JPH04305593A - Ｎ−およびｏ−置換アミノフェノール誘導体、その製造用中間体およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規Ｎ−およびＯ−置換
アミノフェノール誘導体およびその製造方法に関する。

【０００２】本発明はまた本発明のＮ−およびＯ−置換
アミノフェノール誘導体の製造用の中間体ならびにその
製造方法に関する。

【０００３】さらに、本発明はヒドロラーゼ基質として
のＮ−およびＯ−置換アミノフェノール誘導体の使用に
関する。

【０００４】加えて、本発明は、色素生産性酵素基質を
酵素と反応させ、酵素により基質から遊離したロイコ色
物質を酸化し、酵素量測定として得られた着色物質を測
定する、ヒドロラーゼの比色定量測定方法に関する。

【０００５】本発明はまた色素生産性酵素基質および適
当な緩衝物質を含有する、ヒドロラーゼ測定用診断薬に
関する。

【０００６】最後に、本発明はヒドロラーゼ測定用診断
薬の製造におけるＮ−またはＯ−置換アミノフェノール
誘導体の使用に関する。

【０００７】

【従来の技術および課題】ヒドロラーゼは、一般に、水
の消費を伴い、加水分解的に結合を開裂する酵素である
ことが分かっている。近年、臨床化学および診断法の分
野において、グリコシドおよびエーテル結合を開裂する
かかるヒドロラーゼの活性を測定することが重要となっ
た。例として挙げられるものには、エステラーゼ、例え
ば、白血球に存するカルボン酸エステルを開裂する酵素
、またはホスファターゼ、例えば、リン酸エステルを加
水分解するアルカリおよび酸性ホスファターゼがある。 腎臓および尿生殖管の疾患の診断では、その固有のエス
テル分解活性に基づき、尿中の白血球を検出することが
有用であることが証明されている。酸性ホスファターゼ
の活性測定は、前立腺癌腫の初期診断においては有用な
手段である。アルカリホスファターゼは、酵素イムノア
ッセイの標識酵素として用いることができる。

【０００８】グリコシダーゼ、例えば、ガラクトシダー
ゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、アミラーゼおよ
びＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼは、グリ
コシド結合を開裂する。ヒトおよび動物において、これ
ら酵素は多くの生理学的機能を果たしている。例えば、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼは、それにより、ラクトース
の加水分解が生じるため、炭水化物の代謝において重要
な役割を果たす。さらに、β−Ｄ−ガラクトシダーゼは
、糖脂質、ムコ多糖類および糖蛋白の分解におけるキー
酵素である。さらに生理学的に重要なグルコシダーゼと
して、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−およびβ−
Ｄ−グルコシダーゼならびにα−Ｄ−マンノシダーゼが
挙げられる。

【０００９】これらの生理学的価値に加えて、近年、グ
ルコシダーゼは診断学の分野および生物工学の分野にお
いて重要になってきた。すなわち、例えば、これらの酵
素は、酵素イムノアッセイに関して、指示酵素として広
範囲に用いられる。これに関しては、特に、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼが好ましい。

【００１０】体液中における酵素Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニダーゼ（β−ＮＡＧａｓｅ）の存在は、
生体において、疾患または機能障害に関する有用な指示
役である。例えば、尿において、腎臓移植の場合、数値
の増大は、ドナー腎臓の拒絶の指示を意味する。また、
多くの腎臓に関する疾患および毒性損傷の場合にも数値
の増大が生じる。女性の唾液において、ＮＡＧａｓｅ活
性は、受胎能および妊娠の指標である。

【００１１】ヒドロラーゼ活性の測定では、酵素含有試
料を適当な基質と反応させる。該基質が酵素により開裂
され、開裂生成物の一方が適当な方法により検出される
。検出すべき酵素に対する天然基質が、しばしば、基質
として適当である。しかしながら、特に好ましくは、開
裂生成物の一方が、分光的に可視領域で、または紫外線
領域で検出しうる残部である色素生産性化合物である。

【００１２】欧州特許明細書第Ａ−０２７４７００にお
いて、エステルおよびグリコシド結合開裂酵素を測定す
る色素生産性基質として、ジヒドロレゾルフィン（ｄｉ
ｈｙｄｒｏｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）化合物が記載されてい
る。基質の酵素的開裂後、直ちに水溶性ロイコ色物質が
得られ、酸化剤により容易に酸化され、着色物質が得ら
れる。ジ置換のジヒドロレゾルフィン誘導体は、複数の
反応工程で加水分解され、反応速度の測定において、複
雑化の要因となる。

【００１３】グリコシド結合開裂酵素として、多くの色
素生産性基質が知られている。すなわち、バイオケム・
ゼット（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｚ．），３３３，２０９／１
９６０において、β−Ｄ−ガラクトシダーゼに対する基
質として、フェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、ならびに
その芳香族環が置換されているいくつかの誘導体（例え
ば、ｏ−ニトロフェニル−およびｐ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシド）が記載されている。加水分解に
より遊離したフェノールを紫外線領域にて、または、ニ
トロフェノールの場合、短波可視波長領域にて測光学的
に測定する。アミノアンチピリンでの酸化的カップリン
グをまた、指示体反応として行うことができる（アナリ
ティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．），４０，２８１／１９７１参照
）。

【００１４】組織化学的研究では、ナフチル−β−Ｄ−
ガラクトシドが、例えば、ヒストケミー（Ｈｉｓｔｏｃ
ｈｅｍｉｅ），３５，１９９／１９７３において１−ナ
フチル化合物が、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），１９５，
２３９／１９５２において６−ブロモ−２−ナフチル誘
導体が、およびヒストケミー，３７，８９／１９７３に
おいてナフトール−β−Ｄ−ガラクトシドが用いられて
いる。視覚化には、形成したナツトールを種々のジアゾ
ニウム塩と反応させ、アゾ有色物質を得る。かかるカッ
プリング反応において、カップリング成分の代わりに酵
素的開裂により遊離される基質と反応させた場合、該試
料成分は、例えば、有害効果を有するかもしれない。

【００１５】酵素Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ダーゼ（ＮＡＧａｓｅ）の検出については、米国特許明
細書第３９６８０１１号において、酵素反応に必要なｐ
Ｈ値にて開裂し、その反応生成物が着色を形成するか、
または塩基性ｐＨ値にて検出または測定しうるフェノー
ル誘導体の使用が示唆されている。したがって、緩衝剤
が不可欠である。

【００１６】同様に、欧州特許明細書第００９７５０６
号において、ＮＡＧａｓｅ基質が、酵素およびクロモゲ
ン、例えば、ｐ−ニトロフェノールの存在下、酸性ｐＨ
値にて遊離し、塩基性ｐＨ値に再度緩衝処理した後、着
色を形成し、該色相を測定しうることを示唆している。 アンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）の遊
離の場合、蛍光学的に検出することができるが、それは
装置として非常に高価であり、とくに生物学的試料の場
合、それに存する蛍光的バックグラウンドにより妨害さ
れる。

【００１７】欧州特許明細書第００６０７９３号におい
ては、ＮＡＧａｓｅ用基質としてスルホフタレイニル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドが記載されてい
る。しかしながら、ブランク値の測定の必要性、および
反応混合物を再度緩衝剤で処理する付加的操作工程は不
利な点である。

【００１８】欧州特許明細書第０１８０９６１号は、β
−ＮＡＧａｓｅ基質として、２−および４−位にてハロ
ゲンまたはニトロで置換されたＮ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニドを開示している。該基質によるＮＡＧａ
ｓｅの測定方法は、正直なところ、付加的操作工程およ
びブランク値測定を行うことなく実施することができる
が、該基質の溶解性は、湿潤剤の存在下においてさえ非
常に低い。尿中のＮＡＧａｓｅを測定する場合、尿成分
による妨害がもたらされ、低酵素濃度では、試験を行う
のに要する時間が非常に長くなる。

【００１９】ナトリウム３，３’−ジクロロフェノール
スルホンフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミジンが、欧州特許明細書第０２９４８０４号に記載
されている。測定は直接的にかつ停止することなく実施
することができるが、酸性ｐＨ値というわけではないが
、ほんのわずか酸性である場合に遊離したクロモゲンが
十分に発色するため、検出反応はｐＨ６．２５で実施し
なければならない。酵素の反応速度は、ｐＨ４．５〜５
で最大であり、このため基質の酵素的開裂は遅延するこ
ととなる。加えて、ＮＡＧａｓｅ測定に関する前記すべ
ての分析方法では、分光光度装置を必要とする。

【００２０】ドイツ連邦共和国特許明細書第２８５７１
４５号において、直接的にまたはアルカリ処理後のいず
れかにて視覚的アセスメントを可能する基質が記載され
ている。結合する着色物質は、式： ＨＸ−Ａ−Ｙ−ＮＯ２ ［式中、Ａは芳香族基、ＨＡは助色団基およびＹは不飽
和基を意味する］で示される物質である。これらの基質
は赤または青色により酵素を指示する。しかしながら、
該方法は、酵素の存在下、該基質自身が着色されるため
、単に色相変化が生じるにすぎないという欠点を有する
。非−前処理または希釈試料、例えば、尿の場合、尿の
他の成分が酵素的開裂を極端に低下させるため、該基質
を高濃度にて存在させなければならない。弱固有色の基
質でさえ、必要な濃度では、強度の有色試験ストリップ
を提供する。色相変化を介する検出では、低酵素濃度を
検出できないか、または非常に長い時間でほんのわずか
に検出できるにすぎない。

【００２１】日本国特許明細書第Ａ−０１０６８３８９
において、ＮＡＧａｓｅとしてＮ−およびＯ−置換アミ
ノフェニル誘導体が示唆されており、それはＮ−置換基
として、遊離ヒドロキシル基を有するフェノールまたは
ナフトール基またはキノニミン構造を有する。条件とし
て、該分子中に存在する２つのＮ−置換基の一方は、電
子吸引基のみを有し、それに対して他方は電子供与基に
より置換されている。これら化合物は水可溶性が非常に
低い。その結果、該化合物は試料成分による妨害に付さ
れる。例えば、該化合物は尿中にてＨＡＧａｓｅにより
開裂されない。

【００２２】要約すると、先行文献からのヒドロラーゼ
基質の欠点を以下に示すことができる：多段階酵素的開
裂を行う基質は反応速度の測定が複雑である。短波可視
波長領域において測定すべき酵素により分離される基（
例えば、黄色の基）の吸光度は、多くの試料、特に体液
の試料において、多くの物質が存在し、また短波長領域
にて吸収されるため、妨害されることなく測定されない
。別の化合物と結合することにより酵素的に分離するこ
とができる基を可視することもまた、試料成分により妨
害される。蛍光測定はその装置が高価であり、特に生物
学試料の場合、試料物質のバックグラウンド蛍光により
しばしば妨害される。ヒドロラーゼ基質を用いる酵素的
開裂の場合、その色相が単に変わるだけで、低濃度の酵
素測定が、高基質濃度で可能となるにすぎず、そのため
に多くの反応時間を要し、ある環境下においては、測定
すべき酵素を抑制するかもしれない。ヒドロラーゼ基質
の貧溶解性は非常に低い感応性の測定方法をもたらし、
所望の結果が得られるまで多くの時間を要する。ヒドロ
ラーゼ基質を用いる測定方法はさらに、ブランク値測定
のような付加的工程または反応混合物の再緩衝剤処理を
必要とし、それは比較的長時間を要し、加えて、それを
実施することは面倒である。したがって、付加工程を要
する測定方法は使用に適さず、試験担体、いわゆる乾式
化学試験に対し困難性を伴って使用できるにすぎない。 さらには、例えば、再緩衝処理工程を要する測定方法は
、反応速度を測定できないだけでなく、純粋な終点法で
はない。

【００２３】本発明は、ヒドロラーゼ基質の使用に伴な
う前記問題を解決した、すなわち、ヒドロラーゼの迅速
かつ容易な測定を可能とし、反応速度だけでなく、終点
測定をも可能とし、さらに低酵素濃度を測定する感受性
能を有し、できる限り妨害されることなく、ヒドロラー
ゼ測定に供することができ、いずれの高価な装置も必要
とせず、さらにまた試験担体に対しても用いることがで
きる。

【００２４】

【課題を解決するための手段】したがって、本発明は、
式（Ｉ）：

【化２１】 ［式中、Ｇは有機または無機酸の残基またはグリコシド
基；Ｒ１およびＲ２は、同一または異なり、水素または
ハロゲン原子、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２またはこれら酸基
の塩、ヒドロキシル、ニトロ、カルボキシル、カルボキ
シアミドまたはシアノ、または所望により、１つ以上の
ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、シアノ、ＳＯ
３ＨまたはＰＯ３Ｈ２残基またはこれら酸残基の塩によ
り置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルコ
キシ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、ア
ルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、アリールま
たはアラルキル基、または２つの置換基が隣接する炭素
原子上にある場合、これらは一緒になって、所望により
１つ以上のＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２またはこれら酸残基の
塩、アルキルおよび／またはカルボキシル基により置換
されていてもよい１，４−ブタジエンジイル基であって
もよく；Ｒ３は水素原子、ＣＯ−ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、
ＰＯ３Ｈ２またはこれら酸残基の塩、所望により１つ以
上ハロゲン、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈおよび／またはＰＯ３
Ｈ２またはこれら酸基の塩により置換されていてもよい
アルキルカルボニル基、または所望により１つ以上のＳ
Ｏ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２またはこれら酸残基の塩により置換
されていてもよいアリールカルボニル基；およびＬは、
式（ＩＩ）：

【化２２】 （式中、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なり、アルキ
ル基であるか、または一緒になって、酸素、硫黄または
窒素を有していてもよい３〜６員の飽和炭化水素鎖であ
り、該アルキルまたは炭化水素鎖は、所望により１つ以
上のヒドロキシル、カルボキシル、アルコキシカルボニ
ル、アルコキシ、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈ２基、これら
酸残基の塩またはハロゲンにより置換されていてもよく
；Ｒ６およびＲ７は、同一または異なっていてもよく、
水素またはハロゲン原子、ヒドロキシルまたはカルボキ
シアミド、または所望により１つ以上のヒドロキシル、
カルボキシル、ハロゲン、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈ２ま
たはこれら酸残基の塩により置換されていてもよいアル
キル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルコキシカ
ルボニル、アリールまたはアラルキル基を意味する）で
示される基であるか、またはＬは、式（ＩＩＩ）：

【化
２３】 （式中、Ｘ−ＹはＮＲ８−ＣＯまたはＮ＝ＣＲ９であり
、ここでＲ８は水素原子またはアルキル基であり、Ｒ９
はアルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、
アリール、アラルキルで、各々、所望により、ヒドロキ
シル、ジアルキルホスフィニル、カルボキシル、ＳＯ３
Ｈ、ＰＯ３Ｈ２、これら酸残基の塩および／またはアル
コキシカルボニルにより置換されていてもよく、アミノ
、該基は、所望により、１または２個のアルキル基によ
り置換されていてもよく、該アルキル基は、所望により
１つ以上のヒドロキシル、カルボキシルおよび／または
アルコキシカルボニルにより置換されていてもよく、ア
ミノが２個のアルキル基により置換されている場合、こ
れらは一緒になって環を形成することができ、それはア
ミノ基の窒素原子とは別に、さらに所望により酸素、硫
黄またはさらなる窒素原子を有していてもよく、または
アミノは、所望により１または２個のアシル残基、アル
コキシ−および／またはアラルコキシカルボニル基、Ｈ
２Ｎ−ＣＯ、アルキル−、アラルキル−および／または
アリールカルバモイル基により置換されていてもよく、
または水素、カルボキシル、アルコキシカルボニル、カ
ルボキシアミドまたはハロゲンであり；ＺはＮＲ１０−
Ｎ＝Ｎであり、ここでＲ１０は水素原子またはアルキル
またはアラルキル残基であるか、またはＺは窒素原子ま
たは炭素原子を、所望により１以上の窒素または硫黄原
子を含有していてもよい３〜５員の不飽和鎖であり、該
炭素原子は、所望によりアルキル、アルコキシ、ヒドロ
キシアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシル、アラルキ
ル、アリール、カルボキシル、カルボキシアミド、アル
コキシカルボニル、シアノ、所望により１または２個の
アルキル基により置換されていてもよいアミノ（該アル
キル置換基は、所望により１以上のヒドロキシル、カル
ボキシルおよび／またはアルコキシカルボニル基により
置換されていてもよく）、および／またはハロゲンによ
り置換されていてもよく、ならびに二重結合を介して結
合していない窒素は、所望によりアルキルまたはアラル
キルにより置換されていても、または２つの隣接する鎖
置換基は、所望によりアルキレン基を形成してもよく、
次に、所望によりアリールおよびその対応する互変異性
体で置換されているかまたは縮合（ａｎｅｌｌａｔｅ）
されていてもよい）で示されるピラゾロ複素環基を意味
する］で示されるＮ−およびＯ−置換アミノフェノール
誘導体の、ヒドロラーゼ基質としての使用に関する。

【００２５】英国特許明細書第２０６１５３７号および
ドイツ連邦共和国特許明細書第２２６０２０２号から、
Ｇがアルカンカルボン酸残基、Ｒ３が水素原子、所望に
より１以上のハロゲンにより置換されていてもよいアリ
ールカルボニル残基またはアルキルカルボニル残基で、
Ｌが式（ＩＩＩ）のピラゾロ複素環基であり、ここでＸ
−ＹがＮ＝ＣＲ９で、Ｒ９が前記と同じ、加えてＺが二
重結合を介して結合していない窒素原子が水素原子によ
り置換されている１，２，４−トリアゾール環である、
式（Ｉ）に対応するピラゾロトリアゾール誘導体が、写
真作成用の発色物質として知られている。式（Ｉ）の他
の化合物は新規である。

【００２６】したがって、本発明は、さらに式（Ｉ）：

【化２４】 ［式中、Ｇは有機または無機酸の残基またはグリコシド
基；Ｒ１およびＲ２は、同一または異なり、水素、ハロ
ゲン、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２またはこれら酸基の塩、ヒ
ドロキシル、ニトロ、カルボキシル、カルボキシアミド
またはシアノ基、または所望により１つ以上のヒドロキ
シル、カルボキシル、ハロゲン、シアノ、ＳＯ３Ｈまた
はＰＯ３Ｈ２またはこれら酸残基の１つの塩により置換
されていてもよいアルキル、アルケニル、アルコキシ、
アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルコキ
シカルボニル、アルキルカルボニル、アリールまたはア
ラルキル基、または２つの置換基が隣接する炭素原子上
にある場合、一緒になって、所望により１つ以上のＳＯ
３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２またはこれら酸残基の塩により置換さ
れていてもよい１，４−ブタジエンジイル基であり；Ｒ
３は水素、ＣＯ−ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２また
はこれら酸残基の塩、所望により１つ以上ハロゲン、Ｃ
ＯＯＨ、ＳＯ３Ｈおよび／またはＰＯ３Ｈ２またはこれ
ら酸残基の塩により置換されていてもよいアルキルカル
ボニル残基、または所望により１つ以上のＳＯ３Ｈ、Ｐ
Ｏ３Ｈ２またはこれら酸残基の塩により置換されていて
もよいアリールカルボニル残基；およびＬは、式（ＩＩ
）：

【化２５】 （式中、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なり、アルキ
ル残基であるか、または一緒になって、酸素、硫黄また
は窒素を有していてもよい３〜６員の飽和炭化水素鎖で
あり、該アルキルまたは炭化水素鎖は、所望により１つ
以上のヒドロキシル、カルボキシル、アルコキシカルボ
ニル、アルコキシ、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈ２基、これ
ら酸残基の塩またはハロゲンにより置換されていてもよ
く；Ｒ６およびＲ７は、同一または異なっていてもよく
、水素、ハロゲン、ヒドロキシルまたはカルボキシアミ
ド、または所望により１つ以上のヒドロキシル、カルボ
キシル、ハロゲン、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈ２またはこ
れら酸残基の１つの塩により置換されていてもよいアル
キル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルコキシカ
ルボニル、アリールまたはアラルキル残基を意味する）
で示される基であるか、またはＬは、式（ＩＩＩ）：

