JPS62215400A - 色原体アミノ酸エステル及びペプチドエステルを用いたエステル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規色原体であるヒドロキシベンゾ（イソ）
チアゾール及びヒドロキシベンゾピラゾールのアミノ酸
エステル及びペプチドエステルを用いたエステル分解／
又は蛋白分解酵素の検出試薬に関する。本発明の検出試
薬は、特に尿中の白血球の検出に好適に使用される。

体液、特に尿中の白血球の検出は、腎臓及び尿生殖路の
病気の診断に極めて重要である。この検出は、元来、非
遠心分離法又は原油積物中の白血球を計数することによ
って実施された０両方の方法において、完全な白血球だ
けを記録することができる。しかしながら、白血球分解
速度が尿媒体に応じて広範に変動することは公知である
０例えば、強アルカリ性尿中では、白血球の半減期はわ
ずか６０分である。このことは、測定される白血球数が
低すぎることを意味する。この溶解誤差を別にして、遠
心分離していない均質化尿中の白血球の定量的顕微鏡測
定は、計数室中で極めて正確な数値を与える。それにも
かかわらず、この方法は煩雑で１時間がかかり、熟練者
を要するので。

実際にはほとんど使用されていない。

従って、医療実務において、尿中の白血球の好ましい測
定方法は、原油植物中のいわゆる視野法であった。この
方法には、まず、試料（沈積物）を遠心分離によって得
なければならない。しかし、尿の他の成分もそれによっ
て儂縮され、他の成分１例えば塩及び上皮細胞が白血球
の顕微鏡計数を著しく困難にする。沈積物含有量の変動
、不均一な沈積物及び光学的設計の異なる顕微鏡により
、白血球数に比較的大きい誤差（数百％まで）が生じた
。

これらの困難を回避するには、白血球は広い酵素スペク
トルを有するので、種々の体液中の白血球の検出原理と
して、酵素反応を使用する試みが既になされていた。

例えば、体液中の白血球の検出試薬は西ドイツ特許出願
公開第２８　２６　９６５号及び同第２８　３６　６４
４号公報から公知であり、これらの公報では、白血球中
に存在するエステル分解及び／又は蛋白分解活性が分析
に利用されている。スルホンフタレインエステル又はア
ゾ色素エステルは、白血球エステラーゼ及び／又はプロ
テアーゼ用基質として使用されている。酵素反応におい
て放出される色素を次に、公知方法で測定する。しかし
ながら、これらの公報に記載されている試薬は、白血球
濃度が低い場合に、反応時間が長ずざるので、なお実用
するには鋭敏でない。

プロテアーゼ及びエステラーゼを検出する種々の方法は
、組織化学的及び細胞化学的酵素学からも知られている
［例えば、ピアース（Ａ、　Ｇ、　Ｅ。

Ｐｅａｒｓｅ）著、ヒストケミストリイ、セオレティカ
ル・アンド・アプライド（Ｈ４ｓｔｏｃｈμｍ１コニＴ
ｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａ　　１ｉｅｄ　、第
３版、チャーチル・リビングストーン（ｃｈｕｒｃｈｉ
ｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｇｔｏｎｅ）Ｑ行、ニブインバラ−
ロンドン−ニューヨーク、１９６８年参照］、一般に、
無色又はわずかに着色したエステルを検出に使用するが
、これらは酵素によって無色の酸と同様に無色のアルコ
ール（フェノール）成分に分解される０次に、フェノー
ル成分をその後の反応で、例えばジアゾニウム塩とカッ
プリングさせるか、又は酸化によって無色の生成物に変
える０例えば、エフφシュマルツ（Ｆ、　Ｓｃｂ＋＋ａ
ｌｚｌ）及びエイチ拳ブラウンシュタイナ−（Ｈ，Ｂｒ
ａｕｎｓｔｅｉｎｅｒ）は、クリソ・つ゛シュル（Ｋｌ
ｉｎ、　Ｗｓｃｈｒ、）第４６巻、６４２頁（１９６８
年）に、基質としてす７トールーＡｓ−Ｄ−クロロアセ
テート及び遊離されるナフトールと共に着色アゾ化合物
を形成するジアゾニウム塩を用いる特殊な細胞化学的白
血球エステラーゼ検出法を記載している。

しかし、この種の２次分系は、極めて感度が低い（白血
球５０００／ｐｉを含む試料でも、まだ、反応しない）
ので、体液、例えば尿中での白血球の迅速かつ簡単な検
出には不適当であることが判った。

