JPH03500123A - 酵素測定のための基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素測定のための基質 本発明は酵素測定および同測定に使用する基質に関する。

生体内に特定の酵素が存在するか又は存在しないかは、関係する生物体における 病気または欠陥に対する有用な指標である。さらに酵素は、醗酵槽や食品産業に おける微生物増殖の監視に有用であり、また酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）にも 重要であり、がっ培養中の微生物の種の確認にも有用である。

酵素を測定する方法は、基質に付着したときに無色または蒼白色であるが、しか し基質を酵素が攻撃しそのため遊離したときには強力に発色する遊離性発色団（ 即ち同試薬はＳ−Ｘ形をしており、Ｓは酵素によって認識される構造的エレメン トであり、ＸはＳ−Ｘ結合が酵素切断によって遊離する発色基である）でラベル した基質を各酵素について準備することである。

英国特許第２００８１０３号には、本目的に対し、ニトロビニルフェニール誘導 体の使用を開示している。しかしこトロビニルフェニール誘導体には下記の種々 の不利益がある。

（ｉ）　充分な水溶性の欠如１通常、これらニトロビニルフェニール基質のある 種のものを使用した場合、２ミリモルを超える濃度の溶液を得ることは不可能で あり、しかもニトロビニルフェニールカルボン酸エステルの場合には水に対する 溶解度は極端に少ない、したがって検出すべき酵素を飽和させるために、基質の 充分な溶解度を得ることは殆ど不可能である。メタノールやジメチルスルホキシ ドのような溶剤だと溶解度は高くなる。しかし、酵素がこれら溶剤によって有害 な作用を受けることが多い。

（ｉｉ）　容易かつ便利に使用できるようにニトロビニルフェニール基質をキッ トにする必要がある場合は、ニトロビニルフェニール基質を既製溶液として供給 しなければならない、こうすると安定性に問題が起こる。好ましい供給方法は、 容易に水にとける固体にすることであり、好ましくは緩衝塩との混合物にするこ とであり、これによって利用者は手軽に所望の基質溶液が得られる。

（ｉｉｉ）　ニトロビニルフェニール発色団を充分に発色させるには、塩基性で あることが必要であり、望ましくはｐＨ９，５がよいが、このＰＨだと基質が化 学的に分解して発色団が遊離し、相殺すべき好ましくない高いブランク値が生ず る。

（ｉｖ）　このような高ｐＨ値においては、ニトロビニルフェニールはミカエル （旧ｃｈａｅｌ　）反応または逆ネフ反応（ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｎｅｆ　ｒｅａｃ ｔｉｏｎ）を起こし発生した色が急速に退色する。経験的にはＰＨ９，５の場合 、望ましくは測定を５分足らずで終了させる必要があることが分かつている。

出願人は、ニトロビニルフェニール基質より水溶性が高く、そして色の濃い発色 団がｍ離できかつその色がｐｌ（が中性に近い程完全に発色し、さらに通常的な 使用で化学的分解を起こさない酵素基質を提供し、それによってこれらの欠点を 克服しようと図った。その上、不溶性発色体を与える基質は、条件によっては有 用である。すなわち遊離した発色体をＦ紙または膜上にあつめ、水を通さないよ うに強く吸着させる場合に有用である。Ｆ紙または膜の色は特定の酵素の存在ま たは非存在の指標である（たとえば、ＥＬＩＳＡ測定法）、この特殊な性質は、 均一な色（ｅｖｅｎ　ｃｏｌｏｕｒ）を得るために発色性フェノールの固定化が 重要な役割をする、「ディツプスティ・シフ（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）　Ｊ装置に有 用である。

本発明による酵素測定用試薬は、所与の酵素の作用を受けて遊離し着色生成物を 与える、発色団でラベルした測定すべき前記所与酵素に適応する基質からなり、 前記発色団が、一般式： ％式％ ［式中、アリルは任意のアリル基であり、ｎは０ないし３であり、ＲとＲ′は任 意の融和性のある基であり、ｌｅｔはアリル基の電子の非局在化を拡張できる複 素環式％式％ アルキル基または酵素に障害を与えない任意の適当な基である］を有することを 特徴とする酵素測定用試薬である。３Ｉ当な基質を用いて測定できる酵素には、 アリルエステラーゼ、カルボキシエステラーゼ、リパーゼ、酸性ホスファターゼ およびアルカリ性ホスファターゼ、ホスホジェステラーゼ、スルファターゼおよ び多種類のグリコシターゼがあるが、この場合、遊離した基は一〇−アリルー（ ＣＲ＝　ＣＲ’）ｎ　−）ｌｅｔなる形を有している０本発明は、しかし、こう した酵素に限定されるものではなく、適当な基材を選べば他の多くの酵素も原則 的には測定できる。

たとえば、ペプチダーゼおよびアミノ酸転移酵素に対する基質は、式 ％式％ ［式中、置換基Ｒ，Ｒ’は種々の融和性の基であり、遊離した発色基はアミノア リル誘導体！（ＲＮ−アリル−ＣＲ＝　ＣＲ’　−ｎｅｔである。］が考えられ る。

酵素の作用によって生ずる発色性生成物の色は、検査する未反応基質または生物 学的液体に関係のある背景色と実質的に異なることが好ましい。

基質の製造に使用するフェノール類、あるいは基質自体は、ホルミルフェノール またはそのオルト置換誘導体を、活性化した複素環式環内のメチレン基または適 当な複素環パートナ−（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ　ｐａｒｔｎｅｒ）のメチル 基と縮合させて得ることができる。

式中、ＦＩｅＬ　＝複素環、＾ｒ＝アリル環である。

特に好ましい薬剤は、バニリンおよびシリングアルデヒド（または４−ヒドロキ シベンズアルデヒドあるいはサリチルアルデヒドのような類似の出発物質）の。

−アシル誘導体や０−グリコジル誘導体がら、ローダミン−３−酢酸、沃化１． ２−ジメチルピリジウム、沃化１゜２−ジメチルキノリニウム、沃化１．４−ジ メチルキノリニウム、２−チオバルビッル酸およびトシル化２．３−ジメチルベ ンゾチオアゾリウムのような適当な複素環とカップリングさせて得る。ここに掲 げたものは単に代表的なものであって、これらに限定されるものではない。

こうした縮合は、通常、塩基触媒（ピペリジン−エタノール、酢酸アンモニウム −エタノール、酢酸カリウム−酢°酸−エタノールなど）を用いて穏やかな条件 下で行ってきた。ただしバルビッルｖ１誘導体を使用する場合は、反応を酸で触 媒した。多くの類似の試薬がこれらの方法を使って得られるものと信じられてい る１本発明に記載の実施例でとりあげた式では、二重結合に間して二種類の可能 な幾何異性体のうち一つだけを記した。その立体配置はけっして明確に定まった ものではない、しがし、両異性体をクレームした。

本発明の試薬は、代表的にはλｍａｘ４５０〜７００ｎｍで、分子吸光係数εが ２０．０００を越すオレンジ、赤および青色の明瞭な色をした発色体を遊離する 。もし測定を分光光度計を用いて行うならば、目測は別として、εが高いことが 望ましく、詮所（例えば妊娠テスト）上のＥＬＩＳＡや「ディツプスティック」 のような場合には、スペクトルの可視部分における吸光エンベロープの幅はεｓ ｅｘ同様重要であり、そして２０，０００未満のε―ａｘが許容される１本発明 における、酵素によって遊離される発色性化合物は幅ひろい吸光エンベロープを 有しており、したがって目測に適している。

本発明の試薬は、広範囲にわたる化合物からなり、また色彩化学の技術の当業者 には周知な発色性化合物の誘導体からなっている。好ましくは、溶解度を最適化 し、酵素−基質間反応を促進し、さらにすでに言及した遊離した発色性分子の強 度を最適化するために、これら試薬が選択される。

本発明の好ましい試薬は、アリル環にもとづき、しかも複素環系に共役している 不飽和の存在に依存している。

また本試薬はヒドロキシまたはアルキロキシのようなアリル核の助色団に依存す るものであり、かつヒドロキシ基は分子の発色団と基質部の間の結合にあずかっ ている。

複素環系は発色団の色を電子の局在化によって強化するものである。

次に図面について非限定的な説明を行う、すなわち：図１は本発明による酵素測 定法の反応模式である：図２〜６は、本発明を実施するにあたり利用することの できる発色団を系統的に表で示したものである１図７は、特定な例に対する化学 式の一覧表である。

本発明による、ある特に好ましい部類の試薬には２−チクソチアジンジン−４− オン（ローダニン）核［図２（Ｂ）］に基づいたものが含まれている。遊離性化 合物としては、図２（Ｂ）において＾＝ｏ、　ｘ＝ｓ、　ｙ＝　ｃ＝ｓ。

