JP2654355B2 - キノンイミン誘導体およびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規キノンイミン誘導
体およびその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および課題】ヒドロラーゼは、一般に、水
の消費を伴い、加水分解的に結合を開裂する酵素である
ことが分かっている。近年、臨床化学および診断法の分
野において、グリコシドおよびエーテル結合を開裂する
かかるヒドロラーゼの活性を測定することが重要となっ
た。例として挙げられるものには、エステラーゼ、例え
ば、白血球に存するカルボン酸エステルを開裂する酵
素、またはホスファターゼ、例えば、リン酸エステルを
加水分解するアルカリおよび酸性ホスファターゼがあ
る。腎臓および尿生殖管の疾患の診断では、その固有の
エステル分解活性に基づき、尿中の白血球を検出するこ
とが有用であることが証明されている。酸性ホスファタ
ーゼの活性測定は、前立腺癌腫の初期診断においては有
用な手段である。アルカリホスファターゼは、酵素イム
ノアッセイの標識酵素として用いることができる。

【０００３】グリコシダーゼ、例えば、ガラクトシダー
ゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、アミラーゼおよ
びＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼは、グリ
コシド結合を開裂する。ヒトおよび動物において、これ
らの酵素は、多くの生理学的機能を果たしている。例え
ば、β−Ｄ−ガラクトシダーゼは、それにより、ラクト
ースの加水分解が生じるため、炭水化物の代謝において
重要な役割を果たす。さらに、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼは、糖脂質、ムコ多糖類および糖蛋白の分解における
キー酵素である。さらに生理学的に重要なグリコシダー
ゼとして、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−および
β−Ｄ−グルコシダーゼならびにα−Ｄ−マンノシダー
ゼが挙げられる。

【０００４】これらの生理学的価値に加えて、近年、グ
リコシダーゼは、診断学の分野および生物工学の分野に
おいて重要になってきた。すなわち、例えば、これらの
酵素は、酵素イムノアッセイに関して、指示酵素として
広範囲に用いられる。これに関しては、特に、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼが好ましい。

【０００５】体液中に存在する酵素Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニダーゼ（β−ＮＡＧase）は、生体に
おいて、疾患または機能障害に関する有用な指示薬であ
る。例えば、尿において、腎臓移植の場合、数値の増大
は、ドナー腎臓の拒絶の指示を意味する。また、多くの
腎臓に関する疾患および毒性損傷の場合にも数値の増大
が生じる。女性の唾液において、ＮＡＧase活性は、受
胎能および妊娠の指標である。

【０００６】ヒドロラーゼ活性の測定では、酵素含有試
料を適当な基質と反応させる。該基質が酵素により開裂
され、開裂生成物の一方が適当な方法により検出され
る。検出すべき酵素に対する天然基質は、しばしば、基
質として適当である。しかしながら、特に好ましくは、
開裂生成物の一方は、分光的に可視領域で、または紫外
線領域で検出しうる残部である色素産生性化合物であ
る。

【０００７】欧州特許公開明細書第Ａ−０２７４７００
には、エステルおよびグリコシド結合開裂酵素を測定す
るための色素産生性基質として、ジヒドロレゾルフィン
（dihydroresorufin）化合物が記載されている。基質の
酵素的開裂後、直ちに水溶性ロイコ色物質が得られ、酸
化剤により容易に酸化され、着色物質が得られる。ジ置
換のジヒドロレゾルフィン誘導体は、複数の反応工程で
加水分解され、反応速度の測定において、複雑化の要因
となる。

【０００８】グリコシド結合開裂酵素の測定のために、
多くの色素産生性基質が知られている。すなわち、バイ
オケム・ゼット（Ｂiochem．Ｚ．），３３３，２０９／
１９６０には、β−Ｄ−ガラクトシダーゼに対する基質
として、フェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、ならびにそ
の芳香族環が置換されているいくつかの誘導体（例え
ば、ｏ−ニトロフェニル−およびｐ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシド）が記載されている。加水分解に
より遊離したフェノールを紫外線領域にて、または、ニ
トロフェノールの場合には短波可視波長領域にて、測光
学的に測定する。アミノアンチピリンでの酸化的カップ
リングをまた、指示体反応として行うことができる［ア
ナリティカル・バイオケミストリー（Ａnalytical Ｂi
ochem．），４０，２８１／１９７１を参照］。

【０００９】組織化学的研究では、ナフチル−β−Ｄ−
ガラクトシド、例えば、ヒストケミー（Ｈistochemi
e），３５，１９９／１９７３においては１−ナフチル
化合物、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．），１９５，２３９／１９５
２においては６−ブロモ−２−ナフチル誘導体、および
ヒストケミー，３７，８９／１９７３においてはナフト
ール−β−Ｄ−ガラクトシドが用いられている。視覚化
には、形成したナフトールを種々のジアゾニウム塩と反
応させて、アゾ有色物質を得る。かかる必要なカップリ
ング反応において、カップリング成分の代わりに酵素的
開裂により遊離した物質と反応させた場合、該試料成分
は、例えば、有害効果を有するかもしれない。

【００１０】酵素Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ダーゼ（ＮＡＧase）の検出については、米国特許明細
書第３９６８０１１号において、酵素反応に必要なpＨ
値にて開裂し、その反応生成物が色素を形成するか、ま
たは塩基性pＨ値にて検出または測定しうるフェノール
誘導体の使用が示唆されている。したがって、再緩衝化
が不可欠である。

【００１１】同様に、欧州特許公開明細書第００９７５
０６号では、ＮＡＧase基質が、酵素およびクロモゲ
ン、例えば、ｐ−ニトロフェノールの存在下、酸性pＨ
値にて遊離し、塩基性pＨ値に再度緩衝処理した後、色
素を形成し、該色相を測定しうることを示唆している。
アンベリフェロン（umbelliferone）の遊離の場合、蛍
光学的に検出することができるが、それは装置として非
常に高価であり、とくに生物学的試料の場合、それに存
する蛍光的バックグラウンドにより妨害される。

【００１２】欧州特許公開明細書第００６０７９３号に
おいては、ＮＡＧase用基質としてスルホフタレイニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドが記載されて
いる。しかしながら、ブランク値の測定の必要性、およ
び反応混合物を再度緩衝剤で処理するために必要な付加
的操作工程は不利な点である。

【００１３】欧州特許公開明細書第０１８０９６１号に
は、β−ＮＡＧase基質として、２−および４−位にて
ハロゲンまたはニトロで置換されたＮ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニドが開示されている。該基質によるＮ
ＡＧaseの測定方法は、明らかに、付加的操作工程およ
びブランク値測定を行うことなく実施することができる
が、該基質の溶解性は、湿潤剤の存在下においてさえ非
常に低い。尿中のＮＡＧaseを測定する場合、結果とし
て、尿成分による妨害がもたらされ、低酵素濃度では、
試験を行うのに要する時間が非常に長くなる。

【００１４】ナトリウム３,３’−ジクロロフェノール
スルホンフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミジンが、欧州特許公開明細書第０２９４８０４号に
記載されている。測定は、直接的にかつ停止することな
く実施することができるが、酸性pＨ値というわけでは
ないが、ほんのわずか酸性である場合に遊離した色原体
が十分に発色するため、検出反応は、pＨ６.２５で実施
しなければならない。酵素の反応速度は、pＨ４.５〜５
で最大であり、このため、基質の酵素的開裂は、遅延す
ることとなる。加えて、ＮＡＧase測定に関する前記す
べての分析方法では、分光光度装置を必要とする。

【００１５】ドイツ連邦共和国特許明細書第２８５７１
４５号には、直接的にまたはアルカリ処理後のいずれか
にて視覚的アセスメントを可能する基質が記載されてい
る。結合する着色物質は、式： ＨＸ−Ａ−Ｙ−ＮＯ₂ ［式中、Ａは、芳香族基であり、ＨＡは、助色団基であ
り、Ｙは、不飽和基を意味する］で示される物質であ
る。これらの基質は、赤または青色により酵素を指示す
る化合物を遊離する。しかしながら、該方法は、酵素の
存在下、該基質自身が着色されるため、単に色相変化が
生じるにすぎないという欠点を有する。非−前処理また
は希釈試料、例えば、尿の場合、尿の他の成分が酵素的
開裂を極端に低下させるため、該基質を高濃度にて存在
させなければならない。弱固有色の基質でさえ、必要な
濃度では、強度の有色試験ストリップを提供する。色相
変化を介する検出では、低酵素濃度を検出できないか、
または非常に長い時間でほんのわずかに検出できるにす
ぎない。

【００１６】日本国特許公開明細書第Ａ−０１０６８３
８９には、ＮＡＧase基質としてＮ−およびＯ−置換ア
ミノフェニル誘導体が示唆されており、それは、Ｎ−置
換基として、遊離ヒドロキシル基を有するフェノールま
たはナフトール基またはキノンイミン構造を有する。条
件として、該分子中に存在する２つのＮ−置換基の一方
は、電子吸引基のみを有し、それに対して、他方は、電
子供与基により置換されている。これら化合物は、水可
溶性が非常に低い。その結果、該化合物は、試料成分に
より非常に妨害される。例えば、該化合物は尿中にてＨ
ＡＧaseにより開裂されない。

【００１７】要約すると、先行文献からのヒドロラーゼ
基質の欠点を以下に示すことができる：多段階酵素的開
裂を行う基質は、反応速度の測定が複雑である。短波可
視波長領域において測定すべき酵素により分離される基
（例えば、黄色の基）の吸光度は、多くの試料、特に短
波長領域にて吸収される多くの物質が存在する体液の試
料において、妨害されることなく測定されない。別の化
合物と結合することにより酵素的に分離することができ
る基を可視することもまた、試料成分により妨害され
る。蛍光測定は、その装置が高価であり、特に生物学試
料の場合、試料物質のバックグラウンド蛍光によりしば
しば妨害される。ヒドロラーゼ基質を用いる酵素的開裂
の場合、その色相が単に変わるだけで、低濃度の酵素測
定が、高基質濃度で可能となるにすぎず、そのために多
くの反応時間を要し、ある環境下においては、測定すべ
き酵素を抑制するかもしれない。ヒドロラーゼ基質の貧
溶解性により、測定方法の感応性が非常に低くなり、所
望の結果が得られるまで多くの時間を要する。ヒドロラ
ーゼ基質を用いる測定方法は、さらに、ブランク値測定
または反応混合物の再緩衝剤処理のような付加的工程を
必要とし、それは、比較的長時間を要し、加えて、それ
を実施することは面倒であり、場合によっては、一般人
ではなく専門家だけが満足かつ再現性をもって行うこと
ができるにすぎないほど複雑である。さらにまた、付加
工程を要する測定方法は、使用に適さないか、あるい
は、試験担体、いわゆる乾式化学試験に対し困難性を伴
って使用できるにすぎず、困難性を伴って行うことがで
きる。さらには、例えば、再緩衝処理工程を要する測定
方法は、反応速度を測定できないだけでなく、純粋な終
点法ではない。

【００１８】本発明は、ヒドロラーゼの迅速かつ容易な
測定を可能とし、反応速度だけでなく、終点測定をも可
能とし、さらに低酵素濃度の高感度測定能を有し、でき
る限り妨害されることなく、ヒドロラーゼ測定に供する
ことができ、いずれの高価な装置も必要とせず、さらに
また試験担体に対しても用いることができるヒドロラー
ゼ基質を利用可能にするという前記問題を解決した。

【００１９】

【課題を解決するための手段】したがって、本発明は、
式（Ｉ）：

【化４】 ［式中、Ｇは、エステル形成性有機もしくは無機酸残
基、またはグリコシド残基であり；Ｒ¹およびＲ²は、同
一または異なり、水素原子、ハロゲン原子、ＳＯ₃Ｈ、
ＰＯ₃Ｈ₂、またはこれら酸基の塩であるか、ヒドロキシ
ル、ニトロ、カルボキシル、カルボキシアミドまたはシ
アノであるか、所望により１つ以上のヒドロキシル、カ
ルボキシル、ハロゲン、シアノ、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、
またはこれら酸基のうちの１つの塩により置換されてい
てもよいアルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキル
スルフィニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボ
ニル、アルキルカルボニル、アリールまたはアラルキル
であるか、あるいは、２つの置換基が隣接する炭素原子
上にある場合、一緒になって、所望により１つ以上のＳ
Ｏ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、またはこれら酸基の塩、アルキルお
よび／またはカルボキシル基により置換されていてもよ
い１,４−ブタジエンジイル基を表し；Ｒ³は、水素原
子、−ＣＯ−ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、またはこ
れら酸基の塩であるか、所望により１つ以上のハロゲ
ン、ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈおよび／またはＰＯ₃Ｈ₂または
これら酸基の塩により置換されていてもよいアルキルカ
ルボニル基であるか、あるいは所望により１つ以上のＳ
Ｏ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂またはこれら酸基の塩により置換され
ていてもよいアリールカルボニル基であり；Ｌは、式
（ＩＩ）：

【化５】 （式中、Ｒ⁴およびＲ⁵は、同一または異なり、アルキル
基であるか、または一緒になって、酸素、硫黄または窒
素を有していてもよい３〜６員の飽和炭化水素鎖であ
り、該アルキルまたは炭化水素鎖は、所望により１つ以
上のヒドロキシル、カルボキシル、アルコキシカルボニ
ル、アルコキシ、ＳＯ₃ＨまたはＰＯ₃Ｈ₂基、これら酸
残基の塩またはハロゲンにより置換されていてもよく；
Ｒ⁶およびＲ⁷は、同一または異なっていてもよく、水素
原子、ハロゲン原子、ヒドロキシルまたはカルボキシア
ミド、あるいは所望により１つ以上のヒドロキシル、カ
ルボキシル、ハロゲン、ＳＯ₃ＨまたはＰＯ₃Ｈ₂または
これら酸残基の塩により置換されていてもよいアルキ
ル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルコキシカル
ボニル、アリールまたはアラルキル基を意味する）で示
される基であるか、またはＬは、式（ＩＩＩ）：

【化６】 （式中、Ｘ−Ｙは、ＮＲ⁸−ＣＯまたはＮ＝ＣＲ⁹を意味
し、ここで、Ｒ⁸は、水素原子またはアルキル基であ
り、Ｒ⁹は、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アル
キルチオ、アリール、アラルキル（ここで、各々、所望
によりヒドロキシル、ジアルキルホスフィニル、カルボ
キシル、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、これら酸基のうちの１つ
の塩および／またはアルコキシカルボニルにより置換さ
れていてもよい）、アミノ（ここで、該アミノ基は、所
望により１または２つのアルキル基により置換されてい
てもよく、該アルキル基は、所望により１つ以上のヒド
ロキシル、カルボキシルおよび／またはアルコキシカル
ボニル基により置換されていてもよく、該アミノ基が２
つのアルキル基により置換されている場合、これらの基
は、一緒になって環を形成することができ、それは、ア
ミノ基の窒素原子とは別に、さらに所望により酸素、硫
黄またはさらなる窒素原子を有していてもよいか、また
は該アミノ基は、所望により１または２つのアシル基、
アルコキシ−および／またはアラルコキシカルボニル
基、Ｈ₂Ｎ−ＣＯ、アルキル−、アラルキル−またはア
リールカルバモイル基により置換されていてもよい）、
または水素、カルボキシル、アルコキシカルボニル、カ
ルボキシアミドまたはハロゲンであり；Ｚは、ＮＲ¹⁰−
Ｎ＝Ｎを意味し、ここで、該Ｒ¹⁰は、水素原子、アルキ
ル基またはアラルキル基であるか、あるいは、Ｚは、窒
素原子または炭素原子、および所望により１以上の窒素
もしくは硫黄原子を含有していてもよい３〜５員の不飽
和鎖であり、該炭素原子は、所望によりアルキル、アル
コキシ、ヒドロキシアルキル、アルキルチオ、ヒドロキ
シル、アラルキル、アリール、カルボキシル、カルボキ
シアミド、アルコキシカルボニル、シアノ、所望により
１または２個のアルキル基により置換されていてもよい
アミノ（ここで、該アルキル基は、所望により１以上の
ヒドロキシル、カルボキシルおよび／またはアルコキシ
カルボニル基により置換されていてもよい）、および／
またはハロゲンにより置換されていてもよく、ならびに
二重結合を介して結合していない窒素は、所望によりア
ルキルまたはアラルキルにより置換されていてもよい
か、あるいは２つの隣接する鎖置換基は、所望によりア
ルキレン基を形成してもよく、ここで、該アルキレン基
は、所望により、アリールおよび対応する互変異性体で
置換されているか、または縮合（anellate）されていて
もよい）で示されるピラゾロ複素環基を意味する］で示
されるＮ−およびＯ−置換アミノフェノール誘導体の、
ヒドロラーゼ基質としての使用に関する。

【００２０】英国特許公開明細書第２０６１５３７号お
よびドイツ連邦共和国特許公開明細書第２２６０２０２
号から、Ｇがアルカンカルボン酸残基であり、Ｒ³が水
素原子、所望により１以上のハロゲンにより置換されて
いてもよいアリールカルボニル基またはアルキルカルボ
ニル基であり、Ｌが式（ＩＩＩ）のピラゾロ複素環基
（ただし、Ｘ−Ｙは、Ｎ＝ＣＲ⁹であり、Ｒ⁹は、前記定
義と同じであり、Ｚは、二重結合を介して結合していな
い窒素原子が水素原子により置換されている１,２,４−
トリアゾール環である）である式（Ｉ）に対応するピラ
ゾロトリアゾール誘導体が、写真作成用の発色物質とし
て知られている。式（Ｉ）の他の化合物は新規である。

【００２１】したがって、本発明は、さらに、式
（Ｉ）：

【化７】 ［式中、Ｇは、エステル形成性有機もしくは無機酸残
基、またはグリコシド残基であり；Ｒ¹およびＲ²は、同
一または異なり、水素原子、ハロゲン原子、ＳＯ₃Ｈ、
ＰＯ₃Ｈ₂、またはこれら酸基の塩であるか、ヒドロキシ
ル、ニトロ、カルボキシル、カルボキシアミドまたはシ
アノであるか、所望により１つ以上のヒドロキシル、カ
ルボキシル、ハロゲン、シアノ、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、
またはこれら酸基のうちの１つの塩により置換されてい
てもよいアルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキル
スルフィニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボ
ニル、アルキルカルボニル、アリールまたはアラルキル
であるか、あるいは、２つの置換基が隣接する炭素原子
上にある場合、一緒になって、所望により１つ以上のＳ
Ｏ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、またはこれら酸基の塩、アルキルお
よび／またはカルボキシル基により置換されていてもよ
い１,４−ブタジエンジイル基を表し；Ｒ³は、水素原
子、−ＣＯ−ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、またはこ
れら酸基の塩であるか、所望により１つ以上のハロゲ
ン、ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈおよび／またはＰＯ₃Ｈ₂または
これら酸基の塩により置換されていてもよいアルキルカ
ルボニル基であるか、あるいは所望により１つ以上のＳ
Ｏ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂またはこれら酸基の塩により置換され
ていてもよいアリールカルボニル基であり；Ｌは、式
（ＩＩ）：

