JPH03244396A

JPH03244396A - 加水分解酵素の検出方法およびそれに使用する検出器具

Info

Publication number: JPH03244396A
Application number: JP2041130A
Authority: JP
Inventors: Tetsuaki Kawanishi; 徹朗川西; Hiroyuki Asai; 裕之浅井; Hiroshi Suzuki; 宏鈴木
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1990-02-23
Filing date: 1990-02-23
Publication date: 1991-10-31

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、加水分解酵素の改良された検出方法およびそ
れに使用する検出試験片および検出器具に関する。

本発明の検出方法および検出器具は、加水分解酵素、特
に白血球中のエステラーゼまたはプロテアーゼの検出に
好適に利用される。

〔従来の技術〕

尿中に出現する白血球の量は、腎・尿路感染症の診断の
指標とな゛る”。さらに腹膜透析液中の白血球のモニタ
リングは、腹膜炎の早期発見の指標となる。これらの白
血球の検出は従来鏡検によって行われていたが、この方
法は高価な機器を必要とする、長い測定時間を必要とす
る、複雑な７１−１定操作を必要とする等の欠点を有し
ている。このような問題点を解決するため、白血球中の
エステラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素を指標と
した検出法が普及してきた。この方法では、容易な操作
でしかも短時間で結果が得られる。また、酵素活性を指
標とするため崩壊した白血球も検出可能である。すでに
（Ａ）酵素基質としてフェノキシアミノ酸エステルを、
顕色剤としてジアゾニウム塩を含有する、蛋白質分解酵
素の検出法（特公昭６１−４５９８２）、（Ｂ）インド
キシル−アミノ酸エステル及びペプチドエステルを色原
体として含合する、エステル及び蛋白質分解酵素の検出
法（特公昭５９−３４７５）　、（Ｃ）５−フェニルピ
ロールエステルを用いた加水分解対象物の検出法（特公
昭６２４１７１０）が知られている。しかしながらこれ
らの方法においても、使用する試薬が高価である、呈色
安定性に欠ける、感度が悪い等の問題点を有している。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、対象とする加水分解酵素に対して特異
性が高く、良好な呈色を示す基質を用いた加水分解酵素
の検出方法およびそれに使用する検出試験片ならびに検
出器具を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的は、以下の本発明によって達成される。

基質および金属イオンと加水分解酵素を含む試料溶液と
を溶解させてキレート呈色させた該溶液の色調の変化に
より試料中の加水分解酵素の存在を検出する方法におい
て、基゛・質として、ＨＲ３（式中Ａはアミノ酸残基または２〜５個のアミノ酸から
なるペプチド残基を示し、′Ｂはアミノ保護基を示し、
Ｒ，ＲおよびＲ３′はそれぞれ２水素、ハロゲン、アルキル、アリール、アルコキシ、ア
シル、アミド、ニトロまたはアルキルメルカプトを示し
、あるいはＲ１とＲ２が一緒になってそれらが結合して
いるベンゼン環とともに縮合芳香族環を示し、Ｘは式で
表わされるアゾレゾルシノールエステル誘導体を使用す
る・・ことからなる方法。

２）基質および金属塩を担持させた吸水性担体からなる
加水分解酵素検出試験片において基質が１項に記載のア
ゾレゾルシノールエステル誘導体からなることを特徴と
する検出試験片。

３）金属塩が銅、亜鉛、ニッケル、鉄またはコバルトの
ハロゲン化物である２項に記載の検出試験片。

４）吸水性担体がろ紙または布帛である２項または３項
に記載の検出試験片。

５）吸水性担持体に界面活性剤または湿潤剤１を添加し
、てなる′２項に記載の・検出試験片。

６）対象の加水分解酵素の反応に適するｐＨを有する緩
衝剤を添加してなる２項に記載の検出試験片。

７）２項に記載の検出試験片を支持体に固定してなる加
水分解酵素検出器具。

上記式（１）において、Ａはアミノ酸残基または２〜５
個のアミノ酸からなるペプチド残基を示す。アミノ酸残
基は、Ｌ−またはＤ−型またはラセミ形のα−アミノ酸
の残基が望ましく、特にグリシン、アラニン、バリン、
ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン
の残基が好ましい。上記アミノ酸は場合によって存在す
る遊離ヒドロキシル基はアシル化特にアセチル化されて
いてもよい。ペプチド残基は、上記アミノ酸の２〜５個
が結合したものが望ましい。

Ｂはアミノ保護基を示し、例として、アシル、オキシカ
ルボニル、チオカルボニル、スルホニル、スルフェニル
、ビニル、シクロへキセニル、ホスホリルまたはカルバ
モイル基かあげられる。