英国特許第Ａ−１，１２８，３７１号及びヨーロッパ特
許第Ａ−１２，９５７号は、体液中の加水分解酵素を検
出するため色原体基質としてインドキシル及びチオイン
ドキシルエステルを使用することを記載している。基質
が酵素分解されると、遊離インドキシルが形成され、こ
れをその後、酸化して、容易に検出しうる青色色素イン
ジゴにする。ヨーロッパ特許第Ａ−１２，９５７号に基
づく重版の試験手段は、Ｎ−トシル−Ｌ−アラニンＬ−
インドキシルエステルを含浸した濾紙ストリップから成
る。試験ストリップを白血球を含む尿試料中に浸漬する
と、ストリップは青色に変わる。しかしながら、最終的
呈色を達成し、試験を評価できるようになるまでの長い
待ち時間が、この製品の顕著な欠点である。

ヨーロッパ特許第Ａ−１４，９２９号は、酵素分解反応
のため種々の促進剤（ピリジン誘導体、イミダゾール誘
導体、アルカリ土類金属錯体）について記載している。

しかしながら、インドキシルが完全に酸化されるまでに
比較的長い時間を要し、試験感度が低いこと（検出限界
二数千白血球／ｐ−１）が、なお欠点である。同じこと
は、ヨーロッパ特許第Ａ−３４，３２３号により白血球
酵素の基質としてロイコ−インドアニリンのエステルを
使用する場合にも当てはまる。

ヨーロッパ特許第Ａ−３９，８８０号明細書はヨーロッ
パ特許第Ａ−１２，９５７号及び同第１４．９２９号に
よる基質と、前記のジアゾニウム塩とカップリングさせ
る検出原理との組み合わせを提供している。この方法で
白血球の検出限界を著しく低減することができるが、実
際に使用するのに望まれる１５〜２０白血球／ル立の検
出感度はまだ達成されない。

従って１本発明の目的は、高い検出感度と白血球酵素に
よる迅速な分解及びジアゾニウム塩との迅速かつ強い呈
色反応とを合わせもつ、エステル分解酵素の新規色原体
基質を見いだすことであった。この目的は１本発明によ
るエステルによって達成される。

本発明は、一般式（１）： ［式中ｘ１は窒素又は硫黄を表し；ｘ２は窒素を表し；
Ｒ，、Ｒ２及びＲ３は水素を表し；Ａはグリシン、アラ
ニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラ
ニン、チロシン及びリジンから選ばれるアミノ酸基又は
該アミノ酸２〜８個からなるペプチド基を表し；Ｇは水
素又はアルキル−、アリール−及びアルアルキル−オキ
シカルボニル基、アルキル−及びアルアルキル−オキシ
チオカルボニル基、アルキル−、アリール−及びアルア
ルキル−スルホニルもしくは−スルフェニル基、ビニル
オキシカルボニル基、シクロヘキセニルオキシカルボニ
ル基、ホスホリル基並びにカルバミル基から選ばれる窒
素保護基を表す］の化合物を色原体酵素基質として用い
るエステル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬に関
する。

前記化合物（Ｉ）は、一般式（ＩＩ）：Ｒ９ ［式中ＸＩ　、Ｘ２　、Ｒｔ　、Ｒ２及びＲ３は前記の
ものを表す］のフェノールを一般式（ｍ）：Ｇ　−Ａ−
ＯＨ（ＩＩＩ） ［式中Ｇ及びＡは前記のものを表す］のアミノ酸若しく
はペプチド又はその適当な反応性誘導体とペプチド化学
に常用の方法で反応させることにより製造することがで
きる。

適当な反応性誘導体は、酸ハライド及びペプチド合成に
常用の混成無水物、例えばクロロギ酸エチルとの無水物
、又は活性エステル、例えばペンタクロロフェニルエス
テル又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルで
ある。

本発明は、（ａ）色原体酵素基質、（ｂ）ジアゾニウム
塩、必要に応じて（ｃ）緩衝剤及び必要に応じて（ｄ）
担体及び／又は常用の添加剤を含むエステル分解及び／
又は蛋白分解酵素の検出試薬において、色原体酵素基質
が前記化合物（Ｉ）であることを特徴とするエステル分
解及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬に関する。