【化８】 （式中、Ｒ⁴およびＲ⁵は、同一または異なり、アルキル
基であるか、または一緒になって、酸素、硫黄または窒
素を有していてもよい３〜６員の飽和炭化水素鎖であ
り、該アルキルまたは炭化水素鎖は、所望により１つ以
上のヒドロキシル、カルボキシル、アルコキシカルボニ
ル、アルコキシ、ＳＯ₃ＨまたはＰＯ₃Ｈ₂基、これら酸
残基の塩またはハロゲンにより置換されていてもよく；
Ｒ⁶およびＲ⁷は、同一または異なっていてもよく、水素
原子、ハロゲン原子、ヒドロキシルまたはカルボキシア
ミド、あるいは所望により１つ以上のヒドロキシル、カ
ルボキシル、ハロゲン、ＳＯ₃ＨまたはＰＯ₃Ｈ₂または
これら酸残基の塩により置換されていてもよいアルキ
ル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルコキシカル
ボニル、アリールまたはアラルキル基を意味する）で示
される基であるか、またはＬは、式（ＩＩＩ）：

【化９】 （式中、Ｘ−Ｙは、ＮＲ⁸−ＣＯまたはＮ＝ＣＲ⁹を意味
し、ここで、Ｒ⁸は、水素原子またはアルキル基であ
り、Ｒ⁹は、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アル
キルチオ、アリール、アラルキル（ここで、各々、所望
によりヒドロキシル、ジアルキルホスフィニル、カルボ
キシル、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、これら酸基のうちの１つ
の塩および／またはアルコキシカルボニルにより置換さ
れていてもよい）、アミノ（ここで、該アミノ基は、所
望により１または２つのアルキル基により置換されてい
てもよく、該アルキル基は、所望により１つ以上のヒド
ロキシル、カルボキシルおよび／またはアルコキシカル
ボニル基により置換されていてもよく、該アミノ基が２
つのアルキル基により置換されている場合、これらの基
は、一緒になって環を形成することができ、それは、ア
ミノ基の窒素原子とは別に、さらに所望により酸素、硫
黄またはさらなる窒素原子を有していてもよいか、また
は該アミノ基は、所望により１または２つのアシル基、
アルコキシ−および／またはアラルコキシカルボニル
基、Ｈ₂Ｎ−ＣＯ、アルキル−、アラルキル−またはア
リールカルバモイル基により置換されていてもよい）、
または水素、カルボキシル、アルコキシカルボニル、カ
ルボキシアミドまたはハロゲンであり；Ｚは、ＮＲ¹⁰−
Ｎ＝Ｎを意味し、ここで、該Ｒ¹⁰は、水素原子、アルキ
ル基またはアラルキル基であるか、あるいはＺは、窒素
原子または炭素原子、および所望により１以上の窒素も
しくは硫黄原子を含有していてもよい３〜５員の不飽和
鎖であり、該炭素原子は、所望によりアルキル、アルコ
キシ、ヒドロキシアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシ
ル、アラルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシ
アミド、アルコキシカルボニル、シアノ、所望により１
または２個のアルキル基により置換されていてもよいア
ミノ（ここで、該アルキル基は、所望により１以上のヒ
ドロキシル、カルボキシルおよび／またはアルコキシカ
ルボニル基により置換されていてもよい）、および／ま
たはハロゲンにより置換されていてもよく、ならびに二
重結合を介して結合していない窒素は、所望によりアル
キルまたはアラルキルにより置換されていてもよいか、
あるいは２つの隣接する鎖置換基は、所望によりアルキ
レン基を形成してもよく、ここで、該アルキレン基は、
所望により、アリールおよび対応する互変異性体で置換
されているか、または縮合（anellate）されていてもよ
い）で示されるピラゾロ複素環基を意味する；ただし、
Ｇがアルカンカルボン酸基であり、Ｒ³が水素原子、所
望により１以上のハロゲンにより置換されていてもよい
アリールカルボニル基またはアルキルカルボニル基であ
り、Ｌが式（ＩＩＩ）のピラゾロ複素環基であって、こ
こで、Ｘ−ＹがＮ＝ＣＲ⁹（Ｒ⁹は前記定義と同じ）であ
る場合、Ｚは、二重結合を介して結合していない窒素原
子が水素により置換されている１,２,４−トリアゾール
環を形成しない］で示されるＮ−およびＯ−置換アミノ
フェノール誘導体を提供する。

【００２２】さらに、本発明は、式（ＩＶ）： ［式中、Ｇは、エステル形成性有機もしくは無機酸残
基、またはグリコシド残基であり、Ｄは、反応基であっ
て、Ｇにおいて存在する官能基は、所望により、ペプチ
ドおよび炭水化物化学の分野における通常の保護基で保
護されていてもよい］で示される化合物を、式（Ｖ）：

【化１０】 ［式中、Ｒ¹〜Ｒ³およびＬは、式（Ｉ）における定義と
同じであり、加えてＲ³は、アミノ保護基とすることが
でき、Ａは、水素原子、所望により置換されていてもよ
いアンモニウムイオンまたはアルカリ金属を意味する］
で示される化合物と反応させ、その後、所望により、保
護基を分離することを特徴とする式（Ｉ）の化合物の製
造方法を提供する。

【００２３】さらには、本発明は、式（Ｖ'）：

【化１１】 ［式中、Ｒ¹〜Ｒ³は、式（Ｉ）における定義と同じであ
り；式（ＩＩＩ）

【化１２】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは、式（Ｉ）における定義と同
じである；ただし、Ｒ³が、所望により１以上のハロゲ
ンにより置換されていてもよいアリールカルボニル基ま
たはアルキルカルボニル基であり、Ｘ−ＹがＣ＝ＮＲ⁹
である場合、Ｚは、二重結合を介して結合していない窒
素原子が水素原子により置換されている１,２,４−トリ
アゾール環を形成しない）で示されるピラゾロ複素環基
を意味する］で示される化合物を提供する。

【００２４】加えて、本発明は、 ａ）式（ＶＩＩ）：

【化１３】 ［式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＬは、式（Ｖ'）における定義
と同じである］で示される化合物を還元し、Ｒ³が水素
原子でない場合、アニリノ基をアシル化し、所望によ
り、存在してもよいエステル基を除去するか、または ｂ）Ｌが、式（ＩＩＩ）：

【化１４】 ［式中、Ｘ−Ｙ、ＧおよびＺは、式（Ｉ）における定義
と同じである］で示されるピラゾロ複素環基である式
（Ｉ）の化合物を、適当なヒドロラーゼと反応させるこ
とからなる式（Ｖ’）の化合物の製造方法を提供する。

【００２５】さらに、本発明は、式（ＶＩＩ）：

【化１５】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は、式（Ｉ）における定義と同じ
であり、Ｌは、式（ＩＩＩ）：

【化１６】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは、式（Ｉ）における定義と同
じである）で示されるピラゾロ複素環基を意味する］で
示される化合物を提供する。

【００２６】さらにその上、本発明は、 ａ）Ｌが、式（ＩＩＩ）：

【化１７】 ［式中、Ｘ−ＹおよびＺは、式（Ｉ）における定義と同
じである］で示されるピラゾロ複素環基である式（Ｉ）
の化合物を、ヒドロラーゼと反応させ、反応生成物を酸
化するか、または

【００２７】ｂ）式（ＶＩＩＩ）： ［式中、Ｌは、式（ＩＩＩ）：

【化１８】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは、式（Ｉ）における定義と同
じである）で示されるピラゾロ複素環基を意味する］で
示される化合物を、酸化剤の存在下、式（ＩＸ）：

【化１９】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は、式（ＶＩＩ）における定義と
同じであり、Ｖは、水素原子、ハロゲン原子、ＣＯＯＨ
基またはＳＯ₃Ｈ基を意味する］で示されるフェノール
と反応させるか、または

【００２８】ｃ）式（Ｘ）： ［式中、Ｌは、式（ＩＩＩ）：

【化２０】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは、式（Ｉ）における定義と同
じである）で示されるピラゾロ複素環基を意味する］で
示される化合物を、式（ＸＩ）：

【化２１】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は、式（ＶＩＩ）における定義と
同じであり、Ｈalは、ハロゲン原子を意味する］で示さ
れる化合物と反応させるか、または

【００２９】ｄ）式（ＸＸＶ）： ［式中、Ｅは、ニトロまたはニトロソ基であり、Ｌは、
式（ＩＩＩ）：

【化２２】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは、式（Ｉ）における定義と同
じである）で示されるピラゾロ複素環基を意味する］で
示される化合物を、式（ＸＸＶＩ）：

【化２３】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は、式（ＶＩＩ）における定義と
同じであり、Ｑは、ヒドロキシル基またはジアルキルア
ミノ基であり、Ｍｅは、ハロゲン原子で置換されたリチ
ウムまたはマグネシウムを意味する］で示されるオルガ
ノ金属化合物と反応させ、その後、水性媒体中にて後処
理することからなる式（ＶＩＩ）の化合物の製造方法を
提供する。

【００３０】本発明の目的は、また、新規な式（Ｉ）の
化合物の製造についての式（Ｖ'）および（ＶＩＩ）の
化合物の使用にある。

【００３１】本発明の目的は、また、色素産生性酵素基
質を酵素と反応させ、該酵素により該基質から遊離した
ロイコ色物質（leuko coloured material）を酸化
し、酵素量の測定として得られた着色物質を測定するこ
とからなるヒドロラーゼの比色定量測定法であって、酵
素基質として式（Ｉ）の化合物を使用することを特徴と
するヒドロラーゼ比色定量測定方法にある。

【００３２】加えて、本発明の目的は、色素産生性酵素
基質として式（Ｉ）の化合物を使用することを特徴とす
る色素産生性酵素基質および適当な緩衝物質を含有する
ヒドロラーゼ測定用診断薬にある。

【００３３】最後に、本発明の目的は、ヒドロラーゼ測
定用診断薬を製造するための式（Ｉ）の化合物の使用に
ある。

【００３４】前記の式（Ｉ）の化合物が、著しく優れた
方法にて、明確にした問題点を解決するヒドロラーゼ基
質であることが判明した。

【００３５】Ｇの定義におけるエステル形成性無機酸残
基は、特に、エステル結合を介してアミノフェノール基
本構造に結合しているオルトおよびピロリン酸ならびに
硫酸残基であると解される。残基ＰＯ₃ＭＭ'およびＳＯ
₃Ｍ、特にＰＯ₃ＭＭ'が好ましく、ここで、遊離酸の場
合、ＭおよびＭ'は、水素原子であり、それに対して、
該酸が塩として存在する場合、ＭおよびＭ’は、アルカ
リ金属、アルカリ土類金属またはアンモニウムイオンを
意味する。

【００３６】ＭおよびＭ'の定義におけるアルカリ金属
イオンは、特に、リチウム、ナトリウムおよびカリウム
イオンであると解される。アルカリ土類金属イオンは、
特に、マグネシウム、カルシウムまたはバリウムイオン
である。

【００３７】ＭおよびＭ'の定義におけるアンモニウム
イオンとしては、非置換アンモニウムイオンＮＨ₄ ⁺また
は１以上のアルキルまたはアラルキル基により置換され
ているアンモニウムイオンが挙げられる。この場合、ア
ルキル基とは、６個までの炭素原子を有するものである
と解され、メチルまたはエチル基が好ましい。アラルキ
ル基とは、前記アルキル基がアリール基により置換され
ているものであり、該アリールは、炭素芳香族またはヘ
テロ芳香族基であり、好ましくは６〜１０個の環原子を
含有する基であると解され、特にフェニルまたはナフチ
ル基が好ましい。好ましいアラルキル基は、ベンジル基
である。置換アンモニウムイオンの置換基は、同一であ
っても異なっていてもよい。また、アンモニウムイオン
として、例えば、ピペリジニウムカチオンおよびピリジ
ニウムイオンを包含する第４級窒素複素環化合物のカチ
オンを用いることができる。

【００３８】Ｇの定義におけるエステル形成性有機酸残
基とは、特に、アルカンカルボン酸、アミノ酸およびオ
リゴペプチドの残基であると解され、これらは、そのカ
ルボキシル末端で、エステルとして式（Ｉ）のアミノフ
ェノール基本構造に結合している。

【００３９】Ｇの定義におけるアルカンカルボン酸残基
とは、２０個までの炭素原子を含有する化合物である。
特に酢酸、プロピオン酸、酪酸、パルミチン酸およびス
テアリン酸が好ましい。飽和酸残基の他に、さらに、Ｇ
は、不飽和酸残基、例えば、オレイン酸、リノール酸ま
たはリノレン酸とすることができる。

【００４０】アミノ酸残基は、好ましくは、そのＬ−も
しくはＤ−形の、またはそのラセミ形の天然α−アミノ
酸の残基である。特にグリシン、アラニン、バリン、ロ
イシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびチロシ
ンの残基が好ましく、各々、Ｌ−形がとりわけ特に好ま
しい。

【００４１】オリゴペプチド残基は、例えば、ジ−、ト
リ−、テトラ−またはペンタペプチドであり、好ましく
は、ジ−またはトリペプチドであると解されるべきであ
り、ここで、アミノ酸成分は、好ましくは、前記アミノ
酸である。

【００４２】アミノフェノール基にエステル形にて結合
しているアミノ酸およびオリゴペプチド残基のアミノ基
は、遊離または保護形とすることができる。保護基とし
て、全ての通常のアミノ保護基、特に、アシル、オキシ
カルボニル、チオカルボニル、スルホ、スルフィノ、ビ
ニル、シクロヘキセニル、ホスホリルおよびカルバモイ
ル基であると解されるべきである。特に好ましいアミノ
保護基としては、トシル、ベンジルオキシカルボニルお
よびtert−ブトキシカルボニル基が挙げられる。

【００４３】Ｇの定義におけるグリコシド基は、単−ま
たはオリゴ糖類とすることができる。該糖残基は、α−
またはβ−グリコシド的にアミノフェノール基本構造に
結合することができる。好ましい単糖類の例としては、
ガラクトース、グルコースおよびマンノースが挙げられ
る。Ｎ−アセチルグルコサミンが特に好ましい。とりわ
け特に好ましくは、β−グリコシド的に結合したＮ−ア
セチル−２−Ｄ−グルコサミンである。

【００４４】しかしながら、オリゴ糖類もまた、糖残基
として適当であることが証明された。オリゴ糖とは、特
に、２〜１０個、好ましくは２〜７個の単糖単位で構成
されているものを称する。ヘプタオース（heptaose）が
特に好ましい。

【００４５】式（Ｉ）の化合物では、Ｇの定義における
有機酸および無機酸の残基ならびにグリコシド残基の群
のうちグリコシド残基が好ましい。Ｎ−アセチルグルコ
サミン残基が特に有利である。

【００４６】特に指示しない限り、本明細書中の式中、
以下の基は、以下の意義を有する：「アルキル」、なら
びにアルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アル
キルカルボニル、アルキルチオ、アルキルカルバモイ
ル、アルキルアミノおよびアラルキル基中の「アルキ
ル」は、６個まで、好ましくは４個までの炭素原子を含
有する直鎖または分岐鎖状アルキル基を意味し、その例
として、メチル、エチル、プロピル、イソブチルおよび
tert−ブチル基が挙げられる。

【００４７】アミノ基が２個のアルキル基により置換さ
れている場合、これらの基は、結合して環を形成しても
よく、それは、全体として、窒素原子を有する環を表
す。好ましくは、これらアミノ基は、全体で５または６
員環を表し、次に、所望により酸素、硫黄またはさらな
る窒素原子を有していてもよい。モルホリノ基が特に好
ましい。

【００４８】ヒドロキシアルキル基は、ヒドロキシル基
によって置換された６個まで、好ましくは４個までの炭
素原子を有するアルキル基である。該ヒドロキシアルキ
ル基は、第１級、第２級または第３級アルコールの残基
とすることができる。特に、２−および１−ヒドロキシ
エチルおよびヒドロキシメチル基が好ましい。

【００４９】「アルコキシ」、ならびにアルコキシ−お
よびアラルコキシ炭素基中の「アルコキシ」は、６個ま
で、好ましくは４個までの炭素原子を有する直鎖状また
は分岐鎖状アルコキシ基を意味する。その例としては、
メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソブトキシおよび
tert−ブトキシ基が挙げられる。

【００５０】「アリール」、ならびにアリールカルボニ
ルおよびアリールカルバモイル基中の「アリール」は、
炭素芳香族またはヘテロ芳香族基を意味し、好ましく
は、６〜１０個の環原子を有する基で、とりわけ、フェ
ニルまたはナフチル基であり、それらは、さらに、アル
キル、アルコキシおよび／またはハロゲンにより置換さ
れていてもよく、特に、フェニル基が好ましい。

【００５１】「アラルキル」、およびアラルキルカルバ
モイル基中の「アラルキル」基は、前記定義のアルキル
基がアリール基により置換されている基を意味し、ベン
ジル基が好ましい。

【００５２】「アラルコキシ」基、例えば、アラルコキ
シカルボニル基は、前記定義のアルコキシ基がアリール
基により置換されている基を意味し、ベンジルオキシ基
が好ましい。

【００５３】「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素また
はヨウ素原子を意味し、フッ素および塩素が好ましい。

【００５４】「アルケニル」は、２〜６個、好ましくは
２〜４個の炭素原子を有する不飽和炭化水素基を意味
し、その例として、ビニルおよびアリル基が挙げられ
る。

【００５５】アシル基は、アルキル、アラルキルまたは
アリール基を含有しうるカルボン酸残基を示し、アセチ
ル、フェニルアセチルおよびベンゾイル基が好ましい。

【００５６】アルキレンとは、３〜５個、好ましくは３
または４個の炭素原子を有する、２価の、直鎖状または
分岐鎖状飽和または不飽和炭化水素基であると解される
べきである。その例としては、−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ
−、−ＣＨ＝Ｃ(ＣＨ₃)ＣＨ₂−、−ＣＨ(ＣＨ₃)−ＣＨ
＝ＣＨ−、−(ＣＨ₂)₄−および−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ
Ｈ−が挙げられる。ブタジエンジイル基（−ＣＨ＝ＣＨ
−ＣＨ＝ＣＨ−）およびテトラメチレン基（−(ＣＨ₂)₄
−）が好ましい。