【
化２６】 （式中、Ｘ−ＹはＮＲ８−ＣＯまたはＮ＝ＣＲ９であり
、該Ｒ８は水素原子またはアルキル基であり、Ｒ９はア
ルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アリ
ールアラルキルで、各々、所望により、ヒドロキシル、
ジアルキルホスフィニル、カルボキシル、ＳＯ３Ｈ、Ｐ
Ｏ３Ｈ２、これら酸残基の１つの塩および／またはアル
コキシカルボニルにより置換されていてもよく、アミノ
、該基は、所望により、１または２個のアルキル基によ
り置換されていてもよく、該アルキル基は、所望により
１つ以上のヒドロキシル、カルボキシルおよび／または
アルコキシカルボニルにより置換されていてもよく、ア
ミノが２個のアルキル基により置換されている場合、こ
れらの基は一緒になって環を形成することができ、それ
はアミノ基の窒素原子とは別に、さらに所望により酸素
、硫黄またはさらなる窒素原子を有していてもよく、ま
たはアミノは、所望により１または２個のアシル基、ア
ルコキシ−および／またはアラルコキシカルボニル基、
Ｈ２Ｎ−ＣＯ、アルキル−、アラルキル−および／また
はアリールカルバモイル基により置換されていてもよく
、または水素、カルボキシル、アルコキシカルボニル、
カルボキシアミドまたはハロゲンであり；ＺはＮＲ１０
−Ｎ＝Ｎであり、該Ｒ１０は水素、アルキルまたはアラ
ルキルであるか、またはＺは窒素原子または炭素原子を
、所望により１以上の窒素または硫黄原子を含有してい
てもよい３〜５員の不飽和鎖であり、該炭素原子は、所
望により、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル
、アルキルチオ、ヒドロキシル、アラルキル、アリール
、カルボキシル、カルボキシアミド、アルコキシカルボ
ニル、シアノ、所望により１または２個のアルキル基に
より置換されていてもよいアミノ（該アルキル置換基は
、所望により１以上のヒドロキシル、カルボキシルおよ
び／またはアルコキシカルボニルにより置換されていて
もよく）、および／またはハロゲンにより置換されてい
てもよく、ならびに二重結合を介して結合していない窒
素原子は、所望によりアルキルまたはアラルキルにより
置換されていても、または２つの隣接する鎖置換基は、
所望によりアルキレン基を形成してもよく、次に、所望
によりアリールおよびその対応する互変異性体で置換さ
れているかまたは縮合されていてもよい）で示されるピ
ラゾロ複素環基を意味する；ただし、Ｇがアルカンカル
ボン酸基で、Ｒ３が水素原子、所望により１以上のハロ
ゲンにより置換されていてもよいアリールカルボニル基
またはアルキルカルボニル基であり、Ｌが式（ＩＩＩ）
のピラゾロ−複素環基であって、ここでＸ−ＹがＮ＝Ｃ
Ｒ９、該Ｒ９が前記と同じである場合、その場合、Ｚは
二重結合を介して結合していない窒素原子が水素により
置換されている１，２，４−トリアゾールを形成しない
］で示されるＮ−およびＯ−置換アミノフェノール誘導
体を提供する。

【００２７】さらに、本発明は、式（ＩＶ）：Ｇ−Ｄ　
　　　　　　　　　　　　　（ＩＶ）［式中、Ｇは有機
または無機酸の残基またはグリコシド基であり、Ｄは反
応基であって、該Ｇにおける官能基は、所望により、ペ
プチドおよび炭水化物化学の分野における通常の保護基
で保護されていてもよい］で示される化合物を、式（Ｖ
）：

【化２７】 ［式中、Ｒ１〜Ｒ３およびＬは式（Ｉ）の記載と同じ、
加えてＲ３はアミノ保護基とすることができ、Ａは水素
原子、所望により置換されていてもよいアンモニウムイ
オンまたはアルカリ金属を意味する］で示される化合物
と反応させ、その後、所望により、保護基を分離するこ
とを特徴とするこれら化合物の製造方法を提供する。

【００２８】さらには、本発明は、式（Ｖ’）：

【化２
８】 ［式中、Ｒ１〜Ｒ３は式（Ｉ）の記載と同じ、およびＬ
は、式（ＩＩＩ）：

【化２９】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは式（Ｉ）の記載と同じ；ただ
し、Ｒ３が、所望により１以上のハロゲンにより置換さ
れていてもよいアリールカルボニル基またはアルキルカ
ルボニル基であり、Ｘ−ＹがＣ＝ＮＲ９である場合、そ
の場合、Ｚは二重結合を介して結合していない窒素原子
が水素により置換されている１，２，４−トリアゾール
環を形成しない）で示されるピラゾロ複素環基を意味す
る］で示される化合物を提供する。

【００２９】加えて、本発明は、 ａ）式（ＶＩＩ）：

【化３０】 ［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＬは式（Ｖ’）の記載と同じ
］で示される化合物を還元し、Ｒ３が水素原子でない場
合、アニリノ基をアシル化し、所望により存在してもよ
いエステル基を除去するか、または ｂ）Ｌが、式（ＩＩＩ）：

【化３１】 ［式中、Ｘ−Ｙ、ＧおよびＺは式（Ｉ）の記載と同じ］
で示されるピラゾロ複素環基である式（Ｉ）の化合物を
、適当なヒドロラーゼと反応させることからなる式（Ｖ
’）の化合物の製造方法を提供する。

【００３０】さらに、本発明は、式（ＶＩＩ）：

【化３
２】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は式（Ｉ）の記載と同じ、Ｌは
、式（ＩＩＩ）：

【化３３】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは式（Ｉ）の記載と同じ）で示
されるピラゾロ複素環基を意味する］で示される化合物
を提供する。

【００３１】さらにその上、本発明は、ａ）Ｌが、式（
ＩＩＩ）：

【化３４】 ［式中、Ｘ−ＹおよびＺは式（Ｉ）の記載と同じ］で示
されるピラゾロ複素環基である式（Ｉ）の化合物を、ヒ
ドロラーゼと反応させ、反応生成物を酸化するか、また
は

【００３２】ｂ）式（ＶＩＩＩ）： ＮＨ２−Ｌ　　　　　　　　　　　（ＶＩＩＩ）［式中
、Ｌは、式（ＩＩＩ）：

【化３５】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは式（Ｉ）の記載と同じ）で示
されるピラゾロ複素環基を意味する］で示される化合物
を、酸化剤の存在下、式（ＩＸ）：

【化３６】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は式（ＶＩＩ）の記載と同じ、
Ｖは水素またはハロゲン原子またはＣＯＯＨまたはＳＯ
３Ｈ基を意味する］で示されるフェノールと反応させる
か、または

【００３３】ｃ）式（Ｘ）： Ｌ−Ｈ　　　　　　　　　　　　　　（Ｘ）［式中、Ｌ
は、式（ＩＩＩ）：

【化３７】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは式（Ｉ）の記載と同じ）で示
されるピラゾロ複素環基を意味する］で示される化合物
を、式（ＸＩ）：

【化３８】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は式（ＶＩＩ）の記載と同じ、
Ｈａｌはハロゲン原子を意味する］で示される化合物と
反応させるか、または

【００３４】ｄ）式（ＸＸＶ）： Ｌ−Ｅ　　　　　　　　　　　　　　（ＸＸＶ）［式中
、Ｅはニトロまたはニトロソ基、およびＬは、式（ＩＩ
Ｉ）：

【化３９】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは式（Ｉ）の記載と同じ）で示
されるピラゾロ複素環基を意味する］で示される化合物
を、式（ＸＸＶＩ）：

【化４０】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は式（ＶＩＩ）の記載と同じ、
Ｑはヒドロキシル基またはジアルキルアミノ基、Ｍｅは
ハロゲン原子で置換されたリチウムまたはマグネシウム
を意味する］で示されるオルガノ金属化合物と反応させ
、その後、水性媒体中にて後処理することからなる式（
ＶＩＩ）の化合物の製造方法を提供する。

【００３５】本発明の目的は、また、新規な式（Ｉ）の
化合物の製造についての式（Ｖ’）および（ＶＩＩ）の
化合物の使用にある。

【００３６】本発明の目的は、また、色素生産性酵素基
質を酵素と反応させ、該酵素により該基質から遊離した
ロイコ色物質（ｌｅｕｋｏ　　ｃｏｌｏｕｒｅｄ　　ｍ
ａｔｅｒｉａｌ）を酸化し、酵素量の測定として得られ
た着色物質を測定し、ここで、酵素基質として式（Ｉ）
の化合物を使用する、ヒドロラーゼ比色定量測定方法に
ある。

【００３７】加えて、本発明の目的は、色素生産性酵素
基質および適当な緩衝物質を含有し、ここで、色素生産
性酵素基質として式（Ｉ）の化合物を使用する、ヒドロ
ラーゼ測定用診断薬にある。

【００３８】最後に、本発明の目的は、ヒドロラーゼ測
定用診断薬を製造するための式（Ｉ）の化合物の使用に
ある。

【００３９】前記の式（Ｉ）の化合物が、著しく優れた
方法にて、明確にした問題点を解決するヒドロラーゼ基
質であることが判明した。

【００４０】Ｇの定義における無機酸残基とは、特に、
エステル結合を介してアミノフェノール基本構造に結合
しているオルトおよびピロリン酸および硫酸残基である
ことを認識すべきである。残基ＰＯ３ＭＭ’およびＳＯ
３Ｍ、特にＰＯ３ＭＭ’が好ましく、ここで、遊離酸の
場合、ＭおよびＭ’は水素原子であり、それに対して、
該酸が塩として存在する場合、ＭおよびＭ’はアルカリ
金属、アルカリ土類金属またはアンモニウムイオンを意
味する。

【００４１】ＭおよびＭ’の定義におけるアルカリ金属
イオンとは、特に、リチウム、ナトリウムおよびカリウ
ムイオンであることを認識すべきである。アルカリ土類
金属イオンは、特に、マグネシウム、カルシウムまたは
バリウムイオンである。

【００４２】ＭおよびＭ’の定義におけるアンモニウム
イオンとして、非置換アンモニウムイオンＮＨ４＋また
は１以上のアルキルまたはアラルキル基により置換され
ているアンモニウムイオンが挙げられる。この場合、ア
ルキル基とは、６個までの炭素原子を有するものである
ことを認識すべきであり、メチルまたはエチル基が好ま
しい。アラルキル基とは、前記アルキル基がアリール基
により置換されているものであり、該アリールは、炭素
芳香族またはヘテロ芳香族基で、６〜１０個の環原子を
含有する基であることを認識すべきであり、特にフェニ
ルまたはナフチル基が好ましい。好ましいアラルキル基
はベンジル基である。置換アンモニウムイオンの置換基
は、同一であってもまたは異なっていてもよい。また、
アンモニウムイオンとして、例えば、ピペリジニウムカ
チオンおよびピリジニウムイオンを包含する第４級窒素
複素環化合物のカチオンを用いることができる。

【００４３】Ｇの定義における有機酸残基とは、特に、
アルカンカルボン酸、アミノ酸およびオリゴペプチドの
残基であることを認識すべきであり、これらは、そのカ
ルボキシル末端で、エステルとして式（Ｉ）のアミノフ
ェノール基本構造に結合している。

【００４４】Ｇの定義におけるアルカンカルボン酸残基
とは、２０個までの炭素原子を含有する化合物である。 酢酸、プロピオン酸、酪酸、パルミチン酸およびステア
リン酸が特に好ましい。飽和酸残基の他に、さらに、Ｇ
は不飽和酸残基、例えば、オレイン酸、リノール酸また
はリノレン酸とすることができる。

【００４５】アミノ酸残基は、好ましくは、そのＬ−ま
たはＤ−形の、またはそのラセミ形の天然α−アミノ酸
である。グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソ
ロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンの残基が特
に好ましく、その場合、Ｌ−形がとりわけ特に好ましい
。

【００４６】オリゴペプチド残基は、例えば、ジ−、ト
リ−、テトラ−またはペンタペプチドであり、好ましく
は、ジ−またはトリペプチドであることを認識すべきで
あり、ここでアミノ酸成分は、好ましくは、前記アミノ
酸である。

【００４７】アミノフェノール基にエステル形にて結合
しているアミノ酸およびオリゴペプチド残基のアミノ基
は、遊離または保護形とすることができる。保護基とし
て、全ての通常のアミノ保護基、特に、アシル、オキシ
カルボニル、チオカルボニル、スルホ、スルフィノ、ビ
ニル、シクロヘキセニル、ホスホリルおよびカルバモイ
ル基であることを認識すべきである。特に好ましいアミ
ノ保護基は、トシル、ベンジルオキシカルボニルおよび
ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を包含する。

【００４８】Ｇの定義におけるグリコシド基は、単−ま
たはオリゴ糖類とすることができる。該糖残基は、α−
またはβ−グリコシド的にアミノフェノール基本構造に
結合することができる。好ましい単糖類の例は、ガラク
トース、グルコースおよびマンノースを包含する。Ｎ−
アセチルグルコサミンが特に好ましい。とりわけ特に好
ましくは、β−グリコシド的に結合したＮ−アセチル−
２−Ｄ−グルコサミンである。

【００４９】しかしながら、オリゴ糖類もまた、糖残基
として適当であることが証明された。オリゴ糖として、
特に、２〜１０個の、好ましくは２〜７個の単糖単位で
構成されているものを称する。ヘプタオース（ｈｅｐｔ
ａｏｓｅ）が特に好ましい。

【００５０】式（Ｉ）の化合物では、Ｇの定義における
有機および無機酸残基およびグリコシド残基の群のうち
グリコシド残基が好ましい。Ｎ−アセチルグルコサミン
残基が特に有利である。

【００５１】特に指示しない限り、本明細書中の式中、
以下の意義を有する基を用いた：単独、およびアルキル
スルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルカルボニ
ル、アルキルチオ、アルキルカルバモイル、アルキルア
ミノおよびアラルキル基中の「アルキル」は、６個まで
の、好ましくは４個までの炭素原子を含有する直鎖また
は分岐鎖状アルキル基を意味し、その例として、メチル
、エチル、プロピル、イソブチルおよびｔｅｒｔ−ブチ
ル基が挙げられる。

【００５２】アミノ基が２個のアルキル基により置換さ
れている場合、これらの基は結合して環を形成してもよ
く、それは、全体として、窒素原子を有する環を意味す
る。好ましくは、これらアミノ基は、全体で５または６
員環を意味し、次に、所望により酸素、硫黄またはさら
に窒素原子を有していてもよい。モルホリノ基が特に好
ましい。

【００５３】ヒドロキシアルキル基は、ヒドロキシル基
によって置換された６個まで、好ましくは４個までの炭
素原子を有するアルキル基である。該ヒドロキシアルキ
ル基は、第１級、第２級または第３級アルコールの残基
とすることができる。２−および１−ヒドロキシエチル
およびヒドロキシメチル基が特に好ましい。

【００５４】単独、およびアルコキシ−およびアラルコ
キシ炭素基中の「アルコキシ」は、６個まで、好ましく
は４個までの炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルコ
キシ基を意味する。その例として、メトキシ、エトキシ
、プロポキシ、イソブトキシおよびｔｅｒｔ−ブトキシ
基が挙げられる。

【００５５】単独、およびアリールカルボニルおよびア
リールカルバモイル基中の「アリール」は、炭素芳香族
またはヘテロ芳香族基を意味し、好ましくは、６〜１０
個の環原子を有する芳香族基で、とりわけ、フェノール
またはナフチル基であり、それらは、さらにアルキル、
アルコキシおよび／またはハロゲンにより置換されてい
てもよい。フェニル基が特に好ましい。

【００５６】単独、およびアラルキルカルバモイル基中
の「アラルキル」基は、前記のアルキル基がアリール基
により置換されている基を意味する。ベンジル基が好ま
しい。

【００５７】「アラルコキシ」基、例えば、アラルコキ
シカルボニル基は、前記のアルコキシ基がアリール基に
より置換されている基を意味し、ベンジルオキシ基が好
ましい。

【００５８】「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素また
はヨウ素原子を意味し、フッ素および塩素が好ましい。

【００５９】「アルケニル」は、２〜６個の、好ましく
は２〜４個の炭素原子を有する不飽和炭化水素基を意味
し、その例として、ビニルおよびアリル基が挙げられる
。

【００６０】アシル基は、アルキル、アラルキルまたは
アリール基を含有しうるカルボン酸残基を示し、アセチ
ル、フェニルアセチルおよびベンゾイル基が好ましい。

【００６１】アルキレンとは、３〜５個の、好ましくは
３または４個の炭素原子を有する、２価の、直鎖または
分岐鎖状飽和または不飽和炭化水素基であることを認識
すべきである。その例として、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−
、−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２−、−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−
ＣＨ＝ＣＨ−、−（ＣＨ２）４−および−ＣＨ＝ＣＨ−
ＣＨ＝ＣＨ−が挙げられる。ブタジエンジイル基（−Ｃ
Ｈ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−）およびテトラメチレン基（−
（ＣＨ２）４−）が好ましい。

【００６２】ジアルキルホスフィニル基とは、残基が−
Ｐ（＝Ｏ）（アルキル）２であり、ここでアルキルが前
記と同じであることを認識すべきである。ジメチルホス
フィニル残基が好ましい。

【００６３】ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２およびカルボキシル
残基の塩として、アルカリ金属、アルカリ土類金属また
はアンモニウム塩を用いることができる。アルカリ金属
塩とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム
およびセシウム塩をいうことを認識すべきであり、リチ
ウム、ナトリウムおよびカリウム塩、特にナトリウムお
よびカリウム塩が好ましい。アルカリ土類金属塩は、ベ
リリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム
およびバリウムの塩であり、マグネシウムおよびカルシ
ウム塩が、特にカルシウム塩が好ましい。アンモニウム
塩として、非置換アンモニウムイオンＮＨ４＋を用いる
ことができる。しかしながら、さらに、該アンモニウム
イオンが４つまでのアルキル、アリールまたはアラルキ
ル基により置換されているこれらアンモニウムの塩を用
いることも可能である。これらの基としては、前記の定
義が適用され、アルキル基は、好ましくは、メチル、エ
チルまたはｎ−プロピル基であり、アリール基は、好ま
しくは、フェニル基であり、アラルキル基は、好ましく
は、ベンジル基である。アンモニウムイオンとして、第
４級窒素複素環化合物のカチオンを用いることもでき、
その例としてピペリジニウムカチオンおよびピリジニウ
ムイオンが挙げられる。

【００６４】カルボキシアミド基はＣＯＮＨ２基である
が、アミノ基が、１または２個のアルキル基によって置
換されており、該アルキル基が、所望により１以上のヒ
ドロキシル、カルボキシルおよび／またはアルコキシカ
ルボニル基により置換されているアミノ基もまた含まれ
ることを認識すべきである。

【００６５】有利には、特に、Ｒ３が水素原子または１
以上のハロゲンにより置換されているアルキルカルボニ
ル基、例えば、トリフルオロアセチルである本発明の化
合物である。Ｒ３として水素がとりわけ特に好ましい。

【００６６】Ｌが式（ＩＩＩ）のピラゾロ複素環基であ
る本発明の化合物が好ましい。これらのうち、式（ＩＩ
Ｉ）において、特に、Ｚが、不飽和鎖の少なくとも１つ
の二重結合が、二重結合とまたは窒素原子と結合（ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｉｏｎ）する位置にあるような化合物であ
る。

【００６７】さらには、Ｌが式（ＩＩＩ）のピラゾロ複
素環基である本発明の化合物は、不飽和鎖Ｚにおいて、
Ｚが二重結合を介して結合していない窒素原子を有する
場合、これら窒素原子上にてアルキルまたはアラルキル
基によってのみ置換されているものが特に好ましい。

