JPS58994A - 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体およびこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼ活性測定法 - Google Patents

新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体およびこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼ活性測定法

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JPS58994A
JPS58994A JP56039104A JP3910481A JPS58994A JP S58994 A JPS58994 A JP S58994A JP 56039104 A JP56039104 A JP 56039104A JP 3910481 A JP3910481 A JP 3910481A JP S58994 A JPS58994 A JP S58994A
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Yoshitsuru Yoshioka
吉岡　美鶴
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ０発明の概略 本発明は新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導
体およびこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ
−ゲルコサミニ、ダーゼ活性測定法およびその試薬に関
する。本発明における新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミン誘導体は下記一般式で示される。
（［）　　　　　　ＯＲ （式中、Ｒ１〜♂は水素、低級アルキル、またはハロゲ
ンを示す） Ｂ、先行技術および発明の目的 Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（度下ＮＡ
Ｇａｓｅと略す）は、腎尿細管上皮に多く含まれるリゾ
ソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）中の酵素の１つであり、ム
コ多糖類や糖蛋白の分解に関与１ている。尿中ＮＡＧａ
ｓｅ　　は各種腎疾患や腎臓の術後においては上昇し、
また糖尿病においては尿中ばかりでなく血清中ＮＡＧａ
ｓｅも上昇することが認められており、こういった各種
腎疾患の検出の一助として、また薬物の腎毒性検討の指
標としても、臨床および動物実験面でＮＡＧａｓｅの測
定が注目されている。
ＮＡＧａｓｅの活性測定としては従来Ｐ−ニトロフェニ
ルーＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド［Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、１０，
１１８（１９６３）］および］４−メチルウンベリフェ
リルーＮアセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド［Ｃ１ｉ
ｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、６９（１）、８５
−４１（１９７６））か広く用いられているが、前者は
測定波長においてビリルビン、溶血ヘモグロビンなどの
生体成分の影響を受けやすく、検体ごとにブランクを測
定する必要があり、測定操作が煩雑であるなどの欠点を
、また後者はけい光光度計のような特殊な機器か必要で
あるなどの欠点を有している。本発明者らは、前記欠点
を克服し、高感度で精密に、かつ迅速に測定が可能なＮ
ＡＧａｓｅ測定用基質を見出すべく鋭意研究した結果、
本発明を完成するにいたった。
本発明の化合物と類似のフェノールフタレイニル−Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイドが妊婦の唾液中Ｎ
ＡＧａｓｅ測定に用いうることが特開昭５１−１１４９
９０などに記載されているが、反応に用いる試薬が緩衝
液に溶解せず、可溶化剤を加えて可溶化した後に反応さ
せてもその発色は不安定であり退色しやすいなどの欠点
を有している。本発明の化合物は、こういった欠点をも
克服したものである。
Ｃ０構成 上記定義中（Ｉ）式において、低級アルキルとは炭素数
１〜４の直鎖状または分岐したアルキルを意味シ、たと
えばメチル、エチル、プロピル、−イソプロピル、ブチ
ル、イソブチルなどを包含するか、メチルおよびイソプ
ロピルがより好ましい。ノ＼ロゲンとはフルオロ、クロ
ロ、ブロモ、ヨードなどを意味するが、クロロまたはブ
ロモがより好ましい。
本発明の化合物（すは、式（１）で示される１−クロロ
−１−デオキシ−２，３，４，６−チトラアセチルーα
−Ｄ−グルコサミンと式（１）で示されるアグリコンよ
り容易に合成される。
（以下余白） （Ｉｌ）０Ｈ （１） （式中、ｋ１〜Ｒ３は前記と同意義であり、Ａｃはアセ
チルである） 化合物σ４ｃｔ公知物質であり、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　１０　＋１１８（１９６
３）に記載されている。
化合物（ＩＩりは容易に入手し得る市販の中和滴定指示
薬であり、アルカリ溶液（約…１０〜１１）中、赤また
は紫〜青色に着色するものを意味し、たとエバフェノー
ルレッド（フェノールスルホンフタレイン）　ＣＲ’＝
Ｒ２＝Ｒ”＝Ｈ）、クレゾールレッド（ｏ−／ｙレゾー
ルスルホンフタレイン）　［Ｒ１＝＝　Ｒ”　−Ｈ、Ｒ
”　＝　ＣＨ３］　、メタクレゾールパープル（ｍ　−
クレゾールスルホンフタレイン）　ＣＲ’　＝　ＣＲ３
゜Ｒ’＝　Ｒ”＝　Ｈ］、クロロフェノールレッド（ジ
クロロフェノールスルホンフタレイン）［Ｒ”＝ｉｅ＝
ｏ。
Ｒ二Ｃ１１などを例示しつるが、フェノールレッド、メ
タクレゾールパープルがより好ましい。上記アグリコン
はいずれも吸収極太の波長が５５０ｎｍ　ＪＪ上であり
、検体ブランクの測定を省略しつる。
本発明化合物（りの農法を下記工程式に示す。
（以下余白） （式中、ｉ−ｉおよびＡｃ　は前記と同意義であり、ｆ
およびｆはアルカリ金属を、Ｚはアシルを示す）（第一
工程） 本工程は化合物（Ｉｌｌ）のスルトン環を開裂して、そ
の三アルカリ金属塩にする工程であり、塩基で処理する
ことにより容易に達成しつる。塩基としては、アルカリ
金属の水酸化物またはアルコラードが適当であり、たと
えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、ナトリウムメチラート、ナトリウムフェノラートな
どを例示しうるが、水酸化ナトリウムおよびナトリウム
メチラートが特に好ましい。
この工程を独立して行なわず、適当な溶媒中、好ましく
は極性溶媒中、更に好ましくはアセトン中で化合物σ１
）と（■わを塩基の存在下に反応させて化合物（財）に
導いてもよい。
（第二工程） 本工程はエーテル結合を形成させる工程であり、化合物
（ＩＩ）と（菊を反応させることにより達成される。溶
媒としてはアセトン、ジメチルホルムアミド；ジメチル
スルホキシドなどを例示しつるが、無水条件下でジメチ
ルホルムアミドを用いるのが特に好ましい。反応は室温
〜冷却下で行ない、通′常十数時間以内で完了する。
（第三工程） 本工程は酸で処理するＣとにより開環させて、元のスル
トン環を形成させる工程である。酸としては希塩酸、希
硫酸、希硝徴などの無機酸の他、アンバーライト■（Ａ
ｍｂｅｒｌｉｔｅ（ＲＩ　ＲＣ−５０〔ローム参アンド
−バー　Ｘ　（Ｒｏｈｍ　ｋ　Ｈａａｓ　Ｃｏ、　））
