JPH0631294B2 - 新規グルコサミン誘導体、これを用いる酵素活性測定試薬及び酵素活性測定方法 - Google Patents
新規グルコサミン誘導体、これを用いる酵素活性測定試薬及び酵素活性測定方法Info
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- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
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- G—PHYSICS
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミニド誘導体、これを基質として用いる
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定試
薬及びＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性
の測定方法に関する。Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニダーゼは糖質分解酵素のひとつで生体組織中に広く
分布し、とくに腎臓に多く存在する。特に近位尿細管曲
部に高いＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活
性が認められている。
−Ｄ−グルコサミニド誘導体、これを基質として用いる
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定試
薬及びＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性
の測定方法に関する。Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニダーゼは糖質分解酵素のひとつで生体組織中に広く
分布し、とくに腎臓に多く存在する。特に近位尿細管曲
部に高いＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活
性が認められている。
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測定
は、腎移植後の拒絶反応の早期診断、急性腎不全、糸球
体腎炎等の各種腎疾患の診断及び経過観察、薬物の腎毒
性等に有用な情報を与えられるものとして臨床的意義が
高い。
は、腎移植後の拒絶反応の早期診断、急性腎不全、糸球
体腎炎等の各種腎疾患の診断及び経過観察、薬物の腎毒
性等に有用な情報を与えられるものとして臨床的意義が
高い。
［従来の技術及び課題］ 従来、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以
下NAGと略する）活性の測定方法としては、Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミンの還元末端にｐ−ニトロフエ
ノールを結合させた基質を用いてNAGを作用させ、遊離
してくるｐ−ニトロフエノールをアルカリ性下で比色す
る方法が一般的である（Methods Engymol.,28,702(197
2)）。
下NAGと略する）活性の測定方法としては、Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコサミンの還元末端にｐ−ニトロフエ
ノールを結合させた基質を用いてNAGを作用させ、遊離
してくるｐ−ニトロフエノールをアルカリ性下で比色す
る方法が一般的である（Methods Engymol.,28,702(197
2)）。
ところがこの方法では、尿ブランクの測定が必要であ
り、また、呈色物質の分子吸光係数が比較的小さく、分
析感度を上げるためには長時間の反応が必要であるとい
つた問題点が挙げられる。
り、また、呈色物質の分子吸光係数が比較的小さく、分
析感度を上げるためには長時間の反応が必要であるとい
つた問題点が挙げられる。
その他、Ｎ−アセチルグルコサミンに４−メチルウンベ
リフエロンを結合させた基質を用いる方法（Clin.Chim.
Acta.,24,189(1969)）も用いられているが、基質の溶解
度が低くKm値以下の基質濃度で反応を行なうために尿中
の阻害物質の影響を受けやすいうえ、ｐ−ニトロフエノ
ールを用いる方法同様に尿ブランクを測定する必要があ
るといつた問題点が挙げられる。
リフエロンを結合させた基質を用いる方法（Clin.Chim.