【００６８】式（ＩＩＩ）の基として互変異性体形もま
た可能である。これらはまた、式（ＩＩＩ）に含まれる
と考えられる。

【００６９】本発明によれば、Ｌが次式（ＸＩＩＩ）〜
（ＸＸＩＶ）：

【化４１】 で示される１つの基およびその対応する互変異性体形で
ある式（Ｉ）の化合物が好ましい。前記の式において、
Ｘ−ＹおよびＲ１０は前記と同意義である。Ｒ１１、Ｒ
１２、Ｒ１３およびＲ１４は、同一または異なっていて
もよく、水素、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、
アルキルチオ、アラルキル、アリール、カルボキシル、
アルコキシカルボニル、カルボキシアミド、シアノ、所
望により１または２個のアルキル基により置換されてい
てもよいアミノであり、該アルキル基は、所望により１
以上のヒドロキシル、カルボキシルおよび／またはアル
コキシカルボニル基により置換されていてもよく、また
はハロゲンであり、２つの隣接する基は、所望により、
アリールにより置換されているかまたは縮合しているア
ルキレン基を形成してもよい。該基の定義は前記の定義
に対応する。

【００７０】本発明によれば、式（Ｉ）の化合物は、特
に、Ｌが式（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（Ｘ
ＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ）および（ＸＸ）の群からなる
基およびその対応する互変異性体形であることが好まし
い。とりわけ、好ましくは、Ｘ−ＹがＮ＝ＣＲ９である
、ここでＲ９は式（ＩＩＩ）と同意義とすることができ
るが、好ましくは水素原子またはアルコキシ基である化
合物である。

【００７１】特に、本発明の意義において、４−ヒドロ
キシフェニル−２−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリ
ジン−３−イルアミンのβ−グルコシド的に結合したＮ
−アセチル−２−Ｄ−グルコサミニドが好ましい。

【００７２】式（Ｉ）の化合物は新規化合物である。該
化合物は、式（Ｖ）：

【化４２】 ［式中、Ｒ１〜Ｒ３およびＬは式（Ｉ）の記載と同じ、
Ａは水素原子、所望により置換されていてもよいアンモ
ニウムイオンまたはアルカリ金属を意味する］で示され
るロイコメチン（ｌｅｕｋｏ　　ｍｅｔｈｉｎｅ）色物
質を、式（ＩＶ）： Ｇ−Ｄ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　（ＩＶ）［式中、Ｇは式（Ｉ）と同意義を有する有
機または無機酸の残基またはグリコシド残基であり、該
グリコシド残基において存在する官能基、例えば、アミ
ノおよび／またはヒドロキシル基は、所望により、ペプ
チドおよび炭水化物化学の分野における従来の保護基に
より置換されていてもよく；Ｄは反応基を意味する］で
示される化合物と反応させ、その後、所望により、保護
基を分離することにより製造することができる。

【００７３】非置換アンモニウムイオンとは、ＮＨ４＋
であることを認識すべきである。該イオンは、所望によ
り、１以上のアルキルまたはアラルキル基により置換さ
れていてもよく、式（Ｖ）のＡと同意義である。置換ア
ンモニウムイオンの置換基は同一または異なっていても
よい。アンモニウムイオンとして、さらに第４級窒素−
複素環式化合物を用いることができ、例えば、ピペリジ
ニウムカチオンおよびピリジニウムイオンが挙げられる
。

【００７４】式（Ｖ）のＡの意義におけるアルカリ金属
として、リチウム、ナトリウムおよびカリウムを用いる
ことができる；ナトリウムが好ましい。

【００７５】Ｄは式（Ｖ）のフェノールまたはフェノラ
ート基ＯＡと反応しうる反応基を意味する。該反応基の
選択は、Ｇ基の特性に依存している。Ｇが糖残基である
場合、その場合、Ｄは容易に置換される基、例えば、ア
セチル基またはハロゲン基であり、それはフッ素、塩素
、臭素およびヨウ素から選択することができ、塩素、臭
素およびヨウ素が好ましい。

【００７６】炭水化物化学の分野における通常の保護基
として、特に、アセチル、ベンゾイル、ベンジルおよび
トリメチルシリル基が挙げられる。

【００７７】Ｇがアミノ酸残基またはペプチド残基で、
それを、そのカルボニル末端で式（Ｖ）のアミノフェノ
ールによりエステル化する場合、その場合、反応基Ｄと
しては、ペプチド化学における通常のあらゆる基を用い
ることができる。反応性誘導体として、酸ハロゲン化物
、好ましくは酸塩化物、またはペプチド合成において通
常用いられる混成酸無水物または活性エステルを用いる
ことができる。さらには、同一の反応基を、アルカンカ
ルボン酸のアミノフェノール構造への結合に用いること
ができる。

【００７８】Ｇが無機酸残基である場合、式（Ｖ）の化
合物を、対応する酸ハロゲン化物、特に酸塩化物と反応
させることが好ましい。

【００７９】あらゆる場合において、エステル化に関し
ては、式（Ｖ）のＲ３が水素原子である場合、エステル
化反応を実施する前に、このアミノ基を保護基、例えば
、ペプチド化学においてこの目的に通常用いられる基で
置換し、その後、該保護基を再度除去するように計画す
べきである。

【００８０】例示を介して、式（Ｉ）の化合物の製造方
法を、ＧがＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド基で
ある特に好ましい化合物を用いて説明する。該方法は、
また、式（Ｉ）の他のグリコシド誘導体の製造に相応じ
て用いることができる。

【００８１】本発明によれば、式（Ｉ）のＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニジル誘導体は、式（ＶＩ）：

【
化４３】 ［式中、Ｗはハロゲン原子、Ｒは炭水化物化学の分野に
おいて通常のヒドロキシ保護基、Ｂはアジド基、保護ア
ミノ基またはＮＨ−ＣＯＣＨ３、またはＢおよびＷは一
緒になって、式：

【化４４】 で示される基を意味する］で示される化合物を、式（Ｖ
）：

【化４５】 ［式中、Ｒ１〜Ｒ３およびＬは式（Ｉ）と同意義、Ａは
水素原子、所望により置換されていてもよいアンモニウ
ムイオンまたはアルカリ金属を意味する］で示される化
合物と反応させ、Ｂが保護アミノ基である場合、該アミ
ノ保護基を除去するか、またはＢがアジド基である場合
、これを還元することによりアミノ基に変え、該アミノ
基をアセチル化することによりＮＨＣＯＣＨ３に変え、
最終的にヒドロキシ保護基を分離することにより製造す
ることができる。

【００８２】例えば、式（Ｖ）：

【化４６】 ［式中、Ｒ１〜Ｒ３およびＬは式（Ｉ）と同意義である
］で示されるロイコメチン色物質を、式（ＶＩ）：

【化
４７】 ［式中、Ｗはハロゲン原子、ＢはＮＨＣＯＣＨ３および
Ｒは炭水化物化学の分野において通常用いられる保護基
を意味する］で示されるペル−Ｏ−置換１−ハロ−Ｎ−
アセチルグルコサミンと、糖残基のＣ−１原子上におけ
るワルデン反転により反応させ、ペル−Ｏ−置換β−グ
ルコシドを得、その後、該ヒドロキシ保護基を公知方法
に従って分離する。

【００８３】前記の式（Ｖ）と式（ＶＩ）の化合物を反
応させ、式（Ｉ）のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニドを得るには、水性アセトン中または水／ベンゼンま
たは水／クロロホルム混合物のような相間移動条件下、
酸受容体、例えば、水酸化、炭酸または重炭酸アルカリ
金属の存在下にて実施することが好ましい（シンセシス
（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），２２３／１９８８参照）。

【００８４】さらにまた、式（Ｉ）のＮ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミニドは、まず第一に、Ａが水素原子で
ある式（Ｖ）のロイコ色物質を、アルカリ金属水酸化物
またはアルコレートで対応するアルカリ金属塩に、また
は所望により置換されていてもよいアミンでアンモニウ
ム塩に変え、該アルカリ金属およびアンモニウムイオン
は前記と同じとすることができる、その後、該化合物を
、二極性非プロトン性溶媒、例えば、アセトン、ジメチ
ルスルホキシド、ジクロロメタンまたはジメチルホルム
アミド中、ペル−Ｏ−置換１−ハロ−Ｎ−アセチルグル
コサミンと反応させることにより製造することができる
。

【００８５】加えて、式（Ｖ）のロイコ色物質と１−ハ
ロ−Ｎ−アセチルグルコサミンから式（Ｉ）のＮ−アセ
チル−グルコサミニドを合成する場合、塩化メチレン、
クロロホルム、ベンゼンまたはジオキサンのような溶媒
中、銀塩または銀塩の混合物（酸化銀、セライトＲ（Ｃ
ｅｌｉｔｅＲ）上の炭酸銀、トリフルオロメタンスルホ
ン酸銀（ｔｒｉｆｌａｔｅ）、サリチル酸銀）および／
または水銀塩または水銀塩の混合物（臭化水銀、シアン
化水銀、酢酸水銀、酸化水銀）を加え、所望により乾燥
剤、例えば、塩化カルシウムまたはドリエリットＲ（Ｄ
ｒｉｅｒｉｔＲ）を用いることが有用である。

【００８６】さらにまた、式（Ｉ）のＮ−アセチル−グ
ルコサミニドの合成に、式（ＶＩ）のオキサゾリン（式
中、ＢおよびＷは一緒になって、式：

【化４８】 で示される基を意味する）を、有機酸、例えば、ｐ−ト
ルエンスルホン酸またはルイス酸、例えば、三フッ化ホ
ウ素エーテル錯化合物または塩化第二鉄の存在下にて用
いることができる。かかるグリコシド化反応の例は、例
えば、カルボヒドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄ
ｒａｔｅ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１３６、３０９〜３
２３／１９８５および６４，３３４〜３３８／１９７８
にて記載されている。

【００８７】最後に、式（Ｉ）のＮ−アセチルグルコサ
ミニドの製造は、式（ＶＩ）の化合物において、Ｂが保
護基、例えば、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキ
シカルボニル、ジクロロアセトアミドまたはフタルイミ
ド基、またはグリコシド化条件下にて安定しており、そ
れからアミノ基を分離することができる置換基、例えば
、アジド基で置換されているアミノ基である化合物にて
実施することができる。該グリコシド化反応は、ペプチ
ド化学の方法に従って保護基を分離するか、またはアジ
ド基を還元してアミノ基を遊離させ、ついでそれを最終
工程にて選択的にＮ−アセチル化することにより実施さ
れる（例えば、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミ
ストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．），３２，３７６７
／１９６７参照）。

【００８８】保護基の分離は、炭水化物化学の分野にて
公知の方法で、ベンジル型の保護基の場合は水素化分解
によって、アシル基、例えばアセチル基を分離するため
、メタノール中でナトリウムメチラート、シアン化ナト
リウムまたは重炭酸ナトリウムの作用によって行われる
。保護基を分離する方法は、Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄ
ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３９、１３／１９８
１に記載されている。

【００８９】１−ハロ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合
成は、例えば、オーガニック・シンセシス（Ｏｒｇ．Ｓ
ｙｎｔｈ．）、４６巻、１；メソッズ・イン・カルボヒ
ドレート・ケミストリー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　　Ｃｈｅｍ．）、６、２８
２／１９７２およびジャーナル・オブ・オーガニック・
ケミストリー、２６、４４５／１９６１に記載されてい
る。

【００９０】式（Ｉ）および式（Ｖ’）：

【化４９】 ［式中、Ｒ１〜Ｒ３およびＬは式（Ｉ）の記載と同じ、
該Ｌは、好ましくは、式（ＩＩＩ）：

【化５０】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは対応する式（Ｉ）の記載と同
じ）で示されるピラゾロ−複素環基を意味する］で示さ
れる化合物の製造に必要なロイコ色物質は、英国特許明
細書第Ａ−２０６１５３７の、Ｒ３が、所望により１以
上のハロゲンにより置換されていてもよいアリールカル
ボニル基またはアルキルカルボニル基で、Ｚが１，２，
４−トリアゾール環であり、そのうちの二重結合を介し
て結合していない窒素原子が水素で置換されている化合
物を除いて、新規化合物である。

【００９１】該化合物は、式（ＶＩＩ）：

【化５１】 ［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＬは式（Ｖ’）の化合物の記
載と同じ］で示される対応する着色化合物を、公知方法
に従って、還元剤、例えば接触水素添加、水素化ホウ素
ナトリウム、パラジウム／ヒドラジンまたは亜ジチオン
酸ナトリウムを用いて還元することによって製造するこ
とができる。かかる還元剤は、ホイベン・ウェイル（Ｈ
ｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ）、Ｖｏｌ．４／１ｃおよび４／
１ｄに記載されている。

【００９２】アシル基Ｒ３は、式（Ｉ）で示される化合
物におけるように、Ｒ３が水素原子である式（Ｖ’）で
示されるロイコ色物質の段階で、またはＧがグリコシド
残基である式（Ｉ）で示される化合物の製造の場合に生
じるような保護ペル−Ｏ−置換Ｎ−アセチル−グルコサ
ミニドの段階のいずれかにて導入することができる。こ
れらは、ペプチド化学の分野にて公知である、活性化酸
誘導体、例えば、ハロゲン化物、無水物、混成酸無水物
が使用される。

【００９３】式（Ｉ）の化合物から出発し、適当なヒド
ロラーゼと反応させることにより、式（Ｖ’）の化合物
を製造することもできる。

【００９４】式（Ｖ’）で示される化合物の製造に必要
な式（ＶＩＩ）で示される着色物質もまた新規化合物で
ある。該化合物は、好ましくは、式（ＶＩＩＩ）：ＮＨ
２−Ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｖ
ＩＩＩ）［式中、Ｌは、式（Ｉ）の記載と同じであり、
好ましくは、式（ＩＩＩ）で示されるピラゾロ複素環基
であり、該式（ＩＩＩ）におけるＸ−ＹおよびＺは式（
Ｉ）の記載と同じ］で示されるアミノ化合物を、式（Ｉ
Ｘ）：

【化５２】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）の記載と同じ、Ｖ
は水素またはハロゲン原子、カルボキシルまたはＳＯ３
Ｈ基を意味する］で示されるフェノールと酸化的カップ
リングすることによって得られる。

【００９５】このために、式（ＶＩＩＩ）で示されるア
ミノ化合物と、好ましくはＶが水素原子である式（ＩＸ
）で示されるフェノールとを、酸化剤、例えば、フェリ
シアン化カリウム、カリウムペルオキソジサルフェート
、カリウムペルオキソモノサルフェート、ヨウ素、過酸
化水素／ペルオキシダーゼ、二酸化鉛、ＮａＯＣｌ、Ｎ
ａＯＢｒ、有機酸化剤、例えばＮ−ブロモスクシンイミ
ドまたは関連化合物の存在下で反応させる。

【００９６】さらにまた、式（ＶＩＩ）で示される着色
物質は、式（ＸＩ）：

【化５３】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は式（Ｉ）の記載と同じ、Ｈａ
ｌはハロゲン原子であり、該ハロゲンは、フッ素、塩素
、臭素またはヨウ素であり、好ましくは、塩素を意味す
る］で示されるＮ−ハロイミンを、式（Ｘ）：Ｌ−Ｈ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｘ
）［式中、Ｌは式（Ｉ）の記載と同じであり、好ましく
は、Ｘ−ＹおよびＺが式（Ｉ）の記載と同じである式（
ＩＩＩ）で示されるピラゾロ複素環基を意味する］で示
される化合物と反応させることによって製造することが
できる。

【００９７】該反応条件は、ホウベン−ウェイル（Ｈｏ
ｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ）、Ｖｏｌ．７／３、２９６頁以下
の開示に従って選択することができる。

【００９８】式（Ｉ）の化合物から出発し、適当なヒド
ロラーゼと反応させ、ついで酸化することにより式（Ｖ
ＩＩ）の着色物質を得ることかできる。該酸化には、原
則として、式（ＶＩＩＩ）の化合物と式（ＩＸ）の化合
物と間の酸化的カップリングについて記載されている物
質と同じものを用いることができる。

【００９９】さらに、式（ＶＩＩ）の着色物質は、有利
には、式（ＸＸＶ）： Ｌ−Ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｘ
ＸＶ）［式中、Ｅはニトロソまたはニトロ基、およびＬ
はＸ−ＹおよびＺが式（Ｉ）の記載と同じである式（Ｉ
ＩＩ）で示されるピラゾロ複素環基を意味する］で示さ
れる化合物を、式（ＸＸＶＩ）：

【化５４】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は式（ＶＩＩ）の記載と同じ、
Ｍｅはハロゲンにより置換されているリチウムまたはマ
グネシウムおよびＱはヒドロキシル基またはジアルキル
アミノ基を意味する］で示されるオルガノ金属化合物と
反応させ、つづいて該反応混合物を水性処理することに
より製造することができる。式（ＸＸＶ）および（ＸＸ
ＶＩ）の化合物において存在する基は、グリニャールま
たはリチウム化合物と反応しないように、適宜保護され
なければならない。かかる保護基に関する資料は、例え
ば、ティー・グリーン（Ｔ．Ｇｒｅｅｎｅ）の「有機合
成における保護基」、ジョン・ウィリー＆サンズ社（Ｊ
ｏｈｎ　　Ｗｉｌｅｙ　　ａｎｄ　　Ｓｏｎｓ），ニュ
ーヨーク，１９８１；ジェイ・エフ・ダブリュー・マッ
クオミー（Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ）の「有機化学に
おける保護基」、プレナム・プレス社（Ｐｌｅｎｕｍ　
　Ｐｒｅｓｓ），ロンドン，１９７３に示されている。 式（ＸＸＶ）の化合物が、（ニトロまたはニトロソを除
いて）オルガノ金属化合物と反応しうる、例えば、エス
テル基のようないずれの官能基も有していない場合、そ
の際の反応が、式（ＶＩＩ）の化合物の製造には好まし
い。不安定な基を保護することも可能であり、オルガノ
金属化合物との反応後、該保護基を除去することができ
る。

【０１００】ＱがＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ基、とりわ
けジメチルアミノ基である場合、その場合、中間体とし
て形成される、式（ＸＸＶＩ’）：

【化５５】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は式（ＸＸＶＩ）の記載と同じ
であり、Ｌは式（ＸＸＶ）にてさらに詳細に記載されて
いる基、およびＱはジアルキルアミノ基を意味する］で
示される着色物質を単離し、アルカリ性加水分解により
、例えば、水／エタノール中、炭酸ナトリウムを用いて
、式（ＶＩＩ）の所望の着色物質に変形することができ
る。

【０１０１】ニトロソまたはニトロ化合物とオルガノ−
リチウムまたはグリニャール化合物との反応は、ホイベ
ン・ウェイルのメトデン・デェア・オルガニッシェン・
ヘミィー（Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　　ｄｅｒ　　ｏｒｇａｎ
ｉｓｃｈｅｎ　　ｃｈｅｍｉｅ），１０／１巻，１０８
７，１１２６；ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエ
ティー（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），Ｃ，２１１９／１
９７１に記載されており、用いる量に依存してヒドロキ
シルアミン誘導体に、または第２級アミンに、さらに生
成物に至る。意外にも、等モル量を用い、その後、該反
応混合物を水処理した場合に、式（ＸＸＶ）と（ＸＸＶ
Ｉ）の化合物は高収率で反応し、式（ＶＩＩ）の着色物
質が得られることが判明した。

【０１０２】式（ＶＩＩＩ）で示されるアミノ化合物の
場合には、以下の製造方法である。Ｌが式（Ｉ）におい
て定義したような式（ＩＩ）で示される基である場合、
これらアミノ化合物は、公知のものであるか、または、
公知の化合物と同様に製造することができる。通常、置
換Ｎ，Ｎ−アニリンを出発物質として用い、これをニト
ロソ化する。該ニトロソ基の還元によって、式：Ｌ−Ｎ
Ｈ２で示されるｐ−フェニレンジアミン誘導体を得る（
Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．、７３、３１００／１９５１参照）。

