JPS6241710B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（序論） 本発明は、或る種の分析対象物成分の存在につ
いて試験試料を分析するのに有用な新規な化合物
に関する。これらの分析対象物には、白血球、エ
ステラーゼ及びプロテアーゼが含まれる。尿中の
白血球の検出は医学上の診断において特に重要で
ある。 患者の尿中に異常なレベルの白血球が存在する
ことは、腎臓又は尿生殖器路の感染又は他の機能
不全（dysfunction）のような病理学的状態を表
わしていることがあり得る。そのため尿中白血球
の正確な情報は医師にとつてこれらの病気を診断
し治療するための有用な道具となりうる。 従来の医療業者は、尿中の沈澱物又は遠心分離
されていない尿中の白血球の個数を数える目視に
よる測定方法に依存して来ているが、それは遠心
分離器及び顕微鏡のような高価な機器並びに臨床
医師の側の過度の時間の消費を必要とする方法で
ある。また従来の方法には、完全な細胞
（intactcells）しか測定されないという難点があ
る。尿系に存在する白血球は、広汎な細胞溶解に
有利となり得る条件の下におかれる。例えばPH値
の異常に高い尿の場合には、白血球の半減期は非
常に短かく、60分程度になり得ることが知られて
いる。分解された細胞は目視検査技術による検出
を逃れるため、誤つた低い測定値又は間違つた陰
性（negatives）を得ることがある。 白血球の２つの顕微鏡分析技術−尿沈澱及び非
遠心分離均質化尿−のうち、明らかに前者の方法
が最も望ましい。後者の方法によれば、信頼でき
る結果は得られるが、非常に多くの場合に、沈澱
尿の観察が用いられている。尿試料は遠心分離
し、沈澱物を単離し、顕微鏡検査に付さなければ
ならない。検査者は、視野内に現われた白血球の
個数を数える。しかしこの作業は、上皮細胞及び
塩粒子のような沈澱物中の他の尿成分の存在によ
つて更に複雑になる。沈澱成分の量が可変なこと
と、その他の複雑化要因例えば試料の不均質及び
顕微鏡装置間の光学的出力の差異などが組み合わ
されて、最終的な測定値に大きな誤差を生ずるこ
とがある。 多くの時間を要する技術並びに経費のかかる装
置を無用とし、エステラーゼ、プロテアーゼ及び
白血球の細胞（細胞が完全であろうと溶解してい
ようとにかかわらず）に正確に応答する、簡単で
すみやかな白血球測定方法は、実際大きな技術上
の進歩をもたらすであろう。本発明はそのような
飛躍的進歩をもたらすものである。更に、本発明
は、白血球を“見る”能力にではなく、白血球が
示す酵素活性（enzymatic activity）に基づくた
め、前述したような不正確さから実質的に免れて
いる。 （発明の背景） 酵素活性（enzymatic activity）によつて開裂
された時に色その他の検出可能な物質を形成する
或る種のエステルの使用は、従来から、多数の文
献に記載されている。かくして、英国特許第
1128371号には、体液中の加水分解酵素の検出に
とつて有用なクロモゲン（色原体）として、イン
ドキシルエステル及びチオインドキシルエステル
を用いることが開示されている。酵素はエステル
を開裂して遊離インドキシルを生成させ、このも
のは次に酸化し、容易に観察可能な青色の染料で
ある二量体生成物のインジゴを生成する。この活
性は、他の酵素の中でも特にコリンエステラーゼ
によると言われている。前記英国特許は、エステ
ル基質のインドキシル部分のほかに酸基が被検出
酵素との特別の関連において選択されることも教
示している。例えば、エステラーゼ又はリパーゼ
の検出のために酸基がそれぞれ酢酸塩又はラウリ
ン酸塩もしくはステアリン酸塩でありうることが
記載されている。ホスフアターゼ又はスルフアタ
ーゼのような酵素を検出するためには、アシル基
は、無機であつてもよい。従つて前記英国特許
は、エステル分解酵素を測定するための基質とし
て、色原体エステルの使用を教示していると見る
ことができ、これらのエステルは、エステルのア
ルコール部分として、インドキシル又はチオイン
ドキシルを含み、アシル部分は、測定するべき特
定の酵素に役立つように適合させられる。 アシル基がＮ−保護されたアミノ酸又はペプチ
ドから成るエステルに対するエステラーゼ特異性
を実証している下記の２つの文献ほど、アシル基
の注意深い選択の効果がより明瞭に例示されてい
る文献はない。即ち、ヤノフ（Janoff）ほかの
「Proc.Soc.Exper.Biol.Med.」136：1045〜1049
（1971）は、アラニンエステルが人の白血球から
得られたエステラーゼの特異的基質であることを
教示している。この文献は特に人の白血球顆粒の
抽出物がＮ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラ
ニル−Ｌ−アラニンメチルエステルを加水分解し
うることを教示している。更に、該抽出物は、Ｌ
−アラニン−ｐ−ニトロフエノールエステルを同
様に加水分解し、黄色のｐ−ニトロフエノール発
色体を生成させる。 また、スイートマン（Sweetman）ほかの、
「Jour.Hist.Soc.」22：327−339は、エステラー
ゼの存在を示すために１−ナフチル−Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン
と同様に、１−ナフチル−Ｎ−アセチル−DL−
アラニン及び１−ナフチルブチレートを用いるこ
とを開示している。 米国特許第4278763号は、ボーリンゲルマンハ
イム社（Boehringer Manheim GmbH）に譲渡
されているが、これらの教示を組合せて白血球の
エステラーゼ活性の伝統的な色原体基質の更に別
の例として、アミノ酸又はペプチドのインドキシ
ル又はチオインドキシルエステルに到達してい
る。更に、米国特許第4278763号は、エステル分
解傾向（esterolytic penchants）におけるプロテ
アーゼ及びエステラーゼの同等性を教示してい
る。周知のように、エステル加水分解反応は、多
くのアルコール類を含む多くの求核剤の存在によ
つて活性化させることができる。即ち、エステラ
ーゼによるｐ−ニトロフエニルアセテート及び酢
酸フエニルの加水分解速度は、メタノール及びブ
タノールを添加すると、2.5〜5.5倍に増大する
（グリーンザイド（Greenzaid）及びイエンクス
（Jencks）「生化学」10(7)、1210−1227（1971）
参照）。更にその効果は、ｎ−アルキル基の長さ
と共に増大する（ウイン（Wynne）及びシヤラ
テイン（Shalatin）、「ユーロピアン・ジヤーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.
Biochem.）」、31、554−560（1972）参照）。 特に、アルコールのこの活性化効果は、アミノ
酸エステルについて観察されている。ｐ−ニトロ
フエニルＮ−アセチル−Ｌ−アラニネートの加水
分解は、メタノールの存在によつて活性化（加
速）される。フアストレツ（Fastrez）及びフエ
ルシト（Fersht）、「生化学」12(11)、2025〜2034
（1973）参照。高分子量アルコールは、ｐ−ニト
ロフエニル・ｔ−BOC−Ｌ−チロシネートの、
エステラーゼによつて誘発される加水分解の速度
を増大させる（アツシユ（Ashe）及びチンマー
（Zimmer）、「Biochem.and Biophys.Res.Comm.
」75(1)、194〜195（1977）参照）。米国特許第
4299917号には、他の既知のエステル加水分解活
性化剤、例えば或る種の金属錯体、ピリジン誘導
体及びイミダゾールが開示されている。 或る種のジアゾニウム塩を用いてフエノール及
び擬似フエノールと結合させアゾ染料を生成させ
ることも知られている（マーチネツト
（Martinet）及びドルニエ（Dornier）、「Compt.