などの弱酸性陽イオン交換樹脂を用いてもよい。
Ｃ第四工程） 本工程はフェノールフタレイニル基の遊離ヒドロキシ基
を精製のためにアシル化する上程−ｒ；アルが、アグリ
コンの種類や反応条件などにより、可能ならばこの工程
を省略してもよい。アシル化としては特にアセチル化が
好ましく、適当な溶媒中、特に好まし−くはピリジン中
、無水酢酸を当量〜少過剰量作用させればよく、通常室
温下で十数時間以内で完了する。
（第五工程） 本工程はＮ−アセチル基以外のアセチル基（０−アセチ
ル基）もしくは〇−保論基を脱離する工程であり、塩基
で処理することにより達成しつる。
塩基としてはアルカリ金属のアルコラードか好ましく、
特にナトリウムメチラートが最適である。
反応は通常冷却下、好ましくは０〜１０°Ｃで行ない、
十数時間で完了する。
（第六工程） 本工程は第三工程と同様に、酸で処理することにより閉
環させる工程であり、第三工程に準じて行なえばよい。
上記各工程は一容器中で行なうことか可能であり、たと
えば、化合物（■りをアルカリで処理し、コｔＬに（Ｉ
Ｉ）を加え、ついでアルカリ水解してアセチルを除き、
更に酸処理すれば（１）が得られる。
本発明におけるＮＡＧλｓｅ測定試薬は下記構成成分よ
りなる。
ｉ）本発明の化合物（１）からなる基質試薬ｉｉ）　緩
衝剤 １ｉｉ）　アルカリ試薬 ｉ）における基質試薬とば基質すなわち化合物（１）を
単独で、またはホウ砂と混合したものであり、凍結乾燥
し、アンプルまたはバイアル中に封入しておき、特定の
声を維持する緩衝液すなわちｌｉ）における緩衝剤で用
時溶解して用いるのが好ましい。
ｉｉ）　における緩衝剤とは、ＮＡＧａｓｅの反応ｐＨ
を３．５〜６，０、より好ましくはｐＨ４，０〜５．５
に保つ緩衝剤であり、たとえばクエン酸、ホウ砂−クエ
ン酸、クエン酸−リン酸などであり、蒸留本番Ｃ溶かし
て用いる。ホウ砂−クエン酸緩衝液を用いれば、基質と
ＮＡＧａｓｅの反応か３７０Ｃで３０分まで直線的に進
行し、かつ基質の加水分解が抑制され、基質ブランクの
吸光度が小さくなり、ＮＡＧａｓｅの定量範囲が拡大す
るので特に好ましい。ｉ）における基質試薬にホウ砂が
混合されている場合には、クエン酸緩衝液を用いれば同
様の効果が得られる。クエン酸−リン酸緩衝液は、血清
中ＮＡＧａｓｅの測定時には遅延相（ｌａｇ−ｐｈａｓ
ｅ）が生じるので、検体が尿の場合に限られる。
１ｉｉ）　　におけるアルカリ試薬とは、ｐＨ１０〜目
に調整しつるアルカリを意味し、たとえば炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
、ホウ酸−炭酸ナトリウムなどであり、蒸留水に用時溶
解して用いる。基質の加水分解を抑制するため、ホウ酸
−炭酸ナトリウム緩衝液が特に好ましい。
Ｄ、効果・用途 本発明の化合物（１）は、尿、血清などのヒトまたは動
物由来検体中のＮＡＧａｓｅ測定用基質として用いられ
る。
〔測定の原理〕
ある特定の酸性ｐＨ（ｐＨ３，５〜６．０、特にｐＨ４
，０〜５．５）を維持する緩衝液中で、化合物（１）を
基質として検体と共に一定時間インキユベートすると、
下記に示すように、検体中のＮＡＧａｓｅの作用により
基質（Ｉ）が開裂してアグリコン（ＩＩ）とＮ−アセチ
ル−グルコサミン（ＩＸ）が遊離する。これをアルカリ
液でＰＨＩＯ〜１１に調整してアグリコン（［１）を式
（ＩＶ）に示すようなキノイド型構造に変換させて発色
させ、分光光度計で比色定置する。
（以下余、臼） 〔測定操作〕 １〇−試験管に基質溶液（２″〜６　ｍｈＶｌ　　）　
ｉ、　Ｏｍｔをとり、３７Ｃで５分間予備加温した後、
検体性）５０μｌを加えて３７°Ｃで反応させる。Ｘ分
後にアルカリ溶液２．０−を加えて反応を停止し、遊離
するアグリコンの最大吸収波長における吸光度を蒸留水
または空気を対照として１時間以内に測定する。基質ブ
ランクは検体の代りに蒸留水５０μｌを用い、同様に操
作したものを測定する。
注咳体：ヒトもしくは動物由来の尿または血清であり、
採取後直ちに測定するのが好ましい。しかし長時間保存
する時は２Ｎ塩酸または２Ｎ水酸化カリウムを用いてｐ
Ｈを６．５に調整しておく。
こうすれば、検体中のＮＡＧａｓｅ活性は室準で１日、
−２０°Ｃで約４ケ月安定である。
ここで、１分間に１マイクロモルのアグリコン（ＩＩり
を生成するＮＡＧａｓｅ量を１ユニツト（ｕ）とする。
〔酵素濃度の計算〕
検体中のＮＡＧａｓｅ濃度は次式より算出する。
１０００ ０．０５ △Ｅ二Ｅｌ−Ｅ２ Ｅ＋一検体の吸光度 Ｅ２−基質ブランクの吸光度 ｄ−光路長（Ｃ１１） ｅ−アグリコン（ＩＩＩ）の測定波長における吸光係数
（ｄ／μＭ） Ｘ＝反応時間（分） 拳法においては１０〜３０分、より好ましくは１０〜１
５分が適当である。
〔標準曲線〕
測定操作の項に記載したように、化合物（１）を基質と
する溶液に所定量のＮＡＧａｓｅを加えて反応せしめ、
遊離したアグリコン（ＩＩＩ）とＮ　Ａ　Ｇ　ａｓ　ｅ
の関係をプロットして標準曲線を作成する。たとえば、
ｍ−クレゾールスルホンフタレイニル−β−Ｄ−グルコ
サミナイド（Ｉ）　（Ｒ’＝　ＣＨ３、Ｒ２＝　Ｒ”＝
Ｈ）（ＭＣＰ−ＮＡＧと略記）を基質としたキット（Ｍ
ＣＰ−ＮＡＧ法）を用いてＮＡＧａｓｅ活性の測定を行
ない、ＮＡＧａｓｅと遊離するＭＣＰＩ：メタクレゾー
ルパープル（ｍ−りルゾールスルホン゛フタレイン）〕
との量の関係を図１に示す。図１に示すように、ＭＣＰ
−ＮＡＧの場合には、本発明方法により２００　ｕ／ｌ
までのＮＡＧａｓｅが定量的に測定可能である。
〔精度〕
ＮＡＧａｓｅ溶液を用いて同時再現性を検討したところ
、変動係数は１．９５％で高い再現性を示した。
〔正常値〕
膚常人２６名（男子１４名、女子１２名）について、尿
中ＮＡＧａｓｅ活性をＭＣＰ−ＮＡＧ法で測定すると、
その測定値はそれぞれ男子１．１３〜１３、１０　ｕ／
１．女子０．６８〜５．２０　ｕ／／であった。
Ｃ１１ｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　７３，４
５３（１９７６）によれば、早朝３時間尿についての平
均値は、８．１　ｕ／１（１，５〜２９．８　ｕ／ｌ）
と報告されテイル。
〔公知方法との比較〕
公知のＰ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−〇−グ
ルコサミナイドを基質としたキット（ＰＮＰ−ＮＡＧ法
）と本願発明のＭＣＰ−ＮＡＧ法により測定した尿中の
ＮＡＧａｓｅ活性の相関を図２に示す。なお、ＰＮＰ−
ＮＡＧ法によるＮＡＧａｓｅ活性の測定は下記のとお・
りにして行なった。
１０ｍ／試験管ニ試薬−１溶［ｉ）　１．０　ｍＺヲト
リ、３７°Ｃで約１０分間予備加温した後、検体尿５０
μｌを加えて３７°Ｃで反応させる。３０分後に試薬−
１１溶液す２．０−を加えて反応を停止し、４０５ｎｍ
における吸光度を蒸留水または空気を対照として２時間
以内に測定する。検体毎に族ブランクを必要とするが、
これには試薬−１，溶液のがわりに試薬−ＩＩＩ溶液Ｉ
Ｉ）　ｔ　ｏ−を用いて、以下同様に操作する。基質ブ
ランクとしては試薬−■溶液１．０−１蒸留水５０μｌ
、試薬−ＩＩ溶液２．０．７を同様に順次操作しｈもの
を１本用いる。
（ト）す５ｍＭ基質溶液（０，０５Ｍクエン酸・リン酸
緩衝液ｐＨ４，４０） ｉ）ｏ、　２　Ｍホウ酸・炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
１０，５） ｉ）ｏ、ｏ５Ｍクエン酸・リン酸緩衝液（ＰＨ４，４０
検体中のＮ　Ａ　Ｇ　ａｓ６濃度は次式より算出する。
△Ｅ　＝　Ｅｒ　−（Ｅ２＋　Ｅ３　）Ｅ１１検体の吸
光度 Ｅ２−族ブランクの吸光度 Ｅｓ＝基質ブランクの吸光度 ｄ＝光路長（Ｃ１ｍ　） 図２によりＭＣＰ−ＮＡＧ法とＰＮＰ−ＮＡＧ法とは良
好な相関を示すことが明らかであるが、同じ検体につい