【０１０３】Ｌが式（ＩＩＩ）で示されるピラゾロ複素
環基である、式（ＶＩＩＩ）で示される化合物は、Ｌが
式（ＩＩＩ）で示されるピラゾロ複素環基である、式（
Ｘ）で示される化合物を、公知方法により、対応するア
ミノ化合物に変えることによって公知の方法と同様に製
造することができる。これは、 ａ）硝酸または硫酸および／または無水酢酸と混合した
硝酸との反応によって対応するニトロ化合物を得るか、
または ｂ）亜硝酸との反応によって対応するニトロソ化合物を
得るか、または ｃ）芳香族ジアゾニウム塩との反応によって対応するア
リールアゾ化合物を得、次いで、還元することにより達
成できる。

【０１０４】ニトロ、ニトロソおよびアリールアゾ基（
すなわち、式：アリール−Ｎ＝Ｎ−、式中、アリールは
、アリール基およびかかる基を含有する他の基について
前記した意義と同じである）は、例えば塩酸または酢酸
のような酸中の亜鉛、亜ジチオン酸ナトリウム、例えば
塩酸のような酸中のスズ、塩化第二スズのような試薬に
よる還元によって、または例えばパラジウム−炭素によ
るような接触水素添加によってアミノ基に変えることが
できる。かかる反応は、ホウベン−ウェイルのメトデン
・デェア・オルガニッシェン・ヘミィー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｅｎ　ｄｅｒ　ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎＣｈｅｍｉｅ）
、Ｖｏｌ．１１／１、３４１頁以下に記載されている。

【０１０５】式（Ｘ）で示される化合物から出発するニ
トロ、ニトロソまたはアリールアゾ基の導入は、硝酸ま
たは濃硫酸もしくは無水酢酸と混合した硝酸によるニト
ロ化によって行われる。

【０１０６】亜硝酸によるニトロソ化によって、あるい
は芳香族ジアゾニウム塩とのアゾカップリングによって
、ニトロソ基またはアリールアゾ基を導入することがで
きる。かかる反応の例が、ホウベン−ウェイルのメトデ
ン・デェア・オルガニッシェン・ヘミィー、Ｖｏｌ．１
０／１および１０／３に記載されている。

【０１０７】式（Ｘ）で示される複素環式化合物は、Ｈ
が水素原子ではなくカルボキシル、アルコキシカルボニ
ルまたはアルキルカルボニル基である場合、これらは、
濃塩酸による加水分解によって、カルボン酸の場合、熱
脱炭酸によって、式（Ｘ）で示される化合物に変換する
ことができる。ついで、該化合物に、ニトロ、ニトロソ
またはアリールアゾ基が導入される。

【０１０８】二重結合で結合しておらず、かつ式（ＩＩ
Ｉ）におけるＸ−ＸまたはＺ中に存在する窒素原子は、
所望により、アルキル化またはアラルキル化されていて
もよい。Ｎ−アルキル化またはＮ−アラルキル化は、ジ
メチルホルムアミドまたは水性アルコール系のような溶
媒中、水素化ナトリウム、第３級アミン、炭酸アルカリ
金属または水酸化ナトリウムのような塩基の存在下、式
（Ｘ）で示される適当な化合物、好ましくは、Ｈが水素
原子ではなくニトロ、ニトロソ、アルコキシカルボニル
、アシルまたはアリールアゾ基である複素環化合物を、
例えば、ハロゲン化アルキルまたはアラルキル、硫酸ジ
アルキルまたはジアラルキル、またはアリールスルホン
酸アルキルエステルまたはアラルキルエステルのような
アルキル化剤またはアラルキル化剤と反応させることに
よって行うことができる。

【０１０９】式（Ｘ）の所望の出発物質、またはＨの代
わりにアルコキシカルボニルまたはアシルであり、Ｌが
式（ＩＩＩ）で示されるピラゾロ複素環基である式（Ｘ
）で示される対応するこれらの化合物は、既に記載され
ているかまたはこれらの公知化合物と同様に合成するこ
とができる。複素環系の製造に関する資料は、以下の文
献から得られる：ジー・ピー・エリス（Ｇ．Ｐ．Ｅｌｌ
ｉｓ）、「複素環式化合物の化学」における「縮合複素
環の合成」、イー・シー・テイラー（Ｅ．Ｃ．Ｔａｙｌ
ｏｒ）編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ；ピー・
エヌ・プレストン（Ｐ．Ｎ．Ｐｒｅｓｔｏｎ）、「複素
環式化合物の化学」における「縮合イミダゾール」、エ
イ・ウェイスバーガー（Ａ．Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇｅｒ）
およびイー・シー・テイラー編、ジョン・ウィリー・ア
ンド・サンズ；Ａｄｖ．ｏｆ　　Ｈｅｔ．Ｃｈｅｍ．、
３６、３４３／１９８４；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕ
ｌｌ．、２２、４８２／１９７４；Ｊ．Ｈｅｔ．Ｃｈｅ
ｍ．、１２、４８１／１９７５；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ
．Ｂｕｌｌ．、２２、１８１４／１９７４；Ａｎｎ．６
６０、１０４／１９６２；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕ
ｌｌ．２３、４５２／１９７５；Ｊ．Ｈｅｔ．Ｃｈｅｍ
．、１０、４１１／１９７３；Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
、Ｐｅｒｋｉｎ　　Ｉ、２０４７／１９７７。

【０１１０】式（Ｉ）の化合物は、ヒドロラーゼ基質と
して極めて有用である。この使用に特に好ましい化合物
は、前記の式（Ｉ）の化合物である。とりわけ、特に好
ましい化合物は、酵素Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニダーゼ（ＮＡＧａｓｅ）に対する基質として用いる
、ＧがＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニジル基であ
る式（Ｉ）の化合物である。

【０１１１】本発明によりヒドロラーゼの比色定量測定
用方法を実施する場合、酵素基質として、式（Ｉ）の化
合物を、測定すべき酵素と反応させ、該基質から開裂し
て得られたロイコ色物質を酸化し、そうして得られた着
色物質を視覚によりまたは光学的に測定する。

【０１１２】ヒドロラーゼの作用により第１に得られる
式（Ｖ）のロイコ色物質の酸化には、測定すべき酵素の
活性に影響を与えず、かつ得られたロイコ色物質を酸化
するに十分強力ないずれの酸化剤も用いることができる
。概して、酸化剤として、フェリシアン化カリウム、ペ
ルボレート、ビリルビンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ／過酸化水素または好ましくはヨウ素酸塩を用いる。

【０１１３】酸化剤の存在下、基質の酵素による反応が
好ましい。しかしながら、ヒドロラーゼ反応を行い、別
に酸化を実施することも可能である。しかしながら、後
者の操作によれば、反応速度の測定は不可能であり、最
終点しか測定できない。

【０１１４】該測定方法を実施する場合、酵素に調整し
た緩衝系を用いなければならないのは当然である。いず
れの緩衝剤が最も安定しているかは公知である。例えば
、ヒドロラーゼとしてのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニダーゼに対する本発明の測定方法は、３．５〜７
．０、好ましくは４．０〜６．５のｐＨ値にて実施する
。

【０１１５】本発明のヒドロラーゼ測定用診断薬は、本
発明の１種以上の式（Ｉ）の基質、適当な緩衝系の他に
も、かかる試薬に関して通常の適当な添加剤、例えば、
アジュバント酵素、安定化剤等を含有する。酵素基質の
開裂後、着色物質の形成に必要な酸化剤は、該測定方法
に必要な他の物質と一緒に存在させても、または別々と
することもできる。本発明の試薬は、溶液形にて、冷凍
乾燥形として、粉末混合物として、試薬錠剤としてまた
は適当な担体物質上に存在してもよく、それにより該試
薬成分は、一緒になって、別々に、または適合性および
相互に組み合わさった促進性に依存して診断薬を付与す
ることができる。

【０１１６】溶液形の本発明の診断薬は、該試験に必要
な試薬をすべて含有していることが好ましい。溶媒とし
て、水または水と水可溶性有機溶媒、例えば、メタノー
ル、エタノール、アセトンまたはジメチルホルムアミド
の混合物を用いることができる。貯蔵安定性のため、実
際に試験する際に、該試験に必要な試薬を初めて混合す
る２以上の溶液に分けておくことが好都合である。

【０１１７】総重量約５〜２０ｍｇ、好ましくは、約１
０ｍｇの冷凍乾燥形の診断薬を製造する場合、該試験に
必要なすべての試薬、ならびに通常の構造形成剤、例え
ば、ポリビニルピロリドン、さらには充填物質、例えば
、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールを含
有する溶液を乾燥させる。しかしながら、酸化剤は、他
の成分と分離した診断薬にて存在することができる。 これは、別の冷凍乾燥により、または溶けていない酸化
剤の混合により達成される。

【０１１８】粉末混合または試薬錠剤形の試薬は、試験
成分を従来の生薬添加剤と混合し、造粒することにより
製造することができる。この種の添加剤は、例えば、マ
ンニトール、ソルビトールまたはキシリトールのような
糖アルコール、ポリエチレングリコールまたはポリビニ
ルピロリドンのような他の可溶性挿入化合物を包含する
。一般に、粉末混合物または試薬錠剤は、その最終重量
が約３０〜２００ｍｇで、好ましくは５０〜８０ｍｇで
ある。

【０１１９】冷凍乾燥体、粉末混合物または錠剤のよう
な固形試薬混合物は、使用前に、水または他の適当な溶
媒に溶かし、このようにして試薬溶液が得られる。試料
を十分な量の試薬混合物と混合した後、得られた色を光
度計を用いて測定し、個々の酵素濃度を、モル吸光係数
および試薬または試料の添加量を介して算定する。反応
速度だけでなく、終点測定も可能である。

【０１２０】試験ストリップ形の試薬を製造する場合、
吸着担体、好ましくは濾紙、セルロースまたは合成繊維
フリースを、即座に揮発する溶媒、例えば、水、メタノ
ール、エタノールまたはアセトン中、試験ストリップの
製造に通常用いられる必須の試薬を含有する溶液に含浸
させる。これは、１回の含浸工程で行うことができる。 しかしながら、ある場合においては、試薬の一部の成分
を含有する溶液を用いるため、複数工程にて含浸を実施
することが望ましい。例えば、第１工程において、酸化
剤、緩衝剤および所望により他の水溶性添加剤を含有す
る水溶液で含浸を実施し、ついで第２工程において、ヒ
ドロラーゼ基質を含有する溶液で含浸を行う。該完了試
験ストリップをそれ自体で用いてもよく、または公知方
法にてハンドルに取り付けても、または好ましくは、ド
イツ連邦共和国特許明細書第２１１８４５５号の記載に
従って合成物質と細かいメッシュの間にシールすること
ができる。

【０１２１】本発明の好ましい診断薬として、添付図面
第５図に示す試験担体が得られる。該試験担体は、吸着
担体物質、例えば、緩衝剤およびヒドロラーゼ基質を含
有する濾紙（１）、該吸着担体（１）と平面的に接触す
る、酸化剤含有のメッシュ（２）、例えば、ポリマー物
質のメッシュ、およびプラスチックフィルム（４）のハ
ンドル上に（１）および（２）を固定するカバーメッシ
ュ（３）とからなる。該カバーメッシュ（３）はまたポ
リマー物質からなっていてもよい。該カバーメッシュ（
３）それ自体は、融解接着（５）の手段によりフィルム
（４）に固定される。

【０１２２】ヒドロラーゼ測定を行う場合、検査すべき
試料を第５図の試験担体のカバーメッシュ（３）に塗布
するか、またはこれを検査すべき液体試料中に浸す。該
試料は、迅速にカバーメッシュ（３）に浸透し、酸化剤
の溶解を伴い、メッシュ（２）を通って吸着物質（１）
に浸透し、酵素の存在下にて、そこにある酵素基質の酵
素的開裂が起こり、ロイコ色物質を形成する中間体の測
定しうる着色物質への酸化が起こる。

【０１２３】得られた色彩を対照色と関連付けることに
より半定量的測定が可能である。定量評価は、レミッシ
ョンにて光学的に実施することができる。

【０１２４】概して、式（Ｉ）の化合物は、本発明の診
断薬における使用に対して十分な貯蔵安定性を有してい
る。しかしながら、本発明のヒドロラーゼ基質の安定性
は、該化合物が、式（ＸＩＩ）： Ａｒ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯＮＨ２　　　　　　　　　　　
　　（ＸＩＩ）［式中、Ａｒは、所望によりアルキル、
アルコキシまたはハロゲンにより置換されていてもよい
アリール基を意味する］で示される化合物と一緒にある
場合にさらに増加することを確認した。

【０１２５】この式中、アルキル、アルコキシ、ハロゲ
ンおよびアリールは、式（Ｉ）の置換基に対する前記定
義と同意義を有する。特に有利な式（ＸＩＩ）の化合物
は、ｐ−メチル、ｏ−メトキシ、ｍ−メトキシ、ｐ−メ
トキシ、ｏ−クロロ−、ｍ−クロロ−、ｐ−クロロ−、
ｏ−メチル−、ｍ−メチル−および非置換フェニルセミ
カルバジド、ならびにナフチルセミカルバジドである。

【０１２６】式（ＸＩＩ）の化合物は、本発明のＮ−ア
セチルグルコサミニドの貯蔵安定性の増加に特に有利で
あることが証明された。

【０１２７】本発明の範囲において、式（Ｉ）の化合物
は多くの利点を示す。特に、本発明の基質が無色であり
、本発明の方法を実施した場合に、明らかに確認するこ
とのできる赤色または青色の着色物質を形成することが
有意な利点である。大きな波長シフト、すなわち、基質
と形成着色物質の最大吸収波長の差異が、非常に鋭敏な
測定を可能とした。得られた色彩が試料物質の色彩と明
らかにかなり異なるため、かかる測定は、特に生物学的
流体、例えば、血漿、血清および尿にて可能である。 本発明の基質の開裂後に形成される着色物質は、非常に
広範なｐＨ範囲にて形成される。特に、本発明によれば
、着色物質が中性および塩基性ｐＨ領域だけでなく、か
なり酸性範囲のｐＨ値、すなわち、ｐＨ３．５からの範
囲においても容易に形成されため、その結果、「酸性」
酵素、すなわち、酸性ｐＨ範囲にて最大活性を示す酵素
を測定する場合に、再度緩衝処理する必要がないことは
重要なことである。この事実により、本発明の式（Ｉ）
の化合物は、「酸性」酵素、例えば、ＮＡＧａｓｅに対
して特に適した基質となる。無色の基質を用い、酵素の
最適ｐＨにて、本発明のヒドロラーゼ測定を実施するこ
とにより、低酵素濃度においてでさえ、迅速な検出が可
能となる。最後に、本発明の基質は、溶液における湿式
化学測定に対してだけでなく、試験担体での乾式化学測
定に対しても好適である。評価は、視覚によるか、また
はトランスミッションまたはレミッションにて光学的に
行うことができる。

【０１２８】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明する。

【０１２９】実施例１ ４−（４’−ジメチルアミノフェニルアミノ）−フェニ
ル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グリコ
ピラノシド

【化５６】

【０１３０】１．１　　　　Ｎ，Ｎ−ジメチルインドア
ニリン（Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．、６１、３７６／１９３９）
６ｇを、水２５０ｍｌ中、水酸化ナトリウム７ｇの溶液
に加えた。 激しく撹拌しながら、青色が消えるまで、亜ジチオン酸
ナトリウムを少しづつ加えた。該溶液を濾過し、濾液を
約５℃に冷却し、沈殿物が完全に析出するまで、氷酢酸
を滴下して混合した。該沈殿物を濾去し、濃塩酸２５ｍ
ｌに溶かした。該溶液を炭素で処理し、濾過して蒸発さ
せた。残渣をエタノールから再結晶した。４−ジメチル
アミノ−４’−ヒドロキシジフェニルアミン３．１ｇ（
収率５１％）を得た。

【０１３１】１．２　　　　１．１において得られたロ
イコ色物質２．６ｇ、２−アセトアミド−３，４，６−
トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコシ
ルクロリド８．８３ｇおよび臭化ベンジルトリエチルア
ンモニウム４．２１ｇを、クロロホルム１２５ｍｌおよ
び水１２５ｍｌの混合物に加えた。該混合物を激しく撹
拌し、炭酸カリウム８．７ｇと混合し、６時間加熱還流
し、その３時間後、ハロゲナーゼ（ｈａｌｏｇｅｎａｓ
ｅ）４．４ｇおよび炭酸カリウム４．３ｇを加えた。該
クロロホルム相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し
、蒸発させた。

【０１３２】残渣を酢酸エチルを用いるシリカゲル上の
クロマトグラフィーに付した。生成物含有フラクション
を蒸発させた。次式：

【化５７】 で示される保護された糖誘導体５００ｍｇ（収率９％）
を得た。

【０１３３】１．３　　　　１．２において得られた保
護糖誘導体４６０ｍｇをメタノール１０ｍｌに溶かし、
炭酸水素ナトリウム０．９ｇと混合し、室温にて３時間
激しく撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を蒸発させ
、残渣を酢酸エチル／メタノール（８：２ｖ／ｖ）を用
いるシリカゲル上のクロマトグラフィーに付した。生成
物含有フラクションを合して蒸発させた。該残渣を少量
のメタノールに溶かし、該溶液をジエチルエーテルと混
合した。このようにして得られた沈殿物を吸引濾過し、
ジエチルエーテルで洗浄した。標記化合物０．３４ｇ（
収率９６％）を得た。融点２０７〜２０９℃（分解）。

【０１３４】実施例２ ４−（（Ｎ−アセチル−４’−ジメチルアミノフェニル
）−アミノ）−フェニル−２−アセトアミド−２−デオ
キシ−β−Ｄ−グルコピラノシド

【化５８】

【０１３５】実施例１．２において得られた保護グリコ
シド０．３ｇを無水酢酸５ｍｌと混合し、８０℃に加熱
し、この温度を２時間維持した。該反応混合物を蒸発さ
せ、残渣をジエチルエーテルを混合した。得られた沈殿
物を濾去し、実施例１．３と同様、保護基を分離するた
めに、メタノール中の炭酸水素ナトリウムで処理した。 該粗製生成物を、トルエン／酢酸エチル／メタノール（
１：１：１ｖ／ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル上のクロマ
トグラフィーに付した。標記化合物０．１ｇ（収率４７
％）を得た。融点１４２〜１４４℃。Ｒｆ（シリカゲル
、トルエン／酢酸エチル／メタノール　　１：１：１　
　ｖ／ｖ／ｖ）＝０．３７。

【０１３６】実施例３ ４−（（４’−ジメチルアミノフェニル−Ｎ−トリフル
オロアセチル）−アミノ）−フェニル−２−アセトアミ
ド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド

【化５９
】

【０１３７】無水酢酸の代わりに無水トリフルオロ酢酸
を用い、０℃の反応温度にて実施例２と同様にして、標
記化合物を得た。融点１９１〜１９８℃。Ｒｆ（シリカ
ゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　　２：１：
１　　ｖ／ｖ／ｖ）＝０．３５。

【０１３８】実施例４ 実施例１．２と１．３に従い、対応するロイコ色物質と
２−アセトアミド−３．４．６−トリ−Ｏ−アセチル−
２−デオキシ−α−Ｄ−グルコシルクロリドとから、表
１および表２に列挙する化合物を得た。

【０１３９】

【表１】

【０１４０】

【表２】

【０１４１】ロイコ色物質成分の製造 　　４．１　　　　４−ジメチルアミノ−２’−クロロ
−４’−ヒドロキシジフェニルアミン ０〜−５℃に冷却した、水２００ｍｌ中、ｍ−クロロフ
ェノール７．７ｍｌ、水酸化ナトリウム４ｇおよび酢酸
ナトリウム８ｇの溶液を、各々、水１００ｍｌ中のＮ，
Ｎ−ジメチルフェニレンジアミン塩酸塩１０．４５ｇの
溶液および４％次亜塩素酸ナトリウム溶液１２５ｍｌを
有する２つの滴下漏斗から同時に、４５〜６０分間にわ
たって充分に撹拌しながら混合した。その後、該反応混
合物を１５分間撹拌し、沈殿物を濾去し、水で数回洗浄
した。残渣を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液５０ｍｌ、水
３０ｍｌおよびメタノール２０ｍｌの混合物に溶かし、
約４０〜４５℃（浴温度）の温度にて、亜ジチオン酸ナ
トリウム約１０〜２０ｇ添加することによりロイコ色物
質に還元した。該反応混合物を、氷酢酸を添加すること
によりｐＨ６に調整し、得られた沈殿物を吸引濾過した
。精製には、該生成物を酢酸エチル／リグロイン（８：
２　　ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル上のクロマトグラフ
ィーに付した。標記化合物３．５ｇを得た。