試料を本発明による試薬と接触させ、起こった呈色反応
を測定することにより液体試料、殊に体液中のエステル
分解及び／又は蛋白分解酵素を検出することができる。

本発明において、一般式（Ｉ）の好ましい化合物は、ｘ
ｌが硫黄を表す化合物である。

基Ｇ−Ａ−０−が一般式（Ｉ）の化合物において５位に
存在するのが好ましい。

最後に、Ｇ−Ａ−は、一般式（■）： ［式中Ｒ４は水素、又は場合により分岐したアルキル基
、シクロアルキル基、アルアルキル基を表し、これらの
基は１〜１５個、好ましくは１〜９個の炭素原子を有し
、場合により１個又は２個、特に１個のヒドロキシル基
、メルカプト基、カルボキシル基、アミノ基又はグアニ
ド基で置換されており、Ｒ，は水素又は好ましくは−０
００−アルキル基、−ＣＯＯ−アルアルキル基、−Ｃ０
〇−７リール基、−５Ｏ２−アルキル基又は−５０２−
７リール基を表し、アルキル基は１〜９個の炭素原子、
好ましくは１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖
の基であり、アリール基は好ましくは６〜１２個の炭素
原子、好ましくは６個の炭素原子を含み、場合により炭
素原子ａ１〜４のアルコキシ基又はハロゲンで置換され
ている］の基を表すのが好ましい。

Ｇ−Ａ−は、特に好ましくは、天然に存在するアミノ酸
又はこのような酸２〜８個のペプチドの、前記窒素保護
基を有する基を表す。

アミノ酸基は、そのＬ−又はＤ−形又はそのラセミ形で
存在しうる。特に好ま、しい基は、グリシン、アラニン
、バリン、リジン、ロイシン、イソロイシン、フェニル
アラニン及びチロシンの基であり、それぞれの場合にＬ
−形が特に好ましい。

存在する遊離ヒドロキシル基をアシル化、好ましくはア
セチル化することができる。

Ａの定義におけるペプチド基は１例えばジー。

トリー、テトラ−及びペンタ−ペプチド、好ましくはジ
ー及びトリペプチドを表す。

一般式（■）のフェノール類は、自体公知であるか、又
は公知方法で製造される。

一般式（ＩＩ）のフェノール類の製造方法は、例えば下
記の参照文献に記載されている。フラツグ（Ｆｒａｎｋ
ｅ）ら著、アルツナイミッテルーフォルシュング（虹…
旦虹旦虹三匹胚胞」）亀ユ旦遷（１１頁）１８３１　Ｎ
１８３８年；ドイツ特許第Ａ−２７０４７９３号公報、
ディピース（ｎａｖｉｅｓ）、ツク（囲）１９５５．２
４１２；クラーク（ｃ１ａｒｋｅ）ら著、縮合したイソ
チアゾール類（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ　ｌ５ｏｔｈｉａｚ
ｏｌｅｓ）第７部、ジェイ・ケム”Ｌ／ス・シップ（Ｊ
、　Ｃｈｅｗ、　Ｒｅｓ、　　Ｓ　ｎｏ　、　）（第６
巻）１９７頁（１９８０年）及びヒドロキシインダゾー
ル・イン・ザ・ケミストリイΦオブ・ヘテロサイクリッ
ク・コンパウンズ（Ｈｄｒａｗ　１ｎｄａｚｏｌｅ　ｉ
ｎ　Ｔｈｅ　Ｃｈｅ＋５ｉｓｔｒ　　ｏｆ）１ｅｔｅｒ
ｏｃ　ｃｌｉｃ　Ｃｏｗ　ｏｕｎｄｓ）第２２巻３３６
〜３４０頁、アール・エイチ・ウィリイ（Ｒ，Ｈ。

留日ｅｙ　）編。

本発明による化合物は、一般式（ＩＩ）のフェノール類
及び一般式（ＩＩＩ）のアミノ酸若しくはペプチド又は
それらの反応性誘導体（特に酸ハライド又は活性エステ
ル）から、ペプチド化学から自体公知の合成方法によっ
て製造することができる。この種の方法は１例えば、下
記の刊行物（及び本明細書に引用する文献）、即ち、ジ
ャノッフ（Ｊａｎｏｆｆ）ら著、ブロク・ツク・イクス
ペル・ビオル・メト（Ｐｒｏｃ、　Ｓａｃ、　Ｅｘ　ｅ
ｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｗｅｄ、）第１３６巻、１０４５〜
１０４９頁（１９７１年）；スィートマン（Ｓｗｅｅｔ
ｗａｎ）ら著、ジェイ・ヒスト・ツク（Ｊ、旧ｓｔ、　
Ｓａｃ、　）第２２巻３２７〜３３９頁；ヤクブヶ（Ｊ
ａｋｕｂｋｅ）ら著、ケム・ベル（ｃｈｅｗ、　Ｈｅｒ
、）　１００．２２６７〜２３７２頁（１９６７４Ｆ）
及ヒ特に、ツーベン−ワイル（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ
）著、メトーデン会デルφオルガニツシェン・ヘミ−（
Ｍｅｔｈｏｄ且」肛ユ」組ｎ■胚Ｃｈｅ＋５ｉｅ）　、
第ＸＶ／１巻及びＸＶ／２巻に記載されている。