てのＭＣＰ−ＮＡＧ法による測定はＰＮＰ−ＮＡＧ法よ
りも約４チ゛高い活性値が得られる。
以下に・実施例を示して一本発明の態様を明らかにする
。
（以下余白） （１）　　フェノールスルホンフタレイン１３７３１Ｎ
ｉ（１，０５ミリモル）をＩＮナトリウムメトキシド−
メタノール溶液２．０　、ｄ　（２，０ミＩＪモル）に
溶かし、次いでメタノールを３５°Ｃ以下で減圧留去す
る。残渣にベンゼンを加えて磨砕した後、３５・Ｃ以下
で減圧濃縮する。この操作を更に２度繰り返し、次いで
減圧下で３時間乾燥すると、フェノールスルホンフタレ
インのニナトリウム塩λを得る。
（２）上記（１）で得たニナトリウム塩？をＤＭＦ（１
０ｒｎｌ）に可及的に溶かすと青味がかった紫色の液と
なる。これに１−クロロ−１−デオキシ−２゜３、４．
６−チトラアセチルーα−Ｄ−グルコサミン３　（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓｌｏ、
１１８（１９６３））３６６ｗｑ（１，０ミＩＪモル）
を撹拌下に加えると、赤味かかった紫色の殆ど溶液状態
となる。約３０分間室温で撹拌し、５°Ｃで一夜（１８
時間）放置する。これに、メタノールで洗浄したアンバ
ーライト＠ＩｉｔＣ−５０（２ｍ／）を加え、３０分間
撹拌した後、濾過し、ついでメタノールで洗浄する。
ｐ液および洗液を合わせて減圧濃縮し、残渣にトルエン
を加えて再び減圧下で濃縮乾固する。残渣をメタノール
に溶かし、シリ゛カゲル３グに吸着させ、メタノールを
除いた後、カラムクロマトグラフ〔固定相ニジリカゲル
３０Ｆ！、溶媒系：酢酸エチル〜酢酸エチルーメタノー
ル−３：１〕処理しテ分離スると、フェノールスルホン
フタレイニル−２，３，４，６−チトラアセチルーβ−
Ｄ−グルコサミナイド巨を主成分として含む画分５４０
■を得る。
（３）上記画分を、無水酢酸４．５−およびピリジン７
−の混液中−夜装置する。これに、冷却撹拌〒にメタノ
ール２ｒｎｌを加え、１時間放置後、減圧下で溶媒留去
する。残渣にトルエンを加え、減圧下で濃縮乾固する。
この操作を２度繰り返し、残渣に塩化メチレンを加え、
可溶部分（約５４０〜）を分取する。これは薄層クロマ
トグラフィー上、２つの主スポットを与えるため、カラ
ムクロマトグラフ（固定相ニジリカゲル８．５Ｉｉ、溶
媒系：ベンゼンー酢酸エチル＝１：２）処理して分離す
る（！：、第一画分からは０，０−ジアセチルフェノー
ルスルホンフタレインを得、また第二画分かラバＯ−ア
セチルフェノールスルホンフタレイニル−２゜３、４．
６−チトラアセチルーβ−Ｄ−グルコサミナイド９を殆
ど無色の泡状物として得る。収率４２チ。
この生成物損を再度カラムクロマトグラフ（固定相ニジ
リカゲル、溶媒系：ベンゼンー酢酸エチル−１：２〕処
理して精製すると、純粋な生成物９を得る。
Ｉ　Ｒ：　ｐ”ＩＣ”　　１７５０．１６８９ｃｍ、　
’。
ａＸ ＮＭＲ：δ”Ｃｌ３１．８６（’ｓ、３Ｈ）、２．０３
（ｓ、９Ｈ）。
２．２９　（Ｓ　、　３Ｈ）　、　３．７〜４．４（４
Ｈ）、５．１０（Ｌ、Ｊ＝９．ＦＨｚ、ＩＨ）、５．３
６（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、ＩＨ）、５．４３（１゜Ｊ＝
９．５Ｈｚ、ＩＨ）、６．２４（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、
ＩＨ）、６．８〜８．０（１２Ｈ）。
〔α］０　−６．３±０．３°（Ｃ二１．９５６．ＣＨ
Ｃｌ５　）（４）上記（３）で得た生成物旦３０８■（
０，４２４ミリモル）を乾燥メタノール４−に溶がし、
これにＩＮナトリウムメトキシド−メタノール溶液０．
８５ｍ／（０，８５ミＩＪモル）を加える。得られた赤
色溶液を５°Ｃで１５時間放置し、メタノールで湿らせ
たアンバーライト＠Ｉ　ＲＣ＝５０　（１，５，Ｊ　）
を加え、１．５時間撹拌後、濾過し、メタノールで洗う
。
涙液および洗液を合わせ、減圧濃縮すると、橙色の粉末
状残渣を得る。これをカラムクロマトグラフ〔固定相ニ
ジリカゲル１．５ｇ、溶媒系：酢酸エチル−メタノール
−２＝１〕処理して精製すると、フェノールスルホンフ
タレイニル　Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド
７２０９Ｍ９を吸湿性の高い橙色粉末として得る。収率
８９チ。
Ｉ　Ｒ：　叱：：　〜３３５０（ｂｒ）、１６６５（Ｓ
ｈ）、１６２５１ ＩＩＩＯ ＮＭＲ：δＣＤ　ａＯｏｌ、９５（Ｓ　、　３Ｈ）　、
　３．３〜４．２（６Ｈ）。
５．１２（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、ＩＨ）、６．０〜６．
６（２Ｈ）。
６．８〜７．８（ｄ　、　９Ｈ）　、　７．９〜８．３
（ＩＨ）。
Ｕ■：λ得’：　２６２ｎｍ（ｇ＝１０３００）＋４０
８０ｍ（ε＝２２４００）（Ｃ＝１６．９４μｇ／ｍ／
）。
ＴＬＣ（メルク社製プレコーテッド、キーゼルゲル、酢
酸エチル：メタノール＝２：、１）Ｒｆ値約０．１４゜ 〔ｃｔ〕”ｌ：　　＋３５．９＋０．８°（Ｃ；１．０
３９　、ｌ　９　／−ル）。
（以下余白） （１）ｍ−クレゾールスルホンフタレイン８４．０２９
（１０，５ミリモル）およびＩＮナトリウムメトキシド
−メタノール溶液２０ａ／（２０ミリモル）から、実施
例１（１）に従ってｍ−クレゾールスルホンフタレイン
のニナトリウム塩？を得る。
（２）上記ニナトリウム塩ｐをＤＭＦ５０艷に可及的に
溶かし、ついで１−クロロ−１−デオキシ−２，３，４
，６−チトラアセチルーα−Ｄ−グルコサミン３３．６
６９Ｃ１０ミリモル）を撹拌下に加えると、赤味がかっ
た紫色のほとんど完全な溶液となる。これを５°Ｃで１
６．５時間放置し、メタノールで湿らせたアンバーライ
トｏＩＲＣ−５０（２５−）を加えると赤味がかった褐
色に変化する。３０分間撹拌後、濾過し、メタノールで
洗う。Ｆ液と洗液を合わせて濃縮し、更にトルエンとの
共沸によりＤＭＦを留去し、残渣をメタノール２５−に
溶かし、シリカゲル２５２に吸着させてメタノールをよ
く除いた後、カラムクロマトグラフ（固定相ニジリカゲ
ル）処理する。酢酸エチル２．３１で溶出する分画は捨
て、ついでメタノール０．８１で溶出すると、ｍ−クレ
ゾールスルホンフタレイニル−２，３，４，６−チトラ
アセチルーβ−Ｄ−グルコサミナイドＬ１を主成分とし
て含む分画を得る。
ｆ３＋　　上記分画を無水酢酸５０ｉおよびピリジン７
０ｍ／の混液中、−夜装置し、実施例１（３ｊと同様に
後処理する。得られた残渣８．３３ｆは薄層クロマトグ
ラフ上２つの主スポットを与えるため、カラムクロマト
グラフ（固定相ニジリカゲル１００ｉ溶媒１ベンゼン−
酢酸エチル＝１：２）処理して分離すると、第一画分か
らは０．０−ジアセチル　ｍ−クレゾールスルホンフタ
レイニル得、また第二画分からはＯ−アセチル−ｍ−ク
レゾールスルホンフタレイニル−２，３，４，６−チト
ラアセチルーβ−Ｄ−グルコサミナイド１２４．５０Ｌ
ｉを淡黄色泡状物として得る。収率６０％。
・　ＣＨ（Ｊｓ ＩＲ，νｍａｘ　　　１７４７，１６８８ｃｍ　　ｉ。
ＮＭＲ：δ””　　１．８８（Ｓ、３Ｈ）、２．０２（
８，９Ｈ）。
２．１２（Ｓ、６Ｈ）、２．２７（ｍ、３Ｈ）、’３．
７〜４．４（４Ｈ）。
５．１０（ｔ、Ｊ−９，５Ｈｚ、ＩＨ）、５．３２（ｄ
、Ｊ＝８．０Ｈ２゜ＩＨ）、５．４３（ｔ、Ｊ＝９．５
Ｈｚ、ＩＨ）、５．９８（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、ＩＨ）
、６．８〜８．０（ＩＯＨ）。
〔α〕６４・５０．０（Ｃ＝０．９７７、−ＣＨＣ／ａ
）Ｃｒｔ〕ｉ’ｌ、虞＋２．８±０．４ＣＣ＝０．９７
７、ＣＨＣｌ３）（４）上記（３）ｐ得た生成物す４．
４２グ（５，８６ミリモル）を乾燥メタノール１００−
に溶かし、これにＩＮナトリウムメトキシド−メタノー