Rend.」、170，592（1920）参照）。この技術をエ
ステラーゼ分析に使用して、酢酸インドキシルを
エステラーゼにより加水分解してインドキシルを
生成させ、このものを次にジアゾニウム塩と結合
させて対応するアゾ染料を生成させる（ホルト
（Holt）及びヒツクス（Hicks）、「J.Cell Biol.」
29，361〜366（1966）；ゴツスラウ（Gossrau）
「組識化学」57，323〜342（1978）；西独国特許
公開公報第31 17 721号（出願日、1980年５月９
日）参照）。 医療診断分析とは明らかに類似していないが長
い間多くの実験有機化学の方法の宝庫であつた技
術である染料化学は、或る種のアミノ酸及びその
環化反応について、いくらかの指針を与える。即
ち、β−フエニルグリシド酸の塩にグリシンを添
加し、次に高温の無水酢酸で処理することによつ
てピロールを形成することは、公知である。（マ
ーデルング（Madelung）及びオーベルマン
（Obermann）、「ベリヒテ（Ber.）」63，2870
（1930）参照）。 （発明の概要） 本発明は、試験試料中の白血球、エステラーゼ
及び／又はプロテアーゼの存在を測定するうえで
有用な新規な化合物を提供するものである。 この化合物は、構造式： （式中、Ａは−COCH₃又は

【式】 を表すが、このときTsはトシルを表し；Ｒは炭
素原子数１〜６を有する低級アルキル基、フエニ
ル又はクロロフエニルを表し；Ｒ〓は水素又は炭
素原子数１〜６を有する低級アルキル基を表し；
ＸはNR′を表すが、このときR′は水素又は炭素原
子数１〜６の低級アルキル基を表す） によつて示される化合物である。 本発明による製造方法は、構造が、式 （式中、ＢはＮ−ブロツクされたアミノ酸残基
又はＮ−ブロツクされたペプチド残基であり、Ｒ
は低級アルキル、アリール、カルボキシル、カル
ボキシルエステル、アミド又はシアノであり、そ
して、Ｒ〓はＨ又は低級アルキルである） によつて表わされるエステル（）の製造に関す
る。 この方法は、 (a) 構造式 を有する３−ヒドロキシピロールを生成させ、 (b) Ｎ−ブロツクされたペプチド又はＮ−ブロツ
クされたアミノ酸の酸ハロゲン化物を有機酸の
存在下３−ヒドロキシピロールに添加して、生
成物の混合物を生成させ、そして、 (c) 該生成物の混合物からエステル（）を単離
する 順次の工程から成ることを特徴とする。 前記工程(a)は、 (i) ケトン、アルカリ金属のモノ過硫酸塩及び構
造式 を有する化合物の混合物水溶液を、該混合物水
溶液のPHを少くとも７に保つに足りる量のアル
カリ金属重炭酸塩の存在下反応させて、第１反
応混合物を生成させ、 (ii) 該第１反応混合物にHOOC−CH₂−
NHR′（この時、R′は上に定義されている通
り）を添加して、第２反応混合物を生成させ、 (iii) 該第２反応混合物から水分を除去して、実質
的に乾燥した第２混合物を生成し、 (iv) 有機塩基の存在下該乾燥した第２混合物にカ
ルボン酸無水物を添加して、第３反応混合物を
生成させ、 (v) 工程(iv)によつて得た第３反応混合物を加水分
解環境に付して、３−ヒドロキシピロール含有
反応混合物を生成させ、 (vi) ３−ヒドロキシピロールを単離する 順次の工程から成る。 （定義） 次の定義は、本発明の範囲を明らかにし、製造
その製造及び使用を可能とするためになされる。 「酸残基」という表現は、特徴的な酸性の−
OH基のないエステル生成酸の誘導体構造を含
む。従つて、この用語は、リン酸、スルホン酸、
炭酸及び他のエステル生成性−OH基含有酸のア
シル部分を含む。 「Ｎ−ブロツクされたアミノ酸残基」及び「Ｎ
−ブロツクされたペプチド残基」という用語につ
いては、２つの点から定義する必要がある。「Ｎ
−ブロツクされた」とは、窒素原子に結合された
水素が、保護基、例えばアセチル、ｐ−トルエン
スルホニル（トシル（tosyl））及び第３ブチルオ
キシカルボニル（ｔ−BOC）及び他の当該技術
において周知のＮ−保護基により置換される、ア
ミノ酸又はペプチドのアミノ基の化学に関する。 「アミノ酸残基」及び「ペプチド残基」という
表現は、そのカルボキシル基の−OHのないアミ
ノ酸又はペプチド分子を意味する。 「アリール」という表現は、芳香族性を有する
全ての環系を意味する。この用語には、５員及び
６員の環、例えばピロール、フエニル、ピリジル
並びに縮合環系例えばナフチルも含まれる。従つ
て、芳香環系は、ヘテロ環式でも、ホモ環式でも
よく、また白血球細胞、エステラーゼ又はプロテ
アーゼを検出する能力において本発明の組成物又
は試験具の作用又は機能を置換基が妨害しない限
りで、置換基を有していてもよく、また有してい
なくてもよい。これらの置換基の選択は、本明細
書の開示があれば日常の実験室の決定事項とな
る。 本明細書中で使用されている「低級アルキル」
という表現は、炭素原子数約１〜６のアルキル基
である。低級アルキルの意味にはメチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、
第２ブチル、第３ブチル並びにペンチル及びヘキ
シルの全ての異性体が含まれる。これらは置換さ
れていなくとも、また、白血球細胞、エステラー
ゼ又はプロテアーゼの検出能力において試験具又
は組成物の作用ないしは機能が置換基によつて妨
害されない限り、置換されていてもよい。これら
の置換基は、本明細書の開示があれば、日常の実
験室の決定により選択することができる。 （発明の詳細） 本明細書の請求の範囲に示された化合物は、特
別の需要に適合するようにそのアルコール（フエ
ノール）及びアシル部分を選ぶことのできる広範
なエステルを含む。従つて、アルコール部分は、
特定の所望の応答例えば特定の色又は吸光性を与
えるように適合させ、またアシル部分は検出しよ
うとする特定の分析対象物に従つて選択すること
ができる。 アルコール部分 エステルのアルコール部分は、非局在化し、環
中の２重結合と協調して芳香族性を生ずることが
あり得る電子対を有するヘテロ原子を含むという
点で、擬似フエノールである。従つてヘテロ原子
Ｘは、酸素、イオウ又は窒素であり得る。Ｘが窒
素である場合に、原子の置換はなされていなくて
も（即ちNHでも）低級アルキル又はアリール基
により置換されていてもよい。化合物はこの芳香
族性の結果として、エステルの加水分解後に容易
にジアゾニウム塩と結合してアゾ染料となりう
る。 環の５−位の種々の置換基によつて色形成及び
貯蔵安定性が向上することが見出された。即ちＲ
は、白血球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼ
を検出する能力について試験具又は組成物の作用
又は機能を妨害しない限り低級アルキル、アリー
ル、カルボキシル、カルボキシルエステル、アミ
ド、シアノ又はその他の置換基としてよい。白血
球、エステラーゼ又はプロテアーゼについて分析
する目的のためには、Ｒはフエニル又はｐ−クロ
ロフエニルであるエステルが好ましい。 アシル部分 アシル部分Ａは、同様に広範な範囲をもち、計
画された特定の分析目的により選定される。尿中
白血球の測定のように、エステラーゼ又はプロテ
アーゼの活性について試験試料を分析することが
必要な場合に、Ａは、アミノ酸又はペプチド残基
としてよい。この目的には、Ｎ−トシル−Ｌ−ア
ラニン残基が好ましい。 ピロール及びそのエステルの製造 本発明には、Ｎ−ブロツクされたアミノ酸及び
ペプチド（）の或るピロールエステルを合成す
る新規な方法も含まれる。この方法の第１工程
は、構造式（）を有する３−ヒドロキシピロー
ルの生成からなる。これは、構造式（）の化合
物を出発物質として始まる多工程の合成によつて
実現される。この化合物を、アセトン又は他のケ
トンの存在下反応させ、式 のエポキシド化合物を生成する。エポキシ化は
「オキソン（Oxone）」（デユポン社製）として市
販されているKHSO₅などのアルカリ金属のモノ
過硫酸塩を用いて行なうことが好ましい。アルカ
リ金属の重炭酸塩例えばNaHCO₃の過剰量の存在
下、即ちPH７以上で反応を行なつた場合、この工
程のPH制御（文献(1)：J.O.エドワーズ（J.O.
Edwards）ほか、「光化学及び光生物学
（Photochem.Photobiol.）」30，63（1979）及び文
献(2)：R.カーチ（R.Curci）ほか、「ジヤーナ
ル・オブ・オーガニツク・ケミストリ（J.Org.