Acta.,24,189(1969)）も用いられているが、基質の溶解
度が低くKm値以下の基質濃度で反応を行なうために尿中
の阻害物質の影響を受けやすいうえ、ｐ−ニトロフエノ
ールを用いる方法同様に尿ブランクを測定する必要があ
るといつた問題点が挙げられる。
さらにブランクテストを行なわなくてもよいように改良
した基質としてｍ−クレゾールスルホフタリルＮ−アセ
チル−β−Ｄ−グリコサミニドが知られている（特開昭
58-994、特公昭63-7169）。しかし、これらは反応停止
剤試薬を加え、アルカリ性で発色させて測定するエンド
ポイント法を用いるため、２試薬法で測定する必要があ
り時間もかかるので、自動化するための機種を限定され
るなどの欠点がある。
した基質としてｍ−クレゾールスルホフタリルＮ−アセ
チル−β−Ｄ−グリコサミニドが知られている（特開昭
58-994、特公昭63-7169）。しかし、これらは反応停止
剤試薬を加え、アルカリ性で発色させて測定するエンド
ポイント法を用いるため、２試薬法で測定する必要があ
り時間もかかるので、自動化するための機種を限定され
るなどの欠点がある。
上記の欠点を改良して酵素反応進行中の一定時間間隔の
NGA活性の吸光度差を測定するレート法で測定できる基
質として２−クロロ−４−ニトロフエニルＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニドや４−クロロ−２−ニトロフ
エニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドが知られ
ている（特開昭61-112092）。しかし、これらは基質の
溶解度が低くKm値以下の基質濃度で反応を行なうため尿
中の阻害物質の影響を受けやすい。
NGA活性の吸光度差を測定するレート法で測定できる基
質として２−クロロ−４−ニトロフエニルＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニドや４−クロロ−２−ニトロフ
エニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドが知られ
ている（特開昭61-112092）。しかし、これらは基質の
溶解度が低くKm値以下の基質濃度で反応を行なうため尿
中の阻害物質の影響を受けやすい。
比色法における尿ブランクは主としてビリルビンとヘモ
グロビンに由来しているため尿ブランクの測定を省略す
るためには、測定波長をこれらの物質の干渉のない540
ｎｍ以上の領域に設定する必要がある。
グロビンに由来しているため尿ブランクの測定を省略す
るためには、測定波長をこれらの物質の干渉のない540
ｎｍ以上の領域に設定する必要がある。
［課題を解決する為の手段］ 本発明者等はこれらの問題点を解決するため種々研究し
た結果、フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニド誘導体を基質として含んだ測定液を使
用して、試料中のNAGの活性を正確簡単に得ることに成
功した。
た結果、フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニド誘導体を基質として含んだ測定液を使
用して、試料中のNAGの活性を正確簡単に得ることに成
功した。
すなわち、本発明はフエニルアゾナフトール誘導体が還
元末端にβ−結合した一般式[I] （式中、Ｒ１〜３のうち少なくとも一つはスルホン酸基
またはアルカリ金属スルホネート基を、残りはハロゲ
ン、メトキシ基、ニトロ基または水素原子を示す。）で
表わされる新規フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミニド誘導体；基質として一般式[I]
で表わされるフエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミニド誘導体を含むＮ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定試薬；及び一般式[I]
で表わされる新規フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニド誘導体を含む測定試薬を緩衝
液で溶解し、これに検体を加えてインキユベートし、生
成するフエニルアゾナフトール誘導体をアルカリ溶液で
発色させて比色定量することを特徴とするＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測定方法である。