Ｚ＝　Ｎ（ＣＨ２）　Ｘ　ＣＯ，Ｈであるかまたは類似の化合物が挙げられる。

たとえば、フェノール［図２　（Ｂ）　］においてＲ’＝ＯＭｅ、Ｒ＝Ｒ”＝Ｒ ’＝Ｒ’＝Ｒフ＝Ｈ，ｎ＝０．　＾＝Ｏ，Ｘ＝Ｓ。

Ｙ＝　Ｃ＝Ｓ、Ｚ＝ＮＣＨ２ＣＯ□ｌＩ］　はλｍａｘ４９０ｎｍ　、ε３２． ６００の共役塩基を有している。アリルと複素環系の間の共役結合を拡張するこ とによって色の強度とλｗａｘを増大することができる：たとえば、Ｒ＝Ｒ”＝ Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒｓ　＝　Ｂ　ｉ　＝　Ｂテ＝Ｈ、Ｒ’＝ＯＮｅ、ｎ＝１．　Ａ＝ 　Ｃ＝０．　χ＝Ｓ、Ｙ＝Ｃ＝Ｓ、　Ｚ＝　ＣＢ２Ｃ０ｄｌテある図２（Ｂ）の フェノールの共役結合はλ鋤ａｘ５２４ｎｍ（ブロードエンベロー１４５０〜′ ６００１ｍ）、モル吸光度＞　４０，０００である。

強く着色した物質を遊離するための好ましい試薬のうち図４と図６に示したもの は価値がある。従って、ＲｌＲ”−Ｒ１０＝ｔｌ、　Ｒ”＝Ｍｅ、　ｎ＝　１　 、　Ｘ＝１−である図４（Ａ）の場合、その強い色は、強い溶媒和発色（６ｏ１ ｖａｔｏｅｈｒｏ−＠１ｓｓ）を示す共役塩基（λｍａｘ４４４ｎｍ、ｔ　２７ ，０００）の生成と関係がある。したがって、有機溶媒または水と有機溶媒の混 合物中の共役塩基は、よく知られているように顕著な深色移動を示すのである。

無水ピリジンの場合、λｍａｘ６０５ｎｍ、（ｇ７８，５００）である。

このような色を可成り強化するには、キノリニウム核を組込むか、あるいは図４ に示すように共役の拡大によって達成される０本発明によれば、上述のような色 とその強化によって酵素の測定感度を一層高めることができる。特に、図４と図 ６に明細に記した化合物は、非常に強い赤色と青色を与え、しかもこれらの色は 有機溶媒の存在下で一層発色が強化される。この点に関し特にアセトンが優れ、 アセトンが水中に２０％ｖ　／　ｖ存在すると非常に顕著な深色移動と淡色移動 が生ずる。この効果は図４と図６の場合に著しいが、これはフェノキシト基の電 子が完全に非局在化してメロシアニンが生じ、そしてメロシアニンの生成が有機 溶媒により促進されるためでしかし、これ以外のここに述べた発色性フェノール はいずれもアセトンの存在下で色強度が僅かに強化するか、あるいはやや強化さ れるものである。

通常、使用する場合には、停止用緩衝剤として炭酸ソーダや重炭酸ソーダを用い る。しかしこの場合、分析時に調製しなければならないという欠点がある。これ ら緩衝剤水溶液を長期間貯蔵するときに問題があるからである。

アセトンの性質は、既にその使用によって生ずる顕著な深色移動と淡色移動に間 遠して述べた。そこで本発明では停止用緩衝剤として使用するため、アセトンと 水の混合物中でアセトン可溶性である塩基の形をした停止用ｗＩ衝剤を用意した 。好ましいアセトン可溶性塩基は１゜４−ジアザビシクロ［２，２，２１オクタ ン（ＤＡＢＣＯ）である。

すべての発色性フェノールを発色させる他の手段としては、塩基性基、例えばジ エチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＳ−セルロース）を含有する固相に吸収 させるという手段がある。基質部、そしてそれにも増して図４と図６に記載の化 合物の大部分の共役塩基が穏やかな塩基性条件下でセルロース間遠のポリマーに 選択的に吸収され、その結果ポリマーから水で浸出することのない強い色が生ず る。セルロース上に形成する色は溶液の場合の色とは全く異なり、メロシアニン の色に似ている。

こうした性質により、これらは「ディツプスティック」装置（”ｄｉｐｓｔｉｅ ｋ　ｄｅｖｉｃｅ）やＥＬＩＳＩＡ診断キットに使用される有用な色原体になる 。

簡単に測定できるサンプルは液状のものであって、それには生理学的液体、例え ば血清、尿、ホモジナイズした細胞からのサンプル、微生物、植物の組織、およ び抗体や抗原に結合した酵素がある。

次の例証的実施例では、本発明による基質の作成法を述べた。さらにまた、エス テラーゼとＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧａｓｅ　）の分 析例をそれぞれ示した。

グリコシドの調製では、４−ホルミル−２−メトキシフェニール　２−アセトア ミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドとβ−Ｄ−ガラクトピラノシド 、および関連化合物（米国特許第２００８１０３号に記載）を適当な複素環と縮 合させた。カルボン酸エステルを得るには、発色性フェノールを直接アシル化す るか、または複素環とヒドロキシベンザルデヒド誘導体のエステルを縮合させる 。ホスフェートを得るには、主として適当な発色性フェノールを直接燐酸化する 。

アンモニウム５−　４−（２−アセトアミド−２−一旦一β−二一グルコピラノ シ口　シー３−メトキシフェニール　シン　−２−ソ　アゾリジン−４−ソー３ −エ　ノエー　４ｂ　。

４−ホルミル−２−メトキシフェニル　２・−アセトアミド−２−デオキシ−β −Ｄ−４−グルコピラノシド（ｌｂ）（５，ＯＯｙ　、０．０１４モル）と２− チオキソチアゾリジン−４−オン−３−エタン酸（２，６９ｇ、０．０１４　モ ル）を、アンモニア（ｄ、０．８８．２．７ｍ１）と塩化アンモニウム（２，６ ３ｇ、０．０４９モル）を含有した９６％エタノール水溶液（３５０ｍｌ’）に 撹拌懸濁し、これを約６０℃で加熱した。得られた混合物は直ちに黄色になった が、物質状態は保持された０反応を４時間続け、そしてその時、ｔ、１．ｃ、　 （クロロホルム−メタノール、５：２）が出発物質であるアルデヒドが黄色の緩 慢な動きをする生成物に変化したことを示した。得られた溶液をＶ遇し、黄色固 体を沸騰メタノールで洗浄し、高純度の微結晶である（４ｂ）［６，６ｙ、８６ ％、繭、ｐ、１６５〜１７３℃（分解）、［αコＤ＋１８°　（ｃｌ、ＤＭＳＯ ）］を得た（実測値：　Ｃ，４４，６５、Ｈ，５，３３。

Ｎ　、　７　、２８　、　Ｃｚ＋ＬｔＬＩＬ。５２１１２０、計算値：Ｃ９４イ 、７５：Ｈ，５，１９、Ｎ、７．４％）。

この化合物はＮＡＧａｓｅ（Ｋ　ｍ　０．９８　ｍ　Ｍ　）に対し優れた基質で あり、最高１０ｍＭの水溶液が得られた。遊離したフェノールは、λｗａｘ（Ｈ ２Ｏ，ｐＨ１０）４９０ｎｍ。

ε３２６００’；λＩＩａｘ（０，２’ＬＩｒ　ＤＡＢＣＯ，ただし水ニア七ト ン４：１の水溶液）５０５ｎｍ、ε４２，０００であって、その色はｐＨ１０以 下では褪色しなかった。

上記縮合を酢酸カリウムを触媒に使用してメタノール中で繰り返したところ、収 率２５％で黄色固体のカリウム塩が得られた。触媒として酢酸−酢酸カリウムを 用いて同様な縮合を繰り返し、過剰な酢酸で酸性化したところ遊離酸が高収率で 得られた（ｍ、ｐ、１７０〜１７２℃）。

４−ホルミル−２６−ジメト　ジフェニル２−アセトアミ’−３４６−）１−ｏ −セ　ルー２−一オンーβ−ニー　ルコピーノシ゛ ２−アセトアミド−３，４，６−トリー立−アセチルー２−デオキシ−α−Ｄ− グルコピラジノシルクロリド（１８，３＋？、５０ｍｍｏｆ）のアセトン（１０ ０＋ｓ１）溶液を、１Ｍ水酸化カリウム溶液（１００ｍｆ）に溶かしたシリング アルデヒド（９，１ｙ、５０ｇ＋−０１）溶液に加えた。得られた混合物を１８ 時間撹拌し、ついで水で希釈した。析出した結晶固体（１０，８ｇ、４２％）を 枦別し、水で洗浄し、更にアセトン−水から再結晶して標記の化合物、ｍ、ｐ、 ２２２〜２２５℃、［α］Ｄ＋３、（ｃＯ，９、ＣｌＣ１’、　）を得た。

ま二二しル膠口に一２６二茗メ　ジフェニル−２−セ上記トリアセテート（７゜ ６ｇ、１５ｍ＋＊ｏｆ）のメタノール（５０（１＋１’）撹拌想濁液をＮ−ナト リウムメトキシド（２ｍｌ）で処理した。上記固体は３０分以内に溶解して淡黄 色の溶液となり、標記化合物が塊状のゼラチン状固体として分離しはじめた。上 澄み液をデカント除去し、ついで水（５０〜１００ｔｊ’）を加えたところ固体 は次第に粗粒化し結晶化した。これを枦別したところ標記化合物２ｂが得られ、 これを水、アセトン、最後にエーテルで充分洗浄した。・次いで熱湯から再結晶 しｍ、ｐ、　１８６〜１８９℃、［α］　Ｄ＋１３°　（ｃＯ，８５、Ｈ＊Ｏ） 　の標記化合物を得た。

ンモニ　ムー　４−２−アセト　ミド−２−一ンーβ−二一　ルコビーノシロ　 シー３５−ジメトシフェニルメ　シン　−２−ソ　アゾ１ジン−４−オン−３− エ　ノエート　１１ｂ　。