ル溶液１１．７２ｒｎｌ（１１，７２ミリモル）を加え
る。得られた暗褐色溶液を５°Ｃで一夜放置し、メタノ
ールで湿らせたアンバーライト■ＩＲＣ−５０（３０ｒ
ｎｌ）を加え、３０分撹拌後、ν過し、メタノールで洗
う。Ｐ液と洗液を合わせ、減圧濃縮し、得られた残渣を
カラムクロマ、トゲラフ（固定相ニジリカゲル１２（Ｈ
’、溶媒系：酢酸エチル−メタノ−ｌ、 ル＝２　：　１　）処理して精製すると、ｍ−クレゾー
ルスルホンフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミナイード１３　２．７７Ｐを吸湿性の高い橙色粉
末として得る。
”　’　νｍｉｘ　〜３４００（ｂｒ）、１６６０（ｓ
ｈ）。
１６２０ＣＩｌ　　。
ＮＭＲ：δ（、ＤａＯＤ　１．６〜２．４（９Ｈ）　、
　３．３〜４．２　（６Ｈ）。
４．９〜５．２　（ＩＨ）　、　５．９〜８．４　（１
０Ｈ）。
ｃα−、Ｐｏ”　＋５２．６　＋　０．９’　（Ｃ＝１
．０３２．Ｃｌ−１３０８）１２０ ＵＶおよびＶＩＳＩＢＬＥ：　　λ　　　２６９ｎｍ（
ｇ＝ａ　ｘ １２．２００）、４１４ｎｍ（ｇ＝　　１５，５００）
（Ｃ＝１１．８０μ！ｉ’／ｆｆＩ／） 実施例３ ＭＣＰ−ＮＡＧとホウ砂の凍結乾燥品を００５Ｍクエン
−酸緩衝液（ＰＨ４，１５）５０ｆｆｌ／で溶かし、基
質溶液とする（ＭＣＰ−ＮＡＧｓ、ｉ３３ミリル濃度、
ｐＨ４，４）。１０ｍ／試験管に基質溶液１．０−をと
り、３γＣで５分間予備加温した後、検体尿５０μｌを
加えて３７°Ｃで反応させる。１５分後に０．３Ｍ炭酸
ナトリウム水溶液２．０ｍ／を加えて遊離したＭＣＰを
発色させ、５８００ｍにおける吸光度（Ｅｌ）を蒸留水
または空気を対照として、１時間り内に測定する。基質
ブランクは、検体の代りに蒸留水５０μｌを同様に操作
したものを用いて吸光度（Ｅｌ）を測定し、ＮＡＧａｓ
ｅ濃度を計算により求める。
ａＥ　　　　　１　１００Ｏ ＮＡＧａｓｅ濃度（”／’　）＝−×３−０５　Ｘ　ｓ
　ｓ　Ｘ　ｏ、ｏ　ｓ３８×１ ＝△Ｅｘ１０７．０ 実施例　４ フェノールスルホンフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−グ、ルコサミナイド（ＰＲ−ＮＡＧ　）の凍結乾燥
品を０．０５Ｍホウ砂−クエン酸緩衝液（ｐＨ４，４）
に溶かしく５ミリモル濃度）、基質溶液とする。１〇−
試験管に基質溶液１．０−をとり、３７°Ｃの恒温槽で
５分間予備加温した後、ヒト血清５０μｌを加えて直ち
に撹拌し、３７°Ｃで反応させる。１０分後に０．２　
Ｍホウ酸−炭酸ナトリウム緩貨液（ｐＨ１０，ｓ　）　
２．０−を加えて酵素ｉ失活させると同時に、遊離した
ＰＲ〔フェノールレッド（フェノールスルホンフタレイ
ン）〕ヲ発色させ、５５７　ｎｍにおける吸光度（Ｅ＋
）を蒸留水または空気を対照として測定する。基質ブラ
ンクは蒸留水５０μｌを同様に操作したものについての
吸光度（Ｅｌ）を測定し−ＮＡＧａｓｅ濃度を計算によ
り求める。
ａＥ　　　　　　１　１００Ｏ ＮＡＧａｓｅ濃度−＝Ｘ　３−０５　Ｘ　１０Ｘ　ｏ、
ｏ　ｓ６３×１ ＝△Ｅ　Ｘ　９６．８ 実施例　５ ＰＲ−ＮＡＧを０．２５Ｍホウ砂−クエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ４，４）で２５ミリモル濃度に溶解し、５０−ガラス
製バイアルに１０．ｎｌずつ分注し、凍結乾燥して基質
溶液凍結乾燥品とする。
ホウ酸９３．７９と炭酸ナトリウム７０６．３９を粉砕
後混合して粒度を揃えた後、粉末充填機で１゜９８９ず
つ１２０−ポリ瓶に粉末充填する。
実施例　６ 実施例５で得たＰＲ−ＮＡＧの基質溶液凍結乾燥品を蒸
留水５０−で溶かし、こ、のうちの１−を基質溶液とし
て用い、実施例５で得た粉末充填したポリ瓶に蒸留水１
００−を加えて溶かし、このうちの２．０　、ｎｌをア
ルカリ溶液として用いて実施例４と同様に操作し、ＮＡ
Ｇａｓｅ濃度を求める。
ａＥ　　　　」匣筺 Ｎ　Ａ　Ｇ　ａｓｅ（ｕ／ｌ）　−−ｘ３．０５ｘ１ｏ
Ｘ、ｏ５６３×１ ＝△ＥＸ９６．８ 実施例　７ 実施例５と同様にしてＭＣＰ−ＮＡＧの基質溶液凍結乾
燥品を製造し、これを蒸留水５０ｉに溶解したもの１ｒ
ｎｌを基質溶液として用い、実施例５で得た粉末充填し
たポリ瓶に蒸留水１００−を加えて溶かしたもの２ｒｎ
ｌをアルカリ溶液として用いて実施例３と同様に操作す
る。
５８００ｍで測°定： ＮＡＧａｓｅ濃度（ｕ／ｌ　）　＝ａ　ｓ、ｚ　、　ｓ
　Ｘ　３−０５　Ｘ　１　ｓ　×苅兜＝△ＥＸ１０６．
４６ ０．０５
【図面の簡単な説明】
図１ ＭＣＰ−ＮＡＧ法によるＮＡＧａｓｅ活性と生成するＭ
ＣＰとの関係を示す。横軸はＮＡＧａｓｅ濃度（ｕ／ｌ
　）であり、縦軸は生成するＭＣＰの量イ上５８０　ｎ
ｍ／ｌ　５分）である。これより不法により約２００　
ｕ／／まで定量的に測定できることがわかる。 図２ ＰＮＰ−ＮＡＧ法とＭＣＰ−ＮＡＧ法の相関関係を示す
。横軸はＰＮＰ−ＮＡＧ法によるＮＡＧａｓｅ濃度（ｕ
／ｌ　）であり、縦軸はＭＣＰ−ＮＡＧ法によるＮＡＧ
ａｓｅ濃度（ｕ／ｌ）である。 直線回帰　Ｙ　＝　１．ｏ４×＋０．０２ｒ＝０．９９
９７− 特許出願人　塩野義製薬株式会社 図　　　面 ＋ｕａ　　　　　　　　　　　　ｚｕυ昭和Ｃ７年を月
、？６日 ２発明の名称 事件との関係　特許出願人 住所　大阪府大阪市東区道修町３丁目ノ２番地名称　（
／９２）塩野義製薬株式会社 代表者　　　吉　利　−雄 弘代理人 住所　大阪市福島区鷺洲ｊ丁目１２番μ号塩野義製薬株
式会社特許部 ま補正の対象 明細書全文 乙補正の内容 明細書全文を別紙訂正明細書の通りＩこ訂正する。 Ｚ添付書類の目録 訂正明細書　　　　　ｌ　通 以上 訂正明細書 １発明の名称 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ、ン誘導体およ
びこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニダーゼ活性測定法２特許請求の範囲 （１）　　下記一般式で示されるＮ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミン誘導体。 １式中　Ｈ／〜ＲＪは水素、低級アルキル、またはハロ
ゲンを示し　ｙＪはアルカリ金属を示す）（２）下記構
成成分よりなるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼ測定試薬。 ｉ）特許請求の範囲（１）に記載の化合物からなる基質
試薬 ｉｉ）　　緩衝剤 １ｉｉ）　　アルカリ試薬 （３）基質がラジオ−ｍ−クレゾールまたはフェノール
−スルホンフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミナイドとホウ砂の凍結乾燥品であることを特徴と
する特許請求の範囲（２）に記載の試薬。 （４）緩衝剤がクエン酸緩衝剤粉末であることを特徴と
する特許請求の範囲（２）に記載の試薬。 （５７アルカリ試薬がホウ酸と炭酸ナトリウムの粉末で
あることを特徴とする特許請求の範囲（２）に記載の試
薬。 （６）　　アルカリ試薬が炭酸ナトリウム粉末であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲（２）に記載の試薬。 （７）特許請求の範囲（１）に記載の化合物からなる基
質試薬を緩衝液で溶解し、これに検体を加えてインキユ
ベートシ、アルカリ溶液で発色させて比色定量すること
を特徴とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダー
ゼの活性測定法。 （８）緩衝液の声が３ｊ〜６．Ｏであることを特徴とす
る特許請求の範囲（７）に記載の測定法。 （９）　　Ｗ両液がクエン酸緩衝液であることを特徴と
する特許請求の範囲（７）に記載の測定法。 ０１　　インキュベートを７０〜ｌＳ分間行なうことを