元末端にβ−結合した一般式[I] （式中、Ｒ１〜３のうち少なくとも一つはスルホン酸基
またはアルカリ金属スルホネート基を、残りはハロゲ
ン、メトキシ基、ニトロ基または水素原子を示す。）で
表わされる新規フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミニド誘導体；基質として一般式[I]
で表わされるフエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミニド誘導体を含むＮ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定試薬；及び一般式[I]
で表わされる新規フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニド誘導体を含む測定試薬を緩衝
液で溶解し、これに検体を加えてインキユベートし、生
成するフエニルアゾナフトール誘導体をアルカリ溶液で
発色させて比色定量することを特徴とするＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測定方法である。
本発明のNAG活性測定に用いる基質は一般式[I]で示され
る化合物、すなわちＮ−アセチルグルコサミンがその還
元性末端で置換芳香族化合物とβ−結合したものであ
る。一般式[I]におけるアリカリ金属スルホネート基と
しては、ナトリウムスルホネート、カリウムスルホネー
トなどが、ハロゲンとしてはフツ素、塩素、臭素などが
挙げられる。
る化合物、すなわちＮ−アセチルグルコサミンがその還
元性末端で置換芳香族化合物とβ−結合したものであ
る。一般式[I]におけるアリカリ金属スルホネート基と
しては、ナトリウムスルホネート、カリウムスルホネー
トなどが、ハロゲンとしてはフツ素、塩素、臭素などが
挙げられる。
（式中、Ｒ１〜３のうち少なくとも一つはスルホン酸基
またはアルカリ金属スルホネート基を、残りはハロゲ
ン、メトキシ基、ニトロ基または水素原子を示す。） 上記の置換芳香族化合物は、NAGとその基質である一般
式[I]の化合物とが反応して該基質が解裂して生成する
アグリコンに相当し、基質とは異なつたスペクトル吸収
を示す置換芳香族化合物である。
またはアルカリ金属スルホネート基を、残りはハロゲ
ン、メトキシ基、ニトロ基または水素原子を示す。） 上記の置換芳香族化合物は、NAGとその基質である一般
式[I]の化合物とが反応して該基質が解裂して生成する
アグリコンに相当し、基質とは異なつたスペクトル吸収
を示す置換芳香族化合物である。
基質が解裂して生成するアグリコンとは具体的には次の
一般式[II]（Ｒ１〜３は前記のものと同じ）で示される
フエニルアゾナフトール誘導体である。
一般式[II]（Ｒ１〜３は前記のものと同じ）で示される
フエニルアゾナフトール誘導体である。
これらのフエニルアゾナフトール誘導体としては、例え
ば、４−フエニルアゾ−１−ナフトール−４′−スルホ
ン酸，４−フエニルアゾ−１−ナフトール−４′−ニト
ロ−２′−スルホン酸，４−（４′−メトキシフエニル
アゾ）−１−ナフトール−５−スルホン酸，４−（４′
−ニトロフエニルアゾ）−１−ナフトール−５−スルホ
ン酸，４−（２′−クロロ−４′−ニトロフエニルア
ゾ）−１−ナフトール−５−スルホン酸などと、これら
のアルカリ金属塩が挙げられる。
ば、４−フエニルアゾ−１−ナフトール−４′−スルホ
ン酸，４−フエニルアゾ−１−ナフトール−４′−ニト
ロ−２′−スルホン酸，４−（４′−メトキシフエニル
アゾ）−１−ナフトール−５−スルホン酸，４−（４′
−ニトロフエニルアゾ）−１−ナフトール−５−スルホ
ン酸，４−（２′−クロロ−４′−ニトロフエニルア
ゾ）−１−ナフトール−５−スルホン酸などと、これら
のアルカリ金属塩が挙げられる。
第１図に(a)４−フエニルアゾ−１−ナフトール−４′
−ニトロ−２′−スルホン酸ナトリウム塩（フエニルア
ゾナフトール誘導体：色素）と(b)４−（４′−ニトロ
−２′−スルホフエニルアゾ）−１−ナフチル−Ｎ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサニミド−ナトリウム塩（基
質）のUVスペクトルを、第２図に(c)４−フエニルアゾ
−１−ナフトール−４′−スルホン酸ナトリウム塩（フ
エニルアゾナフトール誘導体：色素）と(d)４−（４′
−スルホフエニルアゾ）−１−トフチル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニド−ナトリウム塩（基質）のUV