４−ホルミル−２，６−シメトキシフエニル　２−アセトアミド−２−デオキシ −β−Ｄ−グルコピラノシド＜２ｂ）（０，５０ｇ、１．３ｍｍｏｎ’）と、ア ンモニア（ｄＯ，８８ｆＩ、　Ｏ、’２５ｍｆ、４　、５　ｌＩｍｏ７りと塩化 アンモニウム（０，２５ｇ、４．７ｍｍｏｊりを含有した９６％エタノール水溶 液（９０＠ｊりに溶かした２−チオキソチアゾリジン−４−′オンー３−エン酸 （０，２５ｇ、１．３ｍｍｏｊりとの懸濁液を室温で撹拌した。そしてその時、 ｔ、］、ｃ、　（クロロホルム−メタノール、５：２）が出発材料であるアルデ ヒドが黄色の、より動きの遅い生成物に変化していたこと−ルで洗浄した結果、 １　ｌ　ｂ　（０，７ｙ、８７％）輪、ｐ。

１５０〜１５５℃（分解）、［α］Ｄ＋３８°（ｃｏ、８ＤＭＳＯ）が黄色固体 の微結晶として得られた。

得られた基質は水溶性でＮＡＧアーゼ（ＮＡＩＩ；ａｓｅ　）に対して優れた基 質であった。遊離したフェノールはλｗａｘ（ＬＯ，ｐ　Ｈ１０の場合）　５１ ５　ｎｍ、　ε４４，０００、λａ＋ａｘ（４：１の水：アセトンに溶解した０ 、２ＭのＤＡＢＣＯの場合）５２９ｎｍ、ｔ　４７，５００であり、ｐＨ１０以 下では色は褪せなかった。

ンモニ　ム５−４−（β−具一　−トピーノシロシ　−３−メト　シ　ェニルメ 　シン　−２−ゝ　ゝ１ジンー４−　ン一　−エ　ノエー　４０）−。

４−ホルミル−２−ジメトキシフェニル　β−Ｄ・−ガラクトピラノシド（ｌｃ ）（０，６５ｙ、２．Ｑｍｍｏｌ）と、アンモニア（ｄｏ、８８ｙ、０．４ｍ／ ）と塩化アンモニウム（０，４ｇ、７ｍ＋＊ｏｆ）を含有した９６％エタノール 水溶液（１５０ｍｌ）に溶かした２−チオキソチアゾリジン−４−オン−３−エ タノイックアシッド（０，３９ｙ、２　、０　ｍｍｏｌ）との撹拌懸濁液を、還 流下で３時間加熱し、そしてその時、ｔ、１．ｃ、　（クロロホルム−メタノー ル、５：２）が出発材料が黄色のより動きの遅い生成物に変化していたことを示 した。得られた溶液を枦遇し集めた固体をエタノールで洗浄した結果、４ｃが黄 色固体として得られた（０．９５ｙ、９７％、論、ｐ、１７６〜１８０℃、［α ］　Ｄ−３５°　（ｃ　ｌ　、ＤＭＳＯ）（実測値：Ｃ１４５，２６；　Ｈ，４ ，７８：Ｎ、５．３２．Ｃ＋５ｌｌｘＪａＯ＋ｏＳ、計算値：Ｃ，４５，２３； Ｈ，４，７９，Ｎ、５．５５％。

本化合物は容易に水に溶け、そしてＥ、コリ（Ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ に対して優れた基質であった。

ソ　アゾ１ジン−４−シー３−エタノエートガラクトピラノシド（２ｃ）［０， １７ｙ、０　、５　ａｍｏｆ、（ＩＣ）に準じて調製しな］の、酢酸アンモニウ ム（０，０９１１，１ｓ＋ｍｏ１）含有メタノール（１０ｍｌ’）ＦＪ濁液に、 ２−チオキソチアゾリジン−４−オン−３−エタン酸（０，１ｇ、Ｑ、５ｍｍｏ ｆ）を加え、得られた混合液を穏やかに還流しながら加熱した。３０分間後に溶 液が均一になり、そして４時間後に生成物が分離しはじめた０次いで１時間混合 物を冷却し、生成物を炉別しメタノールで充分洗浄して、１１　ｃ　（０，１６ ｔｔ、５８％）　、ｍ、ｐ、１７３〜１７４℃、［α］　Ｄ＋２２’″　（ｃＯ ，８、ＤＭＳＯ）を得た。

ンモニウム５−　４−　２−アセ　ミ１−２−−ローβ−２−ルコピーノシロ　 シー３−メ　ジフェニル　シン　−２−ゝ　ゝｌジンー４−　シー３−ベンゼン −４−ルポ　シレート　６ｂ　。

２−チオキソチアゾリジン−４−オン−３−（ベンゼン−４−カルボン酸）（０ ，２７＃、１．１ｍｓ＋ｏ１）を、アンモニア（ｄｏ、８８．２滴）と塩化アン モニウム（０，２１？、４．ＱｍｍｏＺりを含有したメタノール（２５＠ｆ）に 撹拌して４−ホルミル−２−メトキシフェニル２−アセトアミド−２−デオキシ −β−回一グルコピラノシド（１ｂ）（Ｃ１，３８ｇ、１　、１　ｍ５ｏｊりを 懸濁させた液に添加して、黄色の均質混合物を得た。得られた反応混合物を８時 間穏やかに還流しながら沸騰させ時に、ｔ、１．ｃ、　（クロロホルム−メタノ ール、５：２）が全ての出発材料が黄色の動きの遅い生成物に変化していたこと を示した。得られた混合物を冷却し、生成物を炉別しエタノールで充分に洗浄し た結果、黄色粉末（０，３ｇ）、鋤、９．２０９〜２１２℃、（分解）、［α］ Ｄ＋１７°（ｃＯ，４８、ＤＭＳＯ）を得た。

シン　−３−４−ヒ′口　ジフェニル　−２−％　１１ジン−４−ン　５ｂ ３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（０， ２３ｇ、　１．０＋＊ｍｏ１）を、酢酸アンモニウム（０，０Ｂｙ、１．Ｑｍｍ ｏＺ）を含有した無水エタノール（１０＠ｆ）に４−ホルミル−２−メトキシフ ェニル　２−アセトアミド−２−デオキシ−β一旦一グルコピラノシド（ｌｂ） （０，３２ｇ、Ｑ、９ｍｓ＋ｏｆ）を撹拌して懸濁させた液に添加した。得られ た淡黄色の均質な反応混合物は穏やかに沸騰し、５時間後に反応混合物を氷冷し 、黄色の生成物を炉別してメタノールとアセトンでよく洗浄し、５ｂ（０，４２ ｙ、７４％）、鋤、ｐ、２３４〜２３６℃、［ａ］　Ｄ＋２．５°　（ｃｏ、８ １、ＤＭＳＯ）を得たが、（実測値：　Ｃ，５３，６２：Ｈ，４，６５：　Ｎ。

４．７３　、　ＣｚｓＬｓＬＯｓＳｚ、計算値：Ｃ，５３，３８；Ｈ。

４．６３　：　Ｎ、４．９８）であった。

５−４−プロパンノイル　シー３−メト　シフェニルメ　シン　−２−ソ　％１ ジンー４−　ンエ１止一旦ニユニ （ａ）　バニリルブロビオネート（ｌｄ、ｎ＝１）（２ｇ。

１０．３−ｍｏｌ）と２−チオキソチアゾリジン−４−オン（ローダニン）　（ １，３９ｇ、　１．０３ｇｍｏｆ）のエタノール（２０ｍｌ）溶液に対してピペ リジン（５滴）を加えた。

得られた混合液を２時間還流しながら加熱し、その間に生成物が分離を起こした １反応混合物を冷却し、得られた（３ｄ、ｎ＝１＞の淡黄色の針状物を炉別した （　ｍ、ｐ。

２０９〜２１０℃、収率６５％）。

生成物は水に僅かに溶解し、ｐＨ８でカルボキシエステラーゼによって分解して フェノール（３ａ）（λ−ａｘ４８８、ε３２．Ｇｏｏ）を得た。

（ｂ）　前記プロピオネートはまた、フェノール（３ａ）をピリジン中でプロピ オン酸エーテル無水物または塩化プロパノイルを用いて直接アシル化することに よって得ることができた０本方法は、汚染物質として発色性フェノールを生成物 に与えないので一般に好まれている。

５−（ブタノイルオキシ−３５−ジメト　シフェニルメ　シン　−２−キソチア ゾリジン−４−ソー３二盈工２１！（１１ｄ、　ｎ＝２） シリングアルデヒドブチレート（２，ｎ＝２）（１，５ｇ、　６ｍ＠ｏ１）の無 水エタノール（５０ｓ＋１）溶液に、２−チオキソチアゾリジン−４−オン−３ −酢酸（ローダニンＮ−酢酸）（１，１ｇ、５．７５ｍｍｏｌ’）と無水酢酸カ リウム（０，９ｇ、９．２ｍｍｏ１）を加えた。得られた混合物を穏やかに還流 しながら１．５時間加熱し、そして冷却すると生成物のカリウム塩が分離した。