【０１４２】４．２　　　　適当なフェニレンジアミン
を対応する置換フェノールと酸化的にカップリングさせ
ることにより、４．１と同様に、ロイコ色物質の４−ジ
メチルアミノ−２’，５’−ジクロロ−４’−ヒドロキ
シジフェニルアミン、４−モルホリノ−４’−ヒドロキ
シジフェニルアミン、４−ジメチルアミノ−３’−クロ
ロ−４’−ヒドロキシジフェニルアミン、４−モルホリ
ノ−２’−クロロ−４’−ヒドロキシジフェニルアミン
および４−モルホリノ−２’−フルオロ−４’−ヒドロ
キシジフェニルアミンを得た。

【０１４３】４．３　　　　４−ヒドロキシフェニル−
２−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イル
−アミン ４．３．１　　　　３−アセチル−２−メチルピラゾロ
［１，５−ａ］ピリジン７ｇを６Ｎ塩酸１４０ｍｌに溶
かし、０℃にて、亜硝酸ナトリウム５．５２ｇの水溶液
を滴下混合した。２時間後、冷却するのに用いた氷浴を
取り外し、反応混合物を室温にて一夜放置し、ついでｐ
Ｈ９に調整した。沈殿したニトロソ化合物（６．４ｇ）
を吸引濾過し、２Ｎ塩酸約１５０ｍｌに溶かした。該ニ
トロソ化合物を、実施例４．４．２と同様に、塩化第一
スズで還元した。該粗製生成物を酢酸エチルを用いるシ
リカゲル上のクロマトグラフィーに付した。生成物含有
のフラクションを蒸発させ、残渣をエタノールに溶かし
、エタノール性塩酸と混合した。数時間後に析出した沈
殿物を吸引濾過して乾燥させた。３−アミノ−２−メチ
ルピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン塩酸塩３．１ｇ（収
率４５％）を得た。融点＞２７５℃。Ｒｆ（シリカゲル
、酢酸エチル／アセトン／氷酢酸／水　　５０：２５：
１２．５：１２．５　　ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）＝０．６。

【０１４４】４．３．２　　　　フェノール２．８２ｇ
をピリジン７５ｍｌに溶かし、該溶液を水４５０ｍｌと
混合した。ついで、水１５０ｍｌ中、４．３．１からの
３−アミノ−２−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリジ
ン塩酸塩５．５ｇの溶液を加え、つづいて該反応混合物
を、撹拌しながら、水４５０ｍｌ中、フェリシアン化カ
リウム７８ｇの溶液と混合した。沈殿した青色物質を吸
引濾過し、水で洗浄して乾燥した。収量４．８５ｇ。Ｔ
ＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／塩化メチレン　　１：
１ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．５。

【０１４５】４．３．２．１　　着色物質のＮ−（２−
メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イル）−
キノニミンの別合成 乾燥テトラヒドロフラン６０ｍｌ中、４−ブロモジメチ
ルアニリン７．７ｇおよびマグネシウム削りくず１．４
ｇから、対応するグリニャール化合物を製造した（ジャ
ーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．）、４６５／１９６１参照）。該反応溶液
をシリンジで吸い上げ、テトラヒドロフラン６０ｍｌ中
、−１５℃に冷却した、３−ニトロソ−２−メチルピラ
ゾロ［１，５−ａ］ピリジン（実施例４．３．１に従っ
て製造）３．０５ｇの溶液に滴下した。加温後、該反応
混合物を２Ｎ酢酸１００ｍｌ中に注いだ。テトラヒドロ
フランをロータリーエバポレーターにて除去した。該反
応混合物を、該反応物がアルカリ性となるまでエタノー
ル１００ｍｌおよび過剰の炭酸ナトリウムと混合した。 得られたロイコ色物質の酸化には、合計４０ｇのフェリ
シアン化カリウムを加え、ついで反応混合物を室温にて
撹拌した。加水分解終了後、該反応混合物を酢酸エチル
で抽出した。有機相を蒸発させ、残渣を溶出剤酢酸エチ
ル／リグロイン（１：１　　ｖ／ｖ）を用いるシリカゲ
ル上のクロマトグラフィーに付した。着色物質４．４ｇ
（収率９８％、ニトロソ化合物）を得た。Ｒｆ（シリカ
ゲル、塩化メチレン／酢酸エチル（１：１　　ｖ／ｖ）
＋０．６。

【０１４６】４．３．３　　　　ロイコ色物質の還元に
は、着色物質を酢酸エチル２００ｍｌに溶かし、該溶液
を約１００ｍｌの飽和炭酸ナトリウム水溶液と混合した
。色が消えるまで、該溶液を亜ジチオン酸ナトリウムと
一緒に激しく振盪した。有機相を分離し、乾燥し、少量
に濃縮した。ついで、リグロインと混合し、得られた沈
殿物を濾過し、リグロインで洗浄し、つづいて乾燥した
。さらなる後処理に十分純粋な標記化合物４．４５ｇを
得た。 精製は、塩化メチレン／メタノール（９８：２ｖ／ｖ）
を用いるシリカゲル上のクロマトグラフィーによりする
ことができる。 Ｒｆ（シリカゲル、酢酸エチル／塩化メチレン（１：１
　　ｖ／ｖ））＝０．６ Ｒｆ（シリカゲル、塩化メチレン／メタノール（９５：
５　　ｖ／ｖ））＝０．３

【０１４７】４．４　　　　４−ヒドロキシフェニル−
ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イルアミン４．
４．１　　　　ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン２ｇを
６Ｎ塩酸３０ｍｌに溶かし、該溶液を０℃に冷却し、水
３０ｍｌ中、亜硝酸ナトリウム６．９ｇの溶液をゆっく
りと滴下した。１時間後、ニトロソ化が完了した。約１
００ｍｌの水を加え、つづいて酢酸エチルでの抽出を繰
り返した。有機相を乾燥して蒸発させた。３−ニトロソ
ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン９．６ｇを得た。

【０１４８】４．４．２　　　　４．４．１に従って得
られたニトロソ化合物９ｇを、濃塩酸１８０ｍｌ中、塩
化第一スズ二水和物２２ｇの溶液に加えた。反応混合物
を室温にて１時間撹拌し、還元を完了させるために、濃
塩酸３０ｍｌ中、塩化第一スズ二水和物８ｇと混合した
。該懸濁液を水酸化ナトリウムでｐＨ１２に調整した氷
約１５０ｇ上に注ぎ、直ちに酢酸エチルで抽出した。酢
酸エチル相を乾燥させ、蒸発させた。該残渣をジエチル
エーテル３５０ｍｌに溶かし、エーテル性塩酸と混合し
た。得られた沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄
し、乾燥した。３−アミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリ
ジン塩酸塩１１．３ｇ（収率１００％）を得た。融点２
２８〜２３２℃。Ｒｆ（シリカゲル、酢酸エチル／メタ
ノール　　９：１　　ｖ／ｖ）＝０．５２。

【０１４９】４．４．３　　　　出発物質として３−ア
ミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリジンを用い、４．３．
２および４．３．３に従って、ロイコ色物質の４−ヒド
ロキシフェニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−
イルアミンを得た。Ｒｆ（シリカゲル、酢酸エチル／ジ
エチルエーテル　　１：１　　ｖ／ｖ）＝０．６８。

【０１５０】４．５　　　　４−ヒドロキシフェニル−
２−メチルチオピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−
イルアミン ４．５．１　　　　２−メチルチオ−３−ニトロピラゾ
ロ［１，５−ａ］ピリジン（ヘテロサイクル（Ｈｅｔｅ
ｒｏｃｙｃｌｅｓ）、６、１５２８／１９７７参照）４
ｇを、濃塩酸２００ｍｌに溶かし、塩化第一スズ二水和
物２０ｇと混合した。１時間後、塩化第一スズ二水和物
１５ｇ、濃塩酸１５ｍｌおよび水２００ｍｌを再度添加
した。さらに１時間反応させた後、該反応混合物を氷上
に注ぎ、該黄色溶液を水酸化ナトリウムでアルカリ性に
し、酢酸エチルで抽出した。有機相を乾燥させ、蒸発さ
せた。残渣を少量のエタノールに溶かし、エーテル性塩
酸と混合し、塩酸塩を形成させた。３−アミノ−２−メ
チルチオピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン塩酸塩３．９
ｇ（収率９５％）を得た。融点２２６℃。Ｒｆ（シリカ
ゲル、塩化メチレン／ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル
２：８　　ｖ／ｖ）＝０．６６。

【０１５１】４．５．２　　　　３−アミノ−２−メチ
ルチオピラゾロ［１，５−ａ］ピリジンを用い、４．３
．２および４．３．３に従って、ロイコ色物質の４−ヒ
ドロキシフェニル−２−メチルチオピラゾロ［１，５−
ａ］ピリジン−３−イルアミンを得た。Ｒｆ（シリカゲ
ル、酢酸エチル／リグロイン　　１：１　　ｖ／ｖ）＝
０．４７。

【０１５２】実施例５ ４−（（Ｒ，Ｓ−２−（１−ヒドロキシエチル）−ピラ
ゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イル）−アミノ）−
フェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−
グルコピラノシド

【化６０】

【０１５３】５．１　　　　４−ヒドロキシフェニル−
２−（１−ヒドロキシエチルピラゾロ［１，５−ａ］ピ
リジン−３−イル）−アミン Ｎ−アミノピリジン塩酸塩２５ｇを乾燥ジメチルホルム
アミド２５０ｍｌに溶かし、撹拌しながら、炭酸カリウ
ム１７．５ｇと混合した。つづいて、撹拌しながら、Ｒ
，Ｓ−２−ヒドロキシ−５−オキソブト−３−イン（ジ
ャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキン
Ｉ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ　　Ｉ、１９
０８／１９７６）２０．２ｇを滴下した。反応混合物を
加温し、一夜放置した。１．２５リットルの水を添加し
た後、該反応混合物を酢酸エチルで数回抽出した。合し
た抽出物を乾燥して蒸発させた。残りの油をジエチルエ
ーテルで希釈した。数時間後に沈殿した結晶を吸引濾過
した。Ｒ，Ｓ−３−アセチル−２−（１−ヒドロキシエ
チル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン（Ｒｆ（シリ
カゲル、塩化メチレン／酢酸エチル１：１　　ｖ／ｖ）
＝０．３５）９．８ｇ（収率４２％）を得、それを実施
例４．３．１と同様にニトロソ化した。

【０１５４】該ニトロソ化合物をエタノールに懸濁させ
パラジウム／炭素２ｇと混合した。該反応混合物を８０
℃に加熱し、ヒドラジン水和物２．５ｍｌを少しづつ添
加した。１０分後、パラジウム／炭素を濾過し、濾液を
蒸発させた。残渣をエタノールに溶かし、エタノール性
塩酸を混合した。結晶形のＲ，Ｓ−３−アミノ−２−（
１−ヒドロキシエチル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリ
ジン塩酸塩６．８ｇを得、それは１．８モルの塩化水素
を含有し、２２９〜２３１℃にて融解した。Ｒｆ（シリ
カゲル、酢酸エチル／メタノール　　３：１　　ｖ／ｖ
）＝０．６５。

【０１５５】実施例４．３．２と同様に、フェノール３
．０８ｇを得られたアミノ化合物と反応させ、青色物質
を実施例４．３．３と同様に還元した。該粗製生成物を
、溶出剤として酢酸エチル／塩化メチレン（１：１ｖ／
ｖ）を用いるシリカゲル上のクロマトグラフィーに付し
た。 標記化合物３．４ｇを得た。Ｒｆ（シリカゲル、酢酸エ
チル／塩化メチレン　　１：１　　ｖ／ｖ）＝０．２。

【０１５６】５．２　　　　実施例１．２および１．３
と同様に、５．１からのロイコ色物質と２−アセトアミ
ド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−
α−Ｄ−グルコシルクロリドから、標記化合物を得た。 Ｒｆ（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール
　　１：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ）＝０．２５；融点１６
５〜１７０℃（分解）。

【０１５７】実施例６ Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（β−ＮＡ
Ｇａｓｅ）の湿式化学測定２００ｍＭクエン酸緩衝液（
ｐＨ５）中、４ｍＭ基質の溶液９００μｌをキュベット
に入れた。この溶液に、 １．２２０ｍＭヨウ素酸カリウム溶液１００μｌ、およ
び ２．β−ＮＡＧａｓｅ含有の溶液１００μｌをピペット
で移し、混合し、該基質に対応する波長で活性度を測定
した。添付図面の図１〜４の検量線は、公知濃度のＮＡ
Ｇａｓｅを含有する溶液を用いて得ることができる。

【０１５８】６．１　　　　実施例４ｅの基質は、λｍ
ａｘ５６０ｎｍで、添付図面の図１に示すβ−ＮＡＧａ
ｓｅ測定用検量線を付与した。β−ＮＡＧａｓｅが存在
する場合、該基質の色は無色から青紫色に変化した。

【０１５９】６．２　　　　実施例４ｇの基質は、λｍ
ａｘ５７３ｎｍで、添付図面の図２に示すβ−ＮＡＧａ
ｓｅ測定用検量線を付与した。β−ＮＡＧａｓｅの存在
で、該基質の色は無色から青紫色に変化した。

【０１６０】６．３　　　　実施例４ｈの基質は、λｍ
ａｘ５２５ｎｍで、添付図面の図３に示すβ−ＮＡＧａ
ｓｅ測定用検量線を付与した。β−ＮＡＧａｓｅの存在
で、該基質の色は無色から赤紫色に変化した。

【０１６１】６．４　　　　実施例５の基質は、λｍａ
ｘ５６５ｎｍで、添付図面の図４に示すβ−ＮＡＧａｓ
ｅ測定用検量線を付与した。β−ＮＡＧａｓｅの存在で
、該基質の色は無色から青紫色に変化した。

【０１６２】実施例７ β−ＮＡＧａｓｅ測定用試験ストリップａ）シュライヒ
ャー＆シュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌ
ｌ）社の濾紙（２３ＳＬ）を連続的に以下の溶液で含浸
させて乾燥させた： １．クエン酸緩衝液　　　　　　　　２００ｍＭ／ｌ、
ｐＨ５ヨウ素酸カリウム　　　　　　２０ｍＭ／ｌ２．
指示薬　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｍＭ／ｌ
指示薬として： α）実施例４ｅの化合物、 β）実施例４ｈの化合物を用いた。

【０１６３】こうして得られた試験ストリップをＮＡＧ
ａｓｅ含有溶液に浸し、その場合、約５分後で、約１０
Ｕ／ｌ以上のβ−ＮＡＧａｓｅ（その活性は、酵素基質
としてスルホフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニドでの引用方法に従って測定した）であり、
実施例４ｅの化合物を用いた場合、無色から青色への、
実施例４ｈの化合物を用いた場合には無色から赤色への
着色が観察された。酵素活性が高いほど、着色度は大き
くなる。

【０１６４】ｂ）前記ａ）の試験ストリップを、前記と
同じであるがヨウ素酸塩を含有しない溶液で試薬紙を含
浸させるように修飾して比較結果を得た。４０ｍＭ／ｌ
のヨウ素酸ナトリウム水溶液から、６０μｍのフィラミ
ント厚のナイロンメッシュ（スイス、チューリッヒのチ
ューリッヒャー・ボイテルトゥクファブリク（Ｚｕｅｒ
ｉｃｈｅｒ　　Ｂｅｕｔｅｌｔｕｃｈｆａｂｒｉｋ）社
のＮＹ７５ＨＣ）に酸化剤を含浸させた。緩衝剤および
指示薬含有の濾紙（１）、酸化剤含有のメッシュ（２）
、メッシュ（２）と同一成分のカバーメッシュ（３）と
ポリスチレンの剛性プラスチックフィルム（４）から、
添付図面の図５の試験キャリアーを製造した。この目的
のために、濾紙（１）およびメッシュ（２）を６ｍｍ×
６ｍｍの大きさの断片に切断し、溶融接着法（５）によ
り１２ｍｍ×６ｍｍの大きさのカバーメッシュで１００
ｍｍ×６ｍｍの大きさのプラスチックフィルム（４）上
に固定した。

【０１６５】かかる試験ストリップをβ−ＮＡＧａｓｅ
含有溶液に浸した後、化合物４ｅで無色から青色への、
化合物４ｈで無色から赤色への着色が生じた。酵素濃度
が高いほど、着色度は大きくなる。

【０１６６】実施例８ Ｎ−（ｐ−トルエンスルホニル）−Ｌ−アラニン−（４
−（（２−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３
−イル）−アミノ）−フェニルエステル

【化６１】

【０１６７】実施例４．３にて得られたロイコ色物質０
．４８ｇをピリジン８ｍｌに溶かし、撹拌しながら、ク
ロロホルム１２ｍｌ中、塩化ｐ−トルエンスルホニルの
溶液を滴下混合した。簡単に撹拌した後、該反応混合物
を水と混合し、有機相を分離した。該有機相を十分に水
で洗浄し、分離して乾燥させた。残査を溶出剤として水
／メタノールを用いる吸着剤樹脂ＨＰ２０ＳＳ（ミツビ
シ社）上でクロマトグラフィーに付した。生成物含有フ
ラクションを蒸発させ、残査をジエチルエーテル／ヘキ
サンから結晶化させた。標記化合物０．５４ｇを得た。 融点６８〜７８℃（分解）。Ｒｆ＝０．７（シリカゲル
、酢酸エチル／塩化メチレン　　ｇ：ｇ　　ｖ／ｖ）。

【０１６８】実施例９ リン酸モノ−（４−（（２−メチルピラゾロ［１，５−
ａ］ピリジン−３−イル）−アミノ）−フェニルエステ
ルピリジニウム塩

【化６２】

【０１６９】実施例４．３にて得られたロイコ色物質０
．３５ｇをピリジン３ｍｌに溶かした。該溶液を−１５
℃に冷却し、撹拌しながら、ピリジン２．５ｍｌ中、オ
キシ塩化リン０．１５ｍｌの溶液を滴下混合した。該反
応混合物を−１５℃にて３０分間、室温にて２時間撹拌
し、氷と一緒に混合し、２Ｎ硫酸でｐＨ２に酸性化し、
冷却装置中にて一夜放置した。得られた沈澱物を濾過し
、濾液を吸着剤樹脂ＨＰ２０ＳＳ（ミツビシ社）含有の
カラムを通した。該生成物を水で溶出した。生成物含有
フラクションを合し、蒸発させ、残査をメタノール／ジ
エチルエーテルから結晶化させた。標記化合物０．０６
ｇを得た。融点１５８〜１６１℃（分解）。

【０１７０】実施例１０ ４−（２，４−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ］イミダ
ゾール−３−イル）−アミノ）−フェニル−２−アセト
アミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド

【化
６３】

【０１７１】１０．１　　　　１，２−ジメチルイミダ
ゾール１．９２ｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶かし、氷
で冷却しながら、Ｏ−ｐ−トルエンスルホニルアセトヒ
ドロキサム酸エチルエステル１５．４ｇを６０％水性過
塩素酸１１８ｍｌと反応させることにより得られた、Ｏ
−ｐ−トルエンスルホニルヒドロキシルアミンの溶液と
混合した。該反応混合物を室温にて３時間撹拌した。得
られた沈澱物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。 Ｎ−アミノ−１，２−ジメチルイミダゾリウムｐ−トル
エンスルホネート５ｇ（収率８８％）を得た。

