルホンｍ及０−ニトロツレ
チルジンカラ、レゾアズリン−１−スルホン酸を経由し
て、 レゾルフィン−１−スルホン酸 が得られる。

例　４ レゾアズリン−４−カルボン酸 ニーロンレゾルシン１．６０ｇ（１０，５ミｌＪモル）
、２．６−ジヒドロキシ安息香酸１．５５ｇ（１０，０
９９モル）及び／ｆイロルース鉱０．８６ｇ（１０ミリ
モル）をメタノール２０ｄ中に取シ込み、０℃に冷却す
る。これに濃硫酸１．０６１を滴加する。更に２Ｑ間冷
却なしに攪拌する。

沈殿する赤色生成物を濾別し、メタノールで洗浄し、乾
燥する。収量：　２．３１　（、理論値の８５％） ＴＪＶ／ＶＩ８　（０，Ｉ　Ｍ燐酸カリウム緩衝液ｐ）
１７．５）：λＴｎａｘ＝＝６ｊ　４　ｎｍ　（ｉ　＝
４８ｃｍ”モル″″ｌ）酸性後λｍａｘ＝　５２２　ｎ
ｍ　（ｉ　＝　３２ｚ２−ｖ−ル″′１）例　　５ レゾルフィン−４−カルボン酸 レゾアズリン−４−カルボン酸（例４に依シ製造）　２
．３１１を水２０ｍ及び２５チ０７ンモニア５−中ＶＣ
＋６かす。青色溶液に水冷下で亜鉛末５ｇを加える。そ
の後に水冷を除き、従って溶液は徐々に室温に温くなる
。還元は青色から暗紫色への変色で容易に知るか、もし
くは薄層−クロマトグラフィー（展開剤：メタノール／
酢酸エステル１：１）に依シ観察される。過剰の亜鉛末
は濾別する。反応ｍ液を氷酢酸５−及び濃塩酸で酸性化
する。沈殿する生成物を濾別し、希塩酸で洗浄し、真空
中塩化カルシウム上で乾燥する。収量：Ｌ８ｇ（理論値
の８２優）。

ＵＶ　／ＶＩ８　：　（０，Ｉ　Ｍ燐酸カリウム緩衝液
−７，５）：λ　　＝５７９．４　Ｃｍ（ｇ＝４８．（
５ｃｍ１ａｘ モル−１）； 酸性後　：　λｍａｗ冨４８５−９ａｍ（ｇ＝３４・７
ｃＩＲ２モル″″１　） 螢　光　：　吸収：λ　＝５７９　ｎｍａｘ 発光：λ　＝５９５　ｎｍ ｍａχ 例　６ ２．６−シヒドロキシー４−メチル安息香酸８４０Ｍ９
、ニトロルゾルフィン７６０η、パイロルース鉱４３０
ダ及び硫酸Ｑ、５３ｒＩＬｌを例４と同様に反応させて
１−メチルレゾアズリン−４−カルボン酸にする。収ｔ
：ｏ、ａｇこうして得た１−メチルレゾアズリン−４−
カルメン酸を例５と同様に還元して１−メチルレゾルフ
ィン−４−カルボン酸くする。収量二０．４ｇ ＵＶ／ＶＩ８　（０，１Ｍ燐酸カリウム緩衝液−７，５
）：λｍａｘ＝５７１　ａｍ 例　　７ ｊ）Ｎ、Ｏ，Ｏ−）リアセチルジヒドロレゾルフィン−
４−カルざン酸 変法ａ） レゾルフィン−４−カルボン酸５ｇ（１９，４ミリモル
）又はレゾアズリン−４−カルボン酸５．５　ｆｉ　（
１９，４ミリモル）を１０％の塩酸１００ｄ中テ０．５
４間塩化錫（ｆｆ）　７．！ｉ’　（３８ミ９ｑ＝ル）
と共に還流加熱する。この際溶液は緑色に変色する。冷
却し、生成するジヒドロレゾルフィン−４−カルボン酸
を窒素下で濾別し、真空中五酸化燐上で乾燥する。こう
して得た粗生成物を６０分間無水酢酸６０ゴ及び酢酸ナ
トリウム２０ダと共に還流加熱する。反応混合物を氷水
２００ＷｔｌＫ、入れ、１４時間攪拌する。沈殿をエタ
ノール／水から再結晶させる。所望の化合物４．８１！
　（６５％）が得られる。