混合物全体をつぎに水（２５＠ｆ）と濃塩酸（２５ｍｇ）で希釈し、本遊離酸（ １１ｄ　、　ｎ−２）　（ｍ、ｐ、１　９３〜１　９４℃、　６０％）を得た。

さらにそのエステルもとリジン中で塩化ブタノイルによって（ｌｌａ）を直接ア シル化することによって得られた。

本エステルは容易にアルカリ性緩衝液（ｐＨ８など）に溶解して黄色溶液となり 、これはカルボン酸エステルで簡単に分解し、発色フェノール１１ａが得られた 。

本化合物はカリウム塩として単離できたが、遊離酸より不安定で放置中に緩慢に 分解した。また２ｍＭより濃いカリウム塩溶液が得られた。

数種類の関連のエステルが、関連した方法により適当なシリングアルデヒドを用 いて得られた。

ム立１工匪エステル（ｌｉｄ、ｎ＝８）は収率７８％、ｍ、ｐ、１１８〜１１９ ℃の遊離酸として得られ、これは種々のリパーゼに対する優れた基質であった。

ベンゾエートエステル（ｌｉｅ）は収率８０％、鯖、ｐ。

〉２３０℃のカリウム塩として得られ、これはカルボキシエステラーゼに対する 優れた基質（Ｋｍｏ、３３）であった。

ビペｌＩジニウム５−　３−　４’−エ　ノイルシー３′−メト　ジフェニル　 −ｒｏ−２−エ　リーン−２−オ　ソ　アゾ１ジン−４−オン−３−エタノエコ １−仁ユ」」− ４−エタノイルオキシ−３−メトキシシンナムアルデヒド（３０ｍｇ、０　、１ ４　＊ａ＋ｏｌ）とローダニン−Ｎ−酢酸（３０ｍｙ、０　、１６　ｍｍｏｌ） を僅かな滴数のピペリジンを含有したエタノール＜１＠ｉ’）と共に加熱した。

３０分後に、水冷し反応混合物から粘着性の黄色固体が分離した。この固体を少 量の水で洗い乾燥して収率２０％、ｍ、ｐＬ２２５〜２２６℃のピペリジニウム 塩としてのエステルが得られた。このエステルをカルボキシエステラーゼを用い 加温放置して加水分解することにより、λ−ａｘ　５２４ｎｍ（ε４１．Ｇｏｏ ）の適切な前記フェールが得られた。

３−４−　ルポ　ジフェニル　−５−３５−ジメト　シー４−プロパノ　ル　シ フェニルメ　シン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（１３ｄ、ｎ＝１少 数滴数のピペリジンを含有したメタノール（１５ｄ）に溶かしたシリングアルデ ヒドプロピオネート（０，２３８，，１ｍｍｏｔ’）の撹拌溶液に、３−（４− カルボキシフェニル）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（０，２５ｇ、１ １ｏｒ）を添加した。得られた黄色の均質な混合物を穏やかに還流しながら６時 間加熱した。この時に、ｔ、１．ｃ。

（ＣＨＣｆ３：　ＭｅＯｆｌ、５：１）が一部出発物質がまだ残存していること を示していたが、不溶解生成物をＰ別し所望の付加物（１３ｄ、ｎ−１）（０， ２９，３４３％）　、ｍ、ｐ。

２９０〜２９３℃、（実測値：　ｃ　：　５５．８７　：Ｈ。

４．０１　：Ｎ、３．０９　ｃ２□Ｎｌ＊Ｎ０ｔＳｚ　、理論値：Ｃ：５５．８ ７：Ｈ，４，０１、Ｎ、２．９５％）を得た。

本エステルはカルボキシエステラーゼと反応し、λｗａｘ　５３５　ｎ　ｍ　（ ε２０，０００）である適切なフェールシカ（得られた。

次記のエルテルは適切なシリングアルデヒドエステルを用いてつくった： Ｌ又込エニ上−、ｐ、　２８７〜２８９℃、（実測値：Ｃ：　５６．８１　；　 Ｈ，４，３４；　Ｎ、　３．０３．　Ｃ２３Ｈ２２０７ＮＳ２、計算値：Ｃ：５ ６．６７；Ｈ，４，３１；Ｎ、２．８７％）。

乙（ヱ二上、鋤、ｐ、＞　２３０℃、（実測値：Ｃ：５３．８３　、　Ｈ，３， ８１、Ｎ、　３．１０．　Ｃ２山ｔＯＪｓ２、計算値：Ｃ：５４．９０；Ｈ，３ ，７３，Ｎ、３．０５％）。

Ｚナノエート、ｍ、ｐ、１７６〜１８０℃。（実測値：Ｃ：６１．０１　；Ｈ， ５，５８；Ｎ、２．５０．Ｃ，、Ｈ，、Ｏ，ＮＳ２、計算値：Ｃ：６０．４３； Ｈ，５，４０；Ｎ、２．５１％）。

ベンゾエート、輪、ｐ、＞　２５０℃、（実測値：Ｃ：６０．０　１　；　Ｈ， ３，７７；　Ｎ、　２．７０　、　ＣｚＪ＋ＪＯ）Ｓ２、計算値：　Ｃ：　５９ ．８８　：　Ｈ，３，６４、Ｎ、２．６８％）。

この類のエステラーゼ基質は各種エステラーゼによって高い酵素活性を示したが 、水溶液に対する溶解性は低かった。ノナノエートはまたリパーゼによって酵素 活性ガラクトピーノシルオ　シー３−メト　シーフェニルメシン　−２−ソ　％ １ジンー４−　ン　６Ｃ４−ホルミル−２−メトキシフェニル−β−■−ガラク トピラノシド（ｌｃ）（０，４７ｙ、１゜５ｍｍｏ１）の、ピペリジン（１滴） 含有無水エタノール（２５ｍｊり撹拌懸濁液゛に対して（４−カルボキシフェニ ル）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（０゜４４ｙ、１．５ｍｍｏｌ）の カリウム塩を添加し、得られた懸濁液を穏やかに還流しながら２時間加熱した。

得られた黄色固体を分離し、高温下でヂ過し、少量の沸胱メタノールと酢酸エチ ルで洗浄し、ついでエーテルで洗浄してｓ、ｐ、＞　２３０℃（分解）のカリウ ム塩である生成物（０，２２，２２％）を得た。

１　ム５−　−ベンゾイル　シー３５−ジメトシフェニルメ　レタ　−２−ソ　 アゾリジン−４−シー３−　フェニル−４−スルホネート　（１４ｅシリングア ルデヒドベンゾエート（２ｅ）（０，２８６ｙ、ｌｓｍｏｆ）を少滴数のピペリ ジンを含んだメタノール（２０ｍ７）に溶解した。カリウム２−チオキソチアゾ リジン−４−オン−３−（４−フェニルスルホネート）１永和物（０，３３ｆ、 １．０１鋤−ｏｌ）を添加し、得られた溶液を穏やかに還流しながら４時間加熱 し、混合物を次いで冷却し、濾過し、そして生成物をメタノールと酢酸エチルで 洗浄し、収率５３％、ｅ＋、ｐ、＞　３００℃の１４ｅを得、（実測値：Ｃ，４ ８，６１，Ｈ，３，３５，Ｎ、２゜４２、Ｃ□Ｂ＋ｓＮＯ＊５Ｊ−ＬＯ−計算値 ：Ｃ，４８，９２，Ｈ。

３．２８、Ｎ、２．２８％）であった。

本エステルをカルボキシエステラーゼで加水分解して適切なフェノールλ−ａｘ ５４５ｎｍ、（ｔ　２１，０００）を得た。

２−　ゝ−３−４５−１メ　ジフェ ニル　−５−３５−ジメト　シー４−ホスホロイルシフェニルメ　レタ　−　ア ゾリジン−４−ン±上呈工１ 無水ピリジン（２ｍＮ）に懸濁した５−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ フェニルメチレン）−２−チオキソ−３−（３０，４，５−）リメトキシフェニ ル）−チアゾリジン−４−オン［１５ａ、０．２３ｙ、０　、５　ａａｏｊ！で あり、これは普通の方法によってシリングアルデヒドとＮ−（３，４，５−）リ メトキシフェニル）−ローダニンを縮合して得たものである］の水冷懸濁液に対 して、オキシ塩化燐＜０．０７ｍ１．０．８ｍｍｏｆ）を添加した。得られた混 合物を密栓して室温まで加温した。３時間後、反応混合物に砕氷を加えて分解し 、その上に厚い黄色の沈澱が形成され、さらに１時間混合物を撹拌し、アセトン （１０ｍｉ’）を加え、沈澱を炉別し、メタノールで充分洗浄して（１５ｆ）（ ０，３５ｙ、４０％）を得、蒙、ｐ。

２９３〜２９７℃（実測値：Ｃ，４５，５１、Ｈ。

４．４２　；　Ｎ　、　３．６１　、　Ｃｚ＋Ｈ＊ＪＯ＋ｏＰＳｉ４ｉ０．計算 値：Ｃ，４４，９１、Ｈ，４，２７、Ｎ、２．４９％）であった。

これは、中程度にアルカリ性Ｍ衝液に溶解し、ｐＨ約９でアルカリ性燐酸塩で加 水分解し不溶性のフェノール沈澱が生じたが、これはアセトンを含有したＤＡＢ ＣＯ緩衝剤に溶解し強い青色（λｍａｘ６００ｎｍ、ｇ２２，１００）を示した 。