【００５７】ジアルキルホスフィニル基とは、残基が−
Ｐ(＝Ｏ)(アルキル)₂であり、ここで、アルキルが前記
と同じであると解されるべきである。ジメチルホスフィ
ニル残基が好ましい。

【００５８】ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂およびカルボキシル残
基の塩として、アルカリ金属、アルカリ土類金属または
アンモニウム塩を用いることができる。アルカリ金属塩
とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウムお
よびセシウム塩をいうと解されるべきであり、リチウ
ム、ナトリウムおよびカリウム塩、特にナトリウムおよ
びカリウム塩が好ましい。アルカリ土類金属塩は、ベリ
リウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウムお
よびバリウムの塩であり、マグネシウムおよびカルシウ
ム塩、特にカルシウム塩が好ましい。アンモニウム塩と
して、非置換アンモニウムイオンＮＨ₄ ⁺を用いることが
できる。しかしながら、さらに、該アンモニウムイオン
が４個までのアルキル、アリールまたはアラルキル基に
より置換されているこれらアンモニウムの塩を用いるこ
とも可能である。これらの基としては、前記の定義が適
用され、アルキル基は、好ましくは、メチル、エチルま
たはｎ−プロピル基であり、アリール基は、好ましく
は、フェニル基であり、アラルキル基は、好ましくは、
ベンジル基である。アンモニウムイオンとして、第４級
窒素複素環化合物のカチオンを用いることもでき、その
例としては、ピペリジニウムカチオンおよびピリジニウ
ムイオンが挙げられる。

【００５９】カルボキシアミド基は、ＣＯＮＨ₂基であ
ると解されるが、この基は、アミノ基が、１または２個
のアルキル基によって置換されており、該アルキル基
が、所望により１以上のヒドロキシル、カルボキシルお
よび／またはアルコキシカルボニル基により置換されて
いてもよい。

【００６０】特に、Ｒ³が水素原子または１以上のハロ
ゲンにより置換されているアルキルカルボニル基、例え
ば、トリフルオロアセチルである本発明の化合物が有利
である。Ｒ³として水素がとりわけ特に好ましい。

【００６１】Ｌが式（ＩＩＩ）のピラゾロ複素環基であ
る本発明の化合物が好ましい。これらのうち、式（ＩＩ
Ｉ）において、特に、Ｚが、不飽和鎖の少なくとも１つ
の二重結合が二重結合または窒素原子と結合（conjugat
ion）する位置にあるような化合物が好ましい。

【００６２】さらには、Ｌが式（ＩＩＩ）のピラゾロ複
素環基である本発明の化合物は、不飽和鎖Ｚにおいて、
Ｚが二重結合を介して結合していない窒素原子を有する
場合、これら窒素原子上にてアルキルまたはアラルキル
基によってのみ置換されているものが特に好ましい。

【００６３】式（ＩＩＩ）の基として互変異性体形もま
た可能である。これらは、また、式（ＩＩＩ）に含まれ
ると考えられる。

【００６４】本発明によれば、Ｌが次式（ＸＩＩＩ）〜
（ＸＸＩＶ）：

【化２４】 で示される１つの基およびその対応する互変異性体形で
ある式（Ｉ）の化合物が好ましい。前記の式において、
Ｘ−ＹおよびＲ¹⁰は、前記定義と同じである。Ｒ¹¹、Ｒ
¹²、Ｒ¹³およびＲ¹⁴は、同一または異なっていてもよ
く、水素、ヒドロキシル、アルキル、アルコキシ、アル
キルチオ、アラルキル、アリール、カルボキシル、アル
コキシカルボニル、カルボキシアミド、シアノ、所望に
より１または２個のアルキル基により置換されていても
よいアミノ（ここで、該アルキル基は、所望により１以
上のヒドロキシル、カルボキシルおよび／またはアルコ
キシカルボニル基により置換されていてもよい）、また
はハロゲンであり、２つの隣接する基は、所望により、
アリールにより置換されているか、または縮合している
アルキレン基を形成してもよい。該基の定義は、前記の
定義に対応する。

【００６５】本発明によれば、式（Ｉ）の化合物は、特
に、Ｌが式（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（Ｘ
ＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ）および（ＸＸ）の群からなる
基およびその対応する互変異性体形であることが好まし
い。とりわけ、好ましくは、Ｘ−ＹがＮ＝ＣＲ⁹であ
り、ここでＲ⁹は、式（ＩＩＩ）における定義と同じで
あるとすることができるが、好ましくは、水素原子また
はアルコキシ基である化合物である。

【００６６】特に、本発明の意義において、特に、４−
ヒドロキシフェニル−２−メチルピラゾロ[１,５−ａ]
ピリジン−３−イルアミンのβ−グルコシド的に結合し
たＮ−アセチル−２−Ｄ−グルコサミニドが好ましい。

【００６７】式（Ｉ）の化合物は、新規化合物である。
該化合物は、式（Ｖ）：

【化２５】 ［式中、Ｒ¹〜Ｒ³およびＬは、式（Ｉ）における定義と
同じであり、Ａは、水素原子、所望により置換されてい
てもよいアンモニウムイオンまたはアルカリ金属を意味
する］で示されるロイコメチン（leuko methine）色物
質を、式（ＩＶ）： ［式中、Ｇは、式（Ｉ）における定義と同じく有機酸も
しくは無機酸の残基またはグリコシド残基であり、該グ
リコシド残基において存在する官能基、例えば、アミノ
および／またはヒドロキシル基は、所望により、ペプチ
ドおよび炭水化物化学の分野における通常の保護基によ
り置換されていてもよく；Ｄは反応基を意味する］で示
される化合物と反応させ、その後、所望により、保護基
を分離することにより製造することができる。

【００６８】非置換アンモニウムイオンとは、ＮＨ₄ ⁺で
あると解されるべきである。該イオンは、式（Ｖ）にお
けるＡの定義と同じである、所望により、１以上のアル
キルまたはアラルキル基により置換されていてもよい。
置換アンモニウムイオンの置換基は、同一または異なっ
ていてもよい。アンモニウムイオンとして、さらに第４
級窒素−複素環式化合物を用いることができ、例えば、
ピペリジニウムカチオンおよびピリジニウムイオンが挙
げられる。

【００６９】式（Ｖ）におけるＡの定義におけるアルカ
リ金属としては、リチウム、ナトリウムおよびカリウム
を用いることができ、ナトリウムが好ましい。

【００７０】Ｄは、式（Ｖ）のフェノールまたはフェノ
ラート基ＯＡと反応しうる反応基を意味する。該反応基
の選択は、Ｇ基の特性に依存している。Ｇが糖残基であ
る場合、Ｄは、容易に置換される基、例えば、アセチル
基またはハロゲン基であり、それはフッ素、塩素、臭素
およびヨウ素から選択することができ、塩素、臭素およ
びヨウ素が好ましい。

【００７１】炭水化物化学の分野における通常の保護基
としては、特に、アセチル、ベンゾイル、ベンジルおよ
びトリメチルシリル基が挙げられる。

【００７２】Ｇがアミノ酸残基またはペプチド残基で、
それを、そのカルボキシル末端で式（Ｖ）のアミノフェ
ノールによりエステル化する場合、反応基Ｄとしては、
ペプチド化学における通常のあらゆる基を用いることが
できる。反応性誘導体として、酸ハロゲン化物、好まし
くは酸塩化物、またはペプチド合成において通常用いら
れる混成酸無水物または活性エステルを用いることがで
きる。さらには、同一の反応基を、アルカンカルボン酸
のアミノフェノール構造への結合に用いることができ
る。

【００７３】Ｇが無機酸残基である場合、式（Ｖ）の化
合物を、対応する酸ハロゲン化物、特に酸塩化物と反応
させることが好ましい。

【００７４】あらゆる場合において、エステル化に関し
ては、式（Ｖ）におけるＲ³が水素原子である場合、エ
ステル化反応を実施する前に、このアミノ基を保護基、
例えば、ペプチド化学においてこの目的に通常用いられ
る基で置換し、その後、該保護基を再度除去するように
計画すべきである。

【００７５】例示を介して、式（Ｉ）の化合物の製造方
法を、ＧがＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド基で
ある特に好ましい化合物を用いて説明する。該方法は、
また、式（Ｉ）の他のグリコシド誘導体の製造に相当し
て用いることができる。

【００７６】本発明によれば、式（Ｉ）のＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニジル誘導体は、式（ＶＩ）：

【化２６】 ［式中、Ｗは、ハロゲン原子であり、Ｒは、炭水化物化
学の分野において通常のヒドロキシ保護基であり、Ｂ
は、アジド基、保護アミノ基またはＮＨ−ＣＯＣＨ₃で
あるか、あるいはＢおよびＷは、一緒になって、式：

【化２７】 で示される基を意味する］で示される化合物を、式
（Ｖ）：

【化２８】 ［式中、Ｒ¹〜Ｒ³およびＬは、式（Ｉ）における定義と
同じであり、Ａは、水素原子、所望により置換されてい
てもよいアンモニウムイオンまたはアルカリ金属を意味
する］で示される化合物と反応させ、Ｂが保護アミノ基
である場合、該アミノ保護基を除去するか、またはＢが
アジド基である場合、これを還元することによりアミノ
基に変換し、該アミノ基をアセチル化することによりＮ
ＨＣＯＣＨ₃に変換し、最終的にヒドロキシ保護基を分
離することにより製造することができる。

【００７７】例えば、式（Ｖ）：

【化２９】 ［式中、Ｒ¹〜Ｒ³およびＬは、式（Ｉ）における定義と
同じである］で示されるロイコメチン色物質を、式（Ｖ
Ｉ）：

【化３０】 ［式中、Ｗは、ハロゲン原子であり、Ｂは、ＮＨＣＯＣ
Ｈ₃であり、Ｒは、炭水化物化学の分野において通常用
いられる保護基を意味する］で示されるペル−Ｏ−置換
１−ハロ−Ｎ−アセチルグルコサミンと、糖残基のＣ−
１原子上におけるワルデン反転により反応させ、ペル−
Ｏ−置換β−グリコシドを得、その後、該ヒドロキシ保
護基を公知方法に従って分離する。

【００７８】前記の式（Ｖ）と式（ＶＩ）の化合物を反
応させ、式（Ｉ）のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニドを得るには、水性アセトン中、あるいは水／ベンゼ
ンまたは水／クロロホルム混合物のような相間移動条件
下、酸受容体、例えば、水酸化、炭酸または重炭酸アル
カリ金属の存在下にて実施することが好ましい（シンセ
シス（Ｓynthesis），２２３／１９８８参照）。

【００７９】さらにまた、式（Ｉ）のＮ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミニドは、まず第一に、Ａが水素原子で
ある式（Ｖ）のロイコ色物質を、アルカリ金属水酸化物
またはアルコラートで対応するアルカリ金属塩に、また
は所望により置換されていてもよいアミンでアンモニウ
ム塩に変え（ここで、該アルカリ金属およびアンモニウ
ムイオンは前記と同じとすることができる）、その後、
該化合物を、二極性非プロトン性溶媒、例えば、アセト
ン、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタンまたはジメ
チルホルムアミド中、ペル−Ｏ−置換１−ハロ−Ｎ−ア
セチルグルコサミンと反応させることにより製造するこ
とができる。

【００８０】加えて、式（Ｖ）のロイコ色物質および１
−ハロ−Ｎ−アセチルグルコサミンから式（Ｉ）のＮ−
アセチル−グルコサミニドを合成する場合、塩化メチレ
ン、クロロホルム、ベンゼン、トルエンまたはジオキサ
ンのような溶媒中、銀塩または銀塩の混合物（酸化銀、
セライト^R（Ｃelite^R）上の炭酸銀、トリフルオロメタ
ンスルホン酸（triflate）銀、サリチル酸銀）および／
または個々の水銀塩または水銀塩の混合物（臭化水銀、
シアン化水銀、酢酸水銀、酸化水銀）を添加し、所望に
より乾燥剤、例えば、塩化カルシウムまたはドリエリッ
ト^R（Ｄrierit^R）を用いることが有用である。

【００８１】さらにまた、式（Ｉ）のＮ−アセチル−グ
ルコサミニドの合成について、有機酸、例えば、ｐ−ト
ルエンスルホン酸またはルイス酸、例えば、三フッ化ホ
ウ素エーテル錯化合物または塩化第二鉄の存在下式（Ｖ
Ｉ）のオキサゾリン（式中、ＢおよびＷは、一緒になっ
て、式：

【化３１】 で示される基を意味する）を用いることができる。かか
るグリコシド化反応の例は、例えば、カルボヒドレート
・リサーチ（Ｃarbohydrate Ｒesearch），１３６、３
０９〜３２３／１９８５および６４，３３４〜３３８／
１９７８にて記載されている。

【００８２】最後に、式（Ｉ）のＮ−アセチルグルコサ
ミニドの製造は、式（ＶＩ）の化合物において、Ｂが保
護基、例えば、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキ
シカルボニル、ジクロロアセトアミドまたはフタルイミ
ド基、またはグリコシド化条件下にて安定しており、ア
ミノ基が遊離することができる置換基、例えば、アジド
基で置換されているアミノ基である化合物にて実施する
ことができる。該グリコシド化反応は、ペプチド化学の
方法に従って保護基を分離するか、またはアジド基を還
元してアミノ基を遊離させ、次いで、それを最終工程に
て選択的にＮ−アセチル化することにより実施される
（例えば、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミスト
リー（Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.），３２，３７６７／１９６７を
参照）。

【００８３】保護基の分離は、炭水化物化学の分野にて
公知の方法で、ベンジル型の保護基の場合は水素化分解
によって、アシル基、例えばアセチル基を分離するため
にはメタノール中でナトリウムメチラート、シアン化ナ
トリウムまたは重炭酸ナトリウムの作用によって行われ
る。保護基を分離する方法は、Ａdv．Ｃarbohydr．Ｃhe
m．Ｂiochem．、３９、１３／１９８１に記載されてい
る。

【００８４】１−ハロ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合
成は、例えば、オーガニック・シンセシス（Ｏrg.Ｓynt
h.）、第４６巻、第１頁；メソッズ・イン・カルボヒド
レート・ケミストリー（Ｍethods in Ｃarbohydrate Ｃ
hem.）、６、２８２／１９７２およびジャーナル・オブ
・オーガニック・ケミストリー、２６、４４５／１９６
１に記載されている。

【００８５】式（Ｉ）で示される化合物の製造に必要で
あり、式（Ｖ'）：

【化３２】 ［式中、Ｒ¹〜Ｒ³およびＬは、式（Ｉ）における定義と
同じであり、該Ｌは、好ましくは、式（ＩＩＩ）：

【化３３】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは、対応する式（Ｉ）における
定義と同じである）で示されるピラゾロ複素環基を意味
する］で示されるロイコ色物質は、英国特許公開明細書
第Ａ−２０６１５３７の、Ｒ³が、所望により１以上の
ハロゲンにより置換されていてもよいアリールカルボニ
ル基またはアルキルカルボニル基であり、Ｚが二重結合
を介して結合していない窒素原子が水素で置換されてい
る１,２,４−トリアゾール環である化合物を除いて、新
規化合物である。

【００８６】該化合物は、式（ＶＩＩ）：

【化３４】 ［式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＬは、式（Ｖ'）における定義
と同じである］で示される対応する着色化合物を、公知
方法に従って、還元剤、例えば接触水素添加、水素化ホ
ウ素ナトリウム、パラジウム／ヒドラジンまたは亜ジチ
オン酸ナトリウムを用いて還元することによって製造す
ることができる。かかる還元剤は、ホイベン・ウェイル
（Ｈouben−Ｗeyl）、Ｖol.４／１ｃおよび４／１ｄに
記載されている。

【００８７】アシル基Ｒ³は、式（Ｉ）で示される化合
物におけるように、Ｒ³が水素原子である式（Ｖ'）で示
されるロイコ色物質の段階で、またはＧがグリコシド残
基である式（Ｉ）で示される化合物の製造の場合に生じ
るような保護ペル−Ｏ−置換Ｎ−アセチル−グルコサミ
ニドの段階のいずれかにて導入することができる。これ
らは、ペプチド化学の分野にて公知である、活性化酸誘
導体、例えば、ハロゲン化物、無水物、混成酸無水物が
使用される。

【００８８】式（Ｉ）の化合物から出発し、適当なヒド
ロラーゼと反応させることにより、式（Ｖ'）の化合物
を製造することもできる。

【００８９】式（Ｖ'）で示される化合物の製造に必要
な式（ＶＩＩ）で示される着色物質もまた新規化合物で
ある。該化合物は、好ましくは、式（ＶＩＩＩ）： ［式中、Ｌは、式（Ｉ）における定義と同じであり、好
ましくは、式（ＩＩＩ）で示されるピラゾロ複素環基で
あり、該式（ＩＩＩ）におけるＸ−ＹおよびＺは式
（Ｉ）における定義と同じである］で示されるアミノ化
合物を、式（ＩＸ）：

【化３５】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は、式（Ｉ）における定義と同じ
であり、Ｖは、水素原子、ハロゲン原子、カルボキシル
基またはＳＯ₃Ｈ基を意味する］で示されるフェノール
と酸化的カップリングすることによって得られる。

【００９０】このために、式（ＶＩＩＩ）で示されるア
ミノ化合物と、好ましくはＶが水素原子である式（Ｉ
Ｘ）で示されるフェノールとを、酸化剤、例えば、フェ
リシアン化カリウム、カリウムペルオキソジサルフェー
ト、カリウムペルオキソモノサルフェート、ヨウ素、過
酸化水素／ペルオキシダーゼ、二酸化鉛、ＮaＯＣl、Ｎ
aＯＢr、有機酸化剤、例えばＮ−ブロモスクシンイミド
または関連化合物の存在下で反応させる。

【００９１】さらにまた、式（ＶＩＩ）で示される着色
物質は、式（ＸＩ）：

【化３６】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は、式（Ｉ）における定義と同じ
であり、Ｈalは、ハロゲン原子であり、該ハロゲンは、
フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であり、好ましくは、
塩素を意味する］で示されるＮ−ハロイミンを、式
（Ｘ）： ［式中、Ｌは、式（Ｉ）における定義と同じであり、好
ましくは、Ｘ−ＹおよびＺが式（Ｉ）における定義と同
じである式（ＩＩＩ）で示されるピラゾロ複素環基を意
味する］で示される化合物と反応させることによって製
造することができる。