本発明による、ニスエル分解及び／又は蛋白分解酵素の
検出用試薬は、前記化合物（Ｉ）の他に、一般式（Ｖ）
： ［式中Ｋｌは低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級
アルキルメルカプト基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シア
ノ基、トリフルオロメチル基、炭素原子数１〜８のアル
キルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基、炭
素原子数１〜８のアルキルスルホン基、アリールスルホ
ン基、スルホン酸又はカルボン酸、Ｎ−モルホリノ基、
Ｎ−チオモルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基、場合により
Ｎ′−アルキル化Ｎ−ピペラジノ基又はＮ−ピペリジノ
基、ハロゲン又は水素を表し、Ｒ′３は低級アルキル基
、低級アルコキシ基、アリールオキシ基、低級アルキル
メルカプト基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基
、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、炭素原子数１
〜８のアルキルスルホンアミド基、アリールスルホンア
ミド基、炭素原子数１〜８のフルキルスルホン基、アリ
ールスルホン基、スルホン酸又はカルボン酸、Ｎ−モル
ホリノ基、Ｎ−チオモルホリノ基又はＮ−ピロリジノ基
、場合によりＮ′−アルキル化Ｎ−ピペラジノ基又はＮ
−ピペリジノ基又はフェニルアミノ基、場合により低級
アルキル基若しくは低級アルコキシ基で置換されたフェ
ニル基、ハロゲン又は水素を表し、Ｒ′２、Ｒ′４及び
Ｒ′５は、同−又は異なり、それぞれ低級アルキル基、
低級アルコキシ基、ニトロ基、炭素原子数１〜８のアル
キルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基、炭
素原子数１〜８のフルキルスルホン基、アリールスルホ
ン基、スルホン酸基又はカルボン酸基又は低級アルキル
メルカプト基、ハロゲン又は水素を表し、Ｘは安定化陰
イオンを表し、それぞれの場合に２個の隣接する基Ｒ１
〜Ｒ，が閉環して、場合によりハロゲン、炭素原子数１
〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６のアルコキシ基又
はニトロ基、スルホン酸基又はカルボン酸基で置換され
たベンゼン環を形成することができ、ナフタリン系のジ
アゾニウム塩を形成する］のジアゾニウム塩を含む。

一般式（Ｖ）において、好ましくは、に１は炭素原子数
１〜４のアルキル基、炭素原子数１〜４のアルコキシ基
、ヒドロキシル基、ニトロ基、／＼ロゲン又は水素を表
し、Ｋｓは炭素原子数１〜４のアルキル基、炭素原子数
１〜４のアルコキシ基、アリールオキシ基、炭素原子数
１〜４のアルキルアミノ基、炭素原子数１〜４のジアル
キルアミノ基、ニトロ基、炭素原子数１〜４のアルキル
スルホンアミド基、アリールスルホンアミド基、炭素原
子数１〜４のアルキルスルホン基、アリールスルホン基
、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−ピロリシフ基、フェニルアミ
ノ基又はスルホン酸基又は水素を表し、Ｒ’２　、　Ｋ
４及びＲ’５は同−又は異なり、炭素原子数１〜４のア
ルキル基、炭素原子数１〜４のアルコキシ基、炭素原子
数１〜４のアルキルアミノ基、炭素原子数１〜４のジア
ルキルアミノ基、ニトロ基、炭素原子数１〜４のアルキ
ルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基又はス
ルホン酸基、／＼ロゲン又は水素を表す。

それぞれの場合に、２個の隣接する基Ｒ′□〜Ｒ′ｓは
閉環して、ベンゼン環を形成することができ、これは場
合によりハロゲン又は炭素原子数１〜４のアルキル基又
は炭素原子数１〜４のアルコキシ基又はニトロ基又はス
ルホン酸基で置換されていてもよい。

一般式（Ｖ）において、アリール基はそれぞれ６〜１２
個の炭素原子、好ましくは６個の炭素原子を含む芳香族
基を表し、場合によりハロゲン又は炭素原子数１〜４の
アルキル基又は炭素原子数１〜４のアルコキシ基で置換
されている。