特徴とする特許請求の範囲（７）に記載の測定法。 ａυ　アルカリ溶液がホウ酸−炭酸ナトリウム緩衝液で
あることを特徴とする特許請求の範囲（７）に記載の測
定法。 Ｑ４　　検体かヒトまたは動物の尿または血清であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲（７）に記載の測定法。 ３発明の詳細な説明 Ａ０発明の概略 本発明は新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導
体およびこれを基質として用いるＮ−７’セチル−β−
Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定法およびその試薬に関
する。本発明における新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミン誘導体は下記一般式で示される。 ０ ＣＩ） ｃ式中Ｉ　Ｒ’〜Ｒ３は水素、低級アルキル、またはハ
ロゲンを示し、−はアルカリ金属を示す）Ｂ、先行技術
および発明の目的 Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以Ｔ　Ｎ
ＡＧ　ａ　ｓ　ｅと略す）は、前原細管上皮に多く含ま
れるリゾソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）＝中の酵素の１つ
であり、ムコ多糖類や糖蛋白の分解に関与している。 尿中ＮＡＧ　ａ　ａ　ｅは各種腎疾患や腎臓の術後にお
いて・は上昇し、また精糖病においては尿中ばかりでな
く血清中ＮＡＧａｓｅも上昇することが認められており
、こういった各種腎疾患の検出の一助として。 また薬物の腎毒性検討の指標としても、臨床および動物
実験面でＮＡＧ　ａ　ｓ　ｅの測定が注目されている。 ＮＡＧａａｅの活性測定としては従来ｐ−ニトロフェニ
ル−Ｎ〜ルアセチルβ−Ｄ−ゲルコサεナイド〔Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ　ＰｒｅｐａｒａＬｉｏｎｓ、／θ、
／／Ｉ（／９６３）　　）およびグーメチルウンベリフ
ェリル−Ｎ−７セチルーβ−Ｄ−グルコサミナイド（Ｃ
ｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、Ａ？（ｌ）　
、！！ｉ〜９／　（／９７６）　）が広く用いられてい
るが、前者は測定波長においてビリルビン、溶血ヘモグ
ロビンなどの生体成゛分の影響を受けやすく、検体ごと
にブランクを測定する必要があり、測定操作が煩雑であ
るなどの欠点を、また後者はけい光光度計のような特殊
な機器が必要であるなどの欠点を有している。本発明者
らは、前記欠点を克服し、高感度で精密に、かつ迅速に
測定が可能なＮＡＧａｓｅ測定用基質を見出すべく鋭意
研究した結果０本発明を完成するにいたった。本発明の
化合物と類似のフェノールフタレイニル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ　−クルコサミナイドが妊婦の唾液中ＮＡＧａ
ａｅ測定に用いうろことが特開昭３７−／／１９９０な
どに記載されているが２反応に用いる試薬が緩衝液に溶
解せず、可溶化剤を加えて可溶化した後に反応させても
その発色は不安定であり退色しゃす−いなどの欠点を有
している。本発明の化合物は、こういった欠点をも克服
したものである。 Ｃ６構成 王妃定義中（Ｉ）式において　Ｈ／〜ＲＪで示される低
級アルキルとは炭素数／〜ｑの直鎖状または分岐シタア
ルキルを意味し、たとえばメチル、エチル。 プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルなどを包
含するが、メチルおよびイソプロピルがよす好ましい。 ハロゲンとはフルオロ、クロロ、プロ宅、ヨードなどを
意味するが、クロロまたはブロモがより好ましい。−と
はリチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属を
意味する。 本発明の化合物（１）は１式０１）で示されるｌ−クロ
ロ−７−デオキシ−２３’Ａｔ−テトラアセチル−α−
Ｄ＝グルコサミンと式（ＩＩＩ）で示されるアグリコン
より容易に合成される。 ｃ以下余白） Ｃ式中　Ｈ／〜Ｖは前記と同意義であり、Ａｃはアセチ
ルである） 化合物１）は公知物質であり、　Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａ
ｌＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　／θ、／／ざ（／９乙３
）に記載されている。 化合物（［１）は容易に入手し得る市販の中和滴定指示
薬であり、アルカリ溶液（約ｐＨ１０−／／）中、赤ま
たは紫〜青色に着色するも−のを意味し。 タトえばフェノールレッド（フェノ−Ｊレスフレホンフ
タレイン）ＣＲ／　：＝　Ｒ２＝＝　ＲＪ二Ｈ〕、タレ
・／　−ｒレレッド（０−クレゾールスルホンフタレイ
ン）ＣＲ’：Ｒ２＝−Ｈ、Ｒ’二ＣＨ３，１１、メタク
レゾールパープル（ｍ−クレゾールスルホンフ多レイン
）ＣＲ／二ＣＨ３，Ｒ’＝　ＲＪ＝　Ｈ）　、クロロフ
ェノールレッド（ジクロロフェノールスルホンフタレイ
ン）ｌｌ’＝Ｂ２＝　Ｈ、Ｒ，＝Ｃ１）などを例示しつ
るが、フェノールレッド、メタクレゾールパープルがよ
り好まし−い。上記アグリコンはいずれも吸収極大の波
長が５ｊθ膠以上であり、検体ブランクの測定を省略し
うる。 本発明化合物α）の製法を下記工程式に示す。 ｃ以下余白） （式中　Ｈ／〜Ｒ３およびＡｃは前記と同意義であり。 Ｙ′およびｐはアルカリ金属を、２はアシルを示す） （第一工程） 本工程は化合物（１）のスルトン環を開裂して。 そのニアルカリ金属塩にする工程であり、塩基で処理す
ることによ６容易に達成しうる。塩基としては、アルカ
リ金属の水酸化物またはアルコラードが適当であり、た
とえば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムフェノラート
などを例示しうるが、水酸化ナトリウムおよびナトリウ
ムメチラートが特に好ましい。 この工程を独立して行なわず、適当な溶媒中。 好ましくは極性溶媒中、更に好ましくはアセトン中で化
合物（ＩＩ）と（■）を塩基の存在下に反応させて化合
物（■）に導いてもよい。 （第二工程） 本工程はエーテル結合を形成させる工程であり。 化合物（■）と（■）を反応させることにより達成され
る。溶媒としてはアセトン、ジメチルホルムアミド、ジ
メチルスルホキシドな′どを例ボしうるが。 無水条件下でジメチルホルムアミドを用いるのが特に好
ましい。反応は室温〜冷却下で行ない９通常十数時間以
内で完了する。 反応終了後酸で処理することにより生成物（Ｖ）と過剰
の原料物質（ＩＶ）との分離を容易にする。酸としては
希塩酸、希硫酸、希硝酸などの無機酸の他、アラ２、−
ライト■（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ■）ＩＲＣ−３θ〔ロー
ム、アンド、　ハース（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ　Ｃｏ
、　）〕などの弱酸性陽イオン交換樹脂を用いてもよい
。 （第三工程）　　　　。 本工程は第二工程での生成物（ｖ）を精製のためにアシ
ル化する工程であるが、アグリコンの種類や反応条件な
どにより、可能ならばこの工程を省略してもよい。アシ
ル化としては特にアセチル化が好ましく、適当な溶媒中
、特に好ましくはピリジン中、無水酢酸を当量〜少過剰
量作用させればよく１通常室温下で十数時間以内で完了
する。 （第四工程） 本工程はＮ−アセチル基以外のアセチル基（０−アセチ
ル基）もしくは〇−保護基を脱離する工程であり、塩基