Chem.））」45，4758（1980）参照）が著しく容易
になることが見出された。反応混合物を約20゜〜
30℃の温度範囲に保つことが好ましい（しかしこ
の温度範囲は決定的なものではない）。得られた
反応混合物を酸性化した後、有機溶剤例えば塩化
メチレンを添加することによつて、エポキシドを
有機相に抽出することができる。 次に有機相を塩基水溶液で洗浄する。この工程
によつて、エポキシドは水溶性になり、水相に移
される。水相は分離され、グリシンが添加され、
次式の複塩 を含む反応混合物を生成させる。 この工程は、塩基水溶液のPH値が約10.5〜12の
範囲にある時に最もよく行なわれることが見出さ
れた。（好ましいPH値は約11.5である）。この工程
の温度を好ましくは約100℃に上昇させ、低沸点
液体（アセトン及び水）の実質量を除去する。蒸
気温度が100℃に近くなつた時、約100℃において
還流が持続されるように加熱を維持する。冷却
し、有機溶剤例えばCH₂Cl₂で洗浄し、蒸発乾涸
して残留水を除いた後、溶剤例えばエタノール中
において沸騰させ、結晶を分離することによつ
て、化合物（）を残留物から単離する。 次に化合物（）を、カルボン酸無水物で処理
して、式 （式中、R″は低級アルキル又はアリールであ
り、Acは、無水物が無水酢酸である場合に酢酸
塩である）によつて表わされる化合物を生成す
る。この工程は、最初は周囲温度で行ない、最終
的には約90゜〜約140℃にまで加熱する。この工
程の眼目は、ピリジンのような有機塩基を含める
ことにある。好ましくは化合物（）を塩基中に
懸濁させ、次にこれを酸無水物を加える。 このようにして生成させた、化合物（）を含
有する反応混合物を蒸発乾涸して残留無水物及び
溶剤を除去し、生成物（）を回収する。 加水分解環境の下に化合物（）を処理し、式 の化合物を得る。加水分解環境として好ましいの
は、アルコール例えばメタノールと塩基水溶液例
えば2NのNaOHとの混合物である。化合物
（）、アルコール及び塩基水溶液を低温例えば約
−15℃〜約10℃で混合することが望ましい。一般
に化合物（）は、この温度で溶液から析出し、
例えば過によつて単離され、精製される。 製造方法の第２工程では、化合物（）をエス
テル化して、式 （式中、ＢはＮ−ブロツクされたアミノ酸又は
ペプチド残基である）によつて表わされる生成物
を生成する。化合物（）を、有機塩基例えばピ
リジン、及び有機酸例えばトリフルオロ酢酸、蓚
酸、くえん酸、酢酸又は他のカルボン酸を含有す
る無水物溶剤例えばテトラヒドロフラン
「THF」、ジエチルエーテルなどに添加する。こ
の目的に好ましいのは、ピリジン及びトリフルオ
ロ酢酸である。次にペプチド残基又は所望のブロ
ツクされたアミノ酸のハロゲン化アシルを徐々に
添加する。反応が終了したら、反応混合物を必要
によりくえん酸及び酢酸エチルなどの緩衝液を含
有した水で急冷し、生成物（）を回収する。 （実験） 以下の実施例は、本発明の製造及び使用におい
て読者をさらに助けるためのものである。従つ
て、好ましい実施態様を実験の詳細を示した記述
し、その効用について分析がなされる。これらの
実施例は、単に説明の為であり、決して、本明細
書において説明され請求される本発明の範囲を制
限する意図のものではない。 概活的資料 以下の実施例の記載に使用される略記号の意味
は次の通りである。 ｇ＝グラム Kg＝キログラム Ｌ＝リツトル mL＝ミリリツトル Ｍ＝モル濃度 mM＝ミリモル濃度 Ｎ＝規定度 lq＝当量 mol＝グラム分子（モル） mmol＝（グラム分子）×10^-3（ミリモル） aq＝水性（水溶液の） hr＝時間 TLC＝薄層クラマトグラフイー 赤外線（IR）スペクトルは、特に他の記載が
ない限り、CHCl₃中溶液として、パーキン−エル
マ−（Perkin−Elmer）710B又は237型赤外線分光
光度計によつて得た。ポリスチレンフイルムの
1602cm^-1帯を外部較正規準として用いた。信号は
cm^-1として記録した。 JEOL FX−900分光計を用いて89.55MHzで、
又はバリアン（Varian）Ｔ−60分光計を用いて
60MHzで、陽子磁気共鳴（ ¹H NMR）スペクト
ルを得た。他の記載がない限り、CDCl₃溶液中に
おいてスペクトルを得た。化学的シフトは、内部
標準テトラメチルシランから低磁場方向への百万
分率（ppm）で報告されている。 炭素−13磁気共鳴〔 ¹³C NMR〕スペクトル
は、フーリエ変換及び全陽子広帯域ノイズデカツ
プリングにより、JEOL FX90Q分光計を用い
て、22.5MHzにおいて得た。スペクトルは、他の
記載がない限り、CDCl₃溶液中において得た。炭
素シフトは、内部標準テトラメチルシランから低
磁場方向への百万分率で報告されている。 電子インパクト（EI）又は高速原子衝撃
（FAB）モードにおいて作動するヒユーレツト−
パツカード（Hew lett−packard）5985A分光計
を用いて、質量スペクトルを得た。AEI MS−
902型分光計によつて高分解能質量スペクトルを
得た。 有機試薬は、オールドリツヒ・ケミカル・カン
パニー（Aldrich Chemical Company）から入手
し、他の記載がない限り、精製せずに使用した。
無機試薬は、フイツシヤー・サイエンテイフイツ
ク・カンパニー（Fisher Scientific Company）
又は他の大手販売業者からのACS試薬用であつ
た。反応溶剤は、ACS試薬用、テトラヒドロフ
ラン（THF）は、ジエイ・テイー・ベイカー・
ケミカル・カンパニー（J.T.Baker Chemical
Company）からのHPLC用であつた。ブライン
（brine）は、塩化ナトリウムの飽和水溶液を指
す。 薄層クロマトグラフイー（TLC）は、E.メル
ク社（E.Merck）からのシリカゲル60F−254プ
レートを用いて行なつた。カラムクロマトグラフ
イーは、E.メルク社（E.Merck）のシリカゲル60
（70−230メツシユ）を用いて行なつた。ここに報
告される融点及び沸点は全て無修正値である。 化合物の合成 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５
−フエニルピロール(4)の合成 (4)の合成を次の反応連鎖によつて示す： Ｎ−トシル−Ｌ−アラニン Ｌ−アラニン（100ｇ；1.11mol）を、1Nの水
酸化ナトリウム（aq）2.25Lに溶解し、５℃に冷
却し、撹拌しながらトルエン450mL中のｐ−トル
エンスルホニルクロリド（218ｇ；1.11mol）溶液
を徐々に添加した。混合物を周囲温度で20hr（時
間）撹拌した。各層を分離し、冷却した水溶液層
を濃塩酸でPH１に酸性化した。白色−固体の表題
化合物を取し、水で洗浄し、乾燥させた。収率
178.5ｇ（66％）、融点134〜135℃であつた。IR
（CHCl₃）cm^-11726，1340，1165，1095； ¹H
NMR（DMSO−D₆）δ1.20（ｄ，Ｊ＝７，3H），
2.40（ｓ，3H），3.85（ｐ，Ｊ＝８，1H），6.4
（brs，1H）（CO₂H），7.41（ｄ，Ｊ_AB＝８，
2H）、及び7.75（ｄ，Ｊ_AB＝８，2H）（パターン
中心、7.58；ΔＶ_AB＝20.49Hz），8.03（br ｄ，Ｊ
＝８，1H）（NH）。 Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルクロリド 方法 Ａ Ｎ−トシル−Ｌ−アラニン（12.4ｇ；
0.05mol）と塩化チオニル（25mL）との混合物を
90分間55℃に加熱し、次に回転式蒸発器によつて
40℃で濃縮した。赤色の固体残留物を沸騰
CCl₄200mLに溶解し、オーブン乾燥「ノリツト
（Norit）」211（アメリカン・ノリツト社
（American Norit Co.，Inc.）製）20ｇによつて
脱色し、過し、冷却した。クリーム色の固形の
表題化合物を取し、ヘキサンで洗浄し、乾燥さ
せた。収率8.48ｇ（65％）、融点101〜101.5℃，
IR（CHCl₃）cm^-13360，3260，3025，1775，
1605，1350，1170，910； ¹H NMR（CDCl₃）δ
1.48（ｄ，Ｊ＝７，3H），2.43（ｓ，3H），4.33
（ｐ，Ｊ＝８，1H），5.93（br ｄ，Ｊ＝８，1H）
（NH），7.31（ｄ，Ｊ_AB＝８，2H）及び7.76
（ｄ，Ｊ_AB＝８，2H）（パターン中心、7.53；Δ
Ｖ_AB＝26.83Hz）。 元素分析値（C₁₀H₁₂ClNO₃Sとして）： 計算値：Ｃ，45.89；Ｈ，4.62；Ｎ，5.35 実測値：Ｃ，46.63；Ｈ，4.90；Ｎ，5.19 方法 Ｂ Ｎ−トシル−Ｌ−アラニン（3.1ｇ；13mmol）
と塩化チオニル（6mL）との混合物を、90分間50
℃で加熱し、乾燥ヘキサン50mLを用いて希釈し
た。混合物を素早く撹拌し、冷却し、固形物を
取した。収率3.15ｇ（93％）、融点99〜100℃。IR
スペクトルは、方法Ａにより製造した再結晶物の
ものと同一であつた。 ２−ヒドロキシ−３（カルボキシメチルアミ
ノ）−ヒドロ桂皮酸二カリウム塩二水化物(1) アセトン4.5L中のトランス桂皮酸1.0Kg
（6.75mol）の撹拌スラリーを最初にNaHCO₃
（2.47Kg；29.4mol；4.36eq）で、次に水（4.5L）
で注意深く処理した。得られた濃厚な混合物を
0.4mM水性エチレンジアミン四酢酸（EDTA）二
ナトリウム（14.5L；EDTA二ナトリウム２水化
物2.17ｇを蒸留水14.5Lに溶解させて製造した）
中のOXONE（オキソン）モノ過硫酸塩化合物
（3.78Kg；KHSO₅1.825eqを含有する）溶液によ
つて滴下状に1.5〜2.0時間かけて処理した。この
添加の間、水浴を用いて、反応温度を24〜27℃に