【００９２】該反応条件は、ホウベン−ウェイル（Ｈou
ben−Ｗeyl）、Ｖol.７／３、２９６頁以下の開示に従
って選択することができる。

【００９３】式（Ｉ）の化合物から出発し、適当なヒド
ロラーゼと反応させ、次いで、酸化することにより式
（ＶＩＩ）の着色物質を得ることかできる。該酸化に
は、原則として、式（ＶＩＩＩ）の化合物と式（ＩＸ）
の化合物との間の酸化的カップリングについて記載され
ている物質と同じものを用いることができる。

【００９４】さらに、式（ＶＩＩ）の着色物質は、有利
には、式（ＸＸＶ）： ［式中、Ｅは、ニトロソまたはニトロ基であり、Ｌは、
Ｘ−ＹおよびＺが式（Ｉ）における定義と同じである式
（ＩＩＩ）で示されるピラゾロ複素環基を意味する］で
示される化合物を、式（ＸＸＶＩ）：

【化３７】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は、式（ＶＩＩ）における定義と
同じであり、Ｍｅは、ハロゲンにより置換されているリ
チウムまたはマグネシウムであり、Ｑは、ヒドロキシル
基またはジアルキルアミノ基を意味する］で示されるオ
ルガノ金属化合物と反応させ、次いで、該反応混合物を
水性処理することにより製造することができる。式（Ｘ
ＸＶ）および（ＸＸＶＩ）の化合物において存在する基
は、グリニャールまたはリチウム化合物と反応しないよ
うに、適宜保護されなければならない。かかる保護基に
関する資料は、例えば、ティー・グリーン（Ｔ.Ｇreen
e）の「有機合成における保護基」、ジョン・ウィリー
＆サンズ社（Ｊohn Ｗiley and Ｓons），ニューヨー
ク，１９８１；ジェイ・エフ・ダブリュー・マックオミ
ー（Ｊ.Ｆ.Ｗ.ＭcＯmie）の「有機化学における保護
基」、プレナム・プレス社（Ｐlenum Ｐress），ロンド
ン，１９７３に示されている。式（ＸＸＶ）の化合物
が、（ニトロまたはニトロソを除いて）オルガノ金属化
合物と反応しうる、例えば、エステル基のようないずれ
の官能基も有していない場合、その際の反応が、式（Ｖ
ＩＩ）の化合物の製造には好ましい。不安定な基を保護
することも可能であり、オルガノ金属化合物との反応
後、該保護基を除去することができる。

【００９５】ＱがＮ,Ｎ−ジアルキルアミノ基、とりわ
けジメチルアミノ基である場合、中間体として形成され
る式（ＸＸＶＩ'）：

【化３８】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は、式（ＸＸＶＩ）における定義
と同じであり、Ｌは、式（ＸＸＶ）にてさらに詳細に記
載されている基であり、Ｑは、ジアルキルアミノ基を意
味する］で示される着色物質を単離し、アルカリ性加水
分解により、例えば、水／エタノール中、炭酸ナトリウ
ムを用いて、式（ＶＩＩ）の所望の着色物質に変形する
ことができる。

【００９６】ニトロソまたはニトロ化合物とオルガノ−
リチウムまたはグリニャール化合物との反応は、ホイベ
ン・ウェイルのメトデン・デェア・オルガニッシェン・
ヘミィー（Ｍethoden der organischen chemie），１０
／１巻，１０８７，１１２６；ジャーナル・オブ・ケミ
カル・ソサイエティー（Ｊ.Ｃhem.Ｓoc.），Ｃ，２１１
９／１９７１に記載されており、用いる量に依存してヒ
ドロキシルアミン誘導体に、または第２級アミンに、さ
らに生成物に至る。意外にも、等モル量を用い、その
後、該反応混合物を水処理した場合に、式（ＸＸＶ）と
（ＸＸＶＩ）の化合物は高収率で反応し、式（ＶＩＩ）
の着色物質が得られることが判明した。

【００９７】式（ＶＩＩＩ）で示されるアミノ化合物の
場合には、以下の製造方法である。Ｌが式（Ｉ）におい
て定義したような式（ＩＩ）で示される基である場合、
これらアミノ化合物は、公知のものであるか、または、
公知の化合物と同様に製造することができる。通常、置
換Ｎ,Ｎ−アニリンを出発物質として用い、これをニト
ロソ化する。該ニトロソ基の還元によって、式：Ｌ−Ｎ
Ｈ₂で示されるｐ−フェニレンジアミン誘導体を得る
（Ｊ.Ａ.Ｃ.Ｓ.、７３、３１００／１９５１を参照）。

【００９８】Ｌが式（ＩＩＩ）で示されるピラゾロ複素
環基である式（ＶＩＩＩ）で示される化合物は、Ｌが式
（ＩＩＩ）で示されるピラゾロ複素環基である式（Ｘ）
で示される化合物を公知方法により対応するアミノ化合
物に変えることによって公知の方法と同様に製造するこ
とができる。これは、 ａ）硝酸または硫酸および／または無水酢酸と混合した
硝酸との反応によって対応するニトロ化合物を得るか、
または ｂ）亜硝酸との反応によって対応するニトロソ化合物を
得るか、または ｃ）芳香族ジアゾニウム塩との反応によって対応するア
リールアゾ化合物を得、次いで、還元することにより達
成できる。

【００９９】ニトロ、ニトロソおよびアリールアゾ基
（すなわち、式：アリール−Ｎ＝Ｎ−、式中、アリール
は、アリール基およびかかる基を含有する他の基につい
ての前記定義と同じである）は、例えば塩酸または酢酸
のような酸中の亜鉛、亜ジチオン酸ナトリウム、例えば
塩酸のような酸中のスズ、塩化第二スズのような試薬に
よる還元によって、または例えばパラジウム−炭素によ
るような接触水素添加によってアミノ基に変えることが
できる。かかる反応は、ホウベン−ウェイルのメトデン
・デェア・オルガニッシェン・ヘミィー（Ｍethoden de
r organischen Ｃhemie）、Ｖol.１１／１、３４１頁以
下に記載されている。

【０１００】式（Ｘ）で示される化合物から出発するニ
トロ、ニトロソまたはアリールアゾ基の導入は、硝酸ま
たは濃硫酸もしくは無水酢酸と混合した硝酸によるニト
ロ化によって行われる。

【０１０１】亜硝酸によるニトロソ化によって、あるい
は芳香族ジアゾニウム塩とのアゾカップリングによっ
て、ニトロソ基またはアリールアゾ基を導入することが
できる。かかる反応の例が、ホウベン−ウェイルのメト
デン・デェア・オルガニッシェン・ヘミィー、Ｖol.１
０／１および１０／３に記載されている。

【０１０２】式（Ｘ）で示される複素環式化合物は、Ｈ
が水素原子ではなく、カルボキシル、アルコキシカルボ
ニルまたはアルキルカルボニル基である場合、これら
は、濃塩酸による加水分解によって、カルボン酸の場
合、熱脱炭酸によって、式（Ｘ）で示される化合物に変
換することができる。次いで、該化合物に、ニトロ、ニ
トロソまたはアリールアゾ基が導入される。

【０１０３】二重結合で結合しておらず、かつ式（ＩＩ
Ｉ）におけるＸ−ＸまたはＺ中に存在する窒素原子は、
所望により、アルキル化またはアラルキル化されていて
もよい。Ｎ−アルキル化またはＮ−アラルキル化は、ジ
メチルホルムアミドまたは水性アルコール系のような溶
媒中、水素化ナトリウム、第３級アミン、炭酸アルカリ
金属または水酸化ナトリウムのような塩基の存在下、式
（Ｘ）で示される適当な化合物、好ましくは、Ｈが水素
原子ではなく、ニトロ、ニトロソ、アルコキシカルボニ
ル、アシルまたはアリールアゾ基である複素環化合物
を、例えば、ハロゲン化アルキルまたはアラルキル、硫
酸ジアルキルまたはジアラルキル、またはアリールスル
ホン酸アルキルエステルまたはアラルキルエステルのよ
うなアルキル化剤またはアラルキル化剤と反応させるこ
とによって行うことができる。

【０１０４】式（Ｘ）の所望の出発物質、またはＨの代
わりにアルコキシカルボニルまたはアシルであり、Ｌが
式（ＩＩＩ）で示されるピラゾロ複素環基である式
（Ｘ）で示される対応するこれらの化合物は、既に記載
されているかまたはこれらの公知化合物と同様に合成す
ることができる。複素環系の製造に関する資料は、以下
の文献から得られる：ジー・ピー・エリス（Ｇ.Ｐ.Ｅll
is)、「複素環式化合物の化学」における「縮合複素環
の合成」、イー・シー・テイラー（Ｅ.Ｃ.Ｔaylor）
編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ；ピー・エヌ・
プレストン（Ｐ.Ｎ.Ｐreston）、「複素環式化合物の化
学」における「縮合イミダゾール」、エイ・ウェイスバ
ーガー（Ａ.Ｗeissberger）およびイー・シー・テイラ
ー編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ；Ａdv.of Ｈ
et.Ｃhem.、３６、３４３／１９８４；Ｃhem.Ｐharm.Ｂ
ull.、２２、４８２／１９７４；Ｊ.Ｈet.Ｃhem.、１
２、４８１／１９７５；Ｃhem.Ｐharm.Ｂull.、２２、
１８１４／１９７４；Ａnn.６６０、１０４／１９６
２；Ｃhem.Ｐharm.Ｂull.２３、４５２／１９７５；Ｊ.
Ｈet.Ｃhem.、１０、４１１/１９７３；Ｊ.Ｃhem.Ｓo
c.、Ｐerkin Ｉ、２０４７／１９７７。

【０１０５】式（Ｉ）の化合物は、ヒドロラーゼ基質と
して極めて有用である。この使用に特に好ましい化合物
は、前記の式（Ｉ）の化合物である。とりわけ、特に好
ましい化合物は、酵素Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
ミニダーゼ（ＮＡＧase）に対する基質として用いる、
ＧがＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニジル基である
式（Ｉ）の化合物である。

【０１０６】本発明によりヒドロラーゼの比色定量測定
方法を実施する場合、酵素基質としての式（Ｉ）の化合
物を、測定すべき酵素と反応させ、該基質から開裂して
得られたロイコ色物質を酸化し、そうして得られた着色
物質を視覚によりまたは光学的に測定する。

【０１０７】ヒドロラーゼの作用により第１に得られる
式（Ｖ）のロイコ色物質の酸化には、測定すべき酵素の
活性に影響を与えず、かつ得られたロイコ色物質を酸化
するに十分強力であるいずれの酸化剤も用いることがで
きる。概して、酸化剤として、フェリシアン化カリウ
ム、ペルボレート（perborate）、ビリルビンオキシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ／過酸化水素または好ましくは
ヨウ素酸塩を用いる。

【０１０８】酸化剤の存在下、酵素による基質の反応が
好ましい。しかしながら、ヒドロラーゼ反応および酸化
を別々に実施することも可能である。しかしながら、後
者の操作によれば、反応速度の測定は、不可能であり、
最終点しか測定できない。

【０１０９】該測定方法を実施する場合、酵素に調整し
た緩衝系を用いなければならないのは当然である。いず
れの緩衝剤が最も安定しているかは、公知である。例え
ば、ヒドロラーゼとしてのＮ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニダーゼについての本発明の測定方法は、pＨ３.
５〜７.０、好ましくはpＨ４.０〜６.５にて行われる。

【０１１０】本発明のヒドロラーゼ測定用診断薬は、本
発明の１種以上の式（Ｉ）の基質、適当な緩衝系の他に
も、かかる試薬に関して通常の適当な添加剤、例えば、
アジュバント酵素、安定化剤等を含有する。酵素基質の
開裂後、着色物質の形成に必要な酸化剤は、該測定方法
に必要な他の物質と一緒に存在させても、または別々と
することもできる。本発明の試薬は、溶液形にて、冷凍
乾燥形として、粉末混合物として、試薬錠剤として、ま
たは適当な担体物質上に存在してもよく、それにより該
試薬成分を、一緒に、別々に、または適合性および促進
性に依存して互いに組み合わせた診断薬を得るように処
理することができる。

【０１１１】溶液形の本発明の診断薬は、該試験に必要
な全ての試薬を含有していることが好ましい。溶媒とし
て、水または水と水可溶性有機溶媒、例えば、メタノー
ル、エタノール、アセトンまたはジメチルホルムアミド
の混合物を用いることができる。貯蔵安定性のため、実
際に試験する際に、該試験に必要な試薬を最初に混合す
る２以上の溶液に分けておくことが好都合である。

【０１１２】総重量約５〜２０ｍｇ、好ましくは、約１
０ｍｇの凍結乾燥形の診断薬を製造する場合、該試験に
必要な全ての試薬、ならびに通常の構造形成剤、例え
ば、ポリビニルピロリドン、さらには充填物質、例え
ば、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールを
含有する溶液を乾燥させる。しかしながら、酸化剤は、
他の成分と分離した診断薬にて存在することができる。
これは、別々の凍結乾燥により、または溶けていない酸
化剤の混合により達成される。

【０１１３】粉末混合または試薬錠剤形の試薬は、試験
成分を従来の生薬添加剤と混合し、造粒することにより
製造することができる。この種の添加剤としては、例え
ば、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールの
ような糖アルコール、ポリエチレングリコールまたはポ
リビニルピロリドンのような他の可溶性挿入化合物が挙
げられる。一般に、粉末混合物または試薬錠剤は、その
最終重量が約３０〜２００ｍｇで、好ましくは５０〜８
０ｍｇである。

【０１１４】凍結乾燥体、粉末混合物または錠剤のよう
な固形試薬混合物は、使用前に、水または他の適当な溶
媒に溶解させ、このようにして試薬溶液を調製する。試
料を十分な量の試薬混合物と混合した後、得られた色を
光度計を用いて測定し、個々の酵素濃度を、モル吸光係
数および試薬または試料の添加量を介して算定する。反
応速度だけでなく、終点測定も可能である。

【０１１５】試験ストリップ形の試薬を製造する場合、
吸着担体、好ましくは濾紙、セルロースまたは合成繊維
フリースを、揮発容易性溶媒、例えば、水、メタノー
ル、エタノールまたはアセトン中、試験ストリップの製
造に通常用いられる必須の試薬を含有する溶液に含浸さ
せる。これは、一含浸工程で行うことができる。しかし
ながら、ある場合においては、試薬の一部の成分を含有
する溶液を用いるため、複数工程にて含浸を実施するこ
とが望ましい。例えば、第１工程において、酸化剤、緩
衝剤および所望により他の水溶性添加剤を含有する水溶
液で含浸を実施し、次いで、第２工程において、ヒドロ
ラーゼ基質を含有する溶液で含浸を行う。該最終試験ス
トリップをそれ自体で用いてもよく、または公知方法に
てハンドルに取り付けても、または好ましくは、ドイツ
連邦共和国特許明細書第２１１８４５５号の記載に従っ
て合成物質と細かいメッシュの間にシールすることがで
きる。

【０１１６】本発明の好ましい診断薬として、「図５」
に示す試験担体が得られる。該試験担体は、緩衝剤およ
びヒドロラーゼ基質を含有する、濾紙などの吸収性担体
物質（１）、該吸収性担体（１）と平面的に接触する、
酸化剤含有のメッシュ（２）、例えば、ポリマー物質の
メッシュ、およびプラスチックフィルム（４）のハンド
ル上に該吸収性担体（１）およびメッシュ（２）を固定
するカバーメッシュ（３）とからなる。該カバーメッシ
ュ（３）は、またポリマー物質からなっていてもよい。
該カバーメッシュ（３）それ自体は、融解接着手段
（５）によりフィルム（４）に固定される。

【０１１７】ヒドロラーゼ測定を行う場合、検査すべき
試料を「図５」の試験担体のカバーメッシュ（３）に塗
布するか、または、該試験担体を検査すべき液体試料中
に浸す。該試料は、迅速にカバーメッシュ（３）に浸透
し、酸化剤の溶解を伴い、メッシュ（２）を通って吸収
性物質（１）に浸透し、酵素の存在下にて、そこにある
酵素基質の酵素的開裂が起こり、ロイコ色物質を形成す
る中間体の測定しうる着色物質への酸化が起こる。

【０１１８】得られた色を対照色と関連付けることによ
り半定量的測定が可能である。定量評価は、レミッショ
ンにて光学的に行うことができる。

【０１１９】概して、式（Ｉ）の化合物は、本発明の診
断薬における使用に対して十分な貯蔵安定性を有してい
る。しかしながら、該化合物が、式（ＸＩＩ）： ［式中、Ａｒは、所望によりアルキル、アルコキシまた
はハロゲンにより置換されていてもよいアリール基を意
味する］で示される化合物と一緒に存在する場合に、本
発明のヒドロラーゼ基質の安定性がさらに増加すること
が確認された。

【０１２０】この式中、アルキル、アルコキシ、ハロゲ
ンおよびアリールは、式（Ｉ）の置換基に対する前記定
義と同じである。特に有利な式（ＸＩＩ）の化合物は、
ｐ−メチル−、ｏ−メトキシ−、ｍ−メトキシ−、ｐ−
メトキシ−、ｏ−クロロ−、ｍ−クロロ−、ｐ−クロロ
−、ｏ−メチル−、ｍ−メチル−および非置換フェニル
−セミカルバジド、ならびにナフチルセミカルバジドで
ある。

【０１２１】式（ＸＩＩ）の化合物は、本発明のＮ−ア
セチルグルコサミニドの貯蔵安定性の増加に特に有利で
あることが証明された。

【０１２２】本発明の範囲において、式（Ｉ）の化合物
は多くの利点を示す。特に、本発明の基質が無色であ
り、本発明の方法を実施した場合に、明らかに確認する
ことのできる赤色または青色の着色物質を形成すること
が有意な利点である。大きな波長シフト、すなわち、基
質と形成された着色物質の最大吸収波長の差異により、
測定を非常に高感度になった。得られた色が試料物質の
色と明らかにかなり異なるため、かかる測定は、特に生
物学的流体、例えば、血漿、血清および尿にて可能であ
る。本発明の基質の開裂後に形成される着色物質は、非
常に広範なpＨ範囲にて形成される。特に、本発明によ
れば、着色物質が中性および塩基性pＨ領域だけでな
く、かなり酸性範囲のpＨ値、すなわち、pＨ３.５から
の範囲においても容易に形成されるため、その結果、
「酸性」酵素、すなわち、酸性pＨ範囲にて最大活性を
示す酵素を測定する場合に、再度緩衝処理する必要がな
いことは重要なことである。この事実により、本発明の
式（Ｉ）の化合物は、「酸性」酵素、例えば、ＮＡＧas
eに対して特に適した基質となる。無色の基質を用い
て、酵素の最適pＨにて、本発明のヒドロラーゼ測定を
実施することにより、低酵素濃度においてでさえ、迅速
な検出が可能となる。最後に、本発明の基質は、溶液に
おける湿式化学測定に対してだけでなく、試験担体での
乾式化学測定に対しても好適である。評価は、視覚によ
るか、またはトランスミッションまたはレミッションに
て光学的に行うことができる。