スペクトルを示す。第１図及び第２図から明らかなよう
に、色素(a)及び(c)の吸収ピークを示す波長では、それ
らに対応する基質(b)及び(d)の吸収は極めて微弱であ
る。
−ニトロ−２′−スルホン酸ナトリウム塩（フエニルア
ゾナフトール誘導体：色素）と(b)４−（４′−ニトロ
−２′−スルホフエニルアゾ）−１−ナフチル−Ｎ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサニミド−ナトリウム塩（基
質）のUVスペクトルを、第２図に(c)４−フエニルアゾ
−１−ナフトール−４′−スルホン酸ナトリウム塩（フ
エニルアゾナフトール誘導体：色素）と(d)４−（４′
−スルホフエニルアゾ）−１−トフチル−Ｎ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニド−ナトリウム塩（基質）のUV
スペクトルを示す。第１図及び第２図から明らかなよう
に、色素(a)及び(c)の吸収ピークを示す波長では、それ
らに対応する基質(b)及び(d)の吸収は極めて微弱であ
る。
これら基質の合成方法は、下の反応式に示す通りであ
る。即ち、Ｎ−アセチルグルコサミンをアセチル化し、
このアセチル化されたＮ−アセチルグルコサミンと置換
芳香族化合物、アグリコンを結合させた後、脱アセチル
することにより合成するか（実験化学講座24,304,195
8）、又はアセチル化されたＮ−アセチルグルコサミン
をハロゲン化し、次いでそのハロゲン化物と置換芳香族
化合物、アグリコンをエーテル結合させたあと、脱アセ
チルすることにより合成することができる （Methods in Carbohydrate Chemistry II,334）。
る。即ち、Ｎ−アセチルグルコサミンをアセチル化し、
このアセチル化されたＮ−アセチルグルコサミンと置換
芳香族化合物、アグリコンを結合させた後、脱アセチル
することにより合成するか（実験化学講座24,304,195
8）、又はアセチル化されたＮ−アセチルグルコサミン
をハロゲン化し、次いでそのハロゲン化物と置換芳香族
化合物、アグリコンをエーテル結合させたあと、脱アセ
チルすることにより合成することができる （Methods in Carbohydrate Chemistry II,334）。
本発明のNAG活性測定試薬に用いる緩衝液は体液などの
検体中のNAGの至適pH4.0〜6.0を保つものであれば、い
かなるものでも良い。例えば、クエン酸緩衝液やその他
の有機酸緩衝液が挙げられる。又、必要により界面活性
剤、防腐剤、塩化ナトリウム、安定化剤等を含有しても
良い。
検体中のNAGの至適pH4.0〜6.0を保つものであれば、い
かなるものでも良い。例えば、クエン酸緩衝液やその他
の有機酸緩衝液が挙げられる。又、必要により界面活性
剤、防腐剤、塩化ナトリウム、安定化剤等を含有しても
良い。
本発明は先に述べた通りNAG活性を測定するものであ
り、試料中のNAGとその基質であるフエニルアゾナフチ
ル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド誘導体とを
インキユベートして酵素反応を行わせ、遊離するフエニ
ルアゾナフトール誘導体をアルカリ溶液で発色させて比
色定量し、試料中のNAG活性を測定するものである。
り、試料中のNAGとその基質であるフエニルアゾナフチ
ル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド誘導体とを
インキユベートして酵素反応を行わせ、遊離するフエニ
ルアゾナフトール誘導体をアルカリ溶液で発色させて比
色定量し、試料中のNAG活性を測定するものである。
本発明の測定方法はレート法、エンドポイント法のいず
れでも測定できる。即ち、酵素反応進行中の一定時間間
隔の吸光度差を測定するレート法が反応停止液を加えて
測定するエンドポイント法でも測定することができる。
又、遊離するフエニルアゾナフトール誘導体の吸収波長
が500〜600ｎｍであり、生体試料中の夾雑物による測定
上の影響をほとんど受けないので、本発明のNAG活性測
定試薬を用いることにより正確な測定結果が得られる。
れでも測定できる。即ち、酵素反応進行中の一定時間間
隔の吸光度差を測定するレート法が反応停止液を加えて
測定するエンドポイント法でも測定することができる。
又、遊離するフエニルアゾナフトール誘導体の吸収波長
が500〜600ｎｍであり、生体試料中の夾雑物による測定
上の影響をほとんど受けないので、本発明のNAG活性測