保つた。反応時のPHは約7.4であつた。反応終了
後に混合物を更に0.5時間撹拌した後、約10℃に
冷却した。反応混合物を濃塩酸（〜1.2L）を用い
てPH＝２の酸性とし、この間温度を約10℃に保つ
た。次に反応混合物をCH₂Cl₂（5.05L）で処理
し、10分間激しく撹拌した。 混合物を沈降させた後、水溶液層を傾瀉させて
除去し、不溶性塩を含有する有機層を紙によつて
吸引過した。取した固形物をCH₂Cl₂
（1.9L）を用いて洗浄し、この液を用いて水溶
液層を抽出した。取した固形物をCH₂Cl₂
（3.15L）で再び洗浄し、この液を用いて、水溶
液層を抽出した。１つにしたCH₂Cl₂層を、水
（6.31L）中のKOH（593.3ｇ）の溶液を用いて抽
出した。塩基による抽出の間に分離しうる固形物
を溶解するためには、約40℃までの緩徐な加熱が
屡々必要である。次に水（1.5L）中のKOH（99
ｇ）溶液を用いてCH₂Cl₂層を抽出し、１つにし
た塩基抽出液をグリシン（481.7ｇ；6.416mol；
0.95eq）によつて処理した。有機層は廃棄した。 25％KOH水溶液によつて上記水溶液のPHを
11.5に調節した後、加熱沸騰させた。低沸点液体
（アセトン−水）約900mLを、蒸気温度が99℃に
なるまで留去させた後、混合物を２時間還流させ
た。冷却後に反応混合物をCH₂Cl₂（3.15L）で抽
出し、CH₂Cl₂相は廃棄し、水相は減圧下に70℃
浴を用いて蒸発乾涸させた。残留物を95％エタノ
ール（EtOH）（8.83L）中において30分間沸騰さ
せ、撹拌下に徐冷した後、微細な結晶として生成
物を分離した。これらの結晶を過し、新しい95
％エタノール（1.26L）で洗浄し、50゜〜60℃オ
ーブン中で乾燥させ、融点120〜122℃（無修正）
の白色結晶として表題化合物（1.77Kg；74.6％）
を得た。 IR（KBr）cm^-13420（br.），1590（br.），
1410，1130，710； ¹H NMR（D₂O−TSP）δ
3.1（ｓ，2H），3.89（ｄ，Ｊ_AB＝４，1H）及び
4.52（ｄ，Ｊ_AB＝４，1H）；（パターン中心：
4.21；ΔAB＝18，83Hz），4.68（ｓ，6H、交換可
能な陽子）、7.4（ｓ，5H）；TLC Rf＝0.59
（EtOH：1M重炭酸トリエチルアンモニウム、
７：３）。 元素分析値（C₁₁H₁₅NO₇K₂として）： 計算値：Ｃ，37.59；Ｈ，4.30；Ｎ，3.99 実測値：Ｃ，37.22；Ｈ，4.24；Ｎ，3.96 Ｎ−アセチル−３−アセトキシ−５−フエニルピ
ロール(2) ピリジン（3.0L）中の２−ヒドロキシ−３−
（カルボキシメチルアミノ）−ヒドロ桂皮酸二カリ
ウム塩２水化物(1)（1.0Kg；2.84モル）の懸濁液
を不活性ガス雰囲気下周囲温度で無水酢酸
（4.0L）により処理した。次に緩徐な発熱反応を
行なわせ、反応温度は、1.5〜2.5時間の間60〜70
℃まで指数関数的に増大した。反応混合物が冷却
し始めた時に、15分間、120〜123℃まで加熱し、
次に１時間かけて室温まで冷却させた。この間に
酢酸ピリジニウムが結晶として分離した。混合物
を紙により吸引過し、無色となるまで酢酸エチ
ル（EtOAc）によつて塩を洗浄した。液は真
空下で蒸発乾涸させた。 暗赤色の残留物を酢酸エチル（3.0L）に溶解
し、水で３回（各回1.0Lずつ）洗浄し、MgSO₄
上で乾燥させ、「ダルコ（Darco）」−G60（アイシ
ーアイアメリカズ社（ICI Americas，Inc.）
製）（300ｇ）で処理した。30分間撹拌した後、
「セライト（Celite）」（ジヨンズ・マンビル社
（Johns−Mannville）製）により混合物を過
し、真空下に蒸発乾涸させ、赤橙色の油状物を得
た。この油状物を温２−プロパノール（1.2L）に
溶解させ、一晩かけて周囲温度まで徐冷して、固
形物を分離した。結晶状生成物を過し、50％２
−プロパノール水溶液で洗浄し、乾燥させ、融点
＝58〜60℃（無修正）の表題化合物を得た。一部
をジエチルエーテル（Et₂O）に吸収させ、「ノリ
ツト（Norit）」211で処理し、過し、減圧下で
濃縮した。０℃に放置し、無色の小さな針状の結
晶が析出した。これらの結晶を過し、Et₂O：
ヘキサン（１：１）で洗浄し、真空中において乾
燥させ、融点60〜62.5℃（無修正）の分析試料を
得た。 IR（CHCl₃）cm^-13020，1760，1730，1595，
1378，1320，1220（br.），1030，960，903， ¹H
NMR（CDCl₃）δ2.23（ｓ，3H），2.27（ｓ，
3H），6.18（ｄ，Ｊ＝２，1H），7.35（ｓ，5H），
7.42（ｄ，Ｊ＝２，1H）；TLC Rf＝0.56（トル
エン：ジオキサン、４：１）． 元素分析値（C₁₄H₁₃NO₃として）： 計算値：Ｃ，69.12；Ｈ，5.38；Ｎ，5.76 実測値：Ｃ，68.88；Ｈ，5.25；Ｎ，5.53 ３−ヒドロキシ−５−フエニルピロール(3) 微細に分割したＮ−アセチル−３−アセトキシ
−５−フエニルピロール(2)の少量（36.8ｇ；0.15
モル）を、10分間アルゴンガス流中において撹拌
することにより、脱酸素し、次に脱酸素メタノー
ル（MeOH）（379mL）中に懸濁させ、不活性ガ
ス雰囲気下（−15℃メタノール（MeOH）／乾燥
氷浴中で）−６℃に冷却し、2NのNaOH
（300mL）の氷冷脱酸素溶液によつてすみやかに
処理した。反応温度は、塩基の添加によつて直ち
に18℃に上昇し、反応混合物は３分後に均質にな
つた。反応混合物が冷却するにつれて化合物３が
微細結晶として析出した。15分後に、脱酸素冷
2Mくえん酸（150mL）溶液を添加し、得られた
混合物を10分間撹拌し、過した。生成物の空気
曝露を最小にするように注意しつつ固形物を脱酸
素水（200mL）で十分に洗浄し、一晩真空下で乾
燥させ、薄いピンク色の微細な針状の結晶として
表題化合物（22.3ｇ；93.6％）を得た。 IR（KBr）cm^-13400，3110，2900，1600，
1580，1555，1480，1268，1180，742，640； ¹H
NMR（DMSO−D⁶）δ6.1（ｍ，1H），6.3（ｍ，
1H），7.0−7.7（ｍ，5H），8.0（ｓ，1H），10.4
（brs，1H）；TLC Rf＝0.20−0.28（EtOH：
CHCl₃，１：９）． 元素分析値（C₁₀H₉NOとして）： 計算値：Ｃ，75.45；Ｈ，5.70；Ｎ，8.80 実測値：Ｃ，75.30；Ｈ，5.69；Ｎ，8.67 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５−
フエニルピロール(4) 不活性ガス雰囲気下０℃に保つた、無水テトラ
ヒドロフラン（THF，450mL）、ピリジン
（43.8mL；0.542 mol；1.2eq）及びトリフルオロ
酢酸（85.0mL；1.10mol；2.4eq）の溶液を、一
度に、３−ヒドロキシ−５−フエニルピロール(3)
（71.5ｇ；0.45モル；1.0eq）で処理し、その直後
に、新しく製造したＮ−トシル−Ｌ−アラニニル
クロリド（141.0ｇ；0.54mol；1.2eq）の無水
THF（450mL）溶液を、５〜10分かけて一滴ず
つ加えた。得られた混合物を15分間０℃で撹拌し
た。次に1.0M水性くえん酸溶液（315mL）と
EtOAc（1.35L）とを添加して反応混合物を急冷
した。簡単に混合させた後、各相を分離し、有機
相は、NaCl水溶液（360mL；水1mL当り
NaCl0.18ｇ）で洗浄した。次に有機相を２回５
％NaHCO₃水溶液（各々1.35L）で抽出し、次に
NaCl水溶液の別の少量（360mL；水1mL当り
NaCl0.18ｇ）で洗浄した。赤褐色の有機層を
MgSO₄（101ｇ）及び「ダルコ（Darco）」−G60
（143ｇ）と共に15分間周囲温度で撹拌した後、
「セライト（Celite）」によつて過し、37℃の浴
から真空下に蒸発乾涸させ、化合物(4)をピンク色
がかつた白色の固形物として得た。粗生成物を磨
砕して粉末状とし、温（50℃）THF（250mL）
中に溶解させ、強く撹拌し、ｎ−ヘキサン
（250mL）で希釈した。撹拌は周囲温度で１時間
継続し、この間に生成物が晶出した。固形物を
過し、液が無色となるまでトルエン（約1L）
で洗浄し、一晩乾燥させ、融点154.5〜155℃の白
色粉末として表題化合物（112ｇ；65％）を得
た。 IR（KCl）cm^-13350，3325，1760，1508，
1320，1155，770； ¹H NMR（DMSO−d⁶）δ
1.33（ｄ，Ｊ＝７，3H），2.36（ｓ，3H），4.13
（ｐ，Ｊ＝８，1H），6.25（ｍ，1H），6.73（ｍ，
1H），7.05−7.50（ｍ，5H），7.5−7.85（ｍ，
4H），8.42（ｄ，Ｊ＝８，1H），11.18（br ｓ，
1H）； ¹³C NMR（DMSO−d⁶）δ18.335，
21.001，51.370，98.061，108.336，123.423，
126.024，126.610，128.560，128.756，129.601，
132.397，137.600，138.380，142.737，169.919；
〔α〕_D＝−70゜（ｃ＝1.11，MeOH）；TLC Rf＝
0.45（EtOAc：ヘキサン、１：１）；TLC Rf＝
0.40（トルエン：ヘキサン、４：１）． 元素分析値（C₂₀H₂₀N₂O₄Sとして）： 計算値：Ｃ，62.48；Ｈ，5.24；Ｎ，7.29 実測値：Ｃ，62.62；Ｈ，5.27；Ｎ，7.30 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５−
フエニルチオフエン(9)の合成 以下の頁に概略を記述する文献に報告された方
法（文献(3)：ピー・フリードランダー（P.