融点：１９７〜１９９°Ｃ ＤＣ（珪酸ゲル、展開剤クロロホルム／メタノール／氷
酢酸９　：　１　：　０．１　）Ｒｒ　＝　０．５３ 変法ｂ） レゾルフィン−４−カルボン酸５．１　ｇ（２０ミリモ
ル）を無水酢酸２０プ中で塩化錫（ＩＩ）１１１／Ｃ６
０ミリモル）と共に１時間８０℃で攪拌する。氷水２３
０ｄに加え、１時間攪拌し、濾過し、変法ａ）の様に後
処理する。

収ｔ　：　５．４１１　（７１チ） ２）Ｎ、Ｏ，Ｏ−）リアセチルジヒドロレゾルフィン−
４−カルボン酸クロリド Ｎ、Ｏ，Ｏ−トリアセチルゾヒｒｃｌレゾルフィン−４
−カルボン酸３．８５ｇ（１０ミリモル）に塩化オキサ
リル５−４１１！ｊ（６０ミ替モル）を混合し、−１０
℃に冷却する。これにジメチルホルムアミド１滴を加え
、反応混合物を攪拌下で室温に温める。この際遊離物が
ガス発生下に溶解し、ガス発生の終了後、更に０．５時
間攪拌し、蒸発させ、無水塩化メチレン２０１で各３回
取シ込み、蒸発乾固する。こうして粗生成物４ｇが得ら
れ、これ以上精製することなく、更に処理する。

ＤＣ（珪酸グル、展開剤クロロホルム／メタノール／氷
酢酸９：１：０１１） Ｒｆ＝０．４２； 無色のフレーク状物、これは数時間後に赤色に変わる。

３）Ｎ、０．０−）リアセチルジヒドロレゾルフィン−
４−カルボン酸−モルホリド 粗製ＣＤ＠塩化物Ｉ　Ｌ３ｇ（Ｓ　Ｌ４ミリモル）を無
水塩化メチレン１５０ｄ中に溶かす。これにトリエチル
アミン８．７１１！ｊ（６３ミリモル）及び引続きモル
ホリン３．３　Ｒ１（５７，７ミリモル）を滴加する。

更に２時間攪拌し、溶液を１％のクエン酸、炭酸水素す
）　＋７ウム溶液及び水で洗浄し、有機相を硫酸マグネ
シウム上で乾燥させ、蒸発する。残渣をエタノールから
結晶化させる。

収槍：　８．１１１　（６５チ）、融点：１３３〜１３
５℃（分解） ４）レゾルフィン−４−カルボン酸−モルホリｒトリア
セチルジヒｒロレゾルフィン−４−力これに１ａＶＩＩ
性ソーダ尋液３６−及びヘキサシアノ鉄酸（ワカリウム
６．０　ｇ（１８ミリモル）を加え、１４時間室温で攪
拌する。塩酸でＰ１″］３に酸性化後蒸発乾固させ、ア
セトンで浸出する。

色科−溶液を珪酸デル５００ＷＩＪを介して展開剤とし
てアセトンを用いて濾過する。色科含有の溶離液を蒸発
した後に生成物２．３１　（８０１）を得る。

ＵＶ／ＶＩ８　（０，Ｉ　Ｍ燐酸力ＩＪｒ）ムｌｉ衝液
ｐ）１７．５）：λｍａｘ＝５７５　ｎｍ５ｌ−５５＄
０００ｃｍ”　−ｖ：ｈ−Ｌ　）ＤＣ’（展開剤、２以
下参照） ａｔ−０，５２ ”Ｈ−ＮＭＲ（（Ｄ）６−ＤＭ８０）　：δ−５，３−
３，８（ｍ、　８Ｈ）；６．５０（ｄ、Ｊ−２ＨｚｅＩ
Ｈ）；６−６４（（！　ｅ　Ｊ　”　１０　Ｈｚ　−Ｉ
　Ｈ）　ｐ　６．７６　（ｄ（！　＊　Ｊ閣１０及び２
　Ｈｚ、　　Ｉ　Ｈ）　ａ　７．４４及び７．５１（そ
れぞれｄ、　Ｊ＝１０Ｈｚ　、　２Ｈ）。

ｎ　　８（参考例） ノシ「 レゾルフィン−１−カルボン酸メチルエステル（ｆＦ１
３に依夛製造）　６．８１１、酸化銀（１）５．７５ｇ
炭酸銀６．７５　ｇ、分子ふるい４′に１　ｓｔ及びα
−デロムーテトラアセチルガラクトース１０Ｉを無水ク
ロロホルム２５０Ｒｊと共に４時間室温で攪拌する。更
にα−デロムーテトラアセチルーガラクトース５ｇを添
加した後に一夜更に攪拌する。反応混合物をガラス繊維
濾過器を介して濾過し、蒸発ｍ縮する。油状粗生成物を
珪＃ｌゲル２Ｊ上で溶離剤としてクロロホルム／酢飯エ
ステル２：１でクロマトグラフィーにかける。Ｒｆ＝０
．２８′ｆ：有する黄色の溶離弁２．５ｇが得られる（
　ＨＰ’ｒＬＣ珪酸ゲル、同一の溶離剤）。