一般式（Ｖ）のジアゾニウム塩は、自体公知であるか又
は自体公知の方法によって製造することができる［ツー
ベン−ワイル（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ）著、メソッド
−オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ａｆ　Ｏｒ　ａｎｉｃ　Ｃｈｅ＋１ｉｓｔｒ　）　、
第Ｘ／３巻参照］。

本発明による試薬は、検出すべき酵素による色原体基質
（Ｅ）の分解を促進する物質を含むのが好ましい、可能
な、このような促進剤は１例えばヨーロッパ特許第Ａ−
１４，９２９号に記載されている化合物であり、炭素原
子数８〜２５、好ましくは炭素原子ａ１０〜２０の脂肪
族アルコール（場合により不悠和であってもよい）が好
ましい。このような好ましい促進剤は、例えばｎ−デカ
ノール、ｎ−ドデカメール及び特にｎ−ウンデカノール
である。特に好ましい促進剤は、塩基性アミノ酸を含む
ホモポリアミノ酸又はコポリアミノ酸［イー・カチアル
スキイ（Ｅ、Ｋａｔｃｈａｌｓｋｉ）著、アドバンシイ
ズ・オブ魯プロティン・ケミストリ４　（Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　　）
第１３巻、２４３〜４９３頁（１９５８年）；及びシー
ービーＯアンフィンゼン（ｃ，Ｂ、　Ａｎｆｉｎｓｅｎ
）、エム・エル・アンソン（Ｍ、　Ｌ、　Ａｎｓａｎ）
、ジエイ・ティ豐ニドサル（Ｊ、Ｔ、　Ｅｄｓａｌｌ　
）及びケイＯバイリイ（Ｋ、　Ｂａ１ｌｅｙ）　（編集
者）；アカデミツク・プレス・インコーホレイテッド（
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

ＴＪＩＣ，）　　：ニューヨーク州ニューヨーク市発行
］及び逐次ポリアミノ酸である。可能な塩基性アミノ酸
は、側鎖にアミノ基又はグアニド基を有するアミノ酸で
ある。これらは特に、リジン及びオルニチン、並びにア
ルギニン、及び更に天然に存在しない塩基性アミノ酸、
例えばジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸又はジアミ
ノピメリン酸である。構成アミノ酸は、ポリアミノ酸中
にラセミ形又は光学活性り一又はＬ−形で存在すること
ができる。ポリアミノ酸の分子量（数平均）は１．００
０〜２，０００，０００　　であり、好ましくは　５，
０００〜５００．０００である。塩基性アミノ酸の含有
率は、５〜１００モル％、好ましくは２０〜１００モル
％である。

促進剤は、下記の試験具を製造する際の含浸液の０，５
〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％の量で使用する
のが好ましい。

蛋白分解酵素及び特に白血球酵素の検出用の本発明の試
薬は、適当な緩衝剤系を含むのが好ましい。この目的で
可能な系は、例えば燐酸塩、硼酸塩、炭酸塩／重度酸塩
、炭酸塩、バルビッール酸塩、トリス−（ヒドロキシメ
チル）−７ミノメタン（＝トリス）、２−アミノ−２−
メチル−プロパン−１，３−ジオール（＝アメジオール
）又はアミノ酸緩衝剤であり、ｐＨ値及び容量は原則と
して測定溶液又は試薬ストリップにおいてｐＨ値が６〜
１０、好ましくは７〜９になるように選択する。

本発明の試薬は、自体公知の洗浄剤を含んで１／〜てよ
い、なぜならば、これにより一層均質な色素分布及び一
層強い呈色が達成されるからである。

可能な洗浄剤は゛陽イオン性及び陰イオン性洗浄剤、並
びに両性及び非イオン性洗浄剤である。これらの洗浄剤
としては、例えば、ベンジル−ジメチル−テトラデシル
アンモニウムクロリド、ドデシル硫酸ナトリウム、ゼフ
イロール、ポリビニルピロリドン、活性剤として前記の
ポリアミノ酸、ヘパリノイド及びこれらの化合物の混合
物が挙げられる。

本発明の試薬において、前記の試薬を自体公知の不活性
担体に組み込むのが好ましく、特に好ましい担体マトリ
ックスは多孔性物質、例えば特に７戸紙、及びプラスチ
ック製膜、ガラス繊維マット（米国特許第３，８４６，
２４７号明細書）、多孔性セラミックストリップ、合成
不織布、スポンジ状物質（米国特許第３．５５２，９２
８号明細書）、フェルト、繊維、木材、セルロース又は
シリカゲルである。