【０１７２】１０．２　　　　１０．１にて得られた生
成物５ｇを、酢酸ナトリウム５．４ｇおよび無水酢酸１
２５ｍｌと一緒に１４０℃の浴温度にて１時間加熱した
。反応混合物を真空下にて蒸発させて残査を水に溶かし
た。ｐＨ値を９〜１０に調整し、塩化メチレンで抽出し
た。有機相を乾燥させ、蒸発させた。残査を酢酸エチル
を用いるシリカゲル上のクロマトグラフィーに付した。 ３−アセチル−２，４−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ
］イミダゾール０．４５ｇ（収率１１％）を得た。融点
１６５〜１６７℃。

【０１７３】１０．３　　　　１０．２にて得られた化
合物を実施例４．３．１と同様にニトロソ化した。対応
するニトロソ化合物０．３５ｇ（収率９４％）を得た。 融点１７９〜１８３℃。これを希釈炭酸水素ナトリウム
水溶液１００ｍｌに溶かし、亜ジチオン酸ナトリウムで
還元した。反応混合物を蒸発させ、エタノールで温浸さ
せた。 該エタノール溶液を蒸発させ、生成物をエタノール性塩
酸を添加することにより沈澱させた。アミノ化合物０．
３ｇ（収率８０％）を得た。融点１９９〜２０４℃（分
解）。ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／アセトン／氷
酢酸／水　　５０：２５：１２．５：１２．５　　ｖ／
ｖ／ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．３。

【０１７４】１０．４　　　　実施例４．３．２と同様
に、前記のアミノ化合物をフェリシアン酸カリウムおよ
びフェノールと反応させ、得られた着色物質を実施例４
．３．３と同様に還元した。得られたロイコ色物質のＲ
ｆ：シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　２：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ＝０．５。

【０１７５】１０．５　　　　前記ロイコ色物質０．４
６ｇを塩化メチレン４０ｍｌに溶かし、氷で冷却しなが
ら、まずジイソプロピルエチルアミン０．６５ｍｌと混
合し、ついで無水トリフルオロ酢酸０．５１ｍｌを滴下
した。 １時間後、再度連続的にジイソプロピルエチルアミン０
．３５ｍｌおよび無水トリフルオロ酢酸０．２５ｍｌを
添加した。３０分間撹拌した後、該反応混合物を蒸発さ
せ、残査を、塩化メチレン／酢酸エチル（１：１　　ｖ
／ｖ）を用いるシリカゲル上のクロマトグラフィーに付
した。Ｎ−（２，４−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ］
イミダゾール−３−イル）−Ｎ−（４−ヒドロキシフェ
ニル）−トリフルオロアセトアミド０．４ｇを得た。Ｒ
ｆ＝０．３（シリカゲル、塩化メチレン／酢酸エチル　
　１：１　　ｖ／ｖ）。

【０１７６】１０．６　　　　前記フェノール誘導体を
、実施例１．２と同様に、２−アセトアミド−３，４，
６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−グル
コシルクロリドでグリコシド化した。トリフルオロアセ
チル基を包含する保護基を除去するため、シリカゲル上
のクロマトグラフィー（塩化メチレン／酢酸エチル　　
１：１ｖ／ｖ）により精製した生成物をメタノールに溶
かし、該溶液を大過剰の無水炭酸ナトリウムと混合した
。該混合物を４５℃にて１．５時間撹拌し、塩を吸引濾
過し、残査をいくらかのメタノールで洗浄し、濾液を約
２０ｍｌに濃縮した。この溶液を吸着剤樹脂ＨＰ２０Ｓ
Ｓ（ミツビシ社）含有のカラムに付し、メタノール／水
（１：９〜１：１　　ｖ／ｖ）の段階的グラジエントで
溶出した。 標記化合物を得た。融点１１２〜１１５℃（分解）。Ｒ
ｆ＝０．２（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタ
ノール　　１：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ）。

【０１７７】実施例１１ ４−（（２，４−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ］イミ
ダゾール−３−イル）−Ｎ−トリフルオロアセチル）−
アミノ）−フェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ
−β−Ｄ−グルコピラノシド

【化６４】

【０１７８】実施例１０．６にて得られたグルコシドの
保護基の分離は、実施例１．３と同様に、メタノール中
の炭酸水素ナトリウムを用いて行い、ついでアセチル基
のみを分離し、実施例１０．６と同様にクロマトグラフ
ィー精製後、標記化合物を得た。融点２２３〜２２６℃
（分解）。Ｒｆ＝０．２１（シリカゲル、トルエン／酢
酸エチル／メタノール　　１：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ）
。

【０１７９】実施例１２ 実施例１０．５および１０．６と同様に、適当なロイコ
色物質および２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ
−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコシルクロリ
ドから出発し、以下の表３〜８に列挙する化合物を得た
。

【０１８０】

【表３】 １）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　２：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ ２）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　１：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ

【０１８１】

【表４】 １）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　２：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ ２）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　１：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ ３）シリカゲル、酢酸エチル／アセトン／水／氷酢酸　
　５０：２５：１２．５：１２．５　　ｖ／ｖ／ｖ／ｖ

【０１８２】

【表５】 １）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　２：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ ２）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　１：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ ３）シリカゲル、酢酸エチル／メタノール　　１：１　
　ｖ／ｖ ４）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　１：１：２　　ｖ／ｖ／ｖ

【０１８３】

【表６】 １）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　２：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ ２）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　１：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ

【０１８４】

【表７】 １）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　２：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ ２）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　１：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ

【０１８５】

【表８】 １）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　２：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ ２）シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　１：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ

【０１８６】ロイコ色物質成分の製造 １２．１　　　　４−ヒドロキシフェニル−２−メトキ
シピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イルアミン１
２．１．１　　　　３−アミノ−２−メトキシピラゾロ
［１，５−ａ］ピリジン塩酸塩

【０１８７】２−メトキシピラゾロ［１，５−ａ］ピリ
ジン（ブル・ケム・ソク・ジャパ（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ
．Ｓｏｃ．Ｊａｐ．），４９，１９８０／１９７６参照
）１．４８ｇを、氷で冷却しながら、濃硝酸２０ｍｌに
溶かし、発煙硝酸１０．５ｍｌを滴下混合した。該反応
混合物を氷浴中にて３０分間、室温にて１時間撹拌した
。該反応混合物を氷中に注ぎ、得られた沈澱物を吸引濾
過し、水で洗浄した。２−メトキシ−３−ニトロピラゾ
ロ［１，５−ａ］ピリジン１ｇ（収率５２％）を得た。 融点２１３〜２１６℃。

【０１８８】前記のニトロ化合物０．８ｇを２Ｎ塩酸８
０ｍｌに懸濁させ、激しく撹拌しながら亜鉛粉末と混合
した。亜鉛粉末を数回添加した後、１時間後、過剰の亜
鉛の底部沈積物上の清澄溶液を得た。これを濾過し、該
濾液を水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７に調整した。つ
いで、該混合物を酢酸エチルで抽出し、有機相を蒸発さ
せ、残りの油をシリカゲルのショートカラムを通しエタ
ノールで濾過した。該溶出液を蒸発させ、残査をジエチ
ルエーテルに溶かし、エーテル性塩酸と混合した。得ら
れた沈澱物を吸引濾過し、再度イソプロパノールから再
結晶した。標記化合物（１２．１．１）０．３３ｇ（収
率４２％）を得た。融点２３８〜２４１℃。ＴＬＶ（シ
リカゲル、アセトン／塩化メチレン／氷酢酸　　５０：
４５：５　　ｖ／ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．６。

【０１８９】１２．１．２　　　　実施例４．３．２と
同様に、得られたアミノ化合物から、フェノールとの酸
化カップリングにより着色化合物を得、それを実施例４
．３．３と同様に還元し、ついで実施例１０．５と同様
にトリフルオロアセチル化した。

【０１９０】１２．２　　　　４−ヒドロキシフェニル
−２，５−ジメチル−７−ジメチルアミノピラゾロ［１
，５−ａ］ピリミジン−３−イルアミン １２．２．１　　　　３−アミノ−２，５−ジメチル−
７−ジメチルアミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン
塩酸塩

【０１９１】２，５−ジメチル−７−ヒドロキシ
ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン１．６ｇを、オキシ
塩化リン１６．６ｍｌおよびＮ，Ｎ−ジメチルアニリン
０．８ｍｌと一緒に４０分間加熱還流した。過剰のオキ
シ塩化リンを留去し、残査を氷上に注いだ。該混合物を
塩化メチレンで抽出し、有機相を炭酸ナトリウムの水溶
液で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。残査をエタノール２
８ｍｌに溶かし、ジメチルアミンの４０％水溶液２ｇと
混合した。該混合物を室温にて２．５時間撹拌し、蒸発
させ、残査を酢酸エチルを用いるシリカゲル上のクロマ
トグラフィーに付した。２，５−ジメチル−７−（Ｎ，
Ｎ−ジメチルアミノ）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミ
ジン０．８６ｇ（収率４６％）を得、それを実施例４．
３．１と同様にニトロソ化した。

【０１９２】得られたニトロソ化合物（１ｇ）をエタノ
ール２０ｍｌに溶かし、パラジウム／炭素０．１６ｇと
混合し、ヒドラジン水和物０．４ｍｌと沸騰温度にて混
合した。該反応混合物をさらに１５分間煮沸還流し、吸
引濾過し、濾液をいくらか濃縮した。残査を少量のエタ
ノールに溶かし、エタノール性塩酸と混合し、該塩酸塩
を沈澱させた。３−アミノ−２，５−ジメチル−７−（
ジメチルアミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン塩酸
塩０．８ｇを得た。Ｒｆ＝０．５４（シリカゲル、クロ
ロホルム／メタノール／メチルエチルケトン／氷酢酸／
水　　７５：３５：２５：５：８　　ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／
ｖ）

【０１９３】フェノール６．９４ｇをピリジン１２
４ｍｌおよび水７４３ｍｌに溶かした。水２４８ｍｌ中
、前記アミノ化合物１１．４ｇの溶液をその溶液に加え
た。 最終的に、（ドイツ、マンハイム、ベーリンガー・マン
ハイム社、（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　
　ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、セ
イヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）からの）ペル
オキシダーゼ０．３３ｇの溶液と混合し、それに直ちに
、３０％過酸化水素１１．２３ｍｌを滴下した。青色の
Ｎ−（２，５−ジメチル−６−ジメチルアミノピラゾロ
［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）−キノニミン１
２．９ｇを得た。Ｒｆ＝０．４３（シリカゲル、酢酸エ
チル／塩化メチレン　　９５：５ｖ／ｖ）。該着色物質
を実施例４．３．３と同様に還元し、実施例１０．５と
同様にトリフルオロアセチル化した。着色物質が沈澱し
ない場合、その場合、酢酸エチルで抽出した。 ある情況下では、実施例４．３．３と同様に、亜ジチオ
ン酸ナトリウムおよび炭酸ナトリウム水溶液を添加する
ことによりロイコ色物質に処理すべきである。

【０１９４】１２．３　　　　４−ヒドロキシフェニル
−２，４，６−トリメチルピラゾロ［３，２−ｃ］−ｓ
−トリアゾール−３−イル）−アミン ４−エトキシカルボニル−３−メチルピラゾロ−５−イ
ルヒドラジン（ケミシェ・ベリクテ（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ
．），８９，２５５２／１９５６参照）から出発し、ド
イツ連邦共和国特許明細書Ｎｏ．Ａ−１８１０４６２に
記載の実施例６の方法にて、２，６−ジメチル−４Ｈ−
ピラゾロ［３，２−ｃ］−ｓ−トリアゾール−３−カル
ボン酸エチルエステルを製造した。

【０１９５】このエステル０．４ｇを乾燥ジメチルホル
ムアミド１５ｍｌに溶かし、ｐ−トルエンスルホン酸メ
チルエステル０．４６ｇと混合した。この混合物に、５
５％水素化ナトリウム０．１１ｇを少しづつ加え、つづ
いて室温にて１時間撹拌した。該反応混合物を氷上に注
ぎ、それに塩化ナトリウム５ｇを添加した。ついで、該
反応混合物を酢酸エチルで数回抽出し、該抽出液を乾燥
して蒸発させた。残りの油を、溶出剤として酢酸エチル
／リグロインを用いるシリカゲル上のクロマトグラフィ
ーによって精製した。

【０１９６】こうして、中間体の２，４，６−トリメチ
ルピラゾロ［３，２−ｃ］−ｓ−トリアゾール−３−カ
ルボン酸エチルエステル（Ｒｆ＝０．５２；シリカゲル
、酢酸エチル／リグロイン　　１：１　　ｖ／ｖ）を得
、それを濃塩酸と一緒に煮沸することによりケン化し、
同時に脱炭酸した。淡黄色がかった油として２，４，６
−トリメチルピラゾロ［３，２−ｃ］−ｓ−トリアゾー
ル（Ｒｆ＝０．２４；シリカゲル、酢酸エチル／リグロ
イン１：１　　ｖ／ｖ）を得、それは数時間後に結晶化
した。

【０１９７】この複素環式化合物を氷酢酸４０ｍｌに溶
かし、酢酸ナトリウム１ｇおよびｐ−メトキシベンゼン
ジアゾニウムテトラフルオロボレート３．３ｇと混合し
た。該反応混合物を４０℃にて撹拌し、３時間後、反応
を完了させるために、酢酸ナトリウム０．２ｇおよびジ
アゾニウム塩０．６６ｇを再度添加した。４０℃にて３
時間後、該反応混合物を氷上に注いだ。ついで、酢酸エ
チルで抽出し、得られた粗製生成物を酢酸エチル／リグ
ロイン（１：１　　ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル上のク
ロマトグラフィーにより精製した。レモン色のアゾ化合
物３．７ｇを得た。

【０１９８】該アゾ化合物３．１ｇを氷酢酸５０ｍｌに
溶かし、緩やかに冷却しながら、亜鉛粉末５ｇを混合し
た。１時間後、該反応混合物を濾過し、濾液を蒸発させ
た。精製のため、該粗製生成物をジオキサンに溶かし、
ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート３．９ｇを混合した。 ２時間の反応時間後、該反応混合物を蒸発させ、残査を
リグロイン／アセトン（７：３　　ｖ／ｖ）を用いるシ
リカゲル上のクロマトグラフィーに付した。対応するＮ
−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル化合物１．５ｇを得、
アミノ保護基を分離するために、それをエタノール性塩
酸２５ｍｌに溶かした。１時間後、該溶液を室温にて蒸
発させ、残査をメタノール／ジエチルエーテルから再結
晶した。標記化合物（１２．２．１）１．６ｇを得た。 融点２４０℃。Ｒｆ＝０．５（シリカゲル；酢酸エチル
／アセトン／氷酢酸／水　　５０：２５：１２．５：１
２．５　　ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）。

【０１９９】１２．３．２　　　　前記アミノ化合物を
フェノールとカップリングさせ、実施例４．３．２およ
び４．３．３と同様に着色物質を得、還元し、実施例１
０．５と同様に該ロイコ色物質をトリフルオロアセチル
化した。

【０２００】１２．４　　　　４−ヒドロキシ−２−メ
チルピラゾロ［３，２−ｂ］チアゾール−３−イルアミ
ン３−アセチル−２−メチルピラゾロ［３，２−ｂ］チ
アゾール（ケミカル・アンド・ファーマシューティカル
・ブレチン（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．），２
２，４８２／１９７４参照）から出発し、実施例４．３
．１、４．３．２および４．３．３と同様にしてロイコ
色物質を得、実施例１０．５と同様にトリフルオロアセ
チル化した。

【０２０１】１２．５　　　　４−ヒドロキシフェニル
−２−カルボン酸メチルエステルピラゾロ［１，５−ａ
］ピリジン−３−イルアミン ２−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−カルボン酸エチ
ルエステル（ジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・
ケミストリー（Ｊ．Ｈｅｔ．Ｃｈｅｍ．），１８，１１
４９／１９８１参照）から出発し、実施例４．３．１（
ニトロソ化）、１２．１（亜鉛／塩酸で還元）、１２．
２．２（フェニールでの酸化カップリング）および４．
３．３（ロイコ色物質への還元）と同様にロイコ色物質
成分を得、ついで該ロイコ色物質を実施例１０．５と同
様にしてトリフルオロアセチル化した。最終反応工程に
おけるアセチル保護基の分離において、該エチルエステ
ルをエステル交換してメチルエステルを得た。

【０２０２】１２．６　　　　４−ヒドロキシ−４−メ
チルピラゾロ［１，５−ａ］イミダゾール−３−イルア
ミン１２．６．１　　　　３−アミノ−４−メチルピラ
ゾロ［１，５−ａ］イミダゾール塩酸塩

【０２０３】「オーガニクム（Ｏｒｇａｎｉｋｕｍ）」
（ベルリン、，ＶＥＢドイツ科学出版物）、５１４〜５
１５頁に記載の方法に従って、エトキシメチレンシアノ
酢酸エチル６５ｇを２，２−ジエトキシエチルヒドラジ
ン５５ｇと反応させて５−アミノ−１−（２，２−ジエ
トキシエチル）−ピラゾロ−４−カルボン酸１００．２
ｇを得、それを４リットルのエタノールに溶かし、２リ
ットルの２０％硫酸を混合した。該反応混合物を３時間
加熱還流し、固形炭酸水素ナトリウムを添加して中和し
た。沈澱した塩を濾過し、濾液を蒸発させた。残査を煮
沸塩化メチレンで数回抽出した。濾液を合し、蒸発させ
てピラゾロ［１，５−ａ］イミダゾール−３−カルボン
酸エチルエステル５８．２ｇ（収率８６％）を得た。融
点１２６〜１２７℃；Ｒｆ＝０．６４（シリカゲル、酢
酸エチル）。

【０２０４】前記のカルボン酸エステル１８．７ｇをジ
メチルホルムアミド１９０ｍｌに溶かし、ｐ−トルエン
スルホン酸メチルエステル１７ｇを混合した。撹拌しな
がら、５５％水素化ナトリウム３．９８ｇを少しづつ添
加した。該反応混合物を室温にて３０分間撹拌し、酢酸
エチルで抽出した。４−メチルピラゾロ［１，５−ａ］
イミダゾール−３−カルボン酸エチルエステル２１．９
ｇ（収率１００％）を得、それを濃塩酸６００ｍｌと煮
沸することによりケン化した。同時に、得られたカルボ
ン酸を脱炭酸し、４−メチルピラゾロ［１，５−ａ］イ
ミダゾールジ塩酸塩１６．７ｇ（収率８３％）を得た。 Ｒｆ＝０．３９（シリカゲル、５％メタノール含有の塩
化メチレン）。

【０２０５】アニリン１２．８ｇを、水６４ｍｌの濃硫
酸１２．８ｍｌの溶液中、水４２ｍｌの亜硝酸ナトリウ
ム９．５ｇの溶液を添加することによりジアゾ化した。 該溶液を水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨ５
に調整し、５〜１０℃にて、水１６５ｍｌおよび氷酢酸
１４ｍｌ中、前記４−メチルピラゾロ［１，５−ａ］イ
ミダゾール１６．５ｇの溶液を滴下混合した。該反応混
合物を５〜１０℃にて１時間、そして室温にて３時間撹
拌し、ついで得られた沈澱物を吸引濾過した。４−メチ
ル−３−フェニルアゾピラゾロ［１，５−ａ］イミダゾ
ール１２ｇを得、それを実施例１２．３と同様に亜ジチ
オン酸ナトリウムで還元して精製した。３−アミノ−４
−メチル−ピラゾロ［１，５−ａ］イミダゾール塩酸塩
３．３ｇを得た。融点２１０℃以上（分解）。；Ｒｆ＝
０．２３（シリカゲル、酢酸エチル／アセトン／氷酢酸
／水　　５０：２５：１２．５：１２．５　　ｖ／ｖ／
ｖ／ｖ）。

【０２０６】１２．６．２　　　　ロイコ色物質を得る
ために、実施例１２．３．２と同様に後処理を行った。

【０２０７】１２．７　　　　４−ヒドロキシフェニル
−２，６−ジメチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン
−３−イルアミン １２．７．１　　　　３−アミノ−２，６−ジメチルピ
ラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン塩酸塩