得られる。

収量１．５ｇ ＩＨ−ＮＭＲ（（Ｄ）、−ＤＭ８０）　：ｍ＝　Ｌ９５
．　２．０３゜２．０４及び２１４　（ｊｅｓ、　１２
Ｈ）　；　３．８８（”　＊　　３　Ｈ）　ｚ　４−１
１　（ｄ　−Ｊ　＝７　Ｈｚ　−２Ｈ）　ａ４．５１　
（ｔ、Ｊ−７Ｈｚ　ｍ　２Ｈ）；　５．２４　（ｍ１２
Ｉ（）；５．３６（ｍｅ　　ＩＨ）；５．６９（ｍ、Ｉ
Ｈ）；６．５１（ｄｏ　　Ｊ−２Ｈｚ、ＩＨ）；６．９
７（ｄ　＊　　Ｊ　＝２Ｈｚ　−Ｉ　Ｈ）　　ｐ　　７
．０４　（ｄｄ　、Ｊ　＝８．８及び２．４Ｈｚ　、Ｉ
　Ｈ）　ｓ　７−１４　（ｄ、　ｍ＝２−４　Ｈｚ　　
、　　Ｉ　　Ｈ）　　ｐ　　７−７８　（ａｄ　、　　
Ｊ　＝８−８　Ｈｚ　−ＩＨ）。

その後、Ｒｆ−０，２４を有する同様に黄色の溶離弁が
得られる。メタノールから、テトラアセ晶で晶出する。

収量：１．２ｇ ｌＨ−ＮＭＲ（ＣＤ）、−ＤＭ８０）　：ｍ＝　１．９
５．　２．０２゜２．０４及び２．ｆ　４　（各ｓ、　
１２Ｈ）　；　３．９０（ｓ、３Ｈ）；４．０９（ｍ、
２Ｈ）；４．５１（ｍ−Ｉ　Ｈ）ｎ　５−２５（（１，
：１士７Ｈｚ−Ｉ　Ｈ）；５．２５（ｍ、ＩＨ）；５．
３６（ｍ、　　１Ｈ）；５−７１　（ｍ＝　　Ｉ　Ｈ）
　ｓ　６−５０　（ｄ、　ｍ＝２Ｈｚ。

１　）り；６．８３（ｄｄ、ｍ＝ＴＯ及び２Ｈｚ、ＴＩ
（）　；　７．２０及び７．２４　（各ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ
。

２Ｈ）；７．４７（ｄ、ｍ＝１０Ｈｚ、ＩＨ）。

純粋な生成物の間でなお混合溶離弁が得られ、それから
メタノールからの再結晶によ〕、両異性体化合物の混合
物の結晶２．５ｇが得られる。

同様の方法で、α−デロムーテトラアセチルガラクトー
ス及び ａ）４−メトキシ−レゾルフィン−１−カルボｂ）　　
８−クロル−レゾルフィン−１−カルボン例　９　（参
考例） 一モルホリドーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド及しゾルフ
イ／−４−カルボン酸モルホリド３．２６ｇ（１０ミリ
モル）を例８と同様にしてガラクトシド化する。粗生成
物を珪ｒＩＲデル１Ｊ上で溶離剤として酢酸エステル／
アセトン６二１でクロマトグラフィーにかける。こうし
てｔＤＣ（珪酸ゲル、溶離剤例７参照） Ｒｆ＝０．７１ ０．４ｇ ＤＣ（珪酸デル、同一の溶離剤） Ｒｆ　＝　０．７６ 並びに両異性体よシなる混合Ｉ！２！雌分１．２ｇが得
られる。

例１０（参考例） レゾルフィン−１−カルボン酸メチルエステルテトファ
セチルレゾルフィン−９−力／Ｌ／ボン酸メチルエステ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド１．２ｇを例２と同様
にしてナトリウムメチラート／メタノールで脱アセチル
化する。収量二０．８ｇ ＵＶ／ＶＩ８　（０，１Ｍ燐酸カリウム緩衝液ｐ）ｊ　
７．５　）：λ　　＝４　（５４ｎｍ　（ａ　＝２１．
１３ｃｍ”、モル−’　）ａｘ β−ガラクトシダーゼでの分離後、レゾルフィン−１−
カルボン酸メチルエステルの陰イオンが得られる。λｍ
ａｘ＝５７２ｎｍ（Ｉ＝６５．４（ｍ”モル−１） ＩＨ−ＮＭＲ（（Ｄ１６−ＤＭ８０）　：δ−３−２０
−！１．８０　（ｍ。