この目的で、前記の担体を、容易に除去しうる適当な溶
剤、例えば、水、メタノール、エタノール、アセトン、
ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシド中の前
記試薬の溶液で含浸する。

これは２つの別工程で行うのが好ましい、即ち。

まず、材料を緩衝剤及び他の水溶性添加剤を含む水溶液
で含浸する０次いで、これを一般式（Ｖ）の色原体酵素
基質及び活性剤の溶液で含浸する。

しかしながら、含浸を別の順序で又は組成の異なる２種
の含浸溶液を用いて実施することもできる。含浸溶液又
は試験すべき液体が前記化合物（１）及びジアゾニウム
塩を１０４〜１０−’％ル／文、特に１０−３〜１０’
モル／文の濃度で含むのが好ましい。

濾紙をマトリックスとして使用する場合には、完成試験
紙をそのまま使用するか、又は自体公知の方法で把手に
接着させるか、又は好ましくは、例えば西ドイツ特許出
願公開第２．１１８，４５５号公報によりプラスチック
と微細なメツシュ網との間に封入することができる。

フィルムを被覆した試験ストリップを製造するため、好
ましくはすべての試薬をフィルム形成物質、例えばポリ
ビニルエステル又はポリアミドの溶液又は分散液中に入
れ、均質に混合する。この混合物をプラスチック製担体
上に薄い層を形成するようにブラシで塗布し、乾燥する
。乾燥後、こうして製造したフィルムを被覆した試験ス
トリップを切断し、そのまま使用するか、又は自体公知
の方法で把手に接着させるか、又は例えば西ドイツ特許
出願公開第２　１１８　４５５号公報によりプラスチッ
クと微細なメツシュ網との間に封入することができる。

エステル分解及び／又は蛋白分解酵素、特に白血球酵素
を検出するための本発明の診断剤は、試験試薬の前記成
分に常用の薬品添加剤を添加し、混合物を造粒すること
によって粉末混合物又は試薬錠剤の形で製造することが
できる。この種の添加剤は、例えば炭水化物（例えば単
糖類、オリゴ糖若しくは多糖類）、又は糖アルコール（
例えばマンニット、ソルビット若しくはキシリット）、
又は他の可溶性不活性化合物１例えばポリエチレングリ
コール若しくはポリビニルピロリドンである。粉末混合
物又は試薬錠剤は、例えば、約５０〜２００Ｉ１ｇ、好
ましくは５０〜８０ｍｇ（７）最終重量を有する。

それぞれの場合に、約５〜２０ｍｇ、好ましくは約１０
ｍｇの合計重量を有する凍結乾燥物を製造するには、試
験に必要なすべての試薬の他に、常用の構造形成剤１例
えばポリビニルピロリドン及び必要に応じて他の充填剤
、例えばマンニット、ソルビット若しくはキシリットを
含む溶液を凍結乾燥する。

溶液の形の本発明の診断剤は、試験に必要なすべての試
薬を含むのが好ましい、可能な溶剤は、水及び水と水溶
性有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、アセトン
若しくはジメチルホルムアミドとの混合物である。貯蔵
上の理由では、試験に必要な試薬を２以上の溶液に分割
し、これを実際の試験の間に一緒にするのが有利である
。

こうして製造した診断剤は、試験すべき体液中に浸漬す
るか又は試験すべき体液に添加した後、エステル分解及
び／又は蛋白分解酵素、特に白血球酵素の存在を、発色
により迅速かつ簡単に検出することができ、その発色は
肉眼又は分光光度計で、例えば反射測光法で、すなわち
、キュベツト中で測定することができる。−細胞当たり
の白血球酵素の活性はほぼ一定のパラメータと見なされ
るので、試験する体液の白血球濃度を発色の強度から測
定することができる。これにより、本発明の診断剤を用
いて完全な白血球及び溶解した白血球を記録する。なぜ
ならば白血球酵素の活性は、白血球の溶解後でも完全に
保持されるからである。従って、溶解現象による誤差は
生じない。

下記の実施例は本発明を説明するためのものである。特
に断らない限り、量は重量部又は重量％を表すものとす
る。

合成例！ Ｎ−）シルーＬ−アラニルエステル このエステルは、それぞれの場合に、例えばＮ−トシル
−Ｌ−７ラニルクロリドを無水メチルエチルケトン又は
無水トルエン中で粉末炭酸カリウムの存在下でフェノー
ル類と反応させることによって製造した。約５５℃で６
〜１２時間攪拌した後、４０〜７０％のフェノールが反
応していた。フェノール：に２ＣＯ３：酸クロリドのモ
ル比は、通常１：１．５：１．５であった。　ｐＨ値は
、全反応期間を通じて約７であった。後処理のため、炭
酸カリウムを５０℃で枦去し、次に溶剤を真空中で蒸発
させた。生成物をシリカゲル−溶離剤（例えば石油エー
テル：アセトン−約９＝１）を用いてカラムクロマトグ
ラフィーし、その後、再結晶させることによって精製し
た。