定試薬を用いることにより正確な測定結果が得られる。
しかも第１図及び第２図から明らかなように、色素(a)
及び(c)の吸収ピークを示す波長では基質(b)及び(d)の
吸収は極めて微弱であるから、前記吸収ピークを示す波
長で反応を追跡すれば、基質の減少を正確に追うことが
できる。
及び(c)の吸収ピークを示す波長では基質(b)及び(d)の
吸収は極めて微弱であるから、前記吸収ピークを示す波
長で反応を追跡すれば、基質の減少を正確に追うことが
できる。
［実施例］ 以下に実施例および実験例によりさらに詳細に説明する
が、本発明はこれによつて限定されるものではない。
が、本発明はこれによつて限定されるものではない。
実施例１ ４−（４′−ニトロ−２′−スルホフエニルアゾ）−１
−ナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサニミド−
ナトリウム塩の合成 ａ） クロロホルム75ml中の2,3,4,6−テトラアセチル
グルコサミンクロライド9.3g（25.3ミリモル）の溶液を
60℃に加温する。この温度で１Ｎ−カセイソーダ25.3ml
のトリエチルベンジルアンモニウムクロライド3.4g（1
2.6ミリモル）と４−（４′−ニトロ−２′−スルホフ
エニルアゾ）−１−ナフトール5.0g（12.6ミリモル）の
溶液を添加する。反応混合液を６時間還流させ、その後
室温で一晩攪拌する。有機相を分離し水相を数回クロロ
ホルムで振とうする。出発物質を除去するために、合し
た有機相を0.1Ｎ−カセイソーダ水で数回振とうする。
クロロホルム相を水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥後、
有機溶剤を濃縮する。残渣をエーテルに落とすと４−
（４′−ニトロ−２′−スルホフエニルアゾ）−１−ナ
フチル−2,3,4,6−テトラアセチルグルコサミニド−ナ
トリウム塩2.8gが得られる。
−ナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサニミド−
ナトリウム塩の合成 ａ） クロロホルム75ml中の2,3,4,6−テトラアセチル
グルコサミンクロライド9.3g（25.3ミリモル）の溶液を
60℃に加温する。この温度で１Ｎ−カセイソーダ25.3ml
のトリエチルベンジルアンモニウムクロライド3.4g（1
2.6ミリモル）と４−（４′−ニトロ−２′−スルホフ
エニルアゾ）−１−ナフトール5.0g（12.6ミリモル）の
溶液を添加する。反応混合液を６時間還流させ、その後
室温で一晩攪拌する。有機相を分離し水相を数回クロロ
ホルムで振とうする。出発物質を除去するために、合し
た有機相を0.1Ｎ−カセイソーダ水で数回振とうする。
クロロホルム相を水洗し、硫酸マグネシウムで乾燥後、
有機溶剤を濃縮する。残渣をエーテルに落とすと４−
（４′−ニトロ−２′−スルホフエニルアゾ）−１−ナ
フチル−2,3,4,6−テトラアセチルグルコサミニド−ナ
トリウム塩2.8gが得られる。
赤色無定形粉末（収率：理論量の31％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（展開溶媒ｎ−ブチ
ルアルコール：酢酸：水＝４：１：１v/v）：Rf＝0.78 ｂ） 無水メタノール20mlにａ）で得たテトラアセチル
グルコサミニド2.8g（3.9ミリモル）を溶かした溶液を
０〜５℃に冷却する。脱アセチル化するために、この温
度で攪拌下にナトリウムメチラートの28％メタノール溶
液0.46ml（２ミリモル）を添加する。０〜５℃で１時間
攪拌後、500ml乾燥エーテルに落とし、生成物を析出さ
せる。生成物を濾取し、エーテルで洗浄後、減圧乾燥し
てからカラムクロマトグラフイーにより精製を行う。0.
7gの４−（４′−ニトロ−２′−スルホフエニルアゾ）
−１−ナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ド−ナトリウム塩が得られる。
ルアルコール：酢酸：水＝４：１：１v/v）：Rf＝0.78 ｂ） 無水メタノール20mlにａ）で得たテトラアセチル
グルコサミニド2.8g（3.9ミリモル）を溶かした溶液を
０〜５℃に冷却する。脱アセチル化するために、この温
度で攪拌下にナトリウムメチラートの28％メタノール溶
液0.46ml（２ミリモル）を添加する。０〜５℃で１時間
攪拌後、500ml乾燥エーテルに落とし、生成物を析出さ
せる。生成物を濾取し、エーテルで洗浄後、減圧乾燥し
てからカラムクロマトグラフイーにより精製を行う。0.