６Ｈ）；３．９１　（ｓ、！ＬＨ）；５．０９（（１，
Ｊ−７−５Ｈｚ、　　Ｉ　Ｈ）　；　６−５０　（ｄ、
　Ｊ＝２．１　Ｈｚ。

Ｉ　Ｈ）　；　６．８１　（ｃｉａ　、　Ｊ　＝　９．
８及び２．１　Ｈｚ　。

ＩＨ）；７．３０（ｍ、２Ｈ）；７．５１　（ｄ、Ｊ＝
９．８　Ｈｚ、　　Ｉ　Ｈ）　；　ＯＨ−陽子極めて巾
広い約５゜ 同様の方法で相応するテトラアセテートの脱アセチル化
によシ次のものが得られる。

ａ）　　レゾルフィン−１−カルボン酸メチルエステル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド ”Ｈ−ＮＭＲ（（Ｄ）６−ＤＭ８０）　：　ａ””　３
−４−３−７　（ｍｅ６Ｈ）　ｓ　５−０９　（ｄ−Ｊ
＝７−５Ｈｚ　、　ｌ　Ｈ）；６．３４（ｄ、Ｊ−２Ｈ
名、１Ｈ）：６．９７（ｄ。

Ｊ−２Ｈｚ　ａ　Ｉ　Ｈ）　ｐ　７−０８−７−１７　
（ｍ　−２Ｍ）；７．７５（１，Ｊ＝ｌＯＨｚ、ＩＨ）
；ＯＨ；極めて広巾、約５　ｐｐｍゆ ｂ）　　４−メトキシ−レゾルフィン−１−カルボン酸
メチルエステル−β−〇−がラクトピラノシド Ｃ）　　６−メドキシーレゾルフインー９−　カルボン
酸メチルエステル−β−Ｄ−ガラクトぎラノシｒ ｄ）８−クロル−レゾルフィン−１−カルボン酸メチル
エステル−β−〇−ガラクトピラノシド ｅ）２−クロル−レゾルフィン−９−カルボン酸メチル
エステル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド。

ｆ）　　レゾルフィン−６−カルボン酸モルホリド−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド Ｒｆ（酢酸エステル／イングロパノール／水９：４：２
）＝０．５β−ガラクトシダーゼでの分離後 ＵＶ／ＶＩ８　（０，Ｉ　Ｍ燐酸カリウム緩衝液−７，
５）：λ　　　＝５７　４．６　　ｎｍ ａＸ 螢光発光：λｍａ工＝５９３　ｎｍ ｇ）　　レゾルフィン−４−カルボン酸モルホリド−β
−Ｄ−がラクトぎラノシド Ｒｆ　（酢酸エステル／イノプロパツール／水９：４：
２）−０，５β−ガラクトシダーゼでの分離後、 ＴＩＶ／ＶＩ８　（０，１７燐酸カリウム緩衝液−７，
５）：λ　　”　５７４．６　ｎｍ ａｘ 螢光発光：λ　　”＝　５９３　ａｍ ａｘ 例１１（参考例） レゾルフィン−９−カルざン酸−β−Ｄ−がツレゾルフ
ィン−９−カルボン酸メチルエステル−β−Ｄ−ガラク
トビ２ノシド２６６■を水５０１Ｒ１及び１．４−ジオ
キサン２０１中に取シ込む。これに０．１Ｎ苛性ソーダ
醇液５　ｔｕｔを０．５ｄずつ添加し、この察溶液〇−
−値が１２．５以上に上らないようにする。反応混合物
ｆ、ＤＥＡ！！１−セファデックＸ　（８ｅｐｈａｄｅ
ｘ）　、炭酸基−形６ｄに装入し、水１８０−で洗浄す
る。

その後、生成物ｔ−０，１Ｍ）リエチルアンモニウムカ
ルボネート緩衝液Ｐ）４７．５で容離する。溶離物を真
空中Ｍ発濃縮させる。その後エタノールで数回蒸発させ
る。

収量ニレデルフィン−９−カルボン酸−β−Ｄ−ガラク
トピラノシドートリエチルアンモニウム塩１１０ダ ＯＶ／ＶＩ８　（０，１Ｍ燐酸カリウム緩衝液−７，５
）：λｍａ：ｃ−４６５　Ｈｍ β−ｔｆツクトシダーゼでの分離後：λ　　＝ａｘ ５７０　ｎｍ ｆｌ１２（参考ｆＩｌ） レゾアズリン−ナトリウム塩１２．６ｇを１Ｎ苛性ソ一
ダｍ液６５＋１１７及び水８０１！ｊ中に溶かす。