５−４−ホスホロイル　シー３−メト　シフェニルメ　レタ　−２−’−３−メ 　ル　ゝ１ジンー４＝　ン　９ｆ　ピＩジニ　ム 乾燥ピリジン（１０ｍｌ）中に懸濁した５−（４−しドロキシ−３−メトキシフ ェニルメチレン）−２−チオキソ−３−メチルチアゾリジン−４−オン（０，６ １１Ｆ、１．４ｍｍｏ１）の撹拌水冷懸濁液に対しホスホロイルオキシクロリド （０，２０ｍＮ、２．２−鋤ｏ１）を２分間にわたり注意深く添加したところ溶 液は黄変した。添加を終了後、反応混合物を室温にした。６時間放置後氷を加え た。懸濁物は直ちに溶解したが、直ぐに黄色沈澱が生じた。溶媒は回転エバポレ ターで除去し、生成物をさらに析出させるためにプロパン−２−オールを加えた ０次いで懸濁液をウォーターバスで加温し、この加温溶液（４０℃）を濾過し、 固形物をアセトンとエーテルで洗浄し０．３６ｇの黄色粉末の燐酸エステルを得 た０本生成物は別に炉液からも得られた（０．１２ｇ＞。

本ホスフェートは非常に水にとけやすく、またアルカリ性のホスファターゼによ って容易に加水分解して不溶解性の黄色沈澱が得られたが、これは強いアルカリ を加えると溶解し赤色溶液となった（λ−ａｘ５０７ｎｍ、ε３８、Ｂｏｏ）　 。

シリングアルデヒドから得られた誘導体、すなわち５−（４−ホスホロイルオキ シ−３，５−ジメトキシフェニルメチレン）−２−チオキソ−３−メチルチアゾ リジン−４−オン（１６ｆ）は、上記と同様な方法で得た。

本ホスフェートを元素分析と３６０　Ｎ１１ｚのＩ　Ｈ−ｒ＋、ｍ、ｒ％分光分 析法で分析すると、モノピリジニウム塩と約２分子の結晶水を持った遊離酸の混 合物であることが分かった。ホスファターゼ（Ｋｍｏ、３３ｍＭ＞の作用によっ て遊離したフェノールは、同様に水性媒体には不溶性であるが、ＤＡＢＣＯアセ トン溶液には溶解した（λｗａｘ５３３ｎｍ、＃：４０，３００）　。

ｉ二１Ａ−β一旦一　−トピーノシル　シー３−メト　シフェニルメ　レタ　− ３−４−ヒ゛ロ　ジフェニル　−２−・　アゾ１ジン−４−ン　５Ｃ３−（４− ヒドロキシフェニル）−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（０，２３ｙ、１ ．Ｑｍｍｏｊりを、１滴のピペリデンを含んだメタノール（２０ｍｌ’）に懸濁 した４−ホルミル−２−メトキシフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｉ　Ｃ ＞　（０，３２ｇ、　１．０ｓｅ＋ｏｊり懸濁液に加えた１次いで直ちに黄変し た混合物を還流しながら穏やかに加熱し３０分間後には濃厚な沈澱が生じた。こ の混合物を冷却し一過して所望の生成物（５ｃ）を得たが、（０，１２ｇ、２３ ％、−８ｐ１分解〉２３０℃、［α］Ｄ−３４，４’″（ｃＯ，６、ＤＭＳＯ） ）（実測値：　Ｃ、５３，０４；Ｈ，４，５５；　Ｎ、　２．８１　、　Ｃｚ、 Ｎ２．ＮＯ＊Ｓｚ　、要求値：Ｃ２５２，９６、Ｈ，４，４４：　Ｎ、２．６８ ％）であった。

β−ｐ−ガラクトシダーゼを用いて加温放置して得た遊離フェノールはλ鋤ａｘ ５３５ｎｍ、（ε４４，０００）であった。

”　４−　２−　４−ベンゾイル　シー３５−ジメシ　ェニル　−ビニル　−１ −メ　ル　１ニ　ム工２４虹１ シリングアルデヒドベンゾエート（２ｅ）（０，８１ｆ、０．６３１ｃｍｏｌ） 　、沃化１．４−ジメチルキノリニウム（０，１８ｙ、０．６３ｍｍｏｉ’）お よび酢酸アンモニウム（０，１５１？、１．９ｍｍｏｌ）の混合物を温エタノー ルニ溶解し、還流しながら加熱した。溶液は直ちに黄変し１５分以内に黄色の沈 澱を形成した。この反応を１時間続け、ついで濾過した。あつめた固体をエタノ ールで洗浄し、黄色の微粉末である（２４ｅ）を得、細、ｐ、分解〉２５０℃、 （実測値：Ｃ，５８，８６，Ｈ，４，２５；Ｎ、２．７１゜Ｃ２ＪｚｎＮＯ−１ 、計算値：Ｃ，５８，６０；Ｈ，４，３７；Ｎ。

２．５３％）であった。

本エステルはエステラーゼに対する基質であるが、水に対する溶解度は低かった （＜０．２５ｍＭ）。

シ　−３−メト　ジフェニル　−ビニル　−１−メ　ル星辺彰隘−久ム（１９ｃ ） ４−ホルミル−２−メトキシフェニルβ−込−ガラクトピラノシド（ｌｃ）（０ ，４８ｇ、１．５＋ａ＋ａｏ１）　、沃化１゜４−ジメチルピリジニウム＜０． ３２９．１．５ｓｓｏ１）および酢酸アンモニウム（０，３５ｙ、４．５＋ｕａ ｏ１）をメタノール（１０ｍｌ）に溶解し、還流温度で加熱し、得られた溶液は 次第に黄変していった。２時間後に黄色の沈澱が生じはじめた。この反応をさら に２時間続けたとき、ｔ、Ｉ。

ｃ、（クロロホルム−メタノール、５：４）は、アルデヒドの大部分が殆どすべ て非可動性の生成物に変化したことを示しな０反応混合物を室温に冷却し、沈澱 をｒ別し、少量のメタノールで洗浄して黄色の固体（０，２８ｙ、３４％）であ る（１９ｃ）を得、１１．１）、２３７〜２４２℃、［αコＤ−１６°　（ｃｌ 、ＤＭＳＯ＞（実測値：Ｃ９４７，６８；　Ｈ，４，９９；　Ｎ、　２．８６． 　Ｃｚ＋ＨｚｉｌＮＯｙ　。

計算値：　Ｃ，４７，４７；Ｈ，４，９３、Ｎ、２．６４％）であった。

ガラクトシドはＥ、Ｃｏ１１　β−ガラクトシダーゼに対する基質であり、水に 対する溶解度は可成り高かった。

”　２−　２−　４−　２−アセ　アミド−２−一酢酸アンモニウム（０，１４ ｙ、１．８ｍｍｏｌ）とアンモニウム（ｄＯ，８８，０，２ｍ１）を含有したエ タノール（Ｌｏａｌ）に懸濁させな４−ホルミル−２−メトキシフェニル−２− アセドアミドー２−デトキシーβ一旦一グルコピラノシド（ｌｂ）（０，２１ｙ 、０．５９ｍ５＋ｏｆｆｉ）の撹拌懸濁液に対して、沃化１，２−ジメチルキノ リニウム（０，１６ｇ、０　、５６　ｍｍｏｊりを添加した。得られた混合物を ６０〜６５℃に加熱したところ、オレンジ色に変化し、さらに褐色に変化したこ とが認められた。さらに４時間後、反応混合物を冷却し一固体生成物を炉別し、 順次メタノール、アセトンそしてエーテルで洗浄してオレンジ色の結晶（０，２ ３ｇ、６２％）として（２１ｂ）を得た、そのｗ、ｐ、は１６５℃（分解）であ り［α］Ｄ＋１９’（０，８，ＤＭＳＯ）（実測値：Ｃ，４９，４３、Ｈ。

５．４５；Ｎ、４．４６゜Ｃ１Ｊｓ＋ｌ’ｌＪｙ・２Ｈ２０、計算値：Ｃ９４９ ，２５；Ｈ，５，３６、Ｎ、４．２５％）であった。

本化合物はＨＡ（：ａｓｅ対する基質であり、遊離したフェノールはλｗａｘ（ ＬＯ，ｐＨ１０）　５１５ｅｍ　（ｇ４２，５００）　。

（ＤＡＢＣＯ［衝剤）　５３５　ｎｍ　（ε４６，５００＞　テあった。

”　２−　２−　４−ペンゾイルオ　シー３−メト　ジフェニル　−ビニル　− １−メ　ルキノリニウム（２１立Ｊ− 沃化１．２−ジメチルキノリニウム（０，３０ｇ、１．１ｅｍｏｌ）　、シリン グアルデヒドベンゾニー）　（２ｅ）（０，３１ｙ、　１　、１　ｍｍ＋ｏ１） および酢酸アンモニウム（０，１０ｇ。

１　、　ｌ　ｍｍｏｌ）のメタノール（１５ｍｌ’）撹拌溶液を還流しながら加 熱し、透明なオレンジ色溶液を得た。そしてこの溶液から黄色の沈澱が直ちに形 成された。１時間後に反応混合物を冷却し、沈２１！物を炉別し黄色粉末である （２１ｅ）（０，４５ｇ、７４％）が得られ、輪、ｐ、２４０〜２４５℃、実測 値：Ｃ，５６゜８６：Ｈ，４，２５；Ｎ。