7gの４−（４′−ニトロ−２′−スルホフエニルアゾ）
−１−ナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ド−ナトリウム塩が得られる。
赤色無定形粉末（収率：理論量の16％） 融点：120−124℃（分解） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（展開溶媒ｎ−ブチ
ルアルコール：酢酸：水＝４：１：１v/v）：Rf＝0.32 実施例２ 実施例１と同様にして、下記のフエニルアゾナフトール
誘導体をテトラアセチルグルコサミンクロライドと反応
させてそれぞれ対応する基質を合成することができる。
ルアルコール：酢酸：水＝４：１：１v/v）：Rf＝0.32 実施例２ 実施例１と同様にして、下記のフエニルアゾナフトール
誘導体をテトラアセチルグルコサミンクロライドと反応
させてそれぞれ対応する基質を合成することができる。
実験例１ 測定の実施 ａ） 使用する溶液の調製 緩衝溶液 クエン酸 25mM水溶液 クエン酸ナトリウム 25mM水溶液 上記二試液を混合してpH4.2に調製する。
試薬溶液１ ４−（４′−ニトロ−２′−スルホンフエニルアゾ）−
１−ナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
−ナトリウム塩を0.5mM濃度で緩衝溶液に溶解する。
１−ナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
−ナトリウム塩を0.5mM濃度で緩衝溶液に溶解する。
試薬溶液２ ジエタノールアミン １Ｍ 塩化マグネシウム 0.5mM pH値（塩酸で調製） 10.5（25℃） 酵素溶液 市販のNAGを緩衝溶液に溶かす。この溶液の活性は約100
U/である。
U/である。
ｂ） 測定方法 エンドポイント法によりNAG活性を測定した。試薬溶液
１を１ml取り37℃で５分間加温した後、酵素溶液0.1ml
加え混合する。37℃で５分間反応した後、試薬溶液２を
２ml添加し、アルカリ条件下にして反応を停止させる。
５分間静置した後600ｎｍで吸光度を測定する（基質ブ
ランクは酵素溶液の代りに水を用いる）。
１を１ml取り37℃で５分間加温した後、酵素溶液0.1ml
加え混合する。37℃で５分間反応した後、試薬溶液２を
２ml添加し、アルカリ条件下にして反応を停止させる。
５分間静置した後600ｎｍで吸光度を測定する（基質ブ
ランクは酵素溶液の代りに水を用いる）。
酵素溶液を生理食塩水で10段階に希釈した例の測定値を
記載する。
記載する。
第３図にNAG希釈濃度とOD値との関係を示した。この結
果は原点を通過するきれいな直線を示した。この事実は
NAG活性とODとが比例関係にあることをあらわすととも
に、この新規なNAG活性測定方法の実用性及び有用性を
示している。
果は原点を通過するきれいな直線を示した。この事実は
NAG活性とODとが比例関係にあることをあらわすととも
に、この新規なNAG活性測定方法の実用性及び有用性を
示している。
実験例２ 測定の実施 ａ） 使用する溶液の調製 緩衝溶液 クエン酸 50mM水溶液 クエン酸ナトリウム 50mM水溶液 上記二試液を混合してpH5.0に調製する。
試薬溶液 ４−（４′−スルホフエニルアゾ）−１−ナフチル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド−ナトリウム塩を
２mM濃度で水に溶解する。
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド−ナトリウム塩を
２mM濃度で水に溶解する。
酵素溶液 市販のNAGを緩衝溶液に溶かす。この溶液の活性は約200
U/である。
U/である。
ｂ） 測定方法 レートアツセイ法によりNAG活性を測定した。緩衝溶液
を1.5mlと試薬溶液0.2mlとり37℃で30秒間加温した後、
酵素溶液25μｌを加え攪拌後、分光光度計で505ｎｍに
おける吸光度の増加を測定する。
を1.5mlと試薬溶液0.2mlとり37℃で30秒間加温した後、
酵素溶液25μｌを加え攪拌後、分光光度計で505ｎｍに
おける吸光度の増加を測定する。
酵素溶液を生理食塩水で５段階に希釈した例の測定値を
記載する。
記載する。
第４図はNAG及び希釈NAGにおけるタイムコースを各２度
測定した結果である。第４図からわかるように、5/5は
８分まで、それ以外の各NAGにおいて10分までは直線性
を示し、少なくとも200U/まではレートアツセイ法が
適用できることを示している。
測定した結果である。第４図からわかるように、5/5は
８分まで、それ以外の各NAGにおいて10分までは直線性
を示し、少なくとも200U/まではレートアツセイ法が
適用できることを示している。
また、第５図にNAG希釈濃度とΔODとの関係を示した。
この結果は原点を通過するきれいな直線を示した。この
事実はNAG活性とΔODとが比例関係にあることをあらわ
すとともに、この新規なNAG活性測定方法の実用性およ
び有用性を示している。
この結果は原点を通過するきれいな直線を示した。この