これにりａａホルム１５０ゴ中の７セトデロムーα−Ｄ
−がラクトース２０．６　ｇ及びヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウムゾロミド１８．２ｇを加える。混合物を
３時間還流加熱する。その後蒸発乾固させ、酢酸エステ
ルで浸出する。酢酸エステル溶液を再び濃縮し、珪酸ゲ
ル５００ｇ上でクロマトグラフィーにかける（Ｗ！！離
剤：塩化メチレン／酢酸エステル３　：　１　）。Ｒｆ
＝０．５　（ＨＰＴＬＣ珪酸ゲル、同一の溶離剤）を有
するテトラアセチルレゾアズリン−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド２．１３ｇが得られる。

脱アセチル化には、テトラアセチル−騨導体２．１３ｇ
をナトリウムメチラート０．１　ｇと共に無水メタノー
ル１００ｄ中で１時間室温で攪拌する。沈殿する生成物
を吸引濾過し、塩化カルシウム上で真空中乾燥する。

収量：１．０ｇ Ｒｆ　−０，６２（Ｉ（ＰＴＬＣ珪酸デル、酢酸エステ
ル／イソゾロパノール／水９　：　４：　２）ＩＩ（−
ＮＭＲ（（Ｄ）６”−ＤＭ８０）　：δ−５，５０−５
，９０（ｍ。

６　Ｈ）　；　４．５４　（広ａ　＃　ｙ−４−４Ｈｚ
　＃　Ｉ　Ｈ）　ｚ４．６７　（広ｂ　ｅ　Ｊ−４−４
Ｈｚ　ｅ　Ｉ　Ｈ）　ｎ　５−０７（ｄ　、に７　Ｈｚ
　−Ｉ　Ｈ）　ｐ　５．２７　（広ｄ　、　、Ｔ　−４
−４Ｈｚ　ｅ　Ｉ　Ｈ）　ｓ　６．１５　（ｅｉ　、Ｊ
　＝２　Ｈｚ　＋　ＩＨ）　；　６．６３　（ａａ　、
　Ｊ　＝　９．６及び２　Ｈｚ　−Ｉ　Ｈ）　＃７、ｊ
　Ｏ（ａｄ　、　Ｊ＝９及び２Ｈｚ、１Ｍ）；７．２ｃ
ｍｔ　　２Ｈ）；７．９６ｔｄ、ｓ＝９．６ｕｚ。

ｆＨ）；８−０７（ｄ、、７＝９Ｈｚ、ＩＨ）。

例１３ ４−クロル−レゾルシン４−３１　（３０ミリモル）ｔ
−エタノール２〇−中に溶かす。水酸化カリウム２．４
ｇの添加後５℃に冷却する。冷却下亜硝酸インペンチル
２．８１−を滴加する。その後室温で一倹攪拌する。沈
殿を濾別し、水中に溶解し、酸性化する。黄色沈殿を新
たに濾過し、４０℃で真空中乾燥する。収量：４−クロ
ル−６−ニトロンレゾルシン２．５．９（４８チ）Ｒｆ
　：　０．２８　（ＨＰＴＬＣ、珪酸ゲル、溶離剤：メ
タノール／酢酸エステル１：６）。

４−クロル−６−ニトロンレゾルシン１．８５ｇ、２，
６−ジヒドロキシ安息香酸１．５５１１、パイロルース
鉱０．８６　ｇ及び硫酸１．０６１７をメタノール２０
−中く装入し、２時間０℃で並びに１４時間室温で攪拌
する。赤色沈殿が得られ、これを濾別し、乾燥させる。

収量二８−クロル−レゾアズリン−４−カルボン酸２．
４５１１　（８０％） ｔＪＶ／ＶＩＳ　（Ｑ、１ＭＭ燐酸カリウム緩衝液）１
７．５）：λ　　””　６２１．５　ｎｍ ａｘ 同様の方法で、 ａ）　　２−メチル−レゾルシンから２−メチル−６−
二トロンレプルシンヲ介シて ６−メチル−レジアズリンー４−カルボン酸、 ｂ）４−メチル−レゾルシンから、４−メチル−６−ニ
トロソレゾルシンｔ”介しテ、８−メチル−レゾアズリ
ン−４−カルボン酸 ｃ）４−テロムーレゾルシンかう、４−１”ロム−６−
二トロンレゾルシンヲ介して、 ８−ブロム−レゾアズリン−４−カルボン酸 が得られる。