Friedlander）及びエス・キールバシンスキー
（S.Kielbasinski）、「ヘミツシエ・ベリヒテ
（Chem.Ber.）」、45，3389，1912）；及び文献(4)
（エイ・アイ・コザツク（A.I.Kosak）、アール・
ジエイ・エフ・パルチヤツク（r.J.F.Palchak）、
ダブリユー・エイ・スチール（W.A.Steele）及
びシー・エム・セルウイツツ（C.M.Selwitz）、
「ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイエテイ（J.Amer.Chem.Soc.）」76，4450，
1954）をわずかに変更して、３−ヒドロキシ−５
−フエニルチオフエンを製造するための、一連の
実験を行なつた。得られたヒドロキシチオフエン
を次にＮ−トシル−Ｌ−アラニニルクロリドでア
シル化し、対応するＮ−トシル−Ｌ−アラニネー
トエステルを46％の収率で得た。（最適化されて
いない方法）。 ３−フエニル−１，２−ジチア−３−シクロペン
テン−５−オン(5) 桂皮酸エチル10ｇ（56.82mmol）とイオウ10ｇ
との懸濁液を、50mLフラスコ（反応中に生成す
るエタノールを除去するために蒸留ヘツド及び受
け器を備えたもの）中において４時間250℃に加
熱した。反応混合物を100℃まで冷却させ、還流
エタノール500mLに添加した。得られた沈澱物を
過し、沸騰アセトン500mLで１回、次にエタノ
ール500mLの分量ずつで２回次々にすりつぶし
た。１つにした上澄みを濃縮して黒色の固形物と
し、この固形物をメタノールから晶出させ、暗褐
色の針状結晶(5)を得た。「ノリツト（Norit）」を
用いたメタノールからの２回目の晶出と、「セラ
イト（Celite）」による過とによつて、融点113
〜115℃の淡黄色の針状結晶2.023ｇを得た。 IR（KBr）cm^-11650，1550，1390，1350，
1130，770； ¹H NMR（60MHz，CDCl₃）δ6.92
（ｓ，1H）7.58（ｍ，5H）；TLC Rf＝0.5（ジク
ロロメタン）． 元素分析値（C₉H₆O₂Sとして）： 計算値：Ｃ，55.64；Ｈ，3.11 実測値：Ｃ，55.53；Ｈ，3.47 シス−４−ケト−６−フエニル−３，７−ジチア
−５−ノネンジオイン酸(6) 94℃の硫化ナトリウム９水化物（148mmol）
35.48ｇの融解した溶液を、５分間かけて少しず
つ添加した３−フエニル−１，２−ジチア−３−
シクロペンテン−５−オン(5)6.65ｇ
（34.23mmol）で処理した。炭酸ナトリウムでPH
8.7に調節したH₂O60mL中のブロモ酢酸43.6ｇ
（314mmol）氷冷溶液に混合物を15分後に添加し
た。得られた溶液を、０℃、PH8.7に45分間保つ
た後、過した。液を０℃に保ち、5Nの塩酸
溶液でPH3.7の酸性とした。得られた混合物を一
晩５℃で撹拌した。上澄みを次に傾瀉し、得られ
た油状物をエーテルを用いてすりつぶした。無色
フオーム6.98ｇ（65％）が得られるまで油状物を
トルエンと共に蒸発せしめた。この物質は更に精
製することなく使用した。 分析試料をエーテル上澄みから得た。この上澄
みを濃縮し、酢酸とトルエンとで次々に蒸発さ
せ、エーテルと共にすりつぶして融点142.5〜150
℃の淡褐色の結晶を得た。 IR（KBr）cm^-11705，1655； ¹H NMR（60M
Hz，DMSO−D₆）δ2.06（ｓ，CH₃CO₂H不純物）
3.30（ｓ，2H），3.77（ｓ，2H），5.67（ｍ，Ｏ
Ｈ），6.37（ｓ，1H），7.43（ｍ，5H）；TLC Rf
＝0.85（クロロホルム：メタノール：酢酸、５：
５：１）． 元素分析値（C₁₃H₁₂S₂O₅として）： 計算値：Ｃ，50.00；Ｈ，3.88 実測値：Ｃ，50.26；Ｈ，3.98 ３−ヒドロキシ−５−フエニルチオフエンアセテ
ート(7) 粗シス−４−ケト−６−フエニル−３，７−ジ
チア−５−ノネンジオイン酸(6)3.4ｇ
（10.9mmol）、酢酸ナトリウム3.40ｇ
（41.5mmol）及び無水酢酸0mLの、強く撹拌した
懸濁液を、加熱して１時間還流した。混合物を冷
却し、次に過し、蒸発させ、黒色の油状物を得
た。この残留物を酢酸エチル75mLに溶解させ、
氷冷飽和重炭酸ナトリウム溶液50mLを用いて３
回抽出した。次に有機物を、ブラインで洗浄し、
硫酸ナトリウム上で乾燥させ、過、蒸発させ、
黒色固形物2.826ｇを得た。粗生成物(7)を、120〜
140℃、0.1mmＨｇで蒸発蒸留により精製し、淡橙
色の油状物1.235ｇを得たが、このものは、放置
後に固化した（52％）。 IRcm^-11700，1745； ¹H NMR（60MHz，
CDCl₃）δ2.23（ｓ，3H），7.03（ｄ，Ｊ＝２Hz，
1H），7.13（ｄ，Ｊ＝２Hz，1H）；7.23−7.73
（ｍ，5H）；MS（EI，DIP）ｍ／e218（M⁺，
12.6％）；TLC Rf＝0.48（ヘキサン：酢酸エチ
ル、５：１）． 元素分析値（C₁₂H₁₀SO₂・1/2H₂Oとして）： 計算値：Ｃ，63.41；Ｈ，4.88 実測値：Ｃ，63.78；Ｈ，4.86 ３−ヒドロキシ−５−フエニルチオフエン(8) ３−ヒドロキシ−５−フエニルチオフエン酢酸
塩(7)2.126ｇ（9.74mmol）とメタノール80mLと
の混合物を1NのNaOH11mLで処理した。20分後
に反応混合物を、1Nの塩酸11mLの添加によつて
急冷し、25℃、12mmHgで蒸発させて約50mLの容
積とし、酢酸エチル100mLで処理した。有機層を
分離し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で
乾燥させ、過、蒸発させ、黒色の固形物を得
た。この残留物を酢酸エチル75mLに溶解させ、
MgSO₄上で乾燥させた。過及び蒸発によつて
得た黒色固形物を高温ヘキサンと共に４回すりつ
ぶし、冷却後に、融点74〜75℃の黄色の固形物(8)
合計837ｇ（49％）を得た。１つにした母液を濃
縮して固形物0.87ｇとし、このものにSiO₂100ｇ
上で、クロマトグラフイーを行い、ヘキサン：酢
酸エチル（７：１）溶剤混合物を用いて、溶出し
た。再結晶後に、さらに融点73.5〜74℃の生成物
380mgを得た。合計収率は、従つて、1.217ｇ（71
％）、融点74.5〜75℃（文献(3)，(4)75℃、78℃）。 IRcm^-13380，1635； ¹H NMR（90MHz，
CDCl₃）δ3.81（ｓ，2H），6.57（ｓ，1H），7.2−
7.7（ｍ，5H）；MS（EI）ｍ／e176.0（70.7
％）；TLC Rf＝0.23（ヘキサン；酢酸エチル、
１：５）． 元素分析値（C₁₀H₈OSとして）： 計算値：Ｃ，68.15；Ｈ，4.57 実測値：Ｃ，68.05；Ｈ，4.70 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５−
フエニルチオフエン(9) ジクロロメタン20mL及びピリジン0.61mL
（7.5mmol）中の３−ヒドロキシ−５−フエニル
チオフエン(8)440mg（2.5mmol）溶液を、ジクロ
ロメタン10mL中のＮ−トシルアラニニルクロリ
ド1.314ｇ（5mmol）溶液（５分間かけて滴下す
る）により０℃で、アルゴン雰囲気下に処理し
た。反応混合物を、0.5時間０℃で撹拌した後、
クロロホルム100mL中に注加した。混合物を、
50mLずつの1Nのくえん酸、水、氷冷重炭酸ナト
リウム溶液、水及びブラインを用いて次々に抽出
した。次に混合物を硫酸ナトリウム上で乾燥さ
せ、過し、蒸発させ褐色の油状物1.78ｇを得
た。「ノリツト（Norit）」1.78ｇを用いて処理し
た後、トルエンからの結晶化を試みたが、成功し
なかつた。残留物にSiO₂200ｇカラム上でクロマ