Ｒ１−Ｒ３の定義におけるハロゲンとは、フッ素、塩素
、臭素およびヨウ素であり、特に塩素および臭素が好ま
しい。Ｒ１−Ｒ３の定義におけるアルキル、アルコキシ
、アシル、アルキルメルカプト基は炭素原子１〜５個を
有するものが望ましい。

本発明において基質として用いられるアゾレゾルシノー
ルエステル誘導体（１）は新規化合物であって、式（旧ＨＲ３（式中Ｒ１〜Ｒ３は前述したものと同一意義を有する）を有するレゾルシノール誘導体と式　　　Ｘ−Ｎ２Ｎ”　Ｙ　　　　　　　　　　　　　
（ＩＩＩ）（式中Ｙは安定性アニオンを示し、Ｘは前述
したものと同一意義を有する）を有するジアゾ化合物とをカップリングさせてＨＲ３を有するアゾレゾルシノールエステル誘導体を得、つい
てこれを式（Ｖ）ＨＯ−Ａ−Ｂ　　　　　　　　　　　（Ｖ）（式中Ａお
よびＢは前述したものと同一意義を有する）を有するアミノ酸またはペプタイド化合物あるいは適当
なそれらの反応性誘導体とをペプチド化学に慣用の方法
で反応させることによって得られる。

反応性誘導体としては例えば、酸クロリド、クロルギ酸
エチルエステル、活性エステルが使用される。

上記反応において、レゾルシノール誘導体（ＩＩ）とジ
アゾ化合物（ｍ）との反応は、ピリジン、アルカリ水溶
液のような溶媒中、０〜ｌＯ℃で１〜２時間両化合物を
接触させることによって実施される。反応終了後、反応
混合物から常法に従ってアゾレゾルシノールエステル誘
導体（ＩＶ）を採取し、必要により精製する。例えば再
結晶によって化合物（ＩＶ）を反応混合物中から採取す
る。アゾレゾルシノール誘導体（ＩＶ）とアミノ酸また
はペプタイド化合物（Ｖ）との反応は、塩化メチレン、
テトラヒドロフランのような溶媒中、０〜２５℃で５〜
１０時間両化合物を接触させることによって実施される
。反応終了後、所望の生成物（１）は常法に従って反応
混合物中から採取され、精製される。

例えば、反応混合物をシリカケルを担体とするカラムク
ロマトグラフに供することによって所望の生成物を採取
する。

本発明におけるアゾレゾルシノールエステル誘導体（１
）の好適な例としては次のものがあげられる。

２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−１−ルエンスルホニル
ーＬ−アラニルオキシ）チアゾリルアゾベンゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
し−アラニルオキシ）−６−メドキシチアゾリルアゾベ
ンゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
Ｌ−アラニルオキシ）−６−アセチルチアゾリルアゾベ
ンゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルー
Ｌ−アラニルオキシ）−６−クロロチアゾリルアゾベン
ゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
し−アラニルオキシ）ピリジルアゾベンゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
し−アラニルオキシ）−６−メドキシピリジルアゾベン
ゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルー
Ｌ−アラニルオキシ）−６−アセチルピリジルアゾベン
ゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
し−アラニルオキシ）−６−クロロピリジルアゾベンゼ
ン〔作　　用〕本発明で使用されるアゾレゾルシノールエステル誘導体
（１）は、エステラーゼ、プロテアーゼ等加水分解酵素
、特に好中球−顆粒球中に存在するものに特異性が高い
。上記の化合物は、加水分解酵素によって式（式中Ｒ１〜Ｒ３意義を有する）およびＸは前述したものと同一に変換され、このものは金属イオンと反応してキレート
化合物を生成し、呈色する。例えばＸが式）と下記のキレート化合物を生成する。

酵素切断前のエステル基質も金属と反応してキレート化
合物を生成し、呈色するが酵素反応後のレゾルシノール
型がつくるキレート化合物と波長が異なるので、色の変
化として識別することができる。多くはオレンジ色から
赤色系の呈色変化となる。この呈色の変化を目視で読み
取ったり、分光光度計にて吸光度を測定することにより
、加水分解酵素の検出および定量が可能である。