例１４ ８−クロル−レゾルフィン−４−カルボン酸８−クロル
−レグアズリン−４−カルボン酸（例１０に依り製造）
２ｇを水２〇−及び２５％Ｏアンモニア５−中に溶かす
。水冷下で亜鉛末を赤−紫色へ完全に変色するまで添加
する。

過剰の亜鉛を１別する。酸性化後、沈殿する生成物を濾
別し、真空中４０℃で塩化カリウム上で乾燥する。収量
二８−クロル−レゾルフィン−４−カルボン酸Ｌ５ｇ（
７９％）。

ＵＶ／ＶＩ８　（０，１Ｍ燐酸カリウム緩衝液−八５）
：λｍａｘ−５８５−５ｎｍ 同様の方法で、 ａ）６−／チル−レスアズリン−４−カルボン酸から、
６−メチル−レゾルフィン−４−カルボン酸 ｂ）８−メチル−レスアズリン−４−カルボン酸から、
８−メチル−レゾルフィン−４−カルＭノ酸 ｃ）８−テロムーレズアズリンー４−カルメン酸から、
８−ブロム−レゾルフィン−４−カルざン酸 が得られる。

例１５（参考例） ペンタアセチルガラクトース３．９ｇに無水の塩化亜鉛
０．１ｇを加え、１２５°Ｃに加熱する。

２０分間１０ｍ１１’ｍＨｇで攪拌する。醇融物にレゾ
ルフィン−１−カルボン酸メチルエステル１ｇを加える
。混合物を１時間４１℃で攪拌し、そＯ後例７に記載し
た方法で珪酸デル上でクロロホルム／酢酸エステル２：
１でクロマトグラフィーにかける。

収量：テトラアセチル−レゾルフィン−９−カルボン酸
−メチルエステル−α−Ｄ−ガラクトｔラノシド（黄色
油状物）２５雫 Ｒｆ　＝　０．２２　（）ＩＰＴＬＣ１珪ｉｌｌ　ｒ　
＃、同−ｏｓｓ剤） レゾルフイ／−９−カルボン酸メチルエステル−α−Ｄ
−ガラクトピラノシドへの脱アセチル化は例１０と同様
にして実施する。

例１６（参考Ｎ） テトラアセチルレゾルフィン−９−カルボン酸メチルエ
ステル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．６１にジエチ
レングリコールモノエチルエーテル５Ｑｓｕ及びサジ光
量の水素化ナトリウムを加え、１５分間室温で攪拌する
。その後アセトノ１００−を加える。生成する沈殿を濾
別し、乾燥する。

収ｆニレゾルフィンー９−カルボン酸−（５。

６−シオキサオクチル）−二スチル−β−Ｄ−ガラクト
ぎラノシド５６ダ Ｒｆ＝０．５４（珪酸ｒ　ルＨＰＴＬＣ、／Ｉ　１１１
　剤：　ｈ　ａＮエステル／イノプロパツール９：４） 例１７（参考例） レソルフイノーマルトヘプタノシｒ アミラーゼ（Ｌ　Ｃ，２，４，Ｌ　１９　）、例えばバ
チルス　マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｇ　ｍａｃｓｒａ
ｎりよ〕なるアミラーゼは加水分解作用及び環化作用の
他にグリコシルー転移特性を有し、これは少糖類及び少
糖類−鰐導体の合成のために利用することができる（メ
ソーズ　イン　カルボヒｆレート　ケミストリー（Ｍｅ
ｂｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏ−ｈｙｄｒａｔ、ｅ　Ｃ
ｈｅｍｉｇｂｒｙ　）第…巻、第３４７頁）。

バチルスマセランスＤＡＭ　２４　（凍結乾燥物；０．
４６Ｕ／正味ダ； 正味の蛋白質含量２８．５　％　）　　　　６８０ダレ
ゾルフィン−グルコシＦ　　　　　５００■α−シクロ
デキストリン　　　　　３．５２及び セレンセｙ　（８ｏａｒｅｎｓｅｎ）燐酸塩緩衝液（１
）８Ｈ６，２，０−０１Ｍ　）　　　　　７０ｒｎｌを
混合する。装入物を２４時間３７℃で培養する。次いで
後精製のためにα−及び生じたβ−シククデキストリン
を先ずテトラクロルエチレン封鎖化合物を介して分離す
る。網状化デキストクン〔セファデックス（５ｅｐｈａ
ｄｅｘ　）　Ｌ　Ｈ２０）Ｏクロマトグラフィーにより
アミラーゼ試験で高活性のレゾルフィニルマルトへデタ
ノシドの凍結乾燥物５０叩が得られる。