２．７１　、　ＣｚＪｘ＜ＴＮＯ＜・２１１．０、計算値：Ｃ，５８，６０；Ｈ ，４゜３７：Ｎ、２．５３％）であった。

本ベンゾエートは中程度に水溶性であり（０，２５ｅｍ）、ｐＨ８においてカル ボキシエステラーゼによって簡単に分解した。

゛イ２＝　２−　４−（β−見−ガークトピラノシルシ　−３−メト　ジフェニ ル　−ビニル　−１−メル　）１　ニ　ム　２１ｃ ４−ホルミル−２−メトキシフェニルβ一旦−ガラクトピラノシド（１ｃ　）　 （０，１２ｇ、　０．３７ｓｓｏ１）　、沃化１．２−ジメチルキノリニウム（ ０，１０ｇ、０．３７ｓｓｏ１）および酢酸アンモニウム（０，０６ｇ、０．８ 餉鋤ｏ１）のエタノール（ＬｏＴａｌ）撹拌懸濁液を還流しながら加熱し、均質 な混合物を得、これは直ぐにオレンジ色になった。１時間後、ｔ、１．ｃ、（ク ロロホルム−メタノール、５：４）は、アルデヒドがほぼ非可動性のオレンジ色 生成物に完全に変化していたことを示した。溶液を冷却し、濾過し、集めた生成 物をエタノールで徹底的に洗浄し、オレンジ色の結晶固体である（２１ｃ）（０ ，１６ｙ、７２％）を得たが、＠、１）、２２５℃、［α］Ｄ−１８°　（ｃｌ 、ＤＭＳｏ）であった。

本”化合物は水溶性が非常に大きく、Ｅ、Ｃｏ１１　β−ガラクトシダーゼ（Ｋ ｍｖＪｏ、２）に対し優れた基質であり、濃度が０．５　ｍＭのとき９０％のＶ 　ｗａｘが達せられた。

ｐＨ１０のｔｆ衡液においては、遊離したフェノールはλ＋ｍａｘ　５１５　ｎ 　ｍ　（ｔ　４２，０００）であり、ＤＡＢＣＯｔｌ衝液においては５３５　ｎ ｍ　（ε４６，５００）であった。

”　４−　２−　４−（β−見回−−トピーノシルシ　−　−シ　ェニル　−ビ ニル　−−ル　ノ１ニウム　２３ｃ ４−ホルミル−２−メトキシフェニルβ一旦−ガラクトピラノシド（ｌｃ）（０ ，２０ｙ、０．６３ｖ＋＋ｏｆ）　、沃化１．４−ジメチルキノリニウム（０， １８，，０，６３ｍｍｏｌ）および酢酸アンモニウム（０，１５ｙ、１．９ｍ輪 ０１）のエタノール（２０ｍｇ！ｇ濁液を、撹拌しながら６０〜７０℃で１時間 加熱し、そのとき、　ｔ、ｉ、ｃ、　（クロロホルム−メタノール、５：４）が 、アルデヒドはほぼ非可動性の黄色生成物に完全に変化したことを示した０反応 混合物を冷却し、濾過し黄色固体を得、これをエタノール、・アセトン、エーテ ルで順次洗浄し黄カラシ色の固体である（０．３３ｙ、９０％＞（２３ｃ）が得 られ、ｍ、ｐ、２１６〜２２０℃（分解）、［α］Ｄ−１７°　（ｃｌ、ＤＭｓ Ｏ）　（実測値：　Ｃ，４８，８９、Ｈ，５，２８、Ｎ。

２　、３６　、　Ｃｚｓ［Ｉｚ＊ｌＮ０ｔ・２Ｈ，Ｏ、計算値：　Ｃ，４８，６ ３。

Ｈ，５，２２，Ｎ、２．２７％）であった。

本化合物は水溶性が非常に大きく、Ｅ、Ｃｏ１１β−ガラクトシダーゼ（Ｋｍ約 ０．０６２＞に対し優れた基質であり、濃度が０．５ｍＭのときに（さらに濃度 が高いと僅かに基質阻害が認められたが）９０％のＶｍａｘが達せられた。ｐＨ １０の緩衝液においては、遊離したフェノールはλ−ａｘ　５２５　ｎｍ　（ε ３５．Ｇｏｏ）であり、ＤＡＢＣＯＨ衝液においては５６０　ｎ　ｍ　（ε３７ ，０００）　１：’あった。

＋−−−　−々　＃　−−１ ン−β−見−グルコビラノシルオ　シ　−３−メトキシｂ） ４−ホルミル−２−メトキシフェニル２−アセトアミド−２−デオキシ−β一旦 −グルコピラノシド（１ｂ）（０，２５ｙ、０．７０ａ＋ｍｏ１）と沃化１，４ −ジメチルキノリニウム（０，２０ｇ、０．７０−餉ｏ１）とを、酢酸アンモニ ウム（０，１６ｙ、２．１−醜０１）とアンモニア（濃）（０，１２ｍ／）を含 有したエタノール（２０ｍｌ）に溶かした撹拌溶液を６０〜７０℃で加熱した。

得られた混合物は直ちにオレンジ色となり、ｔ、１．ｃ、　（クロロホルム−メ タノール、５：４）が示したように１．５時間後に反応は完了した。固形物は炉 別し、順次これをエタノール、アセトン、エーテルで洗浄し微細な黄色固体（０ ，３４ｙ、７８％）である（２３ｂ）が得たが、ａ＋、ｐ、２０７〜２１２℃（ 分解）、［α］Ｄ＋２８’　（ｅ　１．ＤＭＳＯ）（実測値：Ｃ，５２，１２， Ｈ，５，０１：Ｎ、４．７８゜Ｃ２Ｊ３１ＴＮ２０ｔ　、計算値：Ｃ，５２，１ ０，Ｈ，５，０２゜Ｎ、４．５０％）であった。

シ　−３−メト　ジフェニル　−ビニル　−１−メ配く匹乏ニュＡ　（１７Ｃ） ４−ホルミル−２−メトキシフェニルβ一旦−ガラクトピノシド（ｌｃ）（０， １２ｙ、０．３８働細０１）、沃化１゜２−ジメチルビリンジニウム（０，１２ ｙ、０．５１　ｍｍｏｊりおよびメタノリックナトリウムメトキシド（ＩＭ。

０゜３８輪１．０．３８＋ｕａｏ１）をメタノール（１０ｄ）中でこれら化合物 が完全に溶解するまで注意深く加熱した。

ついで得られた反応混合物を室温に冷却した。約２時間後に黄色の沈澱が分離し はじめた０反応混合物を一晩（１８時間）放置後、沈澱を炉別し、メタノールで 充分洗浄し、微細な黄色固体である（１７ｃ）（０，１１ｙ、５４％）が得られ 、鍵、ｐ、２１０〜２３０℃（分解）、［α］　Ｄ−１４°　（ｃｌ、ＤＭＳＯ ）であった。

”　２−　２−　４−；、スホロ　ル　シー　−メジフェニル　−ビニル　−１ −メ　ルキノリニウム±λ上エエ 部分的に溶解したフェノールと沃化２−　［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキ シフェニル）−ビニル］−１−メチルキノリニウム（２１ａ）（０，２８ｙ、０ ．６７ｍ−ｏｊりを乾燥ピリジン（５＠１）に撹拌溶解した赤錆色溶液に対して オキシ塩化燐（０，１０ｍ１．１．１ｍｍｏｊりを注意深く添加した０発熱反応 が起こったが、反応混合物は均質のままで顕著な色の変化は生じなかった０反応 混合物の少量サンプルを定期的に採取し、フェノールの存在をモニターするため 塩基性化した。３時間後にも、相当ｌのフェノールが未反応のまま存在していた 。そこでさらにオキシ塩化燐（０，１０ｍｊ！、　１．１−輪０１）を添加した 。オキシ塩化燐エステル錯体を加水分解するために少量の氷を添加して急冷する に先立ち、反応混合物をさらに３０分間撹押した１反応混合物は最初均一になる が、少量の黄色の沈澱が直ぐに生成しはじめた。ピリジン−水溶媒は回転エバポ レーター蒸発し、残留分をエタノールで振とうして微細な固体を分離した。この 固体を炉別しエタノールとアセトンで洗浄した結果、黄色の非常に吸湿性の高い 生成物（０，１４９）が得られ、これを湿り空気に暴露すると漬れて赤色のシロ ップとなった。

これは非常に水に溶けやすく、淡黄色の溶液になり、アルカリ性の燐酸塩と急速 に反応して、これに対応するフェノールが遊離した。しかしこの化合物は極端に 吸湿性のため、貯蔵が不安定であった。

”　２−　２−　４−ホスホロイル　キシ−３５−ジメト　ジフェニル　−ビニ ル　−１−メエ少コし！−ｉミに皇ム　２２ｆ　ビージニウム オキシ塩化燐（０，１０ｍ１．１．１ｍｍｏＩ）を沃化２−［２−（４−しドロ キシ−３，５−ジメトキシフェニル）−ビニル］−１−メチルキノリニウム（２ ２ｅ）（０，２９１Ｆ、　０．６５ｍｍｏｊ’）の乾燥ビリデン（５＠１）の水 冷撹拌懸濁液に注意しながら添加した。この添加が終了したら、水冷は中止し、 さらに３時間撹拌した。得られた混合物は不均質のままであったが、反応時間中 に色が赤からオレンジに変わった。そして反応混合物を氷で急冷したところ、均 質になったが生成物が直ちにオレンジ色の固体になって分離した。混合物を蒸発 舵面し、得られた固体はメタノール（５０＠ｊ）で振とうし、次いでＰ別し、順 次エタノールとアセトンで洗浄し、オレンジ粉末である＜２２ｆ）（０，２５ｐ 、約６６％）を得た。