【０２０８】２，６−ジメチル−３−ニトロピラゾロ［
１，５−ａ］ピリミジン（シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ）、６７３／１９８２参照）３．２ｇをエタノール
３２０ｍｌに溶かし、５％炭酸水素ナトリウム水溶液３
２０ｍｌと混合した。この混合物に、薄層クロマトグラ
フィーが出発物質の不在を示すまで、撹拌および冷却を
続けながら、亜ジチオン酸ナトリウム１４．２ｇを少し
づつ添加した。該反応混合物をいくらか濃縮し、酢酸エ
チルで３回抽出した。有機相を乾燥して蒸発させた。残
査を少量のエタノールに溶かし、等モル量の塩化水素／
ジエチルエーテルと混合した。沈澱した結晶を吸引濾過
した。標記化合物（１２．７．１）２．９ｇ（収率８０
％）を得た。融点２２４℃（分解）。ＴＬＣ（シリカゲ
ル、クロロホルム／メタノール／メチルエチルケトン／
氷酢酸／水　　７５：３５：２５：５：８　　ｖ／ｖ／
ｖ／ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．７３。

【０２０９】１２．７．２　　　　ロイコ色物質は、実
施例４．３．２に従ってフェノールと酸化カップリング
し、実施例４．３．３に従って還元することにより得ら
れ、つづいて実施例１０．５と同様にトルフルオロアセ
チル化した。

【０２１０】１２．８　　　　４−ヒドロキシフェニル
−２−エトキシカルボニルメトキシピラゾロ［１，５−
ａ］ピリジン−３−イルアミン 実施例１２．１と同様に、２−ヒドロキシ複素環化合物
のアルキル化により製造した２−メトキシ化合物（ブル
・ケム・ソク・ジャパ，４９，１９８０／１９７６参照
）と同様に製造した２−エトキシカルボニルメトキシピ
ラゾロ［１，５−ａ］ピリジンから出発し、Ｎ−トリフ
ルオロアセチル化ロイコ色物質を得た。最終反応工程に
おいてアセチル保護基を分離するのに、カルボン酸エス
テル部をケン化した。該エステルと酸は、吸着剤樹脂Ｈ
Ｐ２０ＳＳ（ミツビシ社）でのクロマトグラフィー（溶
出剤：メタノール／水）によりスムーズに分離すること
ができる。

【０２１１】１２．９　　　　４−ヒドロキシフェニル
−２−アセトアミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−
３−イルアミン ２−アセトアミドピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン（ケ
ミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレチン，
２１，２１４６／１９７３）４ｇを、実施例４．３．１
に従ってニトロソ化した。該ニトロソ化合物を実施例５
．１に従ってパラジウム炭素／ヒドラジン水和物で還元
した。２−アセトアミド−３−アミノピラゾロ［１，５
−ａ］ピリジン塩酸塩３．９ｇ（収率６７％）を得た。 融点２５５〜２５９℃（分解）。Ｒｆ＝０．５（シリカ
ゲル、酢酸エチル／アセトン／氷酢酸／水　　５０：２
５：１２．５：１２．５　　ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）。

【０２１２】該アミノ化合物を実施例４．３．２に従っ
てフェノールとカップリングさせて着色物質を得、それ
を実施例４．３．３に従って還元し、実施例１０．５に
従ってＮ−トリフルオロアセチル化した。

【０２１３】１２．１０　　　　４−ヒドロキシフェニ
ル−２−ビニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−
イルアミン Ｒ，Ｓ−３−アセチル−２−（１−ヒドロキシエチル）
−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン（実施例５．１）２
５ｇを濃硫酸５０ｍｌと混合し、９５℃の浴温度にて２
時間加熱した。該反応混合物を多量の氷上に注ぎ、水酸
化ナトリウムでアルカリ性とし、酢酸エチルで抽出した
。 該粗製生成物をリグロイン／酢酸エチル（９５：５〜９
０：１０　　ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル上のクロマト
グラフィーに付した。２−ビニルピラゾロ［１，５−ａ
］ピリジン（Ｒｆ＝０．６；シリカゲル、リグロイン／
酢酸エチル　　３：１　　ｖ／ｖ）３．４ｇを得、それ
を実施例１２．３．１に従ってフェニルジアゾニウム塩
と反応させ、還元して精製した。このようにして対応す
るアミノピラゾールを得た。Ｒｆ＝０．６５（シリカゲ
ル、リグロイン／アセトン／氷酢酸　　５０：４５：５
　　ｖ／ｖ／ｖ）。

【０２１４】該アミノ化合物を実施例１２．２．２に従
ってフェノールとカップリングさせて着色物質を得、そ
れを実施例４．３．３に従って還元し、実施例１０．５
に従ってＮ−トリフルオロアセチル化した。

【０２１５】１２．１１　　　　４−ヒドロキシフェニ
ル−６−（３−アセトキシプロピル）−２−メチルピラ
ゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イルアミン１２．
１１．１　　　　６−（３−アセトキシプロピル）−２
−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン

【０２１６
】実施例１２．７．１に従い、６−（３−アセトキシプ
ロピル）−２−メチル−３−ニトロピラゾロ［１，５−
ａ］ピリミジン（シンセシス，６７３／１９８２参照）
を還元することにより、標記化合物（１２．１１．１）
を得た。Ｒｆ＝０．２１（シリカゲル、塩化メチレン／
メタノール　　９０：１　　ｖ／ｖ）。

【０２１７】１２．１１．２　　　　該アミノ化合物を
実施例４．３．２に従ってフェノールとカップリングさ
せて着色物質を得、それを実施例４．３．３に従って還
元し、実施例１０．５に従ってＮ−トリフルオロアセチ
ル化した。

【０２１８】１２．１２　　　　４−ヒドロキシフェニ
ル−２，３−ジアミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン
−３−イルアミン ２−アミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン（ケミカル
・アンド・ファーマシューティカル・ブレチン，２１，
２１４６／１９７３参照）２．６６ｇを、実施例１２．
３．１と同様にｐ−メトキシベンゼンジアゾニウム塩と
反応させ、得られたアゾ化合物を亜ジチオン酸ナトリウ
ムで還元し、得られた粗製生成物を精製して２，３−ジ
アミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリジンを得た。融点１
９０℃；Ｒｆ＝０．６（シリカゲル、リグロイン／アセ
トン／氷酢酸　　６０：４０：１　　ｖ／ｖ／ｖ）。

【０２１９】該アミノ化合物を実施例４．３．２に従っ
てフェノールとカップリングさせて着色物質を得、それ
を実施例４．３．３に従って還元し、実施例１０．５に
従ってＮ−トリフルオロアセチル化した。

【０２２０】その後のグリコシド化で、該ロイコ色物質
をフェノール性ヒドロキシル基だけでなく、２−アミノ
基もまたグリコシド化した。

【０２２１】１２．１３　　　　　　４−ヒドロキシフ
ェニル−２−クロロピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−
３−イルアミン １２．１３．１　　　　３−アミノ−２−クロロピラゾ
ロ［１，５−ａ］ピリジン塩酸塩

【０２２２】２−アミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリジ
ン（ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレ
チン，２１，２１４６／１９７３参照）を、実施例１２
．３．１に従ってｐ−メトキシベンゼンジアゾニウム塩
と反応させた。得られた３−アゾ化合物０．５３ｇを６
Ｎ塩酸１０ｍｌに懸濁させ、５℃にて撹拌しながら、水
０．２ｍｌ中の亜硝酸ナトリウム１０４ｍｇの溶液を混
合した。３０分後、６Ｎ塩酸６ｍｇ中、塩化第一銅１９
８ｍｇの冷溶液を加え、該反応混合物を室温にて４０時
間撹拌した。該反応混合物を水と混合し、酢酸エチルで
３または４回抽出した。シリカゲル上のクロマトグラフ
ィー（溶出剤：酢酸エチル／リグロイン１：１　　ｖ／
ｖ）により該粗製生成物を精製し、２−クロロ−３−（
ｐ−メトキシフェニルアゾ）ピラゾロ［１，５−ａ］ピ
リジン（Ｒｆ＝０．６５；シリカゲル、酢酸エチル／リ
グロイン　　１：１ｖ／ｖ）３２０ｍｇを得、それを実
施例１２．３．１と同様に亜ジチオン酸ナトリウムで還
元した。標記化合物を得た。融点２４９〜２５１℃（分
解）；Ｒｆ＝０．２（シリカゲル、酢酸エチル／リグロ
イン　　１：１　　ｖ／ｖ）。

【０２２３】１２．１３．２　　　　該アミノ化合物を
、実施例４．３．２に従ってフェノールとカップリング
させて着色物質を得、それを実施例４．３．３に従って
還元し、実施例１０．５と同様にトルフルオロアセチル
化した。

【０２２４】１２．１４　　　　４−ヒドロキシフェニ
ル−２−モルホリノピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−
３−イルアミン １２．１４．１　　　　３−アミノ−２−モルホリノピ
ラゾロ［１，５−ａ］ピリジン塩酸塩

【０２２５】２−アミノピラゾロ［１，５−ａ］ピリジ
ン（ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレ
チン，２１，２１４６／１９７３参照）を、実施例１２
．３．１と同様にｐ−メトキシベンゼンジアゾニウム塩
と反応させた。該アゾ化合物４ｇをジメチルホルムアミ
ド１００ｍｌに溶かし、β，β’−ジブロモジエチルエ
ーテル５．３３ｇおよび水素化ナトリウム（５５％）２
ｇを混合した。該反応混合物を室温にて１．５時間撹拌
し、水および酢酸エチルを加えた。有機相を分離し、水
相を再度酢酸エチルで抽出した。合した有機相を乾燥し
、蒸発させた。得られた残査をヘキサンでトリチュレー
トした。３−（４−メトキシフェニル）−アゾ−２−モ
ルホリノピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン４．７５ｇを
得た。Ｒｆ＝０．７（シリカゲル、酢酸エチル／塩化メ
チレン　　１：１　　ｖ／ｖ）。

【０２２６】該アゾ化合物を実施例１２．３．１に従っ
て亜鉛および氷酢酸で還元し、精製し、ｔｅｒｔ−ブト
キシカルボニル基を塩酸／エタノールで分離した。標記
化合物（１２．１４．１）２．４３ｇを得た。融点１０
５〜１１０℃（分解）。Ｒｆ＝０．４（シリカゲル、酢
酸エチル）。

【０２２７】１２．１４．２　　　　該アミノ化合物を
、実施例４．３．２に従ってフェノールとカップリング
させて着色物質を得、それを実施例４．３．３に従って
還元し、実施例１０．５に従ってトルフルオロアセチル
化した。

【０２２８】ｏ−クロロフェノールとカップリングさせ
ることにより、対応するハロゲン含有ロイコ色物質の３
−クロロ−４−ヒドロキシフェニル−２−モルホリノピ
ラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イルアミンを得た
。

【０２２９】１２．１５　　　　３−クロロ−４−ヒド
ロキシフェニル−７−（２−ヒドロキシエチル）−ピラ
ゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イルアミン１２．１
５．１　　　　３−アミノ−７−（２−ヒドロキシエチ
ル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン

【０２３０】２
−ヒドロキシエチルピリジン１９．１ｇを塩化メチレン
５０ｍｌに溶かし、氷で冷却しながら、文献に記載され
た、Ｏ−ｐ−トルエンスルホニルアセトヒドロキサム酸
エチルエステル４０ｇを６０％過塩素酸３００ｍｌと反
応させる操作に従って得られたＯ−ｐ−トルエンスルホ
ニルヒドロキシルアミンの溶液を混合した。

【０２３１】該反応混合物を、氷浴中にて１５分間、そ
して室温にて１時間撹拌し、ついで蒸発乾固した。残査
をジメチルホルムアミド４０ｍｌに溶かし、炭酸カリウ
ム２８ｇを混合した。プロピオン酸エチル（Ｅｔｈｙｌ
　　ｐｒｏｐｉｏｌａｔｅ）１５ｇを滴下し、それと同
時に、空気を該反応混合物に通した。１時間の反応時間
後、該混合物を蒸発させ、リグロイン／酢酸エチル（１
：１ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル上のクロマトグラフィ
ーに付した。油状の黄褐色物質１０．８ｇを得、それを
濃塩酸２００ｍｌに溶かし、３時間加熱還流した。該反
応混合物を、氷で冷却しながら、水酸化ナトリウム水溶
液でアルカリ性にし、該生成物を酢酸エチルで抽出した
。褐色油４．６ｇを得た。

【０２３２】実施例４．４．１および４．４．２に従っ
て、標記化合物（１２．１５．１）を得た。融点２０８
℃。Ｒｆ＝０．３８（シリカゲル、酢酸エチル／メタノ
ール　　９：１　　ｖ／ｖ）。

【０２３３】１２．１５．２　　　　実施例４．３．２
に従い、２−クロロフェノールとカップリングさせるこ
とにより着色物質を得、それを、触媒量のｐ−ジメチル
アミノピリジンの存在下、無水酢酸と反応させることに
よりヒドロキシエチル基をアセチル化し、実施例４．３
．３に従って還元し、実施例１０．５に従ってトリフル
オロアセチル化した。

【０２３４】１２．１６　　　　３−クロロ−４−ヒド
ロキシフェニル−５−（２−ヒドロキシエチル）−ピラ
ゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イルアミン実施例１
２．１５に従って、４−ヒドロキシエチルピリジンから
出発し、Ｎ−トリフルオロアセチル化ロイコ色物質を得
た。

【０２３５】１２．１７　　　　実施例４．３．２およ
び４．３．３に従い、３−アミノピラゾロ［１，５−ａ
］ピリジン（実施例４．４．２参照）を、適宜置換した
フェノールと酸化カップリングさせることにより、ロイ
コ色物質の２−メトキシ−４−ヒドロキシフェニルピラ
ゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イルアミン、３−ク
ロロ−４−ヒドロキシフェニルピラゾロ［１，５−ａ］
ピリジン−３−イルアミン、３−フルオロ−４−ヒドロ
キシフェニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イ
ルアミンおよび２−メチル−４−ヒドロキシフェニルピ
ラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イルアミンを得た
。Ｎ−トリフルオロアセチル化を実施例１０．５に従っ
て行った。

【０２３６】１２．１８　　　　４−ヒドロキシフェニ
ル−４，６−ジメチルピラゾロ［３，２−ｃ］−ｓ−ト
リアゾール−３−イルアミン １２．１８．１　　　　３−アミノ−４，６−ジメチル
ピラゾロ［３，２−ｃ］−ｓ−トリアゾール塩酸塩

【０
２３７】３−アミノピラゾロ−４−カルボン酸エチル（
オーガニクム、５１４頁、ベルリン、科学ＶＥＢ出版参
照）２４．４ｇを、濃塩酸１００ｍｌに懸濁させ、水５
０ｍｌ中、亜硝酸ナトリウム１０．３５ｇの溶液を添加
することにより０〜５℃にてジアゾ化した。その後、濃
塩酸１００ｍｌ中、塩化第一スズ１００ｇの溶液を加え
、該反応混合物を氷浴中にてさらに２時間撹拌した。得
られた黄色沈澱物を濾過し、水１５０ｍｌに溶かし、無
水酢酸２０ｍｌと混合した。反応混合物を８０℃の浴温
度に加熱し、全体で２時間にわたって、炭酸水素ナトリ
ウム２５ｇを少しづつ混合した。ついで、中性溶液を酢
酸エチルで２４時間連続的に抽出した。有機相を乾燥さ
せ、蒸発させた後、３−アセトヒドラジノピラゾール−
４−カルボン酸エチルエステル（Ｒｆ＝０．３３；シリ
カゲル、アセトン／塩化メチレン／氷酢酸　　５０：４
５：５　　ｖ／ｖ／ｖ）１７ｇを得、それをドイツ連邦
共和国特許明細書第１８１０４６２号の実施例６に記載
の方法に従い、オキシ塩化リンを用いて環化した。 ６−メチルピラゾロ［３，２−ｃ］−ｓ−トリアゾール
−３−カルボン酸エチルエステル４．８ｇ（収率３２％
）を得た。Ｒｆ＝０．７０；シリカゲル、トルエン／酢
酸エチル／メタノール　　２：１：１　　ｖ／ｖ／ｖ）
。

【０２３８】前記の複素環式化合物を実施例１２．３．
１に従ってメチル化し、酢酸エチル／リグロイン（２：
１　　ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル上のクロマトグラフ
ィーにより該生成物を精製した。該エステルを６Ｎ塩酸
と一緒に６時間加熱することによりケン化し、中間体と
して形成されたカルボン酸を脱炭酸した。該酸を炭酸ナ
トリウムを添加することにより中和し、該生成物を酢酸
エチルで抽出した。油状の４，６−ジメチルピラゾロ［
３，２−ｃ］−ｓ−トリアゾール１．１ｇを得た。Ｒｆ
＝０．２６；シリカゲル、酢酸エチル／リグロイン　　
１：１　　ｖ／ｖ）。

【０２３９】該複素環式化合物を実施例４．４．１に従
ってニトロソ化し、該ニトロソ基を実施例５．１と同様
にパラジウム−炭素／ヒドラジンで還元した。塩酸塩と
して標記化合物（１２．１８．１）を得た。融点１９０
℃（分解）。Ｒｆ＝０．５３；シリカゲル、酢酸エチル
／アセトン／氷酢酸／水　　５０：２５：１２．５：１
２．５ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）。

【０２４０】１２．１８．２　　　　該アミノ化合物を
、実施例４．３．２に従ってフェノールとカップリング
させて着色物質を得、それを実施例４．３．３に従って
還元し、実施例１０．５に従ってトルフルオロアセチル
化した。

【０２４１】１２．１９　　　　５−ブロモ−２−メト
キシ−４−ヒドロキシフェニル−２−メトキシピラゾロ
［１，５−ａ］ピリジン−３−イルアミン２−ブロモ−
５−メトキシフェノールから出発し、実施例１２．１．
３と同様にロイコ色物質を得た。

【０２４２】１２．２０　　　　３−クロロ−４−ヒド
ロキシフェニル−２−（２，３−ジヒドロキシプロピル
）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３−イルアミン１
２．２０．１　　　　３−アセチル−２−ヒドロキシピ
ラゾロ［１，５−ａ］ピリジン（ケミカル・アンド・フ
ァーマシューティカル・ブレチン，２３，４５２／１９
７５参照）７ｇを、ジメチルホルムアミド中、実施例１
２．３．１に従って、Ｒ，Ｓ−（２，２−ジメチル−１
，３−ジオキソラン−４−イル）−メチル−ｐ−トルエ
ンスルホネート１４．３ｇおよび塩基として水素化ナト
リウムでＯ−アルキル化した。該粗製生成物を、溶出剤
として酢酸エチル／リグロインを用いるシリカゲル上の
クロマトグラフィーにより精製した。３−アセチル−２
−（Ｒ，Ｓ−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン
−４−イル）−メトキシ）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピ
リジン１．４７ｇを得た。Ｒｆ＝０．４５ｇ；シリカゲ
ル、酢酸エチル／リグロイン　　１：１　　ｖ／ｖ）。

【０２４３】１２．２０．２　　　　実施例４．３．１
および４．３．２に従い、２−クロロフェノールとカッ
プリングさせることにより前記化合物から着色物質を得
、ニトロソ化の場合には該ケタールをクリーブし、着色
物質段階では、２個の遊離脂肪族ヒドロキシル基を触媒
としてｐ−ジメチルアミノピリジンおよび無水酢酸を用
いて保護した。