−トシル−Ｌ−アラニン 文献；イーΦフィッシャー（Ｅ、　Ｆｉｓｃｈｅｒ）及
びダブリュー・リップシッツ（Ｗ、　Ｌｉｐｓｃｈｉｔ
ｚ）著。

ビイ（Ｂ、）第４８巻、３６２頁（１９１５年）Ｌ−ア
ラニア８３．７ｇ　（０，９３モル）を約２Ｎの水酸化
ナトリウム溶液４６５ｍ１に溶かす、この溶液にｐ−）
ルエンスルホニルクロリド１８６ｇ　（０，９７６モル
）を７０〜７２℃で２０分かけて少量ずつ添加する。ス
ルホニルクロリドの添加の間、自動滴定装置を用いて約
２Ｎの水酸化ナトリウム溶液で反応混合物をｐＨ１０に
保持する。ここにおいて、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液５
６０−が消費される０反応混合物のｐＨがもはや変化し
なくなったら、混合物を１５〜５℃に冷却し、３７％強
度の塩酸でｐＨ３にする０分離した生成物を吸引濾過し
、湿ったフィルターケーキを水２３５０−から再結晶さ
せる。

収量：融点１３２〜１３５℃のＬ　−ｐ　−トシルアラ
ニンｔ８５．５ｇ（理論量の８２％）。

−トシル−Ｌ−アラニル　ロリド ｐ−トシル−Ｌ−アラニン１５８．１ｇ（０，６５モル
）を４０℃の塩化チオニル３５〇−中で、澄明な溶液が
形成するまで、攪拌する。

過剰の塩化チオニルを水流ポンプの真空下に溜去する。

フラスコ内の残渣を蒸溜したトルエン３００−に取る。

得られる澄明で、わずかに黄色の溶液を攪拌したりプロ
イン９００−中に注ぐ。

酸クロリドが沈澱する。翌日、吸引濾過し、軽質ガソリ
ンで洗浄し、真空デシケータ中で塩化カルシウム／水酸
化カリウム上で乾燥した。

収量：融点８１〜８３℃のほとんど無色の結晶１５５ｇ
　（理論量の９１％）。

古 ５−ヒドロキシ−１，２−ベンゾイソチアゾール３．０
２ｇを無水メチルエチルケトン１５０−中で無水に２０
０３３ｇと共に攪拌しながら５５℃に加温する０合計６
ｇのＮ−１−シル−し一７ラニルクロリドを５５℃で６
時間かけて、充分攪拌しながら少量ずつ添加する。混合
物をその後、更に２時間５５℃で攪拌する。冷却後、Ｋ
、ＣＯ３を枦去し、次いで溶剤を回転蒸発器で蒸発させ
る。粗製生成物をシリカゲルカラムで高速液体クロマト
グラフィーによって精製した。溶離剤：ヘキサン：塩化
メチレン：ｎ−ブタノール−４０，８：１．所望の生成
物の検出：２５４ｎｍでのＵＶ、３Ｘ１００ｍｇ（７）
適用量に対して、合計１００ｍｇの５−　［Ｎ−（）ル
ｘ７−４”−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ］−１
，２−ベンゾイソチアゾールが単離された。

５−ヒドロキシ−インダゾール０．６ｇを４０℃で無水
ピリジン１．２ｇと一緒に無水塩化メチレン５０−に取
る。無水塩化メチレン２５ｓＪ中に溶解したＮ−１シル
−Ｌ−７ラニルクロリド１．５ｇを４０℃で３時間かけ
て滴加する。その後、混合物を４０℃で更に２時間攪拌
する。冷却後、塩化メチレン溶液を、２％クエン酸を毎
回１０〇−用いて３回洗浄する。ｔｈ！！化メチレン相
を硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤を枦去した後、室温
で真空中で蒸発させる。こうして得た残渣をシリカゲル
上でカラムクロマトグラフィーによって精製する。溶離
剤二石油エーテル：アセトン６二４゜溶剤を所望のフラ
クシ覆ンから蒸発させた後、０．４ｇの５−　［Ｎ−Ｄ
ルエンー４″−スルホニル）−Ｌ−７ラニルオキシ］−
インダゾールが得られる。