トグラフイーを行い、ジクロロメタンを用いて、
流速10mL／分で溶出した。生成物含有分画をプ
ールし、濃縮して、赤味を帯びた油状物951mgを
得た。生成物をトルエンから結晶化させた。トル
エンからの再結晶化を連続して行い、全量463mg
（46％）の生成物（ｇ）を、淡黄色の固形物とし
て得た（融点、85〜87℃）。 IR（KCl）cm^-11735，1330，1150； ¹H NMR
（90MHz，CDCl₃）δ1.53（ｄ，Ｊ＝７Hz，3H），
1.62（ｓ，3H），4.23（ｍ，1H），5.32（ｄ，Ｊ＝
９Hz，1H），6.84（ｄ，Ｊ＝1.4Hz，1H），6.88
（ｄ，Ｊ＝1.4Hz，1H），7.23−7.83（ｍ−9H）；
MS（FAB）ｍ／e402（M⁺1，15％）；TLC Rf
＝0.20（ヘキサン：酢酸エチル、４：１）． 元素分析値（C₂₀H₁₉NO₄Sとして）： 計算値：Ｃ，59.83；Ｈ，4.77；Ｎ，3.59 実測値：Ｃ，59.60；Ｈ，4.77；Ｎ，3.43 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−１−
メチル−５−フエニルピロール（13）の合成 式（）において、ＡがＮ−トシル−Ｌ−アラ
ニニルであり、Ｒがフエニルであり、Ｒ^*がＨで
あり、ＸがNR′であり、そしてR′がCH₃である化
合物に相当する表題のエステルを製造するため
の、一連の実験を行なつた。反応の順序は次の通
りであつた。 ２−ヒドロキシ−３−（Ｎ−メチルカルボキシメ
チルアミノ）−ヒドロ桂皮酸二カリウム塩(10) β−フエニルグリシド酸のカリウム塩（30ｇ；
0.15mol）、Ｎ−メチルグリシン（13.2ｇ；
0.15mol）、蒸留水（119mL）及びKOH溶液
（9N；22.3mL）の混合物を、加熱して３時間還
流し、淡黄色の溶液とした。反応混合物を70℃で
減圧下に蒸発乾涸した。次に残留物を95％EtOH
（100mL）から晶出させ、白色固形物とし、この
ものを110℃で減圧下に１晩乾燥させた後、白色
固形物(10)30.8ｇを得た（収率63％）。 IR（KCl）cm^-13360（br.），1580，1405，
705； ¹H NMR（CD₃OD）δ2.30（ｓ，3H），
2.98（ｓ，2H），3.70（ｄ，Ｊ＝３Hz，1H），4.48
（ｄ，Ｊ＝３Hz，1H），4.92（ｓ，1H），7.40
（ｓ，5H）；TLC Rf＝0.51（EtOH：1M重炭酸
トリエチルアンモニウム、７：３）。（生成物の融
点270℃以上）。 ３−アセトキシ−１−メチル−５−フエニルピロ
ール(11) ２−ヒドロキシ−３−（Ｎ−メチルカルボキシ
メチルアミノ）−ヒドロ桂皮酸二カリウム塩(10)
（15.2ｇ、46mmol）、無水酢酸（173mL）及びト
リエチルアミン（308mL）の混合物を40℃で19hr
加熱した。濃褐色となつた反応混合物を、過
し、固形物をエーテルで洗浄した。液を減圧下
に蒸発せしめ、濃褐色の残留物を得、このものを
エーテル（300mL）及び水（200mL）に吸収させ
た。各層を分離し、エーテル層は、別の水（200
ml）で洗浄した。エーテル溶液を、MgSO₄上で
乾燥させ、過し、減圧下に濃縮し、褐色の残留
物10.7ｇを得た。このものを、クーゲルロール蒸
留（Kugelrohr distillation）し、エーテルから晶
出させて、融点64〜65℃の白色結晶(11)3.0ｇを得
た（収率30％）。 IR（CHCl₃）cm^-12990，1750，1570，1518，
1482，1375，1230（br.），1024，910，700； ¹H
NMR（CDCl₃）δ2.20（ｓ，3H），3.58（ｓ，
3H），6.10（ｄ，Ｊ＝２Hz，1H），6.75（ｄ，Ｊ
＝２Hz，1H），7.35（ｓ，5H）；TLC Rf＝0.58
（ヘキサン：EtOAc、７：３） 元素分析値（C₁₃H₁₃NO₂として）： 計算値：Ｃ，72.54；Ｈ，6.10；Ｎ，6.44 実測値：Ｃ，72.57；Ｈ，6.09；Ｎ，6.51 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−１−
メチル−５−フエニルピロール（13） 脱酸素メタノール（15.5mL）と３−アセトキ
シ−１−メチル−５−フエニルピロール(11)（1.3
ｇ、6.2mmol）との混合物に脱酸素NaOH（2N，
12.5mL）をアルゴン雰囲気下添加した。反応混
合物を氷浴中で15分間撹拌した。次に脱酸素くえ
ん酸（2M、7mL）を添加し、得られた混合物を
氷浴中で８分間撹拌した。反応混合物を減圧下に
濃縮し、次に水20mLを加え、酢酸エチル
（EtOAc）50mLを用いて２回抽出した。酢酸エ
チル層を１つにし、MgSO₄上で乾燥させ、過
し、減圧下に濃縮し、３−ヒドロキシ−１−メチ
ル−５−フエニルピロール(12)を橙色の残留物とし
て得た。無水THF（12.4mL）、ピリジン
（0.6mL；7.4mmol；1.2eq）及びトリフルオロ酢
酸（1.2mL；15mmol；2.4eq）の冷溶液をアルゴ
ン下に橙色の残留物に添加し、その直後に新しく
製造したＮ−トシル−Ｌ−アラニニルクロリド
（1.2ｇ；7.4mmol；1.2eq）の無水THF
（12.4mL）溶液を添加した。得られた混合物を１
時間０℃で撹拌した。次にくえん酸水溶液
（1M、5mL）及び酢酸エチル（30mL）を添加し
て反応混合物を急冷した。簡単に混合した後、各
層を分離し、飽和NaCl溶液、５％NaHCO₃溶液
（２回）及び再び飽和NaCl溶液によつて有機相を
順次洗浄した。次に酢酸エチル抽出物をMgSO₄
上で乾燥させ、「ノリツト（Norit）」211で処理
し、過し、減圧下に濃縮し、粗生成物（13）を
橙色の残留物として得た。このものを、ヘキサ
ン：酢酸エチル（１：１）（5mL）に溶解させ、
SiO₂100ｇカラム上でクロマトグラフイーを行い
ヘキサン：酢酸エチル（７：３）を用いて溶出
し、化合物（13）１ｇを濃厚な淡橙色の油状物と
して得た。この粗生成物の一部を、半調製用
HPLC（カラム、IBMシリカ、１cm×25cm、移動
相、ヘキサン：酢酸エチル８：２；流速4.0mL／
分、圧力0.2psi）によつて更に精製し、蜂蜜色の
濃厚な油状物（13）を得た。 IR（film）cm^-13260，2950，1760，1520，
1350，1170，770； ¹H NMR（DMSO−d₆）δ
1.28（ｄ，Ｊ＝７Hz，3H），2.36（ｓ，3H），3.58
（ｓ，3H），5.85（ｄ，Ｊ＝２Hz，1H），6.15
（ｍ，1H），6.74（ｄ，Ｊ＝２Hz，1H），7.30−
780（ｍ，9H），8.37（ｄ，Ｊ＝８Hz，1H）；¹³C
NMR（DMSO−d₆）ppm18.205，20.936，
34.917，51.240，100.598，113.148，126.544，
127.000，128.105，128.560，129.601，130.901，
132.202，135.714，138.315，142.672，169.724；
TLC Rf＝0.52（トルエン：ジオキサン、４：
１）；C₂₁H₂₂N₂O₄Sの高分解能質量スペクトル
は、ｍ／e398・1300を要するが、実測値は398・
1297であつた。 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５−
（ｐ−クロロフエニル）ピロール（18）の合成 式（）において、ＡがＮ−トシル−Ｌ−アラ
ニニルであり、Ｒがｐ−クロロフエニルであり、
Ｒ^*がＨであり、ＸがNR′であり、R′がＨである
化合物に相当する標題のエステル化合物を製造す
るための一連の実験を行なつた。反応連鎖は次の
通りであつた。 トランス−β−（ｐ−クロロフエニル）グリシド
酸（14） アセトン260mL中のｐ−クロロ桂皮酸（68.5