例１８（参考ｆＦＩＩ） β−〇−ガラクトシダーゼの活性測定 ａ）使用する溶液の！Ｉｌ製 緩衝醇液：ＨＩｌｅＰＩ！：８　　　　　　　　　　１
００ミリモル／Ｊ塩化ナトリウム　　　１５４ミリモル
／ＪＬ−アスパ２ギン酸マグ ネシウム　　　　　　　　　　　　　２ミリモル／−ｅ
Ｂ８Ａ　　　　　　　　　　　　　　　１Ｕ／−８トウ
イーｙ（Ｔｗｅｅｎ）−２００−５，ｌｉ’／−６−−
値（苛性ソーダ溶液 で調整）　　　　　　　　　７．３（３７°Ｃ）試薬溶
液１： 前記の緩衝ｍ液中にレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド０．８ミリモル／Ｊｔ溶かも試薬溶液２： 前記の緩衝ｍ液にレゾルフィン−９−カルボン酸−β−
Ｄ−がラクトピラノシド５．５ミ９試薬溶液３： 前記の緩衝液中にレゾルフィン−９−カルボン酸メチル
エステル−β−Ｄ−がラクトピラノシド１．０ミリモル
／Ｊを溶かす。

酵素溶液 大腸＠　（　Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　ｃｏｌｌ　）よ
りなる市販のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを前記の緩衝溶
液中に溶かす。この溶液の活性は約０．０８ｔ７／ｄ（
製造者−データに対して）である。

測定の実施 測定は測光で５　７　９　ｎｍで行なう。

試薬９　５　０　／Ｊ／を１ｃＩｔキユベツト中で３７
°Ｃで酵素溶液５０μＩと混合する。反応に対する尺度
として時間単位毎の消光上昇をＣ　ｍＥＸ＋．　／分〕
で確かめる。反応時間での除法により測定した消光から
計算する。

次の表に実測した測定値を挙げる： 例１９（参考ｆ１１） 検出 均質の組成物のために次のものを施こす二０、５Ｍ燐酸
カリウム及び０．０５Ｍ 塩化マグネシウムを有する水溶液、 ｐ）１　７．５　　　　　　　　　　　　　５　ａｊア
ルヂン酸ナトリウム　　　　０．１　３　９ポリビニル
プロピオネートの５０ 優の分散物　　　　　　　　　　　　８ｇ珪酸デル　　
　　　　　　　　　　　１０１１水　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１　２ｄト　　リ　　ト
　ｙ　　　（Ｔｒｉｂｏｎ）　　　Ｘ　　−　　１　　
０　　０　　　　　　　　　　　　　　０−４　　Ｅｌ
レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクト ピラノミド　　　　　　　　　　　５０１ｖをメタノー
ル５ＩＩＬｔ中に溶かす。

この組成物を０．１０の厚さのポリカルボネートシート
（ボカロｙ　Ｐｏｋａｌｏｎ，　ｏ　ｙデ社Ｐａ　、　
Ｌｏｎｚａ　）上に０．２ｍｓのスリット巾で塗布する
。被覆を５０℃で乾燥させ、その後に６枚に６關で切断
する。これを接着テープで４００μｍの厚さのポリスチ
ロールシートにはシつける。

こうして得た試験テープを短時間、試験すべき、βーＤ
ーガラクトシダーゼ含有の溶液中に浸漬する。室温で２
分間の待時間後に、赤色の反応色が発現し、その強度は
試験溶液中のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの濃度に依る。

一定の既知の含量Ｏβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを有する
試験溶液に依シ、色尺度が得られ、これに基づき試料中
Ｏβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの未知の含量が確しかめら
れる。

前記の試験テープは、試料中に存在するβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼの活性を運動的に反射測光で測定することに
使用することもできる。これにも常法で既知のβ−Ｄ−
がラクトシダーゼー活性を有する試料に基づき較正曲線
をつくり、それに依り試料の未知のβ−Ｄ−がラクトシ
ダーゼー活性を確かめることができる。

例２０（参考例） 活性測定 ａ）使用する溶液の製造 緩衝溶液：　　ＨＥＰＥ８　　　　　　　　　　　　１
００ミリモル／ぷ塩化ナトリウム　　　１５４ミリモル
／ＪＬーアスパラギン酸 マグネシラＡ　　　　　　　　２ミリモルＺＪＢＢＡ　
　　　　　　　　　　　１０１１７ノトウイーンー２　
０　　　　　０．５Ｆｉ／−ｅ−一値（苛性ソーダ溶液 で１４ＩＩ）　　　　　　　　　−７，５（５７℃）試
薬溶液： 前記Ｏ緩Ｗ廖液中にレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド０．８ミリモル／Ｊを溶かす。