同様の方法で、一般式（■）の対応するヒドロキシベン
ゾイソチアゾール及びヒドロキシインダゾールを特定の
Ｎ−保護アミノ酸又は反応性アミノ酸誘導体と反応させ
ることによって下記の基質が得られる：　４−　［Ｎ−
（）ルエンー４″−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ
］−１，２−ベンゾイソチアゾール、４−　［Ｎ−（ト
ルエン−４″−スルホニル）−Ｌ−バリルオキシ］　−
１、２−ベンゾイソチアゾール、５−［Ｎ−（ｔ−ブチ
ルオキシカルボニル）−Ｌ−７ラニルオキシ］−１，２
−ベンゾイソチアゾール、６−［Ｎ−ベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アラニルオキシ］−インダゾール、５−
［Ｎ−メチルスルホニル−し−リジルオキシ］−インダ
ゾール、４−　［Ｎ−（４”−メトキシベンゼンスルホ
ニル）−Ｌ−アラニルオキシ］−インダゾール、５−［
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−〇−アセチルーＬ−チ
ロシルオキシ］−２，１−ベンゾイソチアゾール、５−
［Ｎ−ベンゼンスルホニル−Ｌ−フェニルアラニルオキ
シ］　−１、２−ベンゾイソチアゾール及び６−［Ｎ−
ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−バリルオキシ］−イン
ダゾール。

実施例１ ７戸紙［例えばイートン拳アンド・ダイクマン（Ｅａｔ
ｏｎ　ａｎｄ　Ｄｉｋｅｍａｎ）　２０５　］を下記の
溶液で順次含浸し、次いで６０℃で乾燥する。

症痙ユ ０．１モルのトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン緩衝液（ｐＨ８，４）、３％のポリビニルピロリド
ン及び２．５％のポリーＬ−フルギニン。

溶剤：水 症亘」 ７．５ｘｌＯ’モル／ｌの５−　［Ｎ−（）ルｚンー４
″−スルホニル）−Ｌ−７ラニルオキシ］−１，２−ベ
ンゾイソチアゾール及びｌＸｌ０−２モル／見の２．４
−ジメトキシーベンゼンジアゾニウムテトラヒドロフル
オボレート。

溶剤：無水アセトン 淡黄色試験紙が得られ、この濾紙は白血球を含む尿中に
浸漬したときに赤褐色に変色する。

実施例２ ５−　［Ｎ−（トルエン−４″−スルホニル）−Ｌ−７
ラニルオキシ］−１，２−ベンゾイソチアゾール５ＩＩ
ｇ、２．４−ジメトキシーベンゼンジアゾニウムテトラ
ヒドロフルオボレート５ｍｇ、燐酸二水素カリウム４履
ｇ、燐酸水素二ナトリウム２水和物８０鳳ｇ、ポリーＬ
−リジン６Ｉ１ｇ及びマンニット１１０ｍｇを含む錠剤
を、白血球を含む尿５−と混合する。尿試料は、赤褐色
に変色する。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）色原体酵素基質、（ｂ）ジアゾニウム塩、
   必要に応じて（ｃ）緩衝剤及び必要に応じて（ｄ）担体
   及び／又は常用の添加剤を含むエステル分解及び／又は
   蛋白分解酵素の検出試薬において、色原体酵素基質が 一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中Ｘ＿１は窒素又は硫黄を表し；Ｘ＿２は窒素を表
   し；Ｒ＿１、Ｒ＿２及びＲ＿３は水素を表し；Ａはグリ
   シン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フ
   ェニルアラニン、チロシン及びリジンから選ばれるアミ
   ノ酸基又は該アミノ酸２〜８個からなるペプチド基を表
   し；Ｇは水素又はアルキル−、アリール−及びアルアル
   キル−オキシカルボニル基、アルキル−及びアルアルキ
   ル−オキシチオカルボニル基、アルキル−、アリール−
   及びアルアルキル−スルホニルもしくは−スルフェニル
   基、ビニルオキシカルボニル基、シクロヘキセニルオキ
   シカルボニル基、ホスホリル基並びにカルバミル基から
   選ばれる窒素保護基を表す］の化合物の少なくとも一つ
   であることを特徴とするエステル分解及び／又は蛋白分
   解酵素の検出試薬。
2. （２）一般式におけるＸ＿１が硫黄を表す特許請求の範
   囲第１項記載の検出試薬。
3. （３）一般式におけるエステル基が５位に存在する特許
   請求の範囲第１項又は第２項記載の検出試薬。