【０１２３】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明する。

【０１２４】参考例１ ４−(４'−ジメチルアミノフェニルアミノ)−フェニル
−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グリコピ
ラノシド

【化３９】

【０１２５】（１） Ｎ,Ｎ−ジメチルインドアニリン
（Ｊ.Ａ.Ｃ.Ｓ.、６１、３７６／１９３９）６ｇを、水
酸化ナトリウム７ｇの水２５０ｍｌ中溶液に添加した。
激しく撹拌しながら、青色が消えるまで、亜ジチオン酸
ナトリウムを滴下した。該溶液を濾過し、濾液を約５℃
に冷却し、沈殿物が完全に析出するまで、氷酢酸を滴下
して混合した。該沈殿物を濾去し、濃塩酸２５ｍｌに溶
解させた。該溶液を炭素で処理し、濾過し、次いで、蒸
発させた。残渣をエタノールから再結晶した。４−ジメ
チルアミノ−４’−ヒドロキシジフェニルアミン３.１
ｇ（収率５１％）を得た。

【０１２６】（２） 前記（１）において得られたロイ
コ色物質２.６ｇ、２−アセトアミド−３,４,６−トリ
−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコシルク
ロリド８.８３ｇおよび臭化ベンジルトリエチルアンモ
ニウム４.２１ｇを、クロロホルム１２５ｍｌおよび水
１２５ｍｌの混合物に添加した。該混合物を激しく撹拌
し、炭酸カリウム８.７ｇと混合し、還流下で６時間沸
騰させ、その３時間後、ハロゲナーゼ４.４ｇおよび炭
酸カリウム４.３ｇを添加した。該クロロホルム相を分
離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。

【０１２７】該残留物を酢酸エチルを用いるシリカゲル
上でのクロマトグラフィーに付した。生成物含有フラク
ションを蒸発させた。次式：

【化４０】 で示される保護された糖誘導体５００ｍｇ（収率９％）
を得た。

【０１２８】（３） 前記（２）において得られた保護
糖誘導体４６０ｍｇをメタノール１０ｍｌに溶解させ、
炭酸水素ナトリウム０.９ｇと混合し、室温にて３時間
激しく撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を蒸発さ
せ、残留物を酢酸エチル／メタノール（８：２ｖ／ｖ）
を用いるシリカゲル上でのクロマトグラフィーに付し
た。生成物含有フラクションを合し、蒸発させた。該残
留物を少量のメタノールに溶解させ、該溶液をジエチル
エーテルと混合した。得られた沈殿物を吸引濾過し、ジ
エチルエーテルで洗浄した。標記化合物０.３４ｇ（収
率９６％）を得た。融点２０７〜２０９℃（分解）。

【０１２９】実施例１ 参考例１の（２）および（３）に従い、対応するロイコ
色物質および２−アセトアミド−３,４,６−トリ−Ｏ−
アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコシルクロリド
から、「表１」に列挙する化合物を得た。

【０１３０】

【表１】

【０１３１】１.１ ４−ヒドロキシフェニル−２−メ
チルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イル−アミン １.１.１ ３−アセチル−２−メチルピラゾロ[１,５−
ａ]ピリジン７ｇを６Ｎ塩酸１４０ｍｌに溶解させ、０
℃にて、亜硝酸ナトリウム５.５２ｇの水溶液を滴下混
合した。２時間後、冷却するために用いた氷浴を取り外
し、反応混合物を室温にて一夜放置し、次いで、pＨ９
に調整した。沈殿したニトロソ化合物（６.４ｇ）を吸
引濾過し、２Ｎ塩酸約１５０ｍｌに溶解させた。該ニト
ロソ化合物を、下記実施例２.２と同様に、塩化第一ス
ズで還元した。該粗製生成物を酢酸エチルを用いるシリ
カゲル上でのクロマトグラフィーに付した。生成物含有
のフラクションを蒸発させ、残留物をエタノールに溶解
させ、エタノール性塩酸と混合した。数時間後に析出し
た沈殿物を吸引濾過し、乾燥させた。３−アミノ−２−
メチルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン塩酸塩３.１ｇ（収
率４５％）を得た。融点＞２７５℃。Ｒｆ（シリカゲ
ル、酢酸エチル／アセトン／氷酢酸／水 ５０：２５：
１２.５：１２.５ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）＝０.６。

【０１３２】１.１.２ フェノール２.８２ｇをピリジ
ン７５ｍｌに溶解させ、該溶液を水４５０ｍｌと混合し
た。次いで、前記１.１.１からの３−アミノ−２−メチ
ルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン塩酸塩５.５ｇの水１５
０ｍｌ中溶液を添加し、次いで、該反応混合物を、撹拌
しながら、フェリシアン化カリウム７８ｇの水４５０ｍ
ｌ中溶液と混合した。沈殿した青色物質を吸引濾過し、
水で洗浄し、乾燥させた。収量４.８５ｇ。ＴＬＣ（シ
リカゲル、酢酸エチル／塩化メチレン １：１ｖ／
ｖ）：Ｒｆ＝０.５。

【０１３３】１.１.２.１ 着色物質Ｎ−(２−メチルピ
ラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イル)−キノンイミン
の別合成 乾燥テトラヒドロフラン６０ｍｌ中の４−ブロモジメチ
ルアニリン７.７ｇおよびマグネシウム削りくず１.４ｇ
から、対応するグリニャール化合物を製造した［ジャー
ナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ.Ｃhem.Ｓo
c.）、４６５／１９６１を参照］。該反応溶液をシリン
ジで吸い上げ、−１５℃に冷却した、３−ニトロソ−２
−メチルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン（前記１.１.１
に従って製造）３.０５ｇのテトラヒドロフラン６０ｍ
ｌ中溶液に滴下した。加温後、該反応混合物を２Ｎ酢酸
１００ｍｌ中に注いだ。テトラヒドロフランをロータリ
ーエバポレーターにて除去した。該反応混合物を、該反
応物がアルカリ性になるまで、エタノール１００ｍｌお
よび過剰の炭酸ナトリウムと混合した。得られたロイコ
色物質の酸化のために、合計４０ｇのフェリシアン化カ
リウムを添加し、次いで、反応混合物を室温にて撹拌し
た。加水分解終了後、該反応混合物を酢酸エチルで抽出
した。有機相を蒸発させ、残留物を溶離剤として酢酸エ
チル／リグロイン（１：１ ｖ／ｖ）を用いるシリカゲ
ル上でのクロマトグラフィーに付した。着色物質４.４
ｇ（収率９８％、ニトロソ化合物と称する）を得た。Ｒ
ｆ（シリカゲル、塩化メチレン／酢酸エチル（１：１
ｖ／ｖ)）＋０.６。

【０１３４】１.１.３ ロイコ色物質の還元のために、
該着色物質を酢酸エチル２００ｍｌに溶解させ、該溶液
を飽和炭酸ナトリウム水溶液約１００ｍｌと混合した。
色が消えるまで、該溶液を亜ジチオン酸ナトリウムと一
緒に激しく振盪した。有機相を分離し、乾燥させ、少量
に濃縮した。次いで、リグロインと混合し、得られた沈
殿物を濾過し、リグロインで洗浄し、次いで、乾燥させ
た。さらなる後処理のために十分純粋な標記化合物４.
４５ｇを得た。精製は、塩化メチレン／メタノール（９
８：２ ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル上でのクロマトグ
ラフィーにより行うことができる。 Ｒｆ（シリカゲル、酢酸エチル／塩化メチレン（１：１
ｖ／ｖ））＝０.６ Ｒｆ（シリカゲル、塩化メチレン／メタノール（９５：
５ ｖ／ｖ））＝０.３

【０１３５】１.２ ４−ヒドロキシフェニル−ピラゾ
ロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イルアミン １.２.１ ピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン２ｇを６Ｎ塩
酸３０ｍｌに溶解させ、該溶液を０℃に冷却し、亜硝酸
ナトリウム６.９ｇの水３０ｍｌ中溶液をゆっくりと滴
下した。１時間後、ニトロソ化が完了した。水約１００
ｍｌを添加し、次いで、酢酸エチルでの抽出を繰り返し
た。有機相を乾燥させ、蒸発させた。３−ニトロソピラ
ゾロ[１,５−ａ]ピリジン９.６ｇを得た。

【０１３６】１.２.２ 前記１.２.１に従って得られた
ニトロソ化合物９ｇを塩化第一スズ二水和物２２ｇの濃
塩酸１８０ｍｌ中溶液に添加した。該反応混合物を室温
にて１時間撹拌し、還元を完了させるために、濃塩酸３
０ｍｌ中の塩化第一スズ二水和物８ｇと混合した。該懸
濁液を氷約１５０ｇ上に注ぎ、水酸化ナトリウムでpＨ
１２に調整し、直ちに酢酸エチルで抽出した。酢酸エチ
ル相を乾燥させ、蒸発させた。該残留物をジエチルエー
テル約３５０ｍｌに溶解させ、エーテル性塩酸と混合し
た。得られた沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄
し、乾燥させた。３−アミノピラゾロ[１,５−ａ]ピリ
ジン塩酸塩１１.３ｇ（収率１００％）を得た。融点２
２８〜２３２℃。 Ｒｆ（シリカゲル、酢酸エチル／メタノール ９：１
ｖ／ｖ）＝０.５２。

【０１３７】１.２.３ 出発物質として３−アミノピラ
ゾロ[１,５−ａ]ピリジンを用い、１.１.２および１.
１.３と同様に、ロイコ色物質の４−ヒドロキシフェニ
ルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イルアミンを得
た。Ｒｆ（シリカゲル、酢酸エチル／ジエチルエーテル
１：１ ｖ／ｖ）＝０.６８。

【０１３８】１.３ ４−ヒドロキシフェニル−２−メ
チルチオピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イルアミ
ン １.３.１ ２−メチルチオ−３−ニトロピラゾロ[１,５
−ａ]ピリジン［ヘテロサイクルズ（Ｈeterocycles）、
６、１５２８／１９７７を参照］４ｇを濃塩酸２００ｍ
ｌに溶解させ、塩化第一スズ二水和物２０ｇと混合し
た。１時間後、塩化第一スズ二水和物１５ｇ、濃塩酸１
５ｍｌおよび水２００ｍｌを再度添加した。さらに１時
間反応させた後、該反応混合物を氷上に注ぎ、該黄色溶
液を水酸化ナトリウムでアルカリ性にし、酢酸エチルで
抽出した。有機相を乾燥させ、蒸発させた。残留物を少
量のエタノールに溶解させ、エーテル性塩酸と混合し、
塩酸塩を形成させた。３−アミノ−２−メチルチオピラ
ゾロ[１,５−ａ]ピリジン塩酸塩３.９ｇ（収率９５％）
を得た。融点２２６℃。Ｒｆ（シリカゲル、塩化メチレ
ン／tert−ブチルメチルエーテル ２：８ ｖ／ｖ）＝
０.６６。

【０１３９】１.３.２ ３−アミノ−２−メチルチオピ
ラゾロ[１,５−ａ]ピリジンを用い、１.１.２および１.
１.３と同様に、ロイコ色物質の４−ヒドロキシフェニ
ル−２−メチルチオピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３
−イルアミンを得た。Ｒｆ（シリカゲル、酢酸エチル／
リグロイン １：１ ｖ／ｖ）＝０.４７。

【０１４０】実施例２ ４−((Ｒ,Ｓ−２−(１−ヒドロキシエチル)−ピラゾロ
[１,５−ａ]ピリジン−３−イル)−アミノ)−フェニル
−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド

【化４１】

【０１４１】２.１ ４−ヒドロキシフェニル−２−(１
−ヒドロキシエチルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３
−イル)−アミン Ｎ−アミノピリジン塩酸塩２５ｇを乾燥ジメチルホルム
アミド２５０ｍｌに溶解させ、撹拌しながら、炭酸カリ
ウム１７.５ｇと混合した。次いで、撹拌しながら、Ｒ,
Ｓ−２−ヒドロキシ−５−オキソブタ−３−イン［ジャ
ーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキンＩ
（Ｊ.Ｃhem.Ｓoc.Ｐerkin Ｉ）、１９０８／１９７６］
２０.２ｇを滴下した。反応混合物を加温し、一夜放置
した。水１.２５リットルを添加した後、該反応混合物
を酢酸エチルで数回抽出した。合した抽出物を乾燥さ
せ、蒸発させた。残存油をジエチルエーテルで希釈し
た。数時間後に沈殿した結晶を吸引濾過した。Ｒ,Ｓ−
３−アセチル−２−(１−ヒドロキシエチル)−ピラゾロ
[１,５−ａ]ピリジン（Ｒｆ（シリカゲル、塩化メチレ
ン／酢酸エチル １：１ ｖ／ｖ）＝０.３５）９.８ｇ
（収率４２％）を得、それを実施例１.１.１と同様にニ
トロソ化した。

【０１４２】該ニトロソ化合物をエタノールに懸濁さ
せ、パラジウム−炭２ｇと混合した。該反応混合物を８
０℃に加熱し、ヒドラジン水和物２.５ｍｌを滴下し
た。１０分後、パラジウム−炭を濾過し、濾液を蒸発さ
せた。残留物をエタノールに溶解させ、エタノール性塩
酸と混合した。結晶形のＲ,Ｓ−３−アミノ−２−(１−
ヒドロキシエチル)−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン塩酸
塩６.８ｇを得、それは、１.８モルの塩化水素を含有し
ており、２２９〜２３１℃にて融解した。Ｒｆ（シリカ
ゲル、酢酸エチル／メタノール ３：１ ｖ／ｖ）＝０.
６５。

【０１４３】実施例１.１.２と同様に、フェノール３.
０８ｇを得られたアミノ化合物と反応させ、青色物質を
実施例１.１.３と同様に還元した。該粗製生成物を、溶
離剤として酢酸エチル／塩化メチレン（１：１ ｖ／
ｖ）を用いるシリカゲル上でのクロマトグラフィーに付
した。標記化合物３.４ｇを得た。Ｒｆ（シリカゲル、
酢酸エチル／塩化メチレン １：１ ｖ／ｖ）＝０.２。

【０１４４】２.２ 参考例１の（２）および（３）と
同様に、前記２.１からのロイコ色物質および２−アセ
トアミド−３,４,６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキ
シ−α−Ｄ−グルコシルクロリドから標記化合物を得
た。Ｒｆ（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノ
ール １：１：１ ｖ／ｖ／ｖ）＝０.２５；融点１６５
〜１７０℃（分解）。

【０１４５】実施例３ Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（β−ＮＡ
Ｇase）の湿式化学測定 ４ｍＭ基質の２００ｍＭクエン酸緩衝液（pＨ５）中溶
液９００μｌをキュベットに入れた。この溶液に、 １．２２０ｍＭヨウ素酸カリウム溶液１００μｌ、およ
び ２．β−ＮＡＧase含有溶液１００μｌ をピペットで移し、混合し、該基質に対応する波長で活
性度を測定した。「図１」〜「図３」の検量線は、公知
濃度のＮＡＧaseを含有する溶液を用いて得ることがで
きる。

【０１４６】３.１ 実施例１ａの基質を用いて、λ_max
５６０ｎｍで、「図１」に示すβ−ＮＡＧase測定用検
量線を作成した。β−ＮＡＧaseが存在する場合、該基
質の色は、無色から青紫色に変化した。

【０１４７】３.２ 実施例１ｂの基質を用いて、λ_max
５２５ｎｍで、「図２」に示すβ−ＮＡＧase測定用検
量線を作成した。β−ＮＡＧaseが存在する場合、該基
質の色は、無色から赤紫色に変化した。

【０１４８】３.３ 実施例２の基質を用いて、λ_max５
６５ｎｍで、「図３」に示すβ−ＮＡＧase測定用検量
線を作成した。β−ＮＡＧaseの存在で、該基質の色
は、無色から青紫色に変化した。

【０１４９】実施例４ β−ＮＡＧase測定用試験ストリップ ａ）シュライヒャー＆シュール（Ｓchleicher＆Ｓchuel
l）社の濾紙（２３ＳＬ）を連続的に以下の溶液で含浸
させて乾燥させた： １．クエン酸緩衝液 ２００ｍＭ／リットル、pＨ５ ヨウ素酸カリウム ２０ｍＭ／リットル ２．指示薬 １０ｍＭ／リットル 試薬として： α）実施例１ａの化合物、 β）実施例１ｂ化合物 を用いた。

【０１５０】こうして得られた試験ストリップをＮＡＧ
ase含有溶液に浸した場合、約５分後、約１０Ｕ／リッ
トル以上のβ−ＮＡＧase（その活性は、酵素基質とし
てスルホフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニドを用いた方法に従って測定した）であり、実施
例１ａの化合物を用いた場合、無色から青色への着色
が、および、実施例１ｂの化合物を用いた場合、無色か
ら赤色への着色が観察された。酵素活性が高いほど、着
色度は大きくなる。

【０１５１】ｂ）前記ａ）の試験ストリップを、前記と
同じであるがヨウ素酸塩を含有しない溶液で試薬紙を含
浸させるように修飾して比較結果を得た。６０μｍのフ
ィラミント厚のナイロンメッシュ（スイス、チューリッ
ヒのチューリッヒャー・ボイテルトゥクファブリク（Ｚ
uericher Ｂeuteltuchfabrik）社のＮＹ７５ＨＣ）上で
４０ｍＭ／リットルのヨウ素酸ナトリウム水溶液から酸
化剤を含浸させた。緩衝剤および指示薬含有の濾紙
（１）、酸化剤含有のメッシュ（２）、メッシュ（２）
と同一素材のカバーメッシュ（３）ならびにポリスチレ
ンの剛性プラスチックフィルム（４）から、「図４」の
試験キャリアーを製造した。この目的のために、濾紙
（１）およびメッシュ（２）を６ｍｍ×６ｍｍの大きさ
の断片に切断し、溶融接着法（５）により１２ｍｍ×６
ｍｍの大きさのカバーメッシュを１００ｍｍ×６ｍｍの
大きさのプラスチックフィルム（４）上に固定した。