事実はNAG活性とΔODとが比例関係にあることをあらわ
すとともに、この新規なNAG活性測定方法の実用性およ
び有用性を示している。
［発明の効果］ 本発明のNAG活性測定法は種々の点で従来法の問題点が
解決されている。本発明の利点を記すと次のごとくであ
る。
解決されている。本発明の利点を記すと次のごとくであ
る。
(1) 基質の水溶性が高く、反応液中で任意の基質濃度
に設定することができ、尿中の阻害物質の影響を受けず
に反応が行なえる。
に設定することができ、尿中の阻害物質の影響を受けず
に反応が行なえる。
(2) 測定波長が500〜600ｎｍであるため生体試料中の
夾雑物の影響をほとんど受けないので、試料ブランクの
測定が省略できる。そのため正確な測定結果が得られ
る。
夾雑物の影響をほとんど受けないので、試料ブランクの
測定が省略できる。そのため正確な測定結果が得られ
る。
(3) 呈色物質に分子吸光係数が比較的大きなアゾ色素
を用いているため短時間でも測定が可能である。
を用いているため短時間でも測定が可能である。
(4) 用いる色素の種類によつてエンドポイント法だけ
でなく、レート法でも測定することができる。
でなく、レート法でも測定することができる。
以上のごとく、本発明のNAG活性測定方法は、従来法の
有する問題点を解決し、正確かつ簡単にNAG活性を測定
できるものである。
有する問題点を解決し、正確かつ簡単にNAG活性を測定
できるものである。
従つて本発明のNAG活性測定法は、正常人、腎障害を有
する患者等の尿中NAG活性を測定する方法として極めて
有用である。
する患者等の尿中NAG活性を測定する方法として極めて
有用である。
第１図はａ）４−フエニルアゾ−１−ナフトール−４′
−ニトロ−２′−スルホン酸ナトリウム塩及びｂ）４−
（４′−ニトロ−２′−スルホフエニルアゾ）−１−ナ
フチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、ナト
リウム塩のUVスペクトル図である。第２図はｃ）４−フ
エニルアゾ−１−ナフトール−４′−スルホン酸ナトリ
ウム塩及びｄ）４−（４′−スルホフエニルアゾ）−１
−ナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド−
ナトリウム塩のUVスペクトル図である。第３図は希釈NA
GとODとの関係を示すグラフである。第４図は希釈NAGに
よるタイムコースを示す。第５図は希釈NAGとΔODの関
係を示すグラフである。
−ニトロ−２′−スルホン酸ナトリウム塩及びｂ）４−
（４′−ニトロ−２′−スルホフエニルアゾ）−１−ナ
フチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、ナト
リウム塩のUVスペクトル図である。第２図はｃ）４−フ
エニルアゾ−１−ナフトール−４′−スルホン酸ナトリ
ウム塩及びｄ）４−（４′−スルホフエニルアゾ）−１
−ナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド−
ナトリウム塩のUVスペクトル図である。第３図は希釈NA
GとODとの関係を示すグラフである。第４図は希釈NAGに
よるタイムコースを示す。第５図は希釈NAGとΔODの関
係を示すグラフである。
Claims (3)
- 【請求項１】一般式[I] （式中、Ｒ１〜３のうち少なくとも一つはスルホン酸基
またはアルカリ金属スルホネート基を、残りはハロゲ
ン、メトキシ基、ニトロ基または水素原子を示す。）で
表わされる新規フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミニド誘導体。 - 【請求項２】基質として下記一般式[I]で表わされるフ
エニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニド誘導体を含むＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニダーゼ活性測定試薬。 （式中、Ｒ１〜３のうち少なくとも一つはスルホン酸基
またはアルカリ金属スルホネート基を、残りはハロゲ
ン、メトキシ基、ニトロ基または水素原子を示す。） - 【請求項３】基質として下記一般式[I]で表わされる新
規フエニルアゾナフチル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニド誘導体を含む測定試薬を緩衝液で溶解し、こ
れに検体を加えてインキユベートし、生成するフエニル
アゾナフトール誘導体をアルカリ溶液で発色させて比色
定量することを特徴とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニダーゼ活性の測定方法。 （式中、Ｒ１〜３のうち少なくとも一つはスルホン酸基
またはアルカリ金属スルホネート基を、残りはハロゲ
ン、メトキシ基、ニトロ基または水素原子を示す。）