で処理することにより達成しうる。 塩基としてはアルカリ金属のアルコラードが好ましく、
特にナトリウムメチラートが最適である。 反応は通常冷却下、好ましくはθ〜ｌθ°Ｃで行ない、
十数時間で完了する。 反応終了後、生成物を酸で処理することにより過剰の塩
基を除去する。 上記各工程は一容器中で行なうことが可能であり、たと
えば、化合物（ｍ）をアルカリで処理し。 これに（ＩＩ）を加え、ついでアルカリ水解してアセチ
ルを除き、更に酸処理すれば（１）が得られる。 本発明におけるＮＡＧ　ａ　ｓ　ｅ測定試薬は下記構成
成分よりなる。 ｉ）本発明の化合物（１）からなる基質試薬ｉｉ）　　
緩衝剤 ｉ）　アルカリ試薬 ｉ）における基質試薬とは基質すなわち化合物（１）を
単独で、またはホウ砂と混合したものであり。 凍結乾燥し、アンプルまたは云イアル中に封入すでおき
、特定の痺を維持する緩衝液すなわちｉｉ）における緩
衝剤で小時溶解して用いるのが好ましい。 ｉｉ）における緩衝剤とは、ＮＡＧａａｅの反応ｐＨを
３ｊ〜乙、θ、より好ましくはｐＨＩＡθ〜３．５に保
つ緩衝剤であり、たとえばクエン酸、ホウ砂−クエン酸
、クエン酸−リン酸などであり、蒸留水に溶かして用い
る。ホウ砂−クエン酸緩衝液を用いれば、基質とＮＡＧ
ａｓｅの反応が３７°Ｃで３θ分まで直線的に進行し、
かつ基質の加水分解が抑制され。 基質ブランクの吸光度が小さくなり、ＮＡＧａｓｅの定
量範囲が拡大するので特に好ましい。ｉ）における基質
試薬にホウ砂が混合されている場合には。 クエン酸緩衝液を用いれば同様の効果が得られる。 クエン酸−リン酸緩衝液は、血清中ＮＡＧａｓｅの測定
時には遅延相（’ｌａｇ−ｐｈａｇｅ　）が生じるので
、検体が尿の場合に限られる。 １ｉｉ）　　ｌこおけるアルカリ試薬とは、ｐＨｔθ〜
／／に調整しうるアル（カリを意味し、たとえば炭酸す
トリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウム、ホウ酸−炭酸ナトリウムなどであり、蒸留水に
用時溶解して用いる。基質の加水分解を抑制するため、
、ホウ酸−炭酸ナトリウム緩衝液が特に好ましい。 Ｄ、効果・用途 本発明の化合物（１）は、尿、血゛清などのヒトまたは
動物由来検体中のＮＡＧａｓｅ測定用基質として用いら
れる。 〔測定の原理〕 ある特定の酸性ｐ１（（ｐＨ３，！；〜乙θ、特にｐＨ
１ｌｔθ〜ｊＳ）を維持する緩衝液中で、化合物（１）
を基質として検体と共に一定時間インキユベートすると
下記に示すように、検体中のＮＡＧａｓｅの作用により
基質（Ｉ）が開裂してアグリコン（■）とＮ−アセチル
−グルコサミン（■）が遊離する。これをアルカリ液で
ｐＨ１０−／／に調整してアグリコン（■）を式（ＩＶ
）に示すようなニアルカリ金属塩に変換させて発色させ
１分光光度計で比色定置する。 〔測定操作〕 １０ｍ１試験管に基質溶液（２〜乙ｒｒＭＬＱ　　）　
１０　Ｍｌ注） をとり、３７℃でＳ分間予備加温した後、検体ｊθμを
加えて３７°Ｃで反応させる。Ｘ分後にアルカリ溶液２
θｍｌを加えて反応を停止し、遊離するアグリコンの最
大吸収波長における吸光度を蒸留水または空気を対照と
して１時間以内に測定する。基質ブランクは検体の代り
に蒸留水ｊθ〆を用い、同様に操作したものを測定する
。 注）検体：ヒトもしくは動物由来の尿または血清であり
、採取後直ちに測定するのが好ましい。しかし長時間保
存する時は、２Ｎ塩酸またはＪＮ水酸化カリウムを用い
て坪を６．５に調整しておく。こうすれば、検体中のＮ
ＡＧ　ａ　ｓ　ｅ活性は室温で１日。 −２θ°Ｃで釣りケ月安定である。 ここで、１分間にｌマイクロモルのアグリコン（Ｍｌ）
を生成するＮＡＧａｓｅ量をｌユニット（、）とする。 〔酵素濃度の計算〕 検体中のＮＡＧ　ａ　ａ　ｅ濃度は次式より算出する。 ΔＥ＝＝Ｅ、−Ｅ。 Ｅ７−検体の吸光度 Ｅ２＝基質ブランクの吸光度 ｄ−光路長（１） ε＝ニアグリコン■）の測定波長における吸光係数（Ｃ
Ｉｔ２／μＭ） Ｘ−反応時間（分） 水沫においてはｌ０〜３０分、より好ましくはｌ０〜７
５分が適当である。 〔標準曲線〕 測定操作の項に記載したように、化合物（１）を基質と
する溶液に所定量のＮＡＧａｓｅを加えて反応せしめ、
遊離したアグリコン（■）とＮＡＧ　ＩＬｓ　ｅの関係
をプロットして標準曲線を作成する。たとえば。 ラジオ−ｍ−クレゾールスルホンフタレイニル−β−Ｄ
−グルコサミナイド（１）　（Ｒ’＝　ＣＨＲ−２，＝
Ｒ３３・ ＝Ｈ，Ｙ’＝Ｎａ）　（ＭＣＰ　−ＮＡＧと略記）を基
質としたキット（ＭＣＰ−ＮＡＧ法）を用いてＮＡＧａ
ｓｅ活性の測定を行ない、ＮＡＧａｓｅと遊離するＭＣ
Ｐ　（メタクレゾールパープル（ｍ−クレゾールスルホ
ンフタレイン）〕との量の関係を図１に示す。図１に示
すように、　ＭＣＰ　−ＮＡ、Ｇの場合には０本発明方
法により２θθｕ／ｌまでのＮＡＧ　ａ　ｓ　ｅが定量
的に測定可能である。 〔精度〕 ＮＡＧａｓｅ溶液を用いて同時再現性を検討したところ
、変動係数は７９３％で高い再現性を示した。 〔正常値〕 健常人２を名（男子／弘名１女子１２名）について、尿
中ＮＡＧ　ａ　ｓ　ｅ活性をＭＣＰ　−ＮＡＧ法で測定
すると、その測定値はそれぞれ男子／、／３〜／３．１
０ｕ／Ａ、女子Ｏ乙ｆ〜３．２θｕ／ｌであった。Ｃ１
ｉｎＣ１１ｎｉｃａＣｈｉ　Ａｅｔａ　７３．’ｌ−３
３（／９７６）によれば、早朝３時間尿についての平均
値は　ｌ　７　ｕ／ｌ　（ｉ　３〜２９１　ｕ／ｌ　）
と報告されている。 ℃公知方法との比較〕 公％（７）ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミナイドを基質としたキット（ＰＮＰ　−Ｎ
ＡＧ法）と本願発明のＭＣＰ　−ＮＡＧ法により測定し
たウシ腎臓のＮＡＧ　ａ　ｓ　ｅ活性の相関を図ユに示
す。なお、　ＰＮＰ−ＮＡＧ法によるＮＡＧ　ａ　ｓ　
ｅ活性の測定は下記のとおりにして行った。 ／θｔｘｔ試験管に試薬−■溶液ｉ）ｌＯｍｌをとり・
３７°Ｃで約７０分間予備加温した後、検体尿Ｓθμを
加えて３７°Ｃで反応させる。３θ分後に試薬１ｉ） −ｎ溶液　ｌＯｍｌを加えて反応を停止し、弘θｊ騙に
おける吸光度を蒸留水または空気を対照としてユ時間以
内に測定する。検体毎に尿ブランクを必要とするが、こ
れには試薬−Ｉ溶液のかわりに試薬−■溶液ｉｉ）ｌＯ
ｍｌを用いて、以下同様に操作する。基質ブランクとし
ては試薬−■溶液／θｔｅｌ　。 蒸留水Ｓθμ、−試薬−■溶液ユθｖｔｌを同様に順次
操作したものを１本用いる。 ”ｉ）５ｍＭ基質溶液（００５Ｍクエン酸・リン酸緩衝
液ｐＨＩＡＡｃ１ ｉｉ）０２Ｍホウ酸−・炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
０！；　） ｍ）００３；Ｍクエン酸・リン酸緩衝液（ｐｌ（ｌＡＦ
θ）検体中のＮＡＧａｓｅ濃度は次式より算出する。 ΔＥ　＝Ｅ、　−（Ｅ、＋ＥＪ） Ｅ、＝検体の吸光度 ち＝尿ブランクの吸光度 ＥＪ−基質ブランクの吸光度 ｄ＝光路長（備） 図２　ニＪ：　ｔ）　ＭＣＰ　−ＮＡＧ法とＰＮＰ　−
ＮＡＧ法トハ良好な相関を示すことが明らかであるが、
同じ検体についてのＭＣＰ　−ＮＡＧ法による測定はＰ
ＮＰ　−ＮＡＧ法よりも約弘％高い活性値が得られる。 以下に実施例を示して本発明の態様を明らかにする。 （以下余白） （１）　　フェノールスルホンフタレイン／３７３１１
１９（７０５２９モル）を／Ｎナトリウムメトキシドー
メタノール溶液２０禦ｔ（，２，０Ｅリモル）に溶かし
１次いでメタノールを３３′Ｃ以下で減圧留去する。残
渣にベンゼンを加えて磨砕した後、３３；℃以下で濃縮
する。この操作を更に２度繰り返し。 次いで減圧下で３時間乾燥すると、フェノールスルホン
フタレインのニナトリウム塩２を得る。 （２）上記（１）で得たニナトリウム塩２をＤ■゛（１
０ｍｔ）に可及的に溶かすと青味がかった紫色の液とな