【０１５２】かかる試験ストリップをβ−ＮＡＧase含
有溶液に浸した後、実施例１ａの化合物で無色から青色
への着色、および、実施例１ｂの化合物で無色から赤色
への着色が生じた。酵素濃度が高いほど、着色度は大き
くなる。

【０１５３】実施例５ Ｎ−(ｐ−トルエンスルホニル)−Ｌ−アラニン−(４−
((２−メチルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イル)
−アミノ)−フェニルエステル

【化４２】

【０１５４】実施例１.１にて得られたロイコ色物質０.
４８ｇをピリジン８ｍｌに溶解させ、撹拌しながら、塩
化ｐ−トルエンスルホニルのクロロホルム１２ｍｌ中溶
液を滴下混合した。簡単に撹拌した後、該反応混合物を
水と混合し、有機相を分離した。該有機相を水で十分に
洗浄し、分離し、乾燥させた。残留物を溶離剤として水
／メタノールを用いる吸着剤樹脂ＨＰ２０ＳＳ（ミツビ
シ社）上でのクロマトグラフィーに付した。生成物含有
フラクションを蒸発させ、残留物をジエチルエーテル／
ヘキサンから結晶化させた。標記化合物０.５４ｇを得
た。融点６８〜７８℃（分解）。 Ｒｆ＝０.７（シリカゲル、酢酸エチル／塩化メチレン
１：１ ｖ／ｖ）。

【０１５５】実施例６ リン酸のモノ−(４−((２−メチルピラゾロ[１,５−ａ]
ピリジン−３−イル)−アミノ)−フェニルエステル・ピ
リジニウム塩

【化４３】

【０１５６】実施例１.１にて得られたロイコ色物質０.
３５ｇをピリジン３ｍｌに溶解させた。該溶液を−１５
℃に冷却し、撹拌しながら、オキシ塩化リン０.１５ｍ
ｌのピリジン２.５ｍｌ中溶液を滴下混合した。該反応
混合物を−１５℃にて３０分間、次いで、室温にて２時
間撹拌し、氷と混合させ、２Ｎ硫酸でpＨ２に酸性化
し、冷却装置中にて一夜放置した。得られた沈澱物を濾
過し、濾液を吸着剤樹脂ＨＰ２０ＳＳ（ミツビシ社）含
有のカラムを通した。該生成物を水で溶離した。生成物
含有フラクションを合し、蒸発させ、残留物をメタノー
ル／ジエチルエーテルから結晶化させた。標記化合物
０.０６ｇを得た。融点１５８〜１６１℃（分解）。

【０１５７】実施例７ ４−(２,４−ジメチルピラゾロ[１,５−ａ]イミダゾー
ル−３−イル)−アミノ)−フェニル−２−アセトアミド
−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド

【化４４】

【０１５８】７.１ １,２−ジメチルイミダゾール１.
９２ｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解させ、氷で冷却し
ながら、Ｏ−ｐ−トルエンスルホニルアセトヒドロキサ
ム酸エチルエステル１５.４ｇを６０％過塩素酸水溶液
１１８ｍｌと反応させることにより得られたＯ−ｐ−ト
ルエンスルホニルヒドロキシルアミンの溶液と混合し
た。該反応混合物を室温にて３時間撹拌した。得られた
沈澱物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。Ｎ−ア
ミノ−１,２−ジメチルイミダゾリウムｐ−トルエンス
ルホナート５ｇ（収率８８％）を得た。

【０１５９】７.２ 前記７.１にて得られた生成物５ｇ
を、酢酸ナトリウム５.４ｇおよび無水酢酸１２５ｍｌ
と一緒に１４０℃の浴温にて１時間加熱した。反応混合
物を真空下にて蒸発させ、残留物を水に溶解させた。p
Ｈ値を９〜１０に調整し、塩化メチレンで抽出した。有
機相を乾燥させ、蒸発させた。残留物を酢酸エチルを用
いるシリカゲル上でのクロマトグラフィーに付した。３
−アセチル−２,４−ジメチルピラゾロ[１,５−ａ]イミ
ダゾール０.４５ｇ（収率１１％）を得た。融点１６５
〜１６７℃。

【０１６０】７.３ 前記７.２にて得られた化合物を実
施例１.１.１と同様にニトロソ化した。対応するニトロ
ソ化合物０.３５ｇ（収率９４％）を得た。融点１７９
〜１８３℃。これを希炭酸水素ナトリウム水溶液１００
ｍｌに溶解させ、亜ジチオン酸ナトリウムで還元した。
反応混合物を蒸発させ、エタノールで温浸させた。該エ
タノール溶液を蒸発させ、生成物をエーテル性塩酸を添
加することにより沈澱させた。アミノ化合物０.３ｇ
（収率８０％）を得た。融点１９９〜２０４℃（分
解）。ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／アセトン／氷
酢酸／水 ５０：２５：１２.５：１２.５ ｖ／ｖ／ｖ／
ｖ）：Ｒｆ＝０.３。

【０１６１】７.４ 実施例１.１.２と同様に、前記の
アミノ化合物をフェリシアン酸カリウムおよびフェノー
ルと反応させ、得られた着色物質を実施例１.１.３と同
様に還元した。得られたロイコ色物質のＲｆ：シリカゲ
ル、トルエン／酢酸エチル／メタノール ２：１：１ ｖ
／ｖ／ｖ＝０.５。

【０１６２】７.５ 前記ロイコ色物質０.４６ｇを塩化
メチレン４０ｍｌに溶解させ、氷で冷却しながら、ま
ず、ジイソプロピルエチルアミン０.６５ｍｌと混合
し、次いで、無水トリフルオロ酢酸０.５１ｍｌを滴下
した。１時間後、再度連続的にジイソプロピルエチルア
ミン０.３５ｍｌおよび無水トリフルオロ酢酸０.２５ｍ
ｌを添加した。３０分間撹拌した後、該反応混合物を蒸
発させ、残留物を、塩化メチレン／酢酸エチル（１：１
ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル上でのクロマトグラフィ
ーに付した。Ｎ−(２,４−ジメチルピラゾロ[１,５−
ａ]イミダゾール−３−イル)−Ｎ−(４−ヒドロキシフ
ェニル)−トリフルオロアセトアミド０.４ｇを得た。 Ｒｆ＝０.３（シリカゲル、塩化メチレン／酢酸エチル
１：１ ｖ／ｖ）。

【０１６３】７.６ 参考例１の（２）と同様に、前記
フェノール誘導体を２−アセトアミド−３,４,６−トリ
−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコシルク
ロリドでグリコシド化した。トリフルオロアセチル基を
包含する保護基を除去するため、シリカゲル上でのクロ
マトグラフィー（塩化メチレン／酢酸エチル １：１ｖ
／ｖ）に付すことにより精製した生成物をメタノールに
溶解させ、該溶液を大過剰の無水炭酸ナトリウムと混合
した。該混合物を４５℃にて１.５時間撹拌し、塩を吸
引濾過し、残渣をいくらかのメタノールで洗浄し、濾液
を約２０ｍｌに濃縮した。この溶液を吸着剤樹脂ＨＰ２
０ＳＳ（ミツビシ社）含有のカラムに付し、メタノール
／水（１：９〜１：１ ｖ／ｖ）の段階的勾配液で溶離
した。標記化合物を得た。融点１１２〜１１５℃（分
解）。Ｒｆ＝０.２（シリカゲル、トルエン／酢酸エチ
ル／メタノール １：１：１ ｖ／ｖ／ｖ）。

【０１６４】実施例８ ４−((２,４−ジメチルピラゾロ[１,５−ａ]イミダゾー
ル−３−イル)−Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノ)
−フェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ
−グルコピラノシド

【化４５】

【０１６５】実施例７.６にて得られたグルコシドの保
護基の分離は、参考例１の（３）と同様に、メタノール
中の炭酸水素ナトリウムを用いて行い、次いで、アセチ
ル基のみを分離し、実施例１０.６と同様にクロマトグ
ラフィー精製後、標記化合物を得た。融点２２３〜２２
６℃（分解）。Ｒｆ＝０.２１（シリカゲル、トルエン
／酢酸エチル／メタノール １：１：１ ｖ／ｖ／ｖ）。

【０１６６】実施例９ 実施例７.５および７.６と同様に、適当なロイコ色物質
および２−アセトアミド−３,４,６−トリ−Ｏ−アセチ
ル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコシルクロリドから出
発し、以下の「表２」〜「表７」に列挙する化合物を得
た。

【０１６７】

【表２】

【０１６８】

【表３】

【０１６９】

【表４】

【０１７０】

【表５】

【０１７１】

【表６】

【０１７２】

【表７】

【０１７３】ロイコ色物質成分の製造 ９.１ ４−ヒドロキシフェニル−２−メトキシピラゾ
ロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イルアミン ９.１.１ ３−アミノ−２−メトキシピラゾロ[１,５−
ａ]ピリジン・塩酸塩 ２−メトキシピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン［ブリチン
・オブ・ケミカル・ソサイエティ・オブ・ジャパン（Ｂ
ull.Ｃhem.Ｓoc.Ｊap.），４９，１９８０／１９７６を
参照］１.４８ｇを、氷で冷却しながら、濃硝酸２０ｍ
ｌに溶解させ、発煙硝酸１０.５ｍｌを滴下混合した。
該反応混合物を氷浴中にて３０分間、次いで、室温にて
１時間撹拌した。該反応混合物を氷中に注ぎ、得られた
沈澱物を吸引濾過し、水で洗浄した。２−メトキシ−３
−ニトロピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン１ｇ（収率５２
％）を得た。融点２１３〜２１６℃。

【０１７４】前記のニトロ化合物０.８ｇを２Ｎ塩酸８
０ｍｌに懸濁させ、激しく撹拌しながら亜鉛粉末と混合
した。亜鉛粉末を数回添加した後、約１時間後、過剰の
亜鉛の底部沈積物より上方の清澄溶液を得た。これを濾
過し、該濾液を水酸化ナトリウムを用いてpＨ７に調整
した。次いで、該混合物を酢酸エチルで抽出し、有機相
を蒸発させ、残留油をシリカゲルのショートカラムを通
し、エタノールで濾過した。該溶出液を蒸発させ、残留
物をジエチルエーテルに溶解させ、エーテル性塩酸と混
合した。得られた沈澱物を吸引濾過し、再度イソプロパ
ノールから再結晶させた。標記化合物０.３３ｇ（収率
４２％）を得た。融点２３８〜２４１℃。ＴＬＶ（シリ
カゲル、アセトン／塩化メチレン／氷酢酸 ５０：４
５：５ ｖ／ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０.６。

【０１７５】９.１.２ 実施例１.１.２と同様に、得ら
れたアミノ化合物から、フェノールとの酸化カップリン
グにより着色化合物を得、それを実施例１.１.３と同様
に還元し、次いで、実施例７.５と同様にトリフルオロ
アセチル化した。

【０１７６】９.２ ４−ヒドロキシフェニル−２,５−
ジメチル−７−ジメチルアミノピラゾロ[１,５−ａ]ピ
リミジン−３−イルアミン ９.２.１ ３−アミノ−２,５−ジメチル−７−ジメチ
ルアミノピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン・塩酸塩 ２,５−ジメチル−７−ヒドロキシピラゾロ［１,５−
ａ］ピリミジン１.６ｇを、オキシ塩化リン１６.６ｍｌ
およびＮ,Ｎ−ジメチルアニリン０.８ｍｌと一緒に４０
分間加熱還流した。過剰のオキシ塩化リンを留去し、残
留物を氷上に注いだ。該混合物を塩化メチレンで抽出
し、有機相を炭酸ナトリウムの水溶液で洗浄し、乾燥さ
せ、蒸発させた。残留物をエタノール２８ｍｌに溶解さ
せ、ジメチルアミンの４０％水溶液２ｇと混合した。該
混合物を室温にて２.５時間撹拌し、蒸発させ、残留物
を酢酸エチルを用いるシリカゲル上でのクロマトグラフ
ィーに付した。２,５−ジメチル−７−(Ｎ,Ｎ−ジメチ
ルアミノ)−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン０.８６ｇ
（収率４６％）を得、それを実施例１と同様にニトロソ
化した。

【０１７７】得られたニトロソ化合物（１ｇ）をエタノ
ール２０ｍｌに溶解させ、パラジウム−炭０.１６ｇと
混合し、ヒドラジン水和物０.４ｍｌと沸騰温度にて混
合した。該反応混合物をさらに１５分間煮沸還流し、吸
引濾過し、濾液をある程度濃縮した。残留物を少量のエ
タノールに溶解させ、エーテル性塩酸と混合し、塩酸塩
を沈澱させた。３−アミノ−２,５−ジメチル−７−(ジ
メチルアミノピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン・塩酸塩
０.８ｇを得た。 Ｒｆ＝０.５４（シリカゲル、クロロホルム／メタノー
ル／メチルエチルケトン／氷酢酸／水 ７５：３５：２
５：５：８ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）

【０１７８】９.２.２ フェノール６.９４ｇをピリジ
ン１２４ｍｌおよび水７４３ｍｌに溶解させた。前記ア
ミノ化合物１１.４ｇの水２４８ｍｌ中溶液をその溶液
に加えた。最終的に、（ドイツ、マンハイム、ベーリン
ガー・マンハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレ
ンクテル・ハフツング（Ｂoehringer Ｍannheim Ｇmb
Ｈ）、セイヨウワサビ（horseradish）由来）ペルオキ
シダーゼ０.３３ｇの溶液と混合し、それに直ちに、３
０％過酸化水素１１.２３ｍｌを滴下した。青色のＮ−
(２,５−ジメチル−６−ジメチルアミノピラゾロ[１,５
−ａ]ピリミジン−３−イル)−キノンイミン１２.９ｇ
を得た。Ｒｆ＝０.４３（シリカゲル、酢酸エチル／塩
化メチレン ９５：５ ｖ／ｖ）。該着色物質を実施例
１.１.３と同様に還元し、実施例７.５と同様にトリフ
ルオロアセチル化した。着色物質が沈澱しない場合、酢
酸エチルで抽出した。ある情況下では、実施例１.１.３
と同様に、亜ジチオン酸ナトリウムおよび炭酸ナトリウ
ム水溶液を添加することによりロイコ色物質に処理すべ
きである。

【０１７９】９.３ ４−ヒドロキシフェニル−２,４,
６−トリメチルピラゾロ[３,２−ｃ]−ｓ−トリアゾー
ル−３−イル)−アミン ４−エトキシカルボニル−３−メチルピラゾロ−５−イ
ルヒドラジン［ケミシェ・ベリクテ（Ｃhem．Ｂe
r．），８９，２５５２／１９５６を参照］から出発
し、ドイツ連邦共和国特許公開明細書第Ａ−１８１０４
６２号の実施例６の方法にて、２,６−ジメチル−４Ｈ
−ピラゾロ[３,２−ｃ]−ｓ−トリアゾール−３−カル
ボン酸エチルエステルを製造した。

【０１８０】このエステル０.４ｇを乾燥ジメチルホル
ムアミド１５ｍｌに溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸
メチルエステル０.４６ｇと混合した。この混合物に、
５５％水素化ナトリウム０.１１ｇを滴下し、次いで、
室温にて１時間撹拌した。該反応混合物を氷上に注ぎ、
それに塩化ナトリウム５ｇを添加した。次いで、該反応
混合物を酢酸エチルで数回抽出し、該抽出液を乾燥して
蒸発させた。残留油を、溶離剤として酢酸エチル／リグ
ロインを用いるシリカゲル上でのクロマトグラフィーに
付すことよって精製した。

【０１８１】こうして、中間体としての２,４,６−トリ
メチルピラゾロ[３,２−ｃ]−ｓ−トリアゾール−３−
カルボン酸エチルエステル（Ｒｆ＝０.５２；シリカゲ
ル、酢酸エチル／リグロイン １：１ ｖ／ｖ）を得、そ
れを濃塩酸と一緒に煮沸することによりケン化し、同時
に脱炭酸した。淡黄色がかった油として２,４,６−トリ
メチルピラゾロ[３,２−ｃ]−ｓ−トリアゾール（Ｒｆ
＝０.２４；シリカゲル、酢酸エチル／リグロイン １：
１ ｖ／ｖ）を得、それは数時間後に結晶化した。

【０１８２】この複素環式化合物を氷酢酸４０ｍｌに溶
解させ、酢酸ナトリウム１ｇおよびｐ−メトキシベンゼ
ンジアゾニウムテトラフルオロボレート３.３ｇと混合
した。該反応混合物を４０℃にて撹拌し、３時間後、反
応を完了させるために、酢酸ナトリウム０.２ｇおよび
ジアゾニウム塩０.６６ｇを再度添加した。４０℃にて
３時間後、該反応混合物を氷上に注いだ。次いで、酢酸
エチルで抽出し、得られた粗製生成物を酢酸エチル／リ
グロイン（１：１ ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル上での
クロマトグラフィーに付すことにより精製した。レモン
色のアゾ化合物３.７ｇを得た。

【０１８３】該アゾ化合物３.１ｇを氷酢酸５０ｍｌに
溶解させ、緩やかに冷却しながら、亜鉛粉末５ｇを混合
した。１時間後、該反応混合物を濾過し、濾液を蒸発さ
せた。精製のため、該粗製生成物をジオキサンに溶解さ
せ、tert−ブチルジカーボナート３.９ｇと混合した。
２時間の反応時間後、該反応混合物を蒸発させ、残留物
をリグロイン／アセトン（７：３ ｖ／ｖ）を用いるシ
リカゲル上でのクロマトグラフィーに付した。対応する
Ｎ−tert−ブトキシカルボニル化合物１.５ｇを得、ア
ミノ保護基を分離するために、それをエタノール性塩酸
２５ｍｌに溶解させた。１時間後、該溶液を室温にて蒸
発させ、残留物をメタノール／ジエチルエーテルから再
結晶した。標記化合物１.６ｇを得た。融点２４０℃。 Ｒｆ＝０.５（シリカゲル；酢酸エチル／アセトン／氷
酢酸／水 ５０：２５：１２.５：１２.５ ｖ／ｖ／ｖ／
ｖ）。

【０１８４】９.３.２ 実施例１.１.２および１.１.３
と同様に、前記アミノ化合物をフェノールとカップリン
グさせて、着色物質を得、還元し、実施例７.５と同様
に該ロイコ色物質をトリフルオロアセチル化した。