本生成物は、非常に水に溶解しやすく、アルカリ性ホスファターゼ（Ｋｍｏ、６ ８ｍＭ）の優れた基質であり、濃度が０．５　ｍＭのときＶｍａｘが４２％に達 した。

４−　２−　４−ホスホロイル　シー３５−ジメトシフェニル　−ビニル　−１ −プロピル　ノ１ニウム沃化４−　［２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキ シフェニル）−ビニル］−１−プロピルキノリニウム（２５ａ）（０，５９ｇ、 １．２ｍｍｏ＃）の水冷無水ピリジン（１０＠ｊり撹拌懸濁液に注意してオキシ 塩化燐（０，１２−〇、　１．２ｗ＋ｍｏ１）を添加した。添加終了次第、混合 物を室温にした０色は赤くなり、混合物は均質となった。１号時間後に氷によっ て分解し、ピリジンと余分の水を回転エバポレーターで除去するに先立ち５分間 撹拌した。得られた残留固体は最後にエタノールで抽出し、残留塩化ピリジニウ ムをすべて除去し、モしてｒ過してオレンジ色粉末である双極性イオンの燐酸塩 （０，４０ｇ、７８％）、ｍ、ｐ、　１８５〜１９５℃（分解）を得たが、貯蔵 中に暗赤色に変化した（実測値：Ｃ，６１，３２；Ｈ，５，６９：Ｎ　、３　、 ０５　、Ｃ１Ｊ２３ＮＯＧＰ、計算値：　Ｃ，６１，６８、Ｈ。

５．４１　；　Ｎ、３．２７％）であった。

本燐酸塩は水溶性でありアルカリ性ホスファターゼ（Ｋｍｏ、１７６）に対して 優れた基質であり、濃度が１ｍＭのときＶＩＩＩＸが８６％に達した。遊離した フェノールは、λｓｉｘ　５５５　ｎｍ　（ＬＯ，ｐＨ１０）　ε３３，８００ ；λ―ａｘ　６０５ｎｍ　（４：　１の水−アセトン中のＤＡＢＣＯ）ε３３， １００であった。

沃化４−　（２−［４−（β−ｐ−−ビーノシルシ　−３５−ジメト　ジフェニ ル　−ビニル　−１ガラクトピラノシルド（２ｃ　）　（０，２０ｆ、　０．５ ８ｍｍｏｌ’）と沃化１，４−ジメチルキノリニウム（０，１７ｇ、０．５８ｍ ｍｏｉ’）　ｆ）、酢酸７’／−Ｔ−ニウム（０，１５ｙ、１．９繭−ｏｉ’） を含んだエタノール（２０＠ｆ）懸濁液を約６０’Ｃで５時間撹拌した０反応中 に生成した暗いオレンジ色の沈澱を炉別し、エタノールについでアセトンで洗浄 しオレンジ色の固体（２４ｃ）（０，２５ｇ、７０％）を得た。

本生成物は水に容易に溶解し、ＥＣｏｌｉβ−ガラクトシダーゼに対し良好な基 質であった。

シ　−３５−ジメト　ジフェニル　−ビニル　−１ガラクトピラノシド（０，１ ９ｇ、　０．５５ｍｍｏｌ）と沃化１゜２−ジメチルキノリニウム（０，１６ｇ 、０．５５鵬鋤ｏｆｆｉ）の、酢酸アンモニウム（０，１３ｙ、１　、７　ｓｍ ｏｌ）を含んだエタノール（２０ｓ＋１）懸濁液を約６０℃で５時間撹拌した。

反応中に生成した暗いオレンジ色の沈澱を炉別し、エタノールについでアセトン で洗浄しオレンジ色の粉末（２２ｃ）（０，２９＃、８６％）を得た。

本生成物は水に容易に溶解し、Ｅ、Ｃｏ１１　β−ガラクトシダーゼに対し良好 な基質であった。

４６−ジ　ゝ−−４−プロパノ　ル　シー３５−ジメト　シフェニルメ　シン　 −２−オ　ソー１−ジ　シ　ロヘ　ン（２８ｄ、ｎ＝１）シリングアルデヒドプ ロピオネート（２ｄ、ｎ＝１＞（２，３８ｇ＞を氷酢酸（２０ｄ）に溶解し、そ して２−チオバルビッル酸（１，５ｇ）の熱酢酸（１０＠ｊり溶液を加えた。得 られた反応混合物を約１分間還流しながら加熱したが、その間に赤橙色に変化し 、そしてオレンジ色の固体が分離した０反応混合物を１時間室温に放置し、生成 物を炉別して（２８ｄ、ｎ＝１）（２，８ｙ、ｓ、ｐ。

２５２〜２５４℃）を得た。

本化合物は、カルボキシエステラーゼに対して弱ないし中程度の基質であり、水 に対する溶解度は特に良好ではなかった。

ｌラム１−　ベンゼン−４−スルホネート　−４−４−ペンゾイルオ　シー３５ −ジメト　シフェニルメ　シン　−３−メ　ルー５−ピー　ロン　２ｅ１−（ベ ンゼン−４−スルホン酸）−３−メチル−５−ピラザロン（０，６１ｙ、０．６ ３ｍ５ｏ１）を酢酸カリウム（０，１９ｙ、１．９　ｓｍｏｊり　ヲ含有シｆ、 ：ｍ酢ＦＩｉ　（１０１ｍｌ＞　ＬＺ溶解した。得られた溶液を室温に冷却し、 シリングアルデヒドベンゾエート（２ｅ）（０，１８ｙ、０　、６３　ｍｍｏｆ ｆｉ）を加えた。溶液はすぐにオレンジ色に変わり、そしてオレンジ色の沈澱が 生じた。３時間後に沈澱を炉別し、アセトンで良く洗ってオレンジ色の固体であ る（２９ｅ）（０，３０ｙ、９０％）を得たが、ｍ、ｐ、＞　２５０　’Ｃ１（ 実測値：Ｃ，５１，１７：Ｈ，４，２５，Ｎ、４．６２、Ｃｚｓｆｌｚ＋ＮＪｓ ＳＫ”３Ｂ２０．計算値：Ｃ，５０，８１；Ｈ。

４．４３　：　Ｎ、４．５６％）であった。

本化合物はカルボキシエステラーゼに対する基質であった。

一ジエ　ルー４６−ジ　ゝ−５−４−ホスホロ　ル　シー３５−ジメ　シフェニ ルメ　シシー２−　ゝ−１３−シア　シ　ロヘ　ン（２７ｆ） バニリルｇＪ酸二ナトリウム（１ｆ）＜０．２ｙ、０．７２５ｍ５ｏｊり［ウィ リアムスおよびネイラー（Ｗｉｌｌｉａｓｓ　ａＶＩｄ　Ｎａｙｌｏｒ）による Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、（ｓｅｃｔｉｏｎ　Ｂ）、　１９７１．１９７３に従っ て調製した］を水（４ｍ！’）に溶解し、濃塩酸（１滴）を加え、次いで０．１ ５ｙ（０，７２，５ｍ＋ｓｏｊりの１．３−ジエチル−２−チオバルビッル酸を 加えた。得られた反応混合物を室温で２４時間保ったが、その間に少量の黄色の 固体が分離した。しかしこれを無視し、全混合物を減圧下で蒸発乾固し、固形物 を得た。これを水−アセトンー酢酸エチルで再結晶し、収率５４％、ｍ、ｐ、＞ 　２５０℃の前記燐酸塩＜２７ｆ）を得た。

これはｐＨ９のとき、水およびＴＲＩ　Ｓ）Ｉ衝液によく溶解し、アルカリ性ホ スファターゼによって分解し明赤色の溶液となった。遊離したフェノールはλｍ ａｘ５１４ｎ　ｍ　、（ｔ　３１，０００）であった。

λニエｌ二１１−（β−ｑ−−トビーノシル　シー　−メ　Ｓ）　ニル　−ビニ ル　−−ベンートビラノシド（ｌｃ）（３，１４ｙ、０．０１　ｍｍｏｌ）を熱 メタノール（２０＋＊ｉ’）に溶解し、これに２．３−ジメチベンゾチアジンウ ムトシレート（３，３５ｇ、０．０１　ｓｍｏｇ）を加え、さらにピペリジンを １滴滴下した。この混合物を２時間還流しながら加熱したところその間に強く着 色した。得られた反応混合物を冷却し、エーテル（２００納ｌ）を加えたところ 、オレンジ色の固体の生成物が沈澱し、これをメタノールで充分洗浄し、（２６ ｃ）（４，８ｇ、８０％）を得たが、論、ｐ、１４７〜１４９℃、［α］Ｄ−１ ０，４°　（ｃ　１．ＤＭＳＯ）、（実測値：Ｃ，５５，６６：　Ｈ，５，２８ ；　Ｎ、　２．１１　、Ｃ，，１（、、Ｏ，、ＮＳ２．計算値：Ｃ，５５，５４ ；Ｈ，５，２８：Ｎ、２．１６％）であった。