る。これにｌ−クロロ〜／−デオキシ−２゜３、　ｌＡ
ｇ−テトラアセチル−ａ−Ｄ−グルコサミン３　（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　／θ
、／／）（／９乙３）〕３３１．６ｍ１ｌθミリモル）
を攪拌下に加えると、赤味がかった紫色の殆ど溶液状態
となる。約３０分間室温で攪拌し、５℃で一夜（１１時
間）放置する。これに、メタノールで洗浄したアラ７、
−、イ、■Ｉ　Ｒｅ−！；　０　（２ｐｔｌ　）を加え
。 ３０分間攪拌した後、濾過し、ついでメタノールで洗浄
する。Ｆ液および洗液を合わせて減圧濃縮し、残渣にト
ルエンを加えて再び減圧下で濃縮乾固する。残渣をメタ
ノールに溶かし、シリカゲル３ｇに吸着させ、メタノー
ルを除いた後、カラムクロマトグラフ〔固定相ニジリカ
ゲル３０１．溶媒系：酢酸エチル−酢酸エチルーメタノ
ール−３：／）処理して分離すると、ソシオフェノール
スルホンフタレイニル−２，３，ｌＡｇ−テトラアセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミナイドｌを主成分として含む両
分５１θダを得る。 （３）上記画分を、無水酢酸ｌＡ３　ｍｌおよびピリジ
ン７　ｙｘｌの混液中−夜装置する。これに、冷却攪拌
下にメタノ−ル２ｍｌを加え、１時間放置後、減圧下で
溶媒留去する。残渣にトルエンを加え、減圧下に濃縮乾
固する。この操作を２度繰り返し、残渣に塩化メチレン
を加え、可溶部分（約、５１θダ）を分取する。これは
薄層クロマトグラフィー上。 ２つの主スポットを与えるため、カラムクロマトグラフ
（固定相ニジリカゲルｇｓｙ　、溶媒系：ベンゼンー酢
酸エチル−／：２）処理して分離するト、第−両分カラ
は４θ−ジアセチルフェノールスルホノフタレインを得
、また第二両分からは〇−アセチルフェノールスルホン
フタレイニル−２３、１Ａ６−チトラアセチルーβ−Ｄ
−グルコサミナイドｊを殆ど無色の泡状物として得る。 収率グ２％。 この生成物ジを再度カラムクロマトグラフ（固定相ニジ
リカゲル、溶媒系：ベンゼンー酢酸エチル＝／：２）処
理して精製すると、純粋な生成物Ｓを得る。 ＮＭＲ：δＣＤＣＪ３１ど６（・、３Ｈ）、２．θ３（
・、９Ｈ）、、２．ユタ（ｓ、３Ｈ’）、３７〜’Ａ’
ｌ（’ＡＨ）、！；、／θ（ｔ　、　Ｊ　＝９５Ｈｚ　
、　ｉＨ）、よ３乙（ｄ、Ｊ＝ＩＯＨｚ、ｉＨ）、！；
、’１３（ｔ　、Ｊ＝９！；Ｈｚ。 ｉＨ）、１２１１（ａ　、Ｊ＝９θＨｚ　、　ｉＨ）　
、　６．ｆ−１０（／、２Ｈ）。 〔α〕０−６．３±０３°−（Ｃ＝１９！；乙、ＣＨＣ
Ｊ３）（４）上記（３）で得た生成物ｊ３ｏざ■（０弘
２弘ミリモル）を乾燥メタノール１ｌｔｘｌに溶かし、
これに／Ｎナトリウムメトキシドーメタノール溶液Ｏｆ
、ｆｍｔ（０ざ３ｉリモル）を加える。得られた赤色溶
液をＳ′Ｃで７５時間放置し、メタノールで）を加え、
！Ｓ時間攪拌後、濾過し、メタノールで洗う。炉液およ
び洗液を合わせ、減圧濃縮すると、橙色の粉末状残渣を
得る。これをカラムクロマトグラフ〔固定相ニジリカゲ
ル７３９　、溶媒系：酢酸エチル−メタノール−２：／
〕処理して精製すると、ソシオーフェノールスルホンフ
タレイニル　Ｎ−アセチル−β−Ｄ’−クルコサミナイ
ド乙ユ０ツユ０９■性の高い橙色粉末として得る。 収率１９％。 Ｂｒ ＩＲニジ　　　〜３３ｊθ（ｂｒ）、／６乙ｊ（ｓｈ）
、／乙２ｊａｘ 備　。 ＮＭＲ：δＣＤ３０Ｄ　　１９長ｓ、３Ｈ）、！１．３
〜１Ａ２（乙Ｈ）。 、３：／２（ｄ、Ｊ＝ｌθＨＺ　、　／　Ｈ）　、　ｌ
−０−１−６（２Ｈ）、６．ざ〜Ｚｇ（９Ｈ）、７９〜
と３（ｉＨ）。 Ｕ■：λＨコ０２Ａ２ｎｍ（ｔ＝／　０３００　）、　
’ＡＯｆ　ｎｍ　（ｔ　−ａｘ ２２グ００　）　（Ｃ＝／ｌ、、９１１−ｐｇ／諺ｌ）
。 ＴＬＣ（メルク社製プレコーテッド・キーゼルゲル、酢
酸エチル：メタノール＝、２：／）訂値約０７グ。 Ｃ１１）ｆｆ）’　＋　Ｊ　Ｊ：　９±θｇ’　（Ｃ−
７θ３９．メタノール）。 ｃ以下余白） 胃　　　　　　　− （１）　　ｍ−クレゾールスルホンフタレイン７１Ａθ
ユｆ（１０３；ミリモル）および／Ｎナトリウムメトキ
シドーメタノール溶液２０ｍｌ　（２０ミリモル）カラ
、実施例／（１）に従ってｍ−クレゾールスルホンフタ
レインのニナトリウム塩ｔを得る。 （２）上記ニナトリウム塩♂をＤＭＦ　５θ鹸に可及的
に溶かし、ついでｌ−クロロ−７−デオキシ−２３久乙
−テトラア士チルーα−Ｄ−グルコサミン３３６乙ｇ（
／θミリモル）を攪拌下に加えると、赤味がかった紫色
のほとんど完全な溶液となる。これをｊ′Ｃで７乙３時
間放置し、メタノールで湿らヤたアッパーライト■ＩＲ
Ｃ−！；０（２３１１Ｉｌ）を加えると赤味がかった褐
色に変化する。３０分間攪拌後、濾過し、メタノールで
洗う。Ｐ液と洗液を合わせて濃縮し、更にトルエンＡの
共沸ニよりＤＭＦを留去し、残渣をメタノール２３　ｘ
ｔｌに溶かし、シリカゲル２３ｆ／に吸着させてメタノ
ールをよく除いた後、カラムクロマトグラフ（固定相ニ
ジリカゲル）処理する。酢酸エチル２．３１で溶出する
分画は捨て、ついでメタノールθ７１で溶出すると、ラ
ジオ−ｍ−タレソールスルホンフタレイニル−，２，３
，４＋！、、４１．−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコ
サミナイド９を主成分として含む分画を得る。 （３）上記分画を無水酢酸ｊθｔＲ１およｄピリジン７
θｍｌの混液中、−夜装置し、実施例１（３）と同様に
後処理する。得られた残渣１３３１！は薄層クロマトグ
ラフ上２つの主スポット、を与えるため、カラムクロマ
トグラフ（固定相：シリカゲｊし１０Ｏｆ、溶媒系：ベ
ンゼンー酢酸エチル＝’／：２）処理して分離すると、
第一両分からはＱθ−ジアセチル　ｍ−クレゾールスル
ホンフタレインを得。 また第二両分からは０−アセとルーｍ−クレゾールスル
ホンフタレイニル−２，３，１Ａ６＝−テトラアセチル
−β−Ｄ−グルフサミナイド／　０　弘ｊθｆを淡黄色
泡状物として得る。収率乙θ％。 ＮＭＲ：δＣＤ”’　Ｉｌ！（８，３Ｈ）、、２．０２
（ｓ　、９Ｈ）　。 ユ／２（ｓ、４Ｈ）、ユ２７（ｓ、３Ｈ）、３．７〜’
Ａ４ｔ（グＨ）。 ！；、１０（＊、Ｊ＝９５Ｈｚ、／Ｈ）、！；、３２（
ｄ、Ｊ＝＆θＨｚ。 ／Ｈ）−、３，４１−？（ｔ、Ｊ＝９ｊＩ（ｚ、／Ｈ）
、３．９Ｊ’（ｄ、Ｊ＝９θＨｚ　　、　／１（）　　
、乙、ｆ〜Ｊ：θ（ｌθＨ）。 ＋２μ　！ 〔α〕Ｄ°０Ｏ（Ｃ−０９７７、ＣＨ（Ｊ３）〔ａ〕″
２″”＋Ｑｆ＋０１１（Ｃ＝０．９７７、ＣＨＣｌ３）
６３ （４）上記（３）で得た生成物ＩＯ’ｉ、’Ａ２ｆ（左
、５′６ミリモル）を乾燥メタノールｌＯθｔｔｔｌに
溶かし。 これに／Ｎナトリウムメトキシドーメタノール溶液／ｉ
’；’２ｍ１（／１７２ミリモル）を加える。得られた
暗褐色溶液を５’Ｃで一夜放置し、メタノールで湿らせ
たアンバーライトのＩＲＣ−！；０（３０ｍｌ　）を加
え、３θ分攪拌後、濾過し、メタノールで洗う。Ｐ液と
洗液を合わせ、減圧濃縮し、得られた残渣をカラムクロ
マトグラフ（固定相ニジリカゲル１２ｏｙ、溶媒系：酢
酸エチル−メタノール＝２：／）処理して精製すると、
ソジオーｍ　−クレゾールスルホンフタレイニル−Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド／／ｎ７７ｆを吸
湿性の高い橙色粉末として得る。 １１゜ 〜！；、２（／Ｈ）、、５：９〜ざグ（１０１−１’）
。 −３，ｊ 〔ａ’）　　　＋！；２６±０９°（Ｃ−／θ３２　、
ＣＨ，ＯＨ）　、　ＵＶＩＩ／ｌｌｎｍ（ｅ＝２’Ａθ
θθ）（Ｃ＝／／Ｊθｐｇ／ｍｌ　）実施例３ ＭＣＰ　−ＮＡＧとホウ砂の凍結乾燥品を０θｊＭクエ
ン酸緩衝液（ｐＨＩＡ／３）３θｍｌで溶かし、基質溶
液とする（　ＭＣＰ　−ＮＡＧ　、５：　ｔ　３ミリモ
ル濃度、　ｐＨｌＡ１１ｔ）。ｌθ耐試験管に基質溶液