【０２４４】実施例４．３．３と同様に、該着色物質を
ロイコ色物質に還元し、実施例１０．５に従ってＮ−ト
リフルオロアセチル化した。

【０２４５】１２．２０．３　　　　実施例１２．２０
．１〜１２．２０．２と同様にして、２，５−ジクロロ
フェノールを用いてさらにまたロイコ色成分を得た。

【０２４６】１２．２１　　　　４−ヒドロキシフェニ
ル−２−メトキシ−５，７−ジメチルピラゾロ［１，５
−ａ］ピリミジン−３−イルアミン 実施例４．３．１と同様に、２−メトキシ−５，７−ジ
メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン（アン・ケム
（Ａｎｍ．Ｃｈｅｍ．），６４７，１１６／１９６１参
照）から出発し、３−アミノ−５，７−ジメチル−２−
メトキシピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン塩酸塩（融
点１８７〜１９０℃）を得、それを実施例４．３．２と
同様にフェノールとカップリングさせて着色物質を得、
それを実施例４．３．３と同様に還元し、実施例１０．
５と同様にトリフルオロアセチル化した。

【０２４７】実施例１３ 実施例１１と同様にして、以下の表９に示す化合物を得
た：

【表９】

【０２４８】実施例１４ ４−（２−メチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリジン−３
−イルアミン）−フェニル−β−Ｄ−ガラクトシド

【化
６５】

【０２４９】実施例１．２および１．３と同様に、実施
例４．３にて得られたロイコ色物質と２，３，４，６−
テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトシルブロミド
を用い、標記化合物を得た。融点１３７℃。Ｒｆ＝０．
５（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール　
　１：１：１ｖ／ｖ／ｖ）。

【０２５０】実施例１５ 白血球エステラーゼ測定用試験ストリップ（白血球試験
） シュライヒャー＆シュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓ
ｃｈｕｅｌｌ）社の濾紙（２３ＳＬ）を連続的に以下の
溶液で含浸させ、乾燥させた： １．ホウ酸塩緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　
　　５０ｍＭ／リットル、ｐＨ８ ２．実施例８の指示薬／メタノール　　　　　　４ｍＭ
／リットル

【０２５１】６０μｍのフィラミント厚のナイロンメッ
シュ（スイス、チューリッヒのチューリッヒャー・ボイ
テルトゥクファブリク（ＺｕｅｒｉｃｈｅｒＢｅｕｔｅ
ｌｔｕｃｈｆａｂｒｉｋ）社のＮＹ７５ＨＣ）を５０ｍ
Ｍ／リットルのヨウ素酸カリウム溶液で含浸させ、乾燥
させた。

【０２５２】緩衝剤および指示薬で含浸させた濾紙（１
）、ヨウ素酸塩ファブリック（２）、カバーメッシュ（
３）とナイロン（ＮＹ７５ＨＣ）製の剛性プラスチック
フィルム（４）から、添付図面の図５と同様の試験スト
リップを製造した。

【０２５３】実施例１６ アルカリ性ホスファターゼの測定 ａ）試験ストリップ 実施例１５の記載と同様に、シュライヒャー＆シュール
社の濾紙（２３ＳＬ）を： １．ヘペス（ｈｅｐｅｓ）緩衝液　　　　　　　　　　
　５０ｍＭ／リットル、ｐＨ７．５ ２．実施例９の指示薬／メタノール　　　　　　４ｍＭ
／リットル で含浸させ、乾燥させて、実施例１５の記載に従って製
造したヨウ素酸塩ファブリックのメッシュでカバーした
。

【０２５４】かかる試験ストリップをアルカリ性ホスフ
ァターゼ溶液に浸すと、無色から青色へと着色が生じた
。１７６Ｕ／リットルの活性が５分後の着色により認め
られた。

【０２５５】ｂ）湿式化学測定 ヘペス緩衝液（５０ｍＭ／リットル）（ｐＨ７．５）中
、４ｍＭ／リットルの実施例９の基質の溶液９００μｌ
を用いた。その中に： １．２２０ｍＭ／リットルのヨウ素酸カリウム溶液１０
０μｌ、および ２．アルカリ性ホスファターゼ含有溶液１００μｌをピ
ペットで移し、混合し、５７３ｎｍの波長で速度を測定
した。添付図面の図６の検量線は、公知の酵素含有溶液
を用いて作成することができる。この検量線に関しては
、ブランク値（酵素不含方法における値）を減じた。

【０２５６】実施例１７ β−Ｄ−ガラクトシダーゼの測定 ５０ｍＭ／リットルのヘペス緩衝液（ｐＨ７．５）中、
４ｍＭ／リットルの実施例１４の基質の溶液９００μｌ
をキュベット中に入れ、その中に： １．２２０ｍＭ／リットルのヨウ素酸カリウム溶液１０
０μｌ、および ２．β−Ｄ−ガラクトシダーゼ含有溶液１００μｌをピ
ペットで移し、混合し、５６０ｎｍの波長で速度を測定
した。添付図面の図７の検量線は、公知のβ−ガラクト
シダーゼ含有溶液を用いて得ることができる。

【０２５７】実施例１８ Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧａ
ｓｅ）の測定用試験ストリップ シュライヒャー＆シュール社の濾紙（２３ＳＬ）を連続
的に以下の溶液で含浸させ、乾燥させた：１．クエン酸
塩緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　２００ｍＭ
／リットル、ｐＨ５ ２．メタノール中、１０ｍＭ／リットルの指示薬および
４ｍＭ／リットルのフェニルセミカルバジド

【０２５８
】６０μｍのフィラミント厚のナイロンメッシュ（スイ
ス、チューリッヒのチューリッヒャー・ボイテルトゥク
ファブリク社のＮＹ７５ＨＣ）を４ｍＭ／リットルのヨ
ウ素酸カリウム水溶液で含浸させ、乾燥させた。

【０２５９】緩衝剤および指示薬で含浸させた濾紙（１
）、ヨウ素酸塩ファブリック（２）、カバーメッシュ（
３）（ナイロンＮＹ７５ＨＣ）と剛性プラスチックフィ
ルム（４）から、添付図面の図５と同様の試験ストリッ
プを製造した。

【０２６０】かかる試験ストリップをＮＡＧａｓｅ含有
溶液（２０Ｕ／リットル）に浸すと、該ストリップの着
色が生じた。表１０に、着色を付与する指示薬を示す：

【表１０】

【図面の簡単な説明】

【図１】　　実施例４ｅの基質を用いる、λｍａｘ５６
０ｎｍでのβ−ＮＡＧａｓｅ測定用検量線を示す。

【図２】　　実施例４ｇの基質を用いる、λｍａｘ５７
３ｎｍでのβ−ＮＡＧａｓｅ測定用検量線を示す。

【図３】　　実施例４ｈの基質を用いる、λｍａｘ５２
５ｎｍでのβ−ＮＡＧａｓｅ測定用検量線を示す。

【図４】　　実施例５の基質を用いる、λｍａｘ５６５
ｎｍでのβ−ＮＡＧａｓｅ測定用検量線を示す。

【図５】　　緩衝液および指示薬含有の濾紙、酸化剤含
有のメッシュ、カバーメッシュおよびプラスチックフィ
ルムからなる試験キャリアーを示す。

【図６】　　実施例９の基質を用いる、λｍａｘ５７３
ｎｍでのアルカリ性ホスファターゼ測定用検量線を示す
。

【図７】　　実施例１４の基質と用いる、λｍａｘ５６
０ｎｍでのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ測定用検量線を示
す。

【符号の説明】

１・・・濾紙、 ２・・・メッシュ、 ３・・・カバーメッシュ、 ４・・・プラスチックフィルム、 ５・・・溶融接着手段。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　式： 【化１】 ［式中、Ｇは有機または無機酸の残基またはグリコシド
   残基；Ｒ１およびＲ２は、同一または異なり、水素また
   はハロゲン原子、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２またはこれら酸
   残基の塩、ヒドロキシル、ニトロ、カルボキシル、カル
   ボキシアミドまたはシアノ、または所望により１つ以上
   のヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、シアノ、Ｓ
   Ｏ３ＨまたはＰＯ３Ｈ２またはこれら酸残基の１つの塩
   により置換されていてもよいアルキル、アルケニル、ア
   ルコキシ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル
   、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、アリー
   ルまたはアラルキル、または２つの置換基が隣接する炭
   素原子上にある場合、一緒になって、所望により１つ以
   上のＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２またはこれら酸基の塩、アル
   キルおよび／またはカルボキシル基により置換されてい
   てもよい１，４−ブタジエンジイル基であり；Ｒ３は水
   素原子、−ＣＯ−ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ２また
   はこれら酸基の塩、所望により１つ以上ハロゲン、ＣＯ
   ＯＨ、ＳＯ３Ｈおよび／またはＰＯ３Ｈ２またはこれら
   酸基の塩により置換されていてもよいアルキルカルボニ
   ル基、または所望により１つ以上のＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ
   ２またはこれら酸基の塩により置換されていてもよいア
   リールカルボニル基；およびＬは、式： 【化２】 （式中、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なり、アルキ
   ルであるか、または一緒になって、酸素、硫黄または窒
   素を有していてもよい３〜６員の飽和炭化水素鎖であり
   、該アルキルまたは炭化水素鎖は、所望により１つ以上
   のヒドロキシル、カルボキシル、アルコキシカルボニル
   、アルコキシ、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈ２、これら酸基
   の１つの塩またはハロゲンにより置換されていてもよく
   ；Ｒ６およびＲ７は、同一または異なっていてもよく、
   水素またはハロゲン原子、ヒドロキシルまたはカルボキ
   シアミド、または所望により１つ以上のヒドロキシル、
   カルボキシル、ハロゲン、ＳＯ３ＨまたはＰＯ３Ｈ２ま
   たはこれら酸基の１つの塩により置換されていてもよい
   アルキル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルコキ
   シカルボニル、アリールまたはアラルキル基を意味する
   ）で示される基であるか、またはＬは、式： 【化３】 （式中、Ｘ−ＹはＮＲ８−ＣＯまたはＮ＝ＣＲ９を意味
   し、ここでＲ８は水素原子またはアルキル基であり、Ｒ
   ９はアルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ
   、アリール、アラルキルで、各々、所望によりヒドロキ
   シル、ジアルキルホスフィニル、カルボキシル、ＳＯ３
   Ｈ、ＰＯ３Ｈ２、これら酸基の１つの塩および／または
   アルコキシカルボニルにより置換されていてもよく、ア
   ミノ、該基は、所望により１または２個のアルキル基に
   より置換されていてもよく、該アルキル基は、所望によ
   り１つ以上のヒドロキシル、カルボキシルおよび／また
   はアルコキシカルボニル基により置換されていてもよく
   、アミノが２個のアルキル基により置換されている場合
   、これらの基は一緒になって環を形成することができ、
   それはアミノ基の窒素原子とは別に、さらに所望により
   酸素、硫黄またはさらなる窒素原子を有していてもよく
   、またはアミノは、所望により１または２個のアシル基
   、アルコキシ−および／またはアラルコキシカルボニル
   基、Ｈ２Ｎ−ＣＯ、アルキル−、アラルキル−および／
   またはアリールカルバモイル基により置換されていても
   よく、または水素、カルボキシル、アルコキシカルボニ
   ル、カルボキシアミドまたはハロゲンであり；ＺはＮＲ
   １０−Ｎ＝Ｎを意味し、該Ｒ１０は水素原子またはアル
   キルまたはアラルキル基であるか、またはＺは窒素原子
   または炭素原子を、所望により１以上の窒素または硫黄
   原子を含有していてもよい３〜５員の不飽和鎖であり、
   該炭素原子は、所望によりアルキル、アルコキシ、ヒド
   ロキシアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシル、アラル
   キル、アリール、カルボキシル、カルボキシアミド、ア
   ルコキシカルボニル、シアノ、所望により１または２個
   のアルキル基により置換されていてもよいアミノ（該ア
   ルキル置換基は、所望により１以上のヒドロキシル、カ
   ルボキシルおよび／またはアルコキシカルボニル基によ
   り置換されていてもよく）、および／またはハロゲンに
   より置換されていてもよく、ならびに二重結合を介して
   結合していない窒素は、所望によりアルキルまたはアラ
   ルキルにより置換されていても、または２つの隣接する
   鎖置換基は、所望によりアルキレン基を形成してもよく
   、次に、所望により、アリールおよび対応する互変異性
   体で置換されているかまたは縮合（ａｎｅｌｌａｔｅ）
   されていてもよい）で示されるピラゾロ複素環基を意味
   する；ただし、Ｇがアルカンカルボン酸基で、Ｒ３が水
   素原子、所望により１以上のハロゲンにより置換されて
   いてもよいアリールカルボニル基またはアルキルカルボ
   ニル基で、Ｌが式（ＩＩＩ）のピラゾロ複素環基であっ
   て、ここでＸ−ＹがＮ＝ＣＲ９（Ｒ９は前記と同じ）で
   ある場合、その場合、Ｚは二重結合を介して結合してい
   ない窒素原子が水素により置換されている１，２，４−
   トリアゾール環を形成しない］で示されるＮ−およびＯ
   −置換アミノフェノール誘導体。
2. 【請求項２】　　Ｇがガラクトシド、グリコシド、マン
   ノシド、Ｎ−アセチルグルコサミニドまたは２〜１０の
   モノサッカリド単位を有するオリゴサッカリド基である
   請求項１記載の化合物。
3. 【請求項３】　　ＧがＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
   ミニジル基である請求項１記載の化合物。
4. 【請求項４】　　ＧがＰＯ３ＭＭ’、ＳＯ３Ｍ、カルボ
   ニル結合アルカンカルボン酸、アミノ酸またはオリゴペ
   プチド残基で、ＭおよびＭ’が水素原子またはアルカリ
   金属、アルカリ土類金属またはアンモニウムイオンであ
   る請求項１記載の化合物。
5. 【請求項５】　　式： Ｇ−Ｄ　　　　　　　　　　　　　　（ＩＶ）［式中、
   Ｇは有機または無機酸の残基またはグリコシド残基であ
   り、Ｄは反応基であって、Ｇにおいて存在する官能基は
   、所望により、ペプチドおよび炭水化物化学の分野にお
   ける通常の保護基で保護されていてもよい］で示される
   化合物を、式： 【化４】 ［式中、Ｒ１〜Ｒ３およびＬは請求項１の記載と同じ、
   Ａは水素原子、所望により置換されていてもよいアンモ
   ニウムイオンまたはアルカリ金属を意味する］で示され
   る化合物と反応させ、その後、所望により、保護基を除
   去することを特徴とする請求項１記載の化合物の製造方
   法。
6. 【請求項６】　　式（ＩＶ）の化合物として、式：【化
   ５】 ［式中、Ｗはハロゲン原子、Ｒは炭水化物化学の分野に
   おいて通常のヒドロキシル保護基、Ｂはアジド基、保護
   アミノ基またはＮＨ−ＣＯＣＨ３、またはＢおよびＷは
   、一緒になって、式： 【化６】 で示される基を形成する］で示される化合物を、式：【
   化７】 ［式中、Ｒ１〜Ｒ３およびＬは請求項１の記載と同じ、
   Ａは水素原子、所望により置換されていてもよいアンモ
   ニウムイオンまたはアルカリ金属を意味する］で示され
   る化合物と反応させ、Ｂが保護アミノ基である場合、該
   アミノ保護基を除去するか、またはＢがアジド基である
   場合、これを還元することによりアミノ基に変形し、該
   アミノ基をアセチル化することにより−ＮＨＣＯＣＨ３
   基に変え、その後、ヒドロキシル保護基を除去すること
   からなる、請求項３の化合物を製造する請求項５記載の
   方法。
7. 【請求項７】　　式： 【化８】 ［式中、Ｒ１〜Ｒ３は請求項１の記載と同じ、Ｌは、式
   ：【化９】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは請求項１の記載と同じ；ただ
   し、Ｒ３が、所望により１以上のハロゲンにより置換さ
   れていてもよいアリールカルボニル基またはアルキルカ
   ルボニル基であり、Ｘ−ＹがＣ＝ＮＲ９である場合、そ
   の場合、Ｚは１，２，４−トリアゾール環を形成せず、
   そのうちの二重結合を介して結合していない窒素原子が
   水素原子により置換されている）で示されるピラゾロ複
   素環基を意味する］で示される化合物。
8. 【請求項８】　　ａ）式： 【化１０】 ［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＬは請求項７の記載と同じ］
   で示される化合物を還元し、Ｒ３が水素原子でない場合
   、アニリノ基をアシル化し、その後、所望により、存在
   するエステル結合を切断するか、または ｂ）Ｌが、式： 【化１１】 ［式中、Ｘ−Ｙ、ＧおよびＺは請求項１の記載と同じ］
   で示されるピラゾロ複素環基である請求項１記載の化合
   物を、適当なヒドロラーゼと反応させることからなる、
   請求項７の化合物の製造方法。
9. 【請求項９】　　式： 【化１２】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は請求項１の記載と同じ、Ｌは
   、式： 【化１３】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは請求項１の記載と同じ）で示
   されるピラゾロ複素環基を意味する］で示される化合物
   。
10. 【請求項１０】　　ａ）Ｌが、式： 【化１４】 ［式中、Ｘ−ＹおよびＺは請求項１の記載と同じ］で示
    されるピラゾロ複素環基である請求項１記載の化合物を
    、ヒドロラーゼと反応させ、反応生成物を酸化するか、
    または ｂ）式： ＮＨ２−Ｌ　　　　　　　　　　　（ＶＩＩＩ）［式中
    、Ｌは、式： 【化１５】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは請求項１の記載と同じ）で示
    されるピラゾロ複素環基を意味する］で示される化合物
    を、酸化剤の存在下、式： 【化１６】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は請求項１の記載と同じ、Ｖは
    水素またはハロゲン原子またはＣＯＯＨまたはＳＯ３Ｈ
    基を意味する］で示されるフェノールと反応させるか、
    または ｃ）式： Ｌ−Ｈ　　　　　　　　　　　　　　（Ｘ）［式中、Ｌ
    は、式： 【化１７】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは請求項１の記載と同じ）で示
    されるピラゾロ複素環基を意味する］で示される化合物
    を、式： 【化１８】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は請求項１の記載と同じ、Ｈａ
    ｌはハロゲン原子を意味する］で示される化合物と反応
    させるか、または ｄ）式： Ｌ−Ｅ　　　　　　　　　　　　　　（ＸＸＶ）［式中
    、Ｅはニトロまたはニトロソ基、Ｌは、式：【化１９】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは請求項１の記載と同じ）で示
    されるピラゾロ複素環基を意味する］で示される化合物
    を、式： 【化２０】 ［式中、Ｒ１およびＲ２は請求項９の記載と同じ、Ｑは
    ヒドロキシル基またはジアルキルアミノ基、Ｍｅはハロ
    ゲンで置換されたリチウム原子またはマグネシウム原子
    を意味する］で示されるオルガノ金属化合物と反応させ
    、その後、水性媒体中にて後処理することからなる、請
    求項９記載の化合物の製造方法。
11. 【請求項１１】　　実質上、前に記載され、かつ説明さ
    れている、請求項９の化合物を製造する請求項１０記載
    の方法。
12. 【請求項１２】　　色素生産性酵素基質を酵素と反応さ
    せ、該酵素により該基質から遊離したロイコ色物質（ｌ
    ｅｕｋｏ　　ｃｏｌｏｕｒｅｄ　　ｍａｔｅｒｉａｌ）
    を酸化し、酵素量測定として得られた着色物質を測定し
    、ここで請求項１記載の化合物を用いることを特徴とす
    るヒドロラーゼの比色定量測定方法。
13. 【請求項１３】　　酵素基質として請求項１記載の化合
    物を用い、酵素Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
    ーゼを測定する請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】　　色素生産性酵素基質および適当な緩
    衝物質を含有し、ここで色素生産性酵素基質として請求
    項１記載の化合物を用いるヒドロラーゼ測定用診断薬。
15. 【請求項１５】　　さらに、式： Ａｒ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯＮＨ２　　　　　　　　　　　
    　　（ＸＩＩ）［式中、Ａｒは、所望により、アルキル
    、アルコキシまたはハロゲンで置換されていてもよいア
    リール基を意味する］で示される１−アリールセミカル
    バジドを含有する請求項１４記載の診断薬。
16. 【請求項１６】　　担体結合形にて成分を含有する請求
    項１４または請求項１５記載の診断薬。