ｇ；0.375mol）の撹拌スラリーに、NaHCO₃
（137ｇ；1.63mol）を添加した後、水260mLを
徐々に添加した。この混合物に、「オキソン
（OXONE）」211ｇ（0.343mol）EDTA二ナトリ
ウム120mg及び水805mLの混合物を22〜27℃で2.5
時間かけて添加した。５時間後に混合物を12Nの
冷塩酸70mLを用いて酸性とし、PHを約2.5に降下
させ、次に酢酸エチル700mLを用いて抽出した。
抽出液をブラインを用いて洗浄し、MgSO₄で乾
燥させ、過し、液を真空下に蒸発乾涸させ
た。白色の固形物を酢酸エチルから結晶化させ
た、融点121〜125℃（72.2ｇ；収率97％）。 ¹H
NMR（CDCl₃／DMSO−D₆）δ7.3（ｍ，4H），
4.05（ｄ，Ｊ＝２，1H）及び3.4（ｄ，Ｊ＝２，
1H）。 元素分析値（C₉H₇ClO₃として）： 計算値：Ｃ，54.43；Ｈ，3.55；Cl，17.85 実測値：Ｃ，54.53；Ｈ，3.80；Cl，17.91 ２−ヒドロキシ−３（カルボキシメチルアミノ）
−ｐ−クロロヒドロ桂皮酸二カリウム塩二水化物
（15） KOH（85％）（46.7ｇ；0.709mol）と水400mL
との溶液に、グリシン（25.9ｇ；0.345mol）を添
加し、次にトランス−β−ｐ−クロロフエニルグ
リシド酸（14）（72.2ｇ；0.3635mol）を添加し
た。この混合物を２時間100℃に加熱し、室温に
冷却し、PHを12に上昇させるのに足る量のKOH
を添加した。混濁溶液を酢酸エチルで３回抽出
し、抽出液を次に廃棄した。70℃水浴を用いて、
透明な水溶液（約500mL）を、真空下に蒸発乾涸
させた。次に固形物を熱エタノール約350mLに溶
解させ、過し、液を氷浴中で数時間冷却し
た。晶出した固形物を取し、冷エタノールで洗
浄した。融点93〜95℃、脱カルボキシル化温度
185℃（57.2ｇ；41％）。 ¹H NMR（D₂O−TSP）δ7.4（ｓ，4H），4.4
（ｄ，Ｊ＝４，1H）4.05（ｄ，Ｊ＝４，1H），及
び3.1（ｓ，2H）． 元素分析値（C₁₁H₁₀ClNO₅K₂・2H₂Oとし
て）： 計算値：Ｃ，34.24；Ｈ，3.66；Ｎ，3.63 実測値：Ｃ，34.40；Ｈ，4.03；Ｎ，3.42 Ｎ−アセチル−３−アセトキシ−５−（ｐ−クロ
ロフエニル）ピロール（16） ２−ヒドロキシ−３−（カルボキシメチルアミ
ノ）−ｐ−クロロヒドロ桂皮酸二カリウム塩二水
化物（15）（10ｇ；0.02591mol）に無水酢酸
（40mL）とピリジン（30mL）とを添加した。こ
の混合物を35℃に徐々に加熱し、この点で溶液は
67％まで発熱し、次に温度が下降し始め、この点
で加熱を再開した。混合物を121゜〜122℃（内部
温度）に１時間加熱し、次に冷却した。反応混合
物に酢酸エチル約30mLを添加し、これにより酢
酸ピリジウム塩の大部分を沈殿させた。この塩を
取し、少量の酢酸エチルで洗浄した。次に液
を真空下に蒸発せしめて油状物とし、これに氷水
を添加した。生成物をエーテルを用いて抽出し、
エーテル抽出液を順に希釈くえん酸冷水溶液と冷
水とで２回、更に希釈NaHCO₃冷水溶液、冷水及
びブラインとで３回それぞれ洗浄し、MgSO₄上
で乾燥させ、過した。液を「ダルコ
（Darco）」10ｇで処理し、20分間撹拌し、次に
過した。液を真空下に蒸発せしめ油状物とし
た。この油状物に２−プロパノール25mLを添加
した。得られた溶液から、冷却及びスクラツチン
グ（scratching）によつて、融点69゜〜71℃の淡
黄色の結晶（3.4ｇ；47％）を得た。TLC Rf＝
0.61（トルエン：ジオキサン、95：５）。分析試
料を２−プロパノールから再結晶させたが、融点
の変化は見られなかつた。 IR（KCl）cm^-11755（Ｃ＝０，エステル）及び
1730（Ｃ＝０，アミド）； ¹H NMR（CDCl₃）δ
7.4（ｍ，5H），6.2（ｄ，Ｊ＝２，1H），2.4
（ｓ，3H）及び2.3（ｓ，3H）． 元素分析値（C₁₄H₁₂ClNO₃として）： 計算値：Ｃ，60.55；Ｈ，4.36；Ｎ，5.04 実測値：Ｃ，60.65；Ｈ，4.55；Ｎ，5.07 ３−ヒドロキシ−５−（ｐ−クロロフエニル）ピ
ロール（17） Ｎ−アセチル−３−アセトキシル−５−ｐ−ク
ロロフエニルピロール（16）（2.8ｇ；0.01mol）
の試料をN₂気流により10分間脱酸素化した。次
に固形物を脱酸素メタノール（30mL）中に溶解
させ、次に−８℃に冷却した。その直後に、
H₂O20mL中のNaOH（1.6ｇ；0.04mol）の脱酸素
冷溶液を添加した。次にこの溶液を短時間15℃に
加熱した後、直ちに−５℃に冷却した。25分後に
透明な溶液をH₂O15mL中のくえん酸（4.2ｇ；
0.02mol）の脱酸素冷溶液で処理した。温度は短
時間に５℃に上昇した。−５℃で0.5hr撹拌した
後、固形物を取し、脱酸素冷H₂Oで洗浄した。
淡緑色の生成物を数日間P₂O₅上で室温で真空下
乾燥させた（1.3ｇ；68％）。TLC Rf＝0.19
（CHCl₃：EtOH、９：１）。IR（KCI）は、Ｃ＝
０吸収の証拠を示さなかつた。 元素分析値（C₁₀H₈ClNO・1/6H₂として）： 計算値：Ｃ，61.08；Ｈ，4.27；Ｎ，7.12 実測値：Ｃ，61.36；Ｈ，4.44；Ｎ，6.85 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５−
（ｐ−クロロフエニル）ピロール（18） N₂で脱酸素化したTHF（15mL）に、ピリジン
（0.65mL；0.008mol）、トリフルオロ酢酸
（1.27mL；0.0164mol）及び３−ヒドロキシ−５
−（ｐ−クロロフエニル）ピロール（17）（1.3
ｇ；0.0065mol）を添加した。溶液を０℃〜−４
℃に冷却し、THF15mL中のＮ−トシル−Ｌ−ア
ラニニルクロリド（2.1ｇ；0.008mol）のN₂脱酸
素冷却溶液（０℃〜−４℃）を10分間かけて添加
した。混合物を１時間０℃に保つた後、氷と1N
くえん酸100mLの混合物を添加した。この混合物
を酢酸エチルを用いて抽出し、抽出液を、冷ブラ
インで１回、希釈冷NaHCO₃で２回、そして冷ブ
ラインで１回それぞれ洗浄した後、MgSO₄上で
乾燥させ、過した。液を「ダルコ
（Darco）」２ｇで処理し、10分間撹拌し、過
し、液を真空下に濃縮し、赤褐色の油状物とし
た。「ダルコ（Darco）」1.3ｇで再び処理し、淡赤
色の油状物を得た。油状物をトルエン：シクロヘ
キサン（４：１）に溶解させ、冷蔵庫に一晩放置
し、淡鮭肉色の結晶を得た（1.45ｇ；53％）。融
点113〜115℃、 TLC Rf＝0.47（Et₂O）；IR（KCl）cm^-11740
（Ｃ＝０，エステル）； ¹H NMR（CDCl₃）δ8.4
（br ｓ，1H），7.8−7.2（ｍ，8H），6.7（ｍ，
1H），6.2（ｍ，1H），5.5（ｄ，Ｊ＝９，1H），
4.2（ｐ，Ｊ＝８，1H），2.4（ｓ，3H），1.4
（ｄ，3H）；MS（EI，DTP）ｍ／e418（M⁺，
2.3％）及び420（M⁺，0.8％）． 元素分析値（C₂₀H₁₉ClN₂O₄Sとして）： 計算値：Ｃ，57.34；Ｈ，4.57；Ｎ，6.69 実測値：Ｃ，57.53；Ｈ，4.58；Ｎ，6.67 本発明の化合物を含有する試験具の製造と使用 本発明による化合物を含有した試験具を製造
し、前記のエステル基質を尿中白血球に対する反
応性について試験するための、一連の実験を行な
つた。この試験具は、分析試薬を含有した小さな
正方形の紙を、ポリスチレンフイルム片の一端
に取付けたものであつた。紙には、緩衝液、エ
ステル、促進剤及びジアゾニウム塩カツプリング
剤を含浸させた。各試験具は、尿中白血球につい