酵素ａ液： 市販の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）
よシなるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを緩衝液中に溶かす
。この溶液の活性は約０．０８　Ｕ／ｍｊ　（製造者−
データに対して）である。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼー抗体−製剤を使用する。か
かる酵素−抗体−複合体の製造は公知である。これは例
えばビオヶム、ビオフィス。

アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ
ａ　）第６１２巻、第４０〜４９頁（１９８０年）に記
載されている。製剤は緩衝液中で、前記の酵素溶液と大
兄比較可能な活性が生じるように、希釈される。

測定の実施 測定は測光的に５７８　ｎｍで行なわれる。試薬溶液９
５０μｔはそＯりど１ｃＩＩｌキユベツト中で３７°Ｃ
で酵素溶液５０μｌと、もしくは酵素−複合体−溶液５
０μｊと混合する。反応のための尺度として時間単位毎
の消光上昇が［ｍ３ｘｂ／分］で確かめられる。

遊離のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼでの反応には８５　ｍ
Ｅｃｔ　７分が、β−Ｄ−ガ２クトシダーゼー抗体−複
合体での反応には９２　ｍＥｘｂ　７分が測定される。

両側定値は、遊離のβ−Ｄ−がラクトシダーゼでも、並
びに複合のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼでも極めて良好に
測定可能な消光差異が判明されることを示す。

そのことから、前記の化合物は基質として遊離のグリコ
シダーゼにも並びにグリコシダーゼ−複合体にも同様の
方法で適していることが明らかである。従って新規の基
質は診断剤としてばかりでなく遊離のグリコシダーゼの
測定のためにも使用することができる。これは有利な方
法で免疫学的測定方法でも使用可能であ勺、その場合グ
リコシダーゼは指示−酵素として使用される。

例２１（参考ｆｉｌ） α−アミラーゼ−活性の測定 クエン酸塩緩衝液−６中に溶解したレゾルフインーマル
トヘゾタノシドに濾紙を浸す。こうして得た試薬紙を順
々にα−アミラーゼ含有の試料で、並びにα−及びβ−
グルコシダーゼで処理する。数分間後、明らかに目に見
える赤色を検出することができ、試料中でその強度又は
α−アミラーゼ−濃度は比例する。

既知のα−アミラーゼ−濃度を有する試料に依シ較正曲
線が確認され、それに基づき試料の未知のα−アミラー
ゼ−含量を測定することができる。

前記の実施例では次の略語が使用された：ａｇｐｍｓ　
　２−　（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラ
ゾニル〕−エタンースル ホン酸 ＢＡＡ　　　牛血清（Ｒｌｎｄｅｒａｅｒｕｎ　）−ア
ルデミ４（牛血清（ｂｏｖｉｎｅａｅｒｕｍ　）　　−
フルデミン） ンモノラウレート

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、互変異性の一般式II′ａ及びII′ｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（II′ｂ） 〔式中Ｒ＾１′は水素原子を表わし、Ｒ＾２′、Ｒ＾３
   ′及びＲ＾５′は同じか又は異なつていてよく、水素原
   子、ハロゲン原子又は低級アルキル基を表わし、Ｒ＾４
   ′及びＲ＾６′は同じか又は異なつていてよく、水素原
   子、ハロゲン原子、シアノ基、低級アルキル基、低級ア
   ルコキシ基、カルボキシ基、低級アルコキシカルボニル
   基、カルボキシ低級アルキル基、低級アルコキシカル１
   個又は２個の ボニル−低級アルキル基又は１個又は２個の基を有して
   いてよいカルボキサミド基又は基：−ＣＯＯ−（ＣＨ＿
   ２ＣＨ＿２Ｏ）＿ｎ−Ｒ＾７（式中Ｒ＾７は水素原子又
   は低級アルキル基を表わし、かつｎは１〜４の整数を表
   わす）を表わし、この際Ｒ＾１′〜Ｒ＾６′は全てが同
   時に水素原子を表わすことはできず、かつＹは窒素原子
   又は基：Ｎ→Ｏを表わす〕のレゾルフイン−誘導体。 ２、式中のＲ＾４′及び／又はＲ＾６′は低級アルキル
   オキシカルボニル、１個又は２個の置換基を有していて
   よいカルボキサミド基又は基： −ＣＯＯ（ＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｏ）＿ｎ−Ｒ＾７（Ｒ＾７
   は水素原子又は低級アルキル基であり、ｎは１〜４の整
   数である）を表わし、Ｙは窒素原子を表わす、特許請求
   の範囲第１項記載の化合物。 ３、式中のＹはＮ→Ｏを表わす、特許請求の範囲第１項
   記載の化合物。