／θｙｘｌをと轢。 ３７°Ｃで５分間予備加温した後、検体尿５ｏｐｔを加
えて３７°Ｃで反応させる。７５分後に０３Ｍ炭酸ナト
リウム水溶液ユθｍｌを加えて遊離したＭＣＰを発色さ
せ、５ざθｎｍにおける吸光度（Ｅ７）を蒸゛留水また
は空気を対照として、７時間以内に測定する。基質ブラ
ンクは、検体の代りに蒸留水Ｓθμを同様に操作したも
のを用いて吸光度（Ｅ、　）を測定し、ＮＡＧａａｅ濃
度を計算により求める。 ＮＡＧａｓｅ濃度（ｕ／ｌ）＝ずＶ７×３．θｊｘ；、
４ｔ、ｔ；二ΔＥＸ／θＺθ 実施例　弘 ソジオーフェノールスルホンフタレイニルーＮ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミナイド（ＰＲ−ＮＡＧ）の凍結
乾燥品を００！；Ｍホウ砂−クエン酸緩衝液（ｐＨ４４
４Ｚ）に溶かしく３’ｉ、’）モル濃度）。 基質溶液とする。１０ｙｇｌ試験管に基質溶液ｌθｙｚ
ｌをとす、３７°Ｃの恒温槽で５分間予備加温した後。 ヒト血清ｊθ４を加えて直ちに攪拌し、３７°Ｃで反応
させる。／θ′分後にθ２Ｍホウ酸−炭酸ナトリウ屯緩
衝液（ｐＨ１０５）、Ｚθｔｐｔｌを加えて酵素を失活
させると同時に、遊離したＰＲ〔フェノールレッド（フ
ェノールスルホンフタレイン）〕を発色させ、！；！；
７ｎｙｓにおける吸光度（Ｅ７）を蒸留水または空気を
対照として測定する。基質ブランクは蒸留水ｊθμを同
様に操作したものについての吸光度（Ｅユ）を測定し、
ＮＡＧａｓｅ濃度を計算により求める。 ＝ΔＥＸ９６，５’ 実施例　ｊ Ｐ　Ｒ−ＮＡＧを０２！；Ｍホウ砂−クエン酸緩衝液（
ｐＨ４４４’）で２Ｓミリモル濃度に溶解し、ｊθｙｓ
ｔガラス製バイアルに１０ｍ１ずつ分注し、凍結乾燥し
て基質溶液凍結乾燥品とする。 ホウ酸９３７ｇと炭酸ナトリウム７０１３１１を粉砕後
混合して粒度を揃えた後、粉末充填機で１９ｆＱずつ１
２θ耐ポリ瓶に粉末充填する。 実施例　乙 実施例ｊで得たＰ　Ｒ−ＮＡＧの基質溶液凍結乾燥品を
蒸留水ｊθゴで溶かし、このうちの／ｍｌを基質溶液と
して用い、実施例５で得た粉末充填したポリ瓶に蒸留水
ンθθｍｌを加えて溶かし、このうちの２θｍｌをアル
カリ溶液として用いて実施例１と同様に操作し、ＮＡＧ
ａｓｅ濃度を求める。 ＝ΔＥＸ９６．ざ 実施例　７ 実施例ｊと同様にしてＭＣＰ　−ＮＡＧの基質溶液凍結
乾燥品を製造し、これを蒸留水ｊθｔｔｔｌに溶解した
もの／ＩＩｌを基質溶液として用い、実施例５で得た粉
末充填したポリ瓶に蒸留水１００ｙｘｌを加えて溶かし
たもの２ｙｘｌをアルカリ溶液として用いて実施例３と
同様に操作する。 ｓｇｏ綿で測定： ΔＥ ＮＡＧａｓｅ濃度（ｕ　／ｌ　””■×３．０３ｘ万×
ｌθθθ 百＝ΔＥＸ／θ６．ｔ６ 弘図面の簡単な説明 図１ ＭＣＰ　−ＮＡＧ法によるＮＡＧ　ａ　ｓ　ｅ活性と生
成するＭＣＰとの関係を示す。横軸はＮＡＧａｓｅ濃度
（ｕ／ｌ）であり、縦軸は生成するＭｃＰの量（ΔＥ５
ざＯｎｍ／／３分）である。これより末法により約２θ
θｕ／ｌまで定量的に測定できることがわかる。 図２ ＰＮＰ　−ＮＡＧ法とＭＣＰ　−ＮＡＧ法の相関関係を
示す。 横軸はＰＮＰ　−ＮＡＧ法によるＮＡＧａｓｅ濃度（ｕ
／ｌ）であり、縦軸ハＭＣＰ−ＮＡＧ法によるＮＡＧ　
ａ　ａ　ｅ濃度（ｕ／Ｊ）である。 直線回帰　Ｙ＝１０１１×十〇θ２ ｒ−０９タツプ 特許出願人　　塩野義製薬株式会社 代　理　人　　弁理士　告時　光纒− し １０θ　　　　　　　　２θθ １００　　　　　　　　２００ 手続補正書 昭和（７年２月Ｚ日 特許庁長官　殿 ｌ事件の表示　昭和５６年特許願第３９７θダ　号３補
正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　大阪府大阪市東区道修町３丁目／２番地名称　（
／９２）塩野義製薬株式会社 代表者　　　吉　利　−雄 弘代理人 住所　大阪市福島区鷺洲Ｓ丁目７２番を号塩野義製薬株
式会社特許部 ６、補正の対象 昭和５７年ｊ月２６日提出の手続補正書の差出書 ７補正の内容 別紙のとおり と添付簀類の目録 手続補正書の差出書　　　　　／　通 以上 特許庁長官　殿 ／事件の表示　昭和Ｓｔ年特許願第　３９７θグ　号３
発明の名称 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ゲルコサｊ４導体およびこ
れを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニダーゼ活性測定法３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　大阪府大阪市東区道修町３丁目７２番地名称　（
１９２）塩野義製薬株式会社 代表者　　　吉　利　−雄 弘代理人 住所　大阪市福島区鷺洲ｊ丁目１２番を号塩野義製薬株
式会社特許部 ま補正の対象 明細書全文および図面 ６、補正の内容 明細書全文および図面を別紙の通りに訂正する。 Ｚ添付書類め目録 訂正明細書および図面　　　各／通 以上

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）下記一般式で示されるＮ−アセチル−β−Ｄ−グ
    ル・コサミン誘導体。 Ｈ （式中、Ｒ１−Ｒ３は水素、低級アルキル、またはハロ
    ゲンを示す） （２）下記構成成分よりなるＮ−アセチル−β−〇−グ
    ルコサミニダーゼ測定試薬。 ｉ）特許請求の範囲（１）に記載の化合物からなる基質
    試薬 ｉｉ）緩衝剤 ｉ）アルカリ試薬 ＋３１　　基質カｍ−クレゾールスルホンフタレイニル
    −Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイドとホウ砂の
    凍結乾燥品であることを特徴とする特許請求の範囲（２
    ）に記載の試薬。 （４）　　緩衝剤がクエン酸緩衝剤粉末であることを特
    徴とする特許請求の範囲（２）に記載の＼＼′に’ｂ”
    ＋鳳＼メ＼＼ベズ＼＼Ｎ＼＼Ｘ＼冥試薬。 （５）アルカリ試薬がホウ酸と炭酸ナトリウムの粉末で
    あることを特徴とする特許請求の範囲（２）に記載の試
    薬。 （６）　　アルカリ試薬が炭酸ナトリウム粉末であるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲（２）に記載の試薬。 （７）特許請求の範囲（１）に記載の化合物からなる基
    質試薬を緩衝液で溶解し、これ番こ検体を加えてインキ
    ュベートし、アルカリ溶液で発色させて比色定量するこ
    とを特徴とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
    ーゼの活性測定法。 （８）　　緩衝液のｐＨが３．５〜６．０であることを
    特徴とする特許請求の範囲（７）に記載の測定法。 （９）緩衝液がクエン酸緩衝液であることを特徴とする
    特許請求の範囲（７）に記載の測定法。 Ｏｅ　　インキュベートを１０〜１５分間行なうことを
    特徴とする特許請求の範囲（７）に記載の測定法。 Ｃ１）　アルカリ溶液がホウ酸−炭酸ナトリヴム緩衝液
    であることを特徴とする特許請求の範囲（７）に記載の
    測定法。 Ｏ２検体がヒトまたは動物の尿または血清であることを
    特徴とする特許請求の範囲（７）に記載の測定法。
JP56039104A 1981-03-17 1981-03-17 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体およびこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼ活性測定法 Granted JPS58994A (ja)

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