て陽性値の分析結果を示した。 エステルが３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニル
オキシ）−５−フエニルピロール(4)である試験具 （実験 (1)） 尿中白血球の存在に対して感受性のある試験具
を製造した。この試験具は、横長のポリスチレン
フイルム片の一端に取付けた小さな正方形の紙
から成るものとした。紙には、色原体エステ
ル、促進剤及びジアゾニウム塩を含む種々の成分
を含浸させた。イートン・アンド・ダイクマン
（Eaton and Dickman）〓205の5.1cm（２イン
チ）幅紙片を、 0.4Mホウ酸塩−NaOH緩衝液PH8.6、 2.0％（Ｗ／Ｖ）ポリビニルピロリドンＫ−
30、 0.2％（Ｗ／Ｖ）「ビオテルジユ（Bioterge）」 AS−40及び0.25M NaCl を含有する水溶液に浸漬した。 次に水柱2.54cm（１インチ）の空気流圧の下に
80.4゜〜93.3℃（175〜200〓）で、オーバーリー
エアーフオイル（Overly Air Foil）紙乾燥機中
で７分間紙を乾燥させた。次に記録した紙
を、 2.0％（Ｖ／Ｖ）ｎ−デカノール、 0.75mM2−メトキシ−４−モルホリノベンゼ
ンジアゾニウムクロリド、及び 0.5mM3−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキ
シ）−５−フエニルピロール を含有するアセトン溶液に浸漬した。 この含浸後に130〓の通風させた「ホツトパツ
ク（Hotpack）」オーブン中で10分間乾燥させ
た。白色がかつた試験紙を得た。 乾燥させた含浸紙片を、１辺の長さが0.51cm
（0.2インチ）の正方形に切り、10.2cm×0.51cm
（４インチ×0.2インチ）の１軸延伸ポリスチレン
片の一端に取付けた。紙片をポリスチレン片に
取付けるために、「ダブルステイツク（Double
stick）」両面接着剤（スリーエム（3M）社製）
を使用した。 エステルが３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオ
キシ）−５−フエニルチオフエン(9)である試験具 （実験 (2)） ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５
−フエニルチオフエンを指示薬として使用し、尿
中白血球の存在に対して感受性を有する試験具を
製造した。紙片（イートン・アンド・ダイクマ
ン（Eaton and Dickman）〓205）を、 0.4Mホウ酸塩−NaOH緩衝液（PH＝8.5）、 0.4M NaCl、及び 1.5％（Ｗ／Ｖ）ポリビニルピロリドン（Ｋ−
30） を含有する第１水溶液に浸漬した。 このように含浸させた紙片を30分間70℃で強
制通風オーブン中において乾燥させた後、室温に
冷却し、次に、 0.75mM3−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキ
シ）−５−フエニルチオフエン、 0.75mM2−メトキシ−４−モルホリノベンゼ
ンジアゾニウムクロリド−塩化亜鉛複塩、及び 0.5％（Ｖ／Ｖ）ｎ−デカノール を含有するアセトン溶液からなる第２浸漬溶液を
含浸させた。 このように２回含浸させた紙片を５分間50℃
で強制通風オーブン中において乾燥させた。 乾燥させた紙を、１辺の長さが0.51cm（0.2
インチ）の正方形に切り0.51cm×8.3cm（0.2×
3.25インチ）のポリスチレンフイルム片の一端に
取付けた。「ダブルステイツク（Double
Stick）」（スリーエム（3M）社製両面接着テー
プ）を用いて取付けを行なつた。試験具は、乾燥
用のシリカゲル及びモレキユラーシーブ
（molecular sieves）と共に100個ずつ複数の壜に
収納し貯蔵した。エステルが３−（Ｎ−トシル−
Ｌ−アラニニルオキシ）−１−メチル−５−フエ
ニルピロール（13）である試験具（実験(3)） エステル指示薬として３−（Ｎ−トシル−Ｌ−
アラニニルオキシ）−１−メチル−５−フエニル
ピロールを、またカツプリング剤として１−ジア
ゾナフタレン−４−スルホン酸塩をそれぞれ使用
し、実験(1)の実験手順に従つて、試験具を製造し
た。第１浸漬水溶液は、 0.4Mホウ酸、 0.2％（Ｗ／Ｖ）ポリビニルピロリドン（Ｋ−
30）及び 0.2％（Ｖ／Ｖ）「ビオテルジユ（Bioterge）」
AS−40 0.25M NaCl を含有していた。 紙の含浸前に溶液をNaOHでPH9.0に滴定し
た。 アセトン中の第２浸漬溶液は、 0.75mM1−ジアゾ−２−ナフト−ル−４−ス
ルホン酸塩 1.3mM3−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキ
シ）−１−メチル−５−フエニルピロール 1.5％（Ｖ／Ｖ）ドデカノール を含有していた。 第１浸漬溶液である前記水溶液を含浸させた
後、約５分間約80℃で紙を乾燥させ、第２浸漬
溶液であるアセトン溶液を含有させた後、約５分
間70℃でこの紙を乾燥させた。 乾燥させた紙は、実験(1)の実験手順と同様に
して取付けた。 エステルが３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニル
オキシ）−５−（ｐ−クロロフエニル）ピロール
（18）である試験具（実験(4)） アセトン溶液がフエニルピロールの代りに
1.3mM3−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキ
シ）−５−（ｐ−クロロフエニル）ピロールを含有
することを除いて、実験(1)の実験手順と同様にし
て試験具を製造した。 試験具の評価 上記の実験において製造した試験具について尿
中の白血球を検出する能力の評価を行なつた。 正常な人の尿のプールから試験試料を製造し
た。１つの試料はブランクとして使用し、新しく
採血した血液から単離した白血球を、２つの別の
尿試料に添加し、それぞれ１μＬ当り白血球数
０，10，75個の濃度とした。 試験具を試験試料に素早く浸漬させた後、それ
から取出した。２分後に分光光度計を用いて試験
具を観察し、400〜700nmの異なつた波長で反射
率（％）を測定した。 試験データは、試験具の全てが試験試料中の異
なつた白血球レベルに対応した明瞭に識別されう
る光反射率の差異を示すことを示している。試験
データを次表に示す。

【表】 目視による観察：10〜12細胞／μＬにおいて紫
色を呈する；ブランクは色の変化を示さなかつ
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 構造式： （式中、Ａは−COCH₃又は【式】 を表すが、このときTsはトシルを表し；Ｒは炭
   素原子数１〜６を有する低級アルキル基、フエニ
   ル又はクロロフエニルを表し；Ｒ〓は水素又は炭
   素原子数１〜６を有する低級アルキル基を表し；
   ＸはNR′を表すが、このときR′は水素又は炭素原
   子数１〜６の低級アルキル基を表す） を有する化合物。 ２ ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−
   １−メチル−５−フエニルピロールである特許請
   求の範囲第１項記載の化合物。 ３ ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−
   ５−フエニルピロールである特許請求の範囲第１
   項記載の化合物。 ４ ３−アセトキシ−１−メチル−５−フエニル
   ピロールである特許請求の範囲第１項記載の化合
   物。 ５ ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−
   ５−（ｐ−クロロフエニル）ピロールである特許
   請求の範囲第１項記載の化合物。