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63331646A JPH0631294B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | 新規グルコサミン誘導体、これを用いる酵素活性測定試薬及び酵素活性測定方法 |
| US07/457,266 US5126329A (en) | 1988-12-29 | 1989-12-27 | Glucosamine derivatives and compositions reagents and containing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63331646A JPH0631294B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | 新規グルコサミン誘導体、これを用いる酵素活性測定試薬及び酵素活性測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02178296A JPH02178296A (ja) | 1990-07-11 |
| JPH0631294B2 true JPH0631294B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=18245993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63331646A Expired - Lifetime JPH0631294B2 (ja) | 1988-12-29 | 1988-12-29 | 新規グルコサミン誘導体、これを用いる酵素活性測定試薬及び酵素活性測定方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5126329A (ja) |
| JP (1) | JPH0631294B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3942355A1 (de) * | 1989-12-21 | 1991-06-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | N- und o-substituierte aminophenolderivate, zwischenprodukte zu deren herstellung, deren verwendung als hydrolasesubstrate, ein entsprechendes bestimmungsverfahren und hierfuer geeignetes diagnostisches mittel |
| DE3942356A1 (de) * | 1989-12-21 | 1991-06-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung von 1-arylsemicarbaziden zur stabilisierung von enzymsubstraten, entsprechende verfahren und diagnostisches mittel enthaltend einen solchen stabilisator |
| JP2722874B2 (ja) * | 1991-08-01 | 1998-03-09 | 日東紡績株式会社 | 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体及びこれを基質に用いたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定法 |
| CN108218926A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-06-29 | 广东优尼德生物科技有限公司 | 检测N-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷酶的底物及其制备方法和试剂盒 |
| US11919837B1 (en) | 2023-11-02 | 2024-03-05 | King Faisal University | 4,4′-naphthalene-1,5-diylbis(diazene-2,1-diyl)dinaphthalen-1-ol as an antioxidant compound |
-
1988
- 1988-12-29 JP JP63331646A patent/JPH0631294B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-12-27 US US07/457,266 patent/US5126329A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02178296A (ja) | 1990-07-11 |
| US5126329A (en) | 1992-06-30 |
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