【０１８５】９.４ ４−ヒドロキシ−２−メチルピラ
ゾロ[３,２−ｂ]チアゾール−３−イルアミン ３−アセチル−２−メチルピラゾロ［３,２−ｂ］チア
ゾール［ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・
ブリチン（Ｃhem.Ｐharm.Ｂull.），２２，４８２／１
９７４を参照］から出発して、実施例１.１.１、１.１.
２および１.１.３と同様に、ロイコ色物質を得、実施例
７.５と同様にトリフルオロアセチル化した。

【０１８６】９.５ ４−ヒドロキシフェニル−２−カ
ルボン酸メチルエステルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン
−３−イルアミン２−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−
カルボン酸エチルエステル［ジャーナル・オブ・ヘテロ
サイクリック・ケミストリー（Ｊ.Ｈet.Ｃhem.），１
８，１１４９／１９８１を参照］から出発して、実施例
１.１.１（ニトロソ化）、９.１（亜鉛／塩酸で還
元）、９.２.２（フェニールとの酸化カップリング）お
よび１.１.３（ロイコ色物質への還元）と同様に、ロイ
コ色物質成分を得、次いで、該ロイコ色物質を実施例
７.５と同様にしてトリフルオロアセチル化した。最終
反応工程におけるアセチル保護基の分離において、該エ
チルエステルをエステル交換してメチルエステルを得
た。

【０１８７】９.６ ４−ヒドロキシ−４−メチルピラ
ゾロ[１,５−ａ]イミダゾール−３−イルアミン ９.６.１ ３−アミノ−４−メチルピラゾロ[１,５−
ａ]イミダゾール・塩酸塩 「オルガニクム（Ｏrganikum）」［ベルリン、ＶＥＢド
イツ科学出版物］、５１４〜５１５頁に記載の方法に従
って、エトキシメチレンシアノ酢酸エチル６５ｇを２,
２−ジエトキシエチルヒドラジン５５ｇと反応させて、
５−アミノ−１−(２,２−ジエトキシエチル)−ピラゾ
ール−４−カルボン酸１００.２ｇを得、それをエタノ
ール４リットルに溶解させ、２０％硫酸２リットルと混
合した。該反応混合物を３時間加熱還流し、固形炭酸水
素ナトリウムを添加して、中和した。沈澱した塩を濾過
し、濾液を蒸発させた。残留物を煮沸塩化メチレンで数
回抽出した。濾液を合し、蒸発させて、ピラゾロ[１,５
−ａ]イミダゾール−３−カルボン酸エチルエステル５
８.２ｇ（収率８６％）を得た。融点１２６〜１２７
℃；Ｒｆ＝０.６４（シリカゲル、酢酸エチル）。

【０１８８】前記のカルボン酸エステル１８.７ｇをジ
メチルホルムアミド１９０ｍｌに溶解させ、ｐ−トルエ
ンスルホン酸メチルエステル１７ｇと混合した。撹拌し
ながら、５５％水素化ナトリウム３.９８ｇを滴下し
た。該反応混合物を室温にて３０分間撹拌し、酢酸エチ
ルで抽出した。４−メチルピラゾロ[１,５−ａ]イミダ
ゾール−３−カルボン酸エチルエステル２１.９ｇ（収
率１００％）を得、それを濃塩酸６００ｍｌと煮沸する
ことによりケン化した。同時に、得られたカルボン酸を
脱炭酸し、４−メチルピラゾロ[１,５−ａ]イミダゾー
ル・二塩酸塩１６.７ｇ（収率８３％）を得た。Ｒｆ＝
０.３９（シリカゲル、５％メタノール含有の塩化メチ
レン）。

【０１８９】濃硫酸１２.８ｍｌの水６４ｍｌ中溶液
中、亜硝酸ナトリウム９.５ｇの水４２ｍｌ中溶液を添
加することにより、アニリン１２.８ｇをジアゾ化し
た。該溶液を水酸化ナトリウムを添加することによりp
Ｈ５に調整し、５〜１０℃にて、前記４−メチルピラゾ
ロ[１,５−ａ]イミダゾール１６.５ｇの水１６５ｍｌお
よび氷酢酸１４ｍｌ中溶液を滴下混合した。該反応混合
物を５〜１０℃にて１時間、次いで、室温にて３時間撹
拌し、次いで、得られた沈澱物を吸引濾過した。４−メ
チル−３−フェニルアゾピラゾロ[１,５−ａ]イミダゾ
ール１２ｇを得、それを前記実施例９.３と同様に亜ジ
チオン酸ナトリウムで還元し、精製した。３−アミノ−
４−メチル−ピラゾロ[１,５−ａ]イミダゾール・塩酸
塩３.３ｇを得た。融点２１０℃以上（分解）；Ｒｆ＝
０.２３（シリカゲル、酢酸エチル／アセトン／氷酢酸
／水 ５０：２５：１２.５：１２.５ ｖ／ｖ／ｖ／
ｖ）。

【０１９０】９.６.２ ロイコ色物質を得るために、前
記実施例９.３.２と同様に後処理を行った。

【０１９１】９.７ ４−ヒドロキシフェニル−２,６−
ジメチルピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン−３−イルア
ミン ９.７.１ ３−アミノ−２,６−ジメチルピラゾロ[１,
５−ａ]ピリミジン・塩酸塩 ２,６−ジメチル−３−ニトロピラゾロ[１,５−ａ]ピリ
ミジン［シンセシス（Ｓynthesis）、６７３／１９８２
を参照］３.２ｇをエタノール３２０ｍｌに溶解させ、
５％炭酸水素ナトリウム水溶液３２０ｍｌと混合した。
この混合物に、薄層クロマトグラフィーが出発物質の不
在を示すまで、撹拌および冷却を続けながら、亜ジチオ
ン酸ナトリウム１４.２ｇを滴下した。該反応混合物を
いくらか濃縮し、酢酸エチルで３回抽出した。有機相を
乾燥させ、蒸発させた。残留物を少量のエタノールに溶
解させ、等モル量のジエチルエーテル中塩化水素と混合
した。沈澱した結晶を吸引濾過した。標記化合物２.９
ｇ（収率８０％）を得た。融点２２４℃（分解）。ＴＬ
Ｃ（シリカゲル、クロロホルム／メタノール／メチルエ
チルケトン／氷酢酸／水 ７５：３５：２５：５：８ ｖ
／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０.７３。

【０１９２】９.７.２ 実施例１.１.２と同様にフェノ
ールと酸化カップリングし、実施例１.１.３と同様に還
元し、次いで、実施例７.５と同様にトルフルオロアセ
チル化することによって、ロイコ色物質を得た。

【０１９３】９.８ ４−ヒドロキシフェニル−２−エ
トキシカルボニルメトキシピラゾロ[１,５−ａ]ピリジ
ン−３−イルアミン 前記実施例９.１と同様に、２−ヒドロキシ複素環化合
物のアルキル化により２−メトキシ化合物［ブリチン・
オブ・ケミカル・ソサイエティ・オブ・ジャパン，４
９，１９８０／１９７６を参照］と同様に製造した２−
エトキシカルボニルメトキシピラゾロ[１,５−ａ]ピリ
ジンから出発して、Ｎ−トリフルオロアセチル化ロイコ
色物質を得た。最終反応工程においてアセチル保護基を
分離する場合、カルボン酸エステル部をケン化した。該
エステルおよび酸は、吸着剤樹脂ＨＰ２０ＳＳ（ミツビ
シ社）でのクロマトグラフィー（溶離剤：メタノール／
水）によりスムーズに分離することができる。

【０１９４】９.９ ４−ヒドロキシフェニル−２−ア
セトアミノピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イルア
ミン 実施例１.１.１と同様に、２−アセトアミドピラゾロ
[１,５−ａ]ピリジン［ケミカル・アンド・ファーマシ
ューティカル・ブリチン，２１，２１４６／１９７３を
参照］４ｇをニトロソ化した。該ニトロソ化合物を、実
施例２.１と同様に、パラジウム−炭／ヒドラジン水和
物で還元した。２−アセトアミド−３−アミノピラゾロ
[１,５−ａ]ピリジン・塩酸塩３.９ｇ（収率６７％）を
得た。融点２５５〜２５９℃（分解）。Ｒｆ＝０.５
（シリカゲル、酢酸エチル／アセトン／氷酢酸／水 ５
０：２５：１２.５：１２.５ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）。

【０１９５】実施例１.１.２と同様に、該アミノ化合物
をフェノールとカップリングさせて、着色物質を得、そ
れを実施例１.１.３と同様に還元し、実施例７.５と同
様にＮ−トリフルオロアセチル化した。

【０１９６】９.１０ ４−ヒドロキシフェニル−２−
ビニルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イルアミン Ｒ,Ｓ−３−アセチル−２−(１−ヒドロキシエチル)−
ピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン（実施例２.１から）２５
ｇを濃硫酸５０ｍｌと混合し、９５℃の浴温にて２時間
加熱した。該反応混合物を多量の氷上に注ぎ、水酸化ナ
トリウムでアルカリ性とし、酢酸エチルで抽出した。該
粗製生成物をリグロイン／酢酸エチル（９５：５〜９
０：１０ ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル上でのクロマト
グラフィーに付した。２−ビニルピラゾロ[１,５−ａ]
ピリジン（Ｒｆ＝０.６；シリカゲル、リグロイン／酢
酸エチル ３：１ ｖ／ｖ）３.４ｇを得、それを実施例
９.３.１と同様にフェニルジアゾニウム塩と反応させ、
還元し、精製した。このようにして対応するアミノピラ
ゾールを得た。Ｒｆ＝０.６５（シリカゲル、リグロイ
ン／アセトン／氷酢酸 ５０：４５：５ ｖ／ｖ／ｖ）。

【０１９７】該アミノ化合物を実施例９.２.２と同様に
フェノールとカップリングさせて、着色物質を得、それ
を実施例１.１.３と同様に還元し、実施例７.５と同様
にＮ−トリフルオロアセチル化した。

【０１９８】９.１１ ４−ヒドロキシフェニル−６−
(３−アセトキシプロピル)−２−メチルピラゾロ[１,５
−ａ]ピリミジン−３−イルアミン ９.１１.１ ６−(３−アセトキシプロピル)−２−メチ
ルピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン 実施例９.７.１と同様に、６−(３−アセトキシプロピ
ル)−２−メチル−３−ニトロピラゾロ[１,５−ａ]ピリ
ミジン［シンセシス，６７３／１９８２を参照］を還元
することにより、標記化合物を得た。Ｒｆ＝０.２１
（シリカゲル、塩化メチレン／メタノール ９０：１ ｖ
／ｖ）。

【０１９９】９.１１.２ 該アミノ化合物を実施例１.
１.２と同様にフェノールとカップリングさせて、着色
物質を得、それを実施例１.１.３と同様に還元し、実施
例７.５と同様にＮ−トリフルオロアセチル化した。

【０２００】９.１２ ４−ヒドロキシフェニル−２,３
−ジアミノピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イルア
ミン ２−アミノピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン［ケミカル・
アンド・ファーマシューティカル・ブリチン，２１，２
１４６／１９７３を参照］２.６６ｇを、実施例９.３.
１と同様にｐ−メトキシベンゼンジアゾニウム塩と反応
させ、得られたアゾ化合物を亜ジチオン酸ナトリウムで
還元し、得られた粗製生成物を精製して２,３−ジアミ
ノピラゾロ[１,５−ａ]ピリジンを得た。融点１９０
℃；Ｒｆ＝０.６（シリカゲル、リグロイン／アセトン
／氷酢酸 ６０：４０：１ ｖ／ｖ／ｖ）。

【０２０１】該アミノ化合物を実施例１.１.２と同様に
フェノールとカップリングさせて、着色物質を得、それ
を実施例１.１.３と同様に還元し、実施例７.５と同様
にＮ−トリフルオロアセチル化した。その後のグリコシ
ド化で、該ロイコ色物質をフェノール性ヒドロキシル基
だけでなく、２−アミノ基もまたグリコシド化した。

【０２０２】９.１３ ４−ヒドロキシフェニル−２−
クロロピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イルアミン ９.１３.１ ３−アミノ−２−クロロピラゾロ[１,５−
ａ]ピリジン・塩酸塩２−アミノピラゾロ[１,５−ａ]ピ
リジン［ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・
ブリチン，２１，２１４６／１９７３を参照］を実施例
９.３.１と同様にｐ−メトキシベンゼンジアゾニウム塩
と反応させた。得られた３−アゾ化合物０.５３ｇを６
Ｎ塩酸１０ｍｌに懸濁させ、５℃にて撹拌しながら、亜
硝酸ナトリウム１０４ｍｇの水０.２ｍｌ中溶液と混合
した。３０分後、塩化第一銅１９８ｍｇの６Ｎ塩酸６ｍ
ｇ中冷溶液を添加し、該反応混合物を室温にて４０時間
撹拌した。該反応混合物を水と混合し、酢酸エチルで３
または４回抽出した。シリカゲル上でのクロマトグラフ
ィー（溶離剤：酢酸エチル／リグロイン １：１ ｖ／
ｖ）に付すことにより該粗製生成物を精製し、２−クロ
ロ−３−(ｐ−メトキシフェニルアゾ)ピラゾロ[１,５−
ａ]ピリジン（Ｒｆ＝０.６５；シリカゲル、酢酸エチル
／リグロイン １：１ ｖ／ｖ）３２０ｍｇを得、それを
実施例１.１.３と同様に亜ジチオン酸ナトリウムで還元
した。標記化合物を得た。融点２４９〜２５１℃（分
解）；Ｒｆ＝０.２（シリカゲル、酢酸エチル／リグロ
イン１：１ ｖ／ｖ）。

【０２０３】９.１３.２ 該アミノ化合物を、実施例
１.１.２と同様にフェノールとカップリングさせて、着
色物質を得、それを実施例１.１.３と同様に還元し、実
施例７.５と同様にトリフルオロアセチル化した。

【０２０４】９.１４ ４−ヒドロキシフェニル−２−
モルホリノピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イルア
ミン ９.１４.１ ３−アミノ−２−モルホリノピラゾロ[１,
５−ａ]ピリジン・塩酸塩 ２−アミノピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン［ケミカル・
アンド・ファーマシューティカル・ブリチン，２１，２
１４６／１９７３を参照］を、実施例９.３.１と同様に
ｐ−メトキシベンゼンジアゾニウム塩と反応させた。該
アゾ化合物４ｇをジメチルホルムアミド１００ｍｌに溶
解させ、β,β'−ジブロモジエチルエーテル５.３３ｇ
および水素化ナトリウム（５５％）２ｇと混合した。該
反応混合物を室温にて１.５時間撹拌し、水および酢酸
エチルを添加した。有機相を分離し、水相を再度酢酸エ
チルで抽出した。合した有機相を乾燥させ、蒸発させ
た。得られた残留物をヘキサンと一緒に粉砕した。３−
(４−メトキシフェニル)−アゾ−２−モルホリノピラゾ
ロ[１,５−ａ]ピリジン４.７５ｇを得た。Ｒｆ＝０.７
（シリカゲル、酢酸エチル／塩化メチレン １：１ ｖ／
ｖ）。

【０２０５】該アゾ化合物を実施例９.３.１と同様に亜
鉛および氷酢酸で還元し、精製し、tert−ブトキシカル
ボニル基を塩酸／エタノールで分離した。標記化合物
２.４３ｇを得た。融点１０５〜１１０℃（分解）。Ｒ
ｆ＝０.４（シリカゲル、酢酸エチル）。

【０２０６】９.１４.２ 該アミノ化合物を、実施例
１.１.２と同様にフェノールとカップリングさせて、着
色物質を得、それを実施例１.１.３と同様に還元し、実
施例７.５と同様にトリフルオロアセチル化した。

【０２０７】同様に、ｏ−クロロフェノールとカップリ
ングさせることにより、対応するハロゲン含有ロイコ色
物質３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル−２−モルホ
リノピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イルアミンを
得た。

【０２０８】９.１５ ３−クロロ−４−ヒドロキシフ
ェニル−７−(２−ヒドロキシエチル)−ピラゾロ[１,５
−ａ]ピリジン−３−イルアミン ９.１５.１ ３−アミノ−７−(２−ヒドロキシエチル)
−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン ２−ヒドロキシエチルピリジン１９.１ｇを塩化メチレ
ン５０ｍｌに溶解させ、氷で冷却しながら、文献記載の
方法と同様にＯ−ｐ−トルエンスルホニルアセトヒドロ
キサム酸エチルエステル４０ｇを６０％過塩素酸３００
ｍｌと反応させることによって得られたＯ−ｐ−トルエ
ンスルホニルヒドロキシルアミンの溶液と混合した。

【０２０９】該反応混合物を、氷浴中にて１５分間、次
いで、室温にて１時間撹拌し、次いで蒸発乾固させた。
残留物をジメチルホルムアミド４０ｍｌに溶解させ、炭
酸カリウム２８ｇと混合した。エチルプロピオラート１
５ｇを滴下し、それと同時に、空気を該反応混合物に通
した。１時間の反応時間後、該混合物を蒸発させ、リグ
ロイン／酢酸エチル（１：１ ｖ／ｖ）を用いるシリカ
ゲル上でのクロマトグラフィーに付した。油状の黄褐色
物質１０.８ｇを得、それを濃塩酸２００ｍｌに溶解さ
せ、３時間加熱還流した。該反応混合物を、氷で冷却し
ながら、水酸化ナトリウム水溶液でアルカリ性にし、該
生成物を酢酸エチルで抽出した。褐色油４.６ｇを得
た。

【０２１０】実施例１.２.１および１.２.２と同様に、
標記化合物を得た。融点２０８℃。Ｒｆ＝０.３８（シ
リカゲル、酢酸エチル／メタノール ９：１ ｖ／ｖ）。

【０２１１】９.１５.２ 実施例１.１.２と同様に、２
−クロロフェノールとカップリングさせることにより着
色物質を得、それを、触媒量のｐ−ジメチルアミノピリ
ジンの存在下、無水酢酸と反応させることによりヒドロ
キシエチル基をアセチル化し、実施例１.１.３と同様に
還元し、実施例７.５と同様にトリフルオロアセチル化
した。

【０２１２】９.１６ ３−クロロ−４−ヒドロキシフ
ェニル−５−(２−ヒドロキシエチル)−ピラゾロ[１,５
−ａ]ピリジン−３−イルアミン 実施例９.１５と同様に、４−ヒドロキシエチルピリジ
ンから出発して、Ｎ−トリフルオロアセチル化ロイコ色
物質を得た。