本ガラクトシドは非常に水に溶けやすく、ｐ　Ｈ６，８で処理した時、反応をお こして深い赤紫色の溶液となった。

本ガラクトシドに最適なｐ）（はｐ　Ｈ６，５でＫｍＯ，２３ｍＭで、９５％の Ｖ　ｗａｘは濃度１ｍＭのときに達せられた。しかし、０．７　ｍＭをこすと基 質阻害が表れはじめた。遊離したフェノールはｐＨ９，２においてλｗａｘ　５ ２０ｎｍ、（ε９３，０００）であった、２０％のアセトンが存在するときＤＡ ＢＣＯｔｌ和衝液は、λｗａｘ５４０ｎｍ、（ε１００，０００）であった。

−グルコサミニダーゼの測定に使用するキットの配合グルコサミニド（４ｂ）を 乳鉢と乳棒を用いて粉砕し微粉末にした。

ｔｌＩ衝剤塩の混合物を、くえん酸−水塩（７４ｙ）と無水燐酸水素二カリウム （８６ｇ）をマ七レータ−（バルブ製造ｆｉりやコーヒー挽き機で挽いて用意し た。この２成分を充分に混合し、その０．２９を１０蒙１’の水に溶解したとき ＰＨが４．５±０．１になるようにすることが重要である。

上記グルコサミニド（４，１ｇ）を上記ＭｆＦｒ剤塩の混合物１００ｇと混合し 充分に振とうし、淡黄色の固形物であるｒ混合物Ａ」を得た９本混合物の２ｇを １０ｍＡ’の水に溶解し、ＰＨが４．５±０．１である、基質の燐酸塩−くえん 酸緩衝剤溶液を得た。

「停止用緩衝剤」を１，４−ジアザビシクロ［２，２゜２］オクタン（ＤＡＢＣ ｏ）（１１２ｇ）をアセトン（８００納ｌ）と水＜２００ｍ１’）の混合液に溶 解して作製した。

本キットは２本の密栓した壜からなっており、その一本（容量：１２〜２０ｍ１ ’）には「混合物Ａ」が２ｇ入れてあり、別の一本には１０ｍ１の「停止用ｗｉ 、ｒｌｆｉ剤」が入れである。

友抹 「混合物Ａ」を１０１１Ａｌの蒸留水に溶解し「溶液Ａ」を用意する。この溶液 をサーモスタットで３７℃に調節した槽内で放置し、次にこの溶液の０．７５ｍ ｅを一連の容量２ｗｂｌの適当な管に入れる。これら管に激しく撹拌しながら、 試験すべき尿のアリコート０．０５ｍ１を添加する。

そして管のうちの一本に尿のかわりに０．０５ｍ１の蒸留水を入れてブランクと する。そして、これら管を一定時間（好ましくは３０分）温置し、次いで０．２ ５ｍ１の「停止用緩衝剤」を各管に添加し、５０５ｎｍにおける吸収（Ａ）を各 サンプルについて測定し、ブランク値に対し補正する。

各サンプルの中の酵素の酵素活性を、式およびε＝　４２，０００を使ってめる 。

酵素活性 ＝（＾／ｌ）　ｘ　１２３２ ここで、ｔ＝温直置時間単位：時間） 血゛　のアリレス−ラーゼ（ａｒ　１ｅｓｔｅｒａｓｅの　゛プロピオネート（ ｌｉｄ、ｎ＝１）（２２，４ｍｇ）を１００１ＩＡＩのｐＨ８のホウ酸塩緩衝液 ［ホウ酸（３，０９ｙ）と塩化カリウム（３，７３ｇ）を水（１０００ｄ　）に 溶解し、２Ｍの水酸化ナトリウム溶液を添加してｐＨ８に調整して準備した］に 溶解して、０．５ｍＭの基質（Ｋｍ＝０．０２５）溶液を用意した。

血清サンプルを測定に先立って１０倍に希釈した。基質溶液と希釈した血清をウ ォーターバスで事前的に３７℃で温置した。基質溶液め一定量（０，７５輪ｆ） を小さなプラスチック管（容量２ＩＩｆｆｉ）にピペットで移し、そして０．０ ５＠１の血清サンプルを各基質に添加し、激しく振とうして確実に混合した。ブ ランクは血清のかわりに水（０，０５ｍ１’）を用い試験した１反応は１０分後 に停止用１ｆ衡剤［ＤＡＢＣＯ（２２，２ｇ）　を水（２００ｍｌ）！：：ｉ解 して作成し、そしてＰＨを少量の濃塩酸を添加して１０に調整し、これにアセト ンを加えて１０００＋ｓ／とした］を０．２５ｍ１加え停止した。吸収（Ａ）は ５２９ｎｍにおいて測定し、酵素活性度はε＠ｉｘ　＝　４７，５００にもとづ いて計算した。

酵素活性 ＝（Ａ八）Ｘ４４２１ ここで、ｔ＝温買置時間単位二時間） カルボン酸ヒドロラーゼＥ、Ｃ，３゜１，１．１の測定安息香酸エステル（１１ ｅ）はカルボキシエステラーゼの測定に適しており、基質濃度は０．２５ｍＭ　 （ＫｍＯ，０３３ｍＭ）とした、それ以外は全て上記と同一の方法に従った。

酵素活性 ＝（＾ハ）Ｘ４４２１ 図１一般的説明 図２ 図３ 図４ 図　５ 図６ 補正書の翻訳文提出書く特許法第１８４条の８）平成　２年　３月１２日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．所与の酵素の作用を受けて遊離し着色生成物を与える、発色団でラベルした 測定すべき前記の所与酵素に適応する基質からなる酵素測定用試薬において、前 記発色団が、一般式： −Ｘ−アリル−（ＣＲ＝ＣＲ′）ｎ−Ｈｅｔ［式中、アリルは任意のアリル基で あり、ｎは０ないし３、ＲとＲ′は任意の融和性のある基、Ｈｅｔはアリル基の 電子の非局在化を拡大できる任意の複素環式基、Ｘは基−Ｏ−または−ＮＲ−（ 式中、Ｒは酵素に障害を与えない任意の融和性のある基）から選択したものであ る〕を有することを特徴とする、前記酵素測定用試薬。
2. ２．前記アリル基が可溶化往（親水性）基を取り入れているフェノール基である 、請求の範囲第１項に記載の試薬。
3. ３．前記複素環式基が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ａは基Ｏ，Ｓ、またはＮＲ（式中、ＲはＨ、アルキルまたは他の任意の 融和性のある基）から選択したもの。 Ｘは基０，Ｓ、またはＮＲ（式中、ＲはＨ，アルキルまたは他の任意の融和性の ある基）から選択したもの。 Ｙは基Ｃ＝０、Ｃ＝Ｓ、またはＣ＝ＮＲ（式中、ＲはＨ，アルキルまたは他の任 意の融和性のある基）から選択したもの。 Ｚは図２に例示のように、窒素が結合した融和性ある基である。 さらに、Ｒ７はＨ，アルキル、アリルまたは他の任意の融和性のある基である］ を有する、請求の範囲第１項または第２項に記載の試薬。
4. ４．前記複素環式基が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ａは基Ｏ，Ｓ、またはＮＲ（式中、ＲはＨ、アルキルまたは他の任意の 融和性のある基）から選択したもの。 Ｘは基Ｃ−アルキル，Ｃ−アリル、または他の任意の融和性のある炭素が結合し た基）から選択したもの。 Ｚは図３に例示のように、窒素が結合した融和性ある任意の基である。 さらに、Ｒ７はＨ、アルキル、アリルまたは任意の融和性のある基である］を有 する、請求の範囲第１項または第２項に記載の試薬。
5. ５．前記複素環式基が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ａは図５に例示のように、窒素が結合した融和性ある任意な基である。 Ｘ，ＹおよびＺは、基Ｏ，ＳおよびＮＲ（式中、ＲはＨ、アルキルまたは他の任 意の融和性のある基である）から独立的に選択できる基である。 さらに、Ｒ７はＨ、アルキル、アリルまたは任意の融和性のある基である］を有 する、請求の範囲第１項または第２項に記載の試薬。
6. ６．ｎが１ないし３の範囲に在り、しかも前記複素環式基が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１１はアルキル、アリルまたは他の任意の融和性ある基であり、そし てＲａ、Ｒｂ、ＲｃとＲｄは基Ｈ、アルキル、アリルまたは他の任意の融和性あ る基のなかから独立的に選択が可能で、しかも独立であるかまたは結合して図４ に例示のように飽和または不飽和なリング構造を形成する］を有する、請求の範 囲第１項または第２項に記載の試薬。
7. ７．ｎが１ないし３の範囲に在り、しかも前記複素環式基が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１１は請求の範囲第６項の場合と同一の意味を有し、そしてＲａとＲ ｂは基Ｈ、アルキル、アリルまたは他の任意の融和性ある基のなかから独立的に 選択が可能で、しかもＲａとＲｂは独立であるかまたは結合して図６に例示のよ うに飽和または不飽和なリング構造を形成する］を有する、請求の範囲第１項ま たは第２項に記載の試薬。
8. ８．酵素の作用で生じたフェノールがセルロースまたはセルロース誘導体に対し て高い親和性を有する、請求の範囲第６項または第７項に記載の試薬。
9. ９．二つの部分、すなわち： （ｉ）緩衝剤を含有した水溶液における、請求の範囲第１項または第８項のいず れかに記載の試薬、と （ｉｉ）アセトン−水混合液におけるアセトン可溶性塩基を含む停止用緩衝剤、 とからなる酵素キット。
10. １０．アセトン可溶性塩基が１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オクタン（ ＤＡＢＣＯ）である、請求の範囲第９項に記載の酵素キット。