【０２１３】９.１７ 実施例１.１.２および１.１.３
と同様に、３−アミノピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン
（実施例１.２.２を参照）を、適宜置換したフェノール
と酸化カップリングさせることにより、ロイコ色物質２
−メトキシ−４−ヒドロキシフェニルピラゾロ[１,５−
ａ]ピリジン−３−イルアミン、３−クロロ−４−ヒド
ロキシフェニルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イ
ルアミン、３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニルピラ
ゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イルアミンおよび２−
メチル−４−ヒドロキシフェニルピラゾロ[１,５−ａ]
ピリジン−３−イルアミンを得た。実施例７.５と同様
にＮ−トリフルオロアセチル化を行った。

【０２１４】９.１８ ４−ヒドロキシフェニル−４,６
−ジメチルピラゾロ[３,２−ｃ]−ｓ−トリアゾール−
３−イルアミン ９.１８.１ ３−アミノ−４,６−ジメチルピラゾロ
[３,２−ｃ]−ｓ−トリアゾール・塩酸塩 ３−アミノピラゾロ−４−カルボン酸エチル［オーガニ
クム、５１４頁、ベルリン、科学ＶＥＢ出版を参照］２
４.４ｇを濃塩酸１００ｍｌに懸濁させ、亜硝酸ナトリ
ウム１０.３５ｇの水５０ｍｌ中溶液を添加することに
より、０〜５℃にてジアゾ化した。その後、塩化第一ス
ズ１００ｇの濃塩酸１００ｍｌ中溶液を添加し、該反応
混合物を氷浴中にてさらに２時間撹拌した。得られた黄
色沈澱物を濾過し、水１５０ｍｌに溶解させ、無水酢酸
２０ｍｌと混合した。反応混合物を８０℃の浴温に加熱
し、全体で２時間にわたって、炭酸水素ナトリウム２５
ｇを滴下混合した。次いで、中性溶液を酢酸エチルで２
４時間連続的に抽出した。有機相を乾燥させ、蒸発させ
た後、３−アセトヒドラジノピラゾール−４−カルボン
酸エチルエステル（Ｒｆ＝０.３３；シリカゲル、アセ
トン／塩化メチレン／氷酢酸 ５０：４５：５ ｖ／ｖ／
ｖ）１７ｇを得、それをドイツ連邦共和国特許公開明細
書第１８１０４６２号の実施例６に記載の方法に従い、
オキシ塩化リンを用いて環化した。６−メチルピラゾロ
[３,２−ｃ]−ｓ−トリアゾール−３−カルボン酸エチ
ルエステル４.８ｇ（収率３２％）を得た。Ｒｆ＝０.７
０；シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール
２：１：１ ｖ／ｖ／ｖ）。

【０２１５】前記の複素環式化合物を実施例９.３.１と
同様にメチル化し、酢酸エチル／リグロイン（２：１
ｖ／ｖ）を用いるシリカゲル上でのクロマトグラフィー
に付すことにより該生成物を精製した。該エステルを６
Ｎ塩酸と一緒に６時間加熱することによりケン化し、中
間体として形成されたカルボン酸を脱炭酸した。該酸を
炭酸ナトリウムを添加することにより中和し、該生成物
を酢酸エチルで抽出した。油状の４,６−ジメチルピラ
ゾロ[３,２−ｃ]−ｓ−トリアゾール１.１ｇを得た。Ｒ
ｆ＝０.２６；シリカゲル、酢酸エチル／リグロイン
１：１ ｖ／ｖ）。

【０２１６】該複素環式化合物を実施例１.２.１と同様
にニトロソ化し、該ニトロソ基を実施例２.１と同様に
パラジウム−炭／ヒドラジンで還元した。塩酸塩として
標記化合物を得た。融点１９０℃（分解）。Ｒｆ＝０.
５３；シリカゲル、酢酸エチル／アセトン／氷酢酸／水
５０：２５：１２.５：１２.５ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）。

【０２１７】９.１８.２ 該アミノ化合物を、実施例
１.１.２と同様にフェノールとカップリングさせて着色
物質を得、それを実施例１.１.３と同様に還元し、実施
例７.５と同様にトルフルオロアセチル化した。

【０２１８】９.１９ ５−ブロモ−２−メトキシ−４
−ヒドロキシフェニル−２−メトキシピラゾロ[１,５−
ａ]ピリジン−３−イルアミン ２−ブロモ−５−メトキシフェノールから出発し、実施
例９.１.３と同様にロイコ色物質を得た。

【０２１９】９.２０ ３−クロロ−４−ヒドロキシフ
ェニル−２−(２,３−ジヒドロキシプロピル)ピラゾロ
[１,５−ａ]ピリジン−３−イルアミン ９.２０.１ 前記実施例９.３.１と同様に、３−アセチ
ル−２−ヒドロキシピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン［ケ
ミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブリチン，
２３，４５２／１９７５を参照］７ｇを、ジメチルホル
ムアミド中、Ｒ,Ｓ−(２,２−ジメチル−１,３−ジオキ
ソラン−４−イル)−メチル−ｐ−トルエンスルホナー
ト１４.３ｇおよび塩基としての水素化ナトリウムでＯ
−アルキル化した。該粗製生成物を、溶離剤として酢酸
エチル／リグロインを用いるシリカゲル上でのクロマト
グラフィーに付すことにより精製した。３−アセチル−
２−(Ｒ,Ｓ−２,２−ジメチル−１,３−ジオキソラン−
４−イル)−メトキシ)−ピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン
１.４７ｇを得た。Ｒｆ＝０.４５ｇ；シリカゲル、酢酸
エチル／リグロイン １：１ ｖ／ｖ）。

【０２２０】９.２０.２ 実施例１.１.１および１.１.
２と同様に、２−クロロフェノールとカップリングさせ
ることにより前記化合物から着色物質を得、ニトロソ化
の場合には該ケタールを開裂させ、着色物質段階では、
２個の遊離脂肪族ヒドロキシル基を、触媒としてｐ−ジ
メチルアミノピリジンおよび無水酢酸を用いて保護し
た。

【０２２１】実施例１.１.３と同様に、該着色物質をロ
イコ色物質に還元し、実施例７.５と同様にＮ−トリフ
ルオロアセチル化した。

【０２２２】９.２０.３ 実施例９.２０.１〜９.２０.
２と同様にして、２,５−ジクロロフェノールを用いて
さらにまたロイコ色成分を得た。

【０２２３】９.２１ ４−ヒドロキシフェニル−２−
メトキシ−５,７−ジメチルピラゾロ[１,５−ａ]ピリミ
ジン−３−イルアミン 実施例１.１.１と同様に、２−メトキシ−５,７−ジメ
チルピラゾロ[１,５−ａ]ピリミジン［Ａnm.Ｃhem.，６
４７，１１６／１９６１を参照］から出発し、３−アミ
ノ−５,７−ジメチル−２−メトキシピラゾロ[１,５−
ａ]ピリミジン・塩酸塩（融点１８７〜１９０℃）を
得、それを実施例１.１.２と同様にフェノールとカップ
リングさせて着色物質を得、それを実施例１.１.３と同
様に還元し、実施例７.５と同様にトリフルオロアセチ
ル化した。

【０２２４】実施例１０ 実施例８と同様にして、以下の「表８」に示す化合物を
得た：

【０２２５】

【表８】

【０２２６】実施例１１ ４−(２−メチルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イ
ルアミン)−フェニル−β−Ｄ−ガラクトシド

【化４６】

【０２２７】参考例１の（２）および（３）と同様に、
実施例１.１にて得られたロイコ色物質と２,３,４,６−
テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトシルブロミド
を用い、標記化合物を得た。融点１３７℃。Ｒｆ＝０.
５（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール
１：１：１ｖ／ｖ／ｖ）。

【０２２８】実施例１２ 白血球エステラーゼ測定用試験ストリップ（白血球試
験） シュライヒャー＆シュール（Ｓchleicher＆Ｓchuell）
社の濾紙（２３ＳＬ）を連続的に以下の溶液で含浸さ
せ、乾燥させた： １．ホウ酸塩緩衝液 ５０ｍＭ／リットル、pＨ８ ２．実施例５の指示薬／メタノール ４ｍＭ／リットル

【０２２９】６０μｍのフィラメント厚のナイロンメッ
シュ（スイス、チューリッヒのチューリッヒャー・ボイ
テルトゥクファブリク（Ｚuericher Ｂeuteltuchfabri
k）社のＮＹ７５ＨＣ）を５０ｍＭ／リットルのヨウ素
酸カリウム溶液で含浸させ、乾燥させた。

【０２３０】緩衝剤および指示薬で含浸させた濾紙
（１）、ヨウ素酸塩ファブリック（２）、ナイロン（Ｎ
Ｙ７５ＨＣ）製のカバーメッシュ（３）および剛性プラ
スチックフィルム（４）から、「図４」と同様の試験ス
トリップを製造した。

【０２３１】実施例１３ アルカリ性ホスファターゼの測定 ａ）試験ストリップ 実施例１２の記載と同様に、シュライヒャー＆シュール
社の濾紙（２３ＳＬ）を： １．ヘペス（hepes）緩衝液 ５０ｍＭ／リットル、pＨ７.５ ２．実施例６の指示薬／メタノール ４ｍＭ／リットル で含浸させ、乾燥させて、実施例１２の記載に従って製
造したヨウ素酸塩ファブリックのメッシュでカバーし
た。

【０２３２】かかる試験ストリップをアルカリ性ホスフ
ァターゼ溶液に浸すと、無色から青色へと着色が生じ
た。１７６Ｕ／リットルの活性が５分後の着色により認
められた。

【０２３３】ｂ）湿式化学測定 ヘペス緩衝液（５０ｍＭ／リットル）（pＨ７.５）中、
４ｍＭ／リットルの実施例６の基質の溶液９００μｌを
用いた。その中に： １．２２０ｍＭ／リットルのヨウ素酸カリウム溶液１０
０μｌ、および ２．アルカリ性ホスファターゼ含有溶液１００μｌ をピペットで移し、混合し、５７３ｎｍの波長で速度を
測定した。「図４」の検量線は、公知の酵素含有溶液を
用いて作成することができる。この検量線の場合、ブラ
ンク値を減じた（対応する酵素不含方法）。

【０２３４】実施例１４ β−Ｄ−ガラクトシダーゼの測定 ５０ｍＭ／リットルのヘペス緩衝液（pＨ７.５）中、４
ｍＭ／リットルの実施例１１の基質の溶液９００μｌを
キュベット中に入れ、その中に： １．２２０ｍＭ／リットルのヨウ素酸カリウム溶液１０
０μｌ、および ２．β−Ｄ−ガラクトシダーゼ含有溶液１００μｌ をピペットで移し、混合し、５６０ｎｍの波長で速度を
測定した。「図６」の検量線は、公知のβ−ガラクトシ
ダーゼ含有溶液を用いて得ることができる。

【０２３５】実施例１５ Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧas
e）の測定用試験ストリップ シュライヒャー＆シュール社の濾紙（２３ＳＬ）を連続
的に以下の溶液で含浸させ、乾燥させた： １．クエン酸塩緩衝液 ２００ｍＭ／リ
ットル、pＨ５ ２．メタノール中、１０ｍＭ／リットルの指示薬および
４ｍＭ／リットルのフェニルセミカルバジド

【０２３６】６０μｍのフィラミント厚のナイロンメッ
シュ（スイス、チューリッヒのチューリッヒャー・ボイ
テルトゥクファブリク社のＮＹ７５ＨＣ）を４ｍＭ／リ
ットルのヨウ素酸カリウム水溶液で含浸させ、乾燥させ
た。

【０２３７】緩衝剤および指示薬で含浸させた濾紙
（１）、ヨウ素酸塩ファブリック（２）、カバーメッシ
ュ（３）（ナイロンＮＹ７５ＨＣ）と剛性プラスチック
フィルム（４）から、「図４」と同様の試験ストリップ
を製造した。

【０２３８】かかる試験ストリップをＮＡＧase含有溶
液（２０Ｕ／リットル）に浸すと、該ストリップの着色
が生じた。「表９」に、着色を付与する指示薬を示す：

【０２３９】

【表９】

【０２４０】

【発明の効果】本発明化合物を用いて、ヒドロラーゼの
迅速かつ容易な測定を行うことができるＮ−またはＯ−
置換アミノフェノール誘導体を得ることができた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１ａの基質を用いる、λ_max５６０ｎ
ｍでのβ−ＮＡＧase測定用検量線を示す。

【図２】 実施例１ｂの基質を用いる、λ_max５２５ｎ
ｍでのβ−ＮＡＧase測定用検量線を示す。

【図３】 実施例２の基質を用いる、λ_max５６５ｎｍ
でのβ−ＮＡＧase測定用検量線を示す。

【図４】 緩衝液および指示薬含有の濾紙、酸化剤含有
のメッシュ、カバーメッシュおよびプラスチックフィル
ムからなる試験キャリアーを示す。

【図５】 実施例６の基質を用いる、λ_max５７３ｎｍ
でのアルカリ性ホスファターゼ測定用検量線を示す。

【図６】 実施例１１の基質を用いる、λ_max５６０ｎ
ｍでのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ測定用検量線を示す。

【符号の説明】

１・・・濾紙、２・・・メッシュ、３・・・カバーメッシュ、４・
・・プラスチックフィルム、５・・・溶融接着手段。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ディーター・マンゴルト ドイツ連邦共和国6701マックスドルフ、 ヒュッテンミュラーシュトラーセ33番

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（ＶＩＩ）： 【化１】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は、同一または異なり、水素原
   子、ハロゲン原子、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、またはこれら
   酸基の塩であるか、ヒドロキシル、ニトロ、カルボキシ
   ル、カルボキシアミドまたはシアノであるか、所望によ
   り１つ以上のヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、
   シアノ、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、またはこれら酸基のうち
   の１つの塩により置換されていてもよいアルキル、アル
   ケニル、アルコキシ、アルキルスルフィニル、アルキル
   スルホニル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニ
   ル、アリールまたはアラルキルであるか、あるいは、２
   つの置換基が隣接する炭素原子上にある場合、一緒にな
   って、所望により１つ以上のＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、また
   はこれら酸基の塩、アルキルおよび／またはカルボキシ
   ル基により置換されていてもよい１,４−ブタジエンジ
   イル基を表し；Ｒ³は、水素原子、−ＣＯ−ＣＯＯＨ、
   ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、またはこれら酸基の塩であるか、
   所望により１つ以上のハロゲン、ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈお
   よび／またはＰＯ₃Ｈ₂またはこれら酸基の塩により置換
   されていてもよいアルキルカルボニル基であるか、ある
   いは所望により１つ以上のＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂またはこ
   れら酸基の塩により置換されていてもよいアリールカル
   ボニル基であり；Ｌは、 一般式（ＩＩＩ）： 【化２】 （式中、Ｘ−Ｙは、ＮＲ⁸−ＣＯまたはＮ＝ＣＲ⁹を意味
   し、ここで、Ｒ⁸は、水素原子またはアルキル基であ
   り、Ｒ⁹は、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アル
   キルチオ、アリール、アラルキル（ここで、各々、所望
   によりヒドロキシル、ジアルキルホスフィニル、カルボ
   キシル、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、これら酸基のうちの１つ
   の塩および／またはアルコキシカルボニルにより置換さ
   れていてもよい）、アミノ（ここで、該アミノ基は、所
   望により１または２つのアルキル基により置換されてい
   てもよく、該アルキル基は、所望により１つ以上のヒド
   ロキシル、カルボキシルおよび／またはアルコキシカル
   ボニル基により置換されていてもよく、該アミノ基が２
   つのアルキル基により置換されている場合、これらの基
   は、一緒になって環を形成することができ、それは、ア
   ミノ基の窒素原子とは別に、さらに所望により酸素、硫
   黄またはさらなる窒素原子を有していてもよいか、また
   は該アミノ基は、所望により１または２つのアシル基、
   アルコキシ−および／またはアラルコキシカルボニル
   基、Ｈ₂Ｎ−ＣＯ、アルキル−、アラルキル−またはア
   リールカルバモイル基により置換されていてもよい）、
   または水素、カルボキシル、アルコキシカルボニル、カ
   ルボキシアミドまたはハロゲンであり；Ｚは、ＮＲ¹⁰−
   Ｎ＝Ｎを意味し、ここで、該Ｒ¹⁰は、水素原子、アルキ
   ル基またはアラルキル基であるか、あるいはＺは、窒素
   原子または炭素原子、および所望により１以上の窒素も
   しくは硫黄原子を含有していてもよい３〜５員の不飽和
   鎖であり、該炭素原子は、所望によりアルキル、アルコ
   キシ、ヒドロキシアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシ
   ル、アラルキル、アリール、カルボキシル、カルボキシ
   アミド、アルコキシカルボニル、シアノ、所望により１
   または２個のアルキル基により置換されていてもよいア
   ミノ（ここで、該アルキル基は、所望により１以上のヒ
   ドロキシル、カルボキシルおよび／またはアルコキシカ
   ルボニル基により置換されていてもよい）、および／ま
   たはハロゲンにより置換されていてもよく、ならびに二
   重結合を介して結合していない窒素は、所望によりアル
   キルまたはアラルキルにより置換されていてもよいか、
   あるいは２つの隣接する鎖置換基は、所望によりアルキ
   レン基を形成してもよく、ここで、該アルキレン基は、
   所望により、アリールおよび対応する互変異性体で置換
   されているか、または縮合（anellate）されていてもよ
   い）で示されるピラゾロ複素環基を意味する；ただし、
   Ｒ³が水素原子、所望により１以上のハロゲンにより置
   換されていてもよいアリールカルボニル基またはアルキ
   ルカルボニル基であり、ＬにおけるＸ−ＹがＮ＝ＣＲ⁹
   （Ｒ⁹は前記定義と同じ）である場合、Ｚは、二重結合
   を介して結合していない窒素原子が水素により置換され
   ている１,２,４−トリアゾール環を形成しない］で示さ
   れるキノンイミン誘導体。
2. 【請求項２】 一般式（ＶＩＩＩ）： ［式中、Ｌは、請求項１における定義と同じである］で
   示される化合物を、酸化剤の存在下、一般式（ＩＸ）： 【化３】 ［式中、Ｒ¹およびＲ²は、請求項１における定義と同じ
   であり、Ｖは、水素原子、ハロゲン原子、ＣＯＯＨ基ま
   たはＳＯ₃Ｈ基を意味する］で示されるフェノールと反
   応させることからなる、請求項１記載のキノンイミン誘
   導体の製造方法。