本発明のアゾレゾルシノールエステル誘導体を用いて、
加水分解酵素を測定するに際しては、□上記化合物を基
質として含有し、場合によっては緩衝剤やその他の反応
助剤を含有する溶液と、被測定試料と混合し反応させる
。その後、金属イオンを加えてキレート呈色させた後、
溶液の色調変化を目視ないしは、分光光度計による透過
吸光度の測定によって読み取る。また、基質、金属イオ
ン、緩衝剤とその他の反応助剤を適当な担体に眼前した
試験具を用いることによって、より簡便な操作で測定が
可能となる。この場合被測定試料は該試験具の上に滴下
するか、該試験具を被測定溶液中に浸漬した後、色調変
化を目視ないしは、分光光度計による反射吸光度の測定
によって読み取る。

金属イオンとしては、Ｃｕ２＋、　Ｚ　ｎ”、　Ｎ　ｉ
　２”Ｆｅ”　　Ｆｅ”　　Ｃｏ　　、Ｃｄ２＋等があ
げられ、２＋塩化物等の形で添加するのが好ましい。

金属塩の添加濃度は、対象酵素に対して阻害活性を有し
ない濃度、好ましくは浸漬液中１〜ｌＯｄで用いる。

また、湿潤剤、界面活性剤としては、トリトン、ラウリ
ル硫酸ナトリウム、スパン、トウイーン、ポリビニルピ
ロリドン、ポリエチレングリコール、高級アルコール類
、エーテルアルコール類等があげられ、好ましくは、炭
素□数８〜１２の直鎖アルコール、炭素数８〜１５のエ
ーテル結合を含む直鎖のアルコールが用いられる。

検出対象の加水分解酵素の反応に適するＩ）Ｉ＋を有す
る緩衝剤としては、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、トリ
ス緩衝剤、クエン酸緩衝剤等が用いられる。

実際の測定においては、測定器具を試料溶液中に浸漬す
るか、試料溶液をｎ１定器具上に滴下した後、色調変化
を目視ないしは、分光光度計にて試験紙表面の反射吸光
度を測定することによって読み取る。

次に参考例、実施例および試験例を示して本発明をさら
に具体的に説明する。

〔参　考　例〕

２−チアゾリルアゾレゾルシノールの合成２−アミノチ
アゾール２．Ｏｇ　（２０，０１＋ａｏｌ）、ｎ−ブチ
ルニトリル２．６ｍｌ　（２２，０＋ｍｏｌ）を乾燥エ
ーテル１５ｍ１に溶解し、８５８ｍｇ　（２２，０ｇｏ
＋ｏｌ）のナトリウムアミドを加え撹拌すると発熱し反
応する。

発熱終了後、更に１時間加熱還流する。生した沈殿を濾
過し、乾燥してチアゾールジアゾ化合物を得た。これを
エタノール１０ｍ１に溶解せしめ、レゾルシノール１．
９８　（１８ａｓｏｌ）を加え、室温で２０時間撹拌反
応した。反応混合物を蒸発乾固し、エーテルより再結晶
を行い目的物２．９６ｇ　（ＩＬ４ｓｓｏｌ）を得た。

２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルー
Ｌ−アラニルオキシ）チアゾリルアゾベンゼンの合成２−チアゾリルアゾレゾルシノール３００ｇ＋ｇ（１，
４１１０１）　、Ｎ　−１）　−）ルエンスルホニルー
Ｌ−アラニン３６５ｔａｇ（Ｌ、５ｔｉｔｓｏ１）　、
ジメチルアミノピリジンＳ１ｍｇ（０，５＋＋ｍｏｌ）
をテトラヒドロフラン５．０ｍｌに溶解し、０℃で撹拌
しながら、ジシクロへキシルカルボジイミド３０９ＩＩ
ｇ（１，５ｍｍｏｌ）を加えて１時間反応後、更に室温
で５時間撹拌反応を続ける。反応混合物を吸引濾過して
生成した尿素を除去した後、濾液を減圧濃縮し粗生成物
を得た。これを、酢酸エチル３／ｎ−ヘキサン７を溶出
溶媒とするシリカゲルフラッシュクロマトグラフに供し
、目的物４９１ｍｇ（１，１ｓ＋５ｏｌ）を得た。

同様にして、２−アミノチアゾールの代わりに２−アミ
ノピリジンを用いることによりピリジルアゾレルシノー
ルエステルが、またレゾルシノールの代わりに置換フェ
ノールを用いることにより該当するアゾレゾルシノール
エステル誘導体が得られる。

実施例　１本発明で用いるアゾレゾルシノールエステル誘導体（Ｉ
）の呈色試験を種々の金属を用いて行った。

〈方　法〉０．１Ｍボラックスー塩酸緩衝液（ｐＨ−８，０）中に
、２５０ｍＭアゾレゾルシノールエステル誘導体（アル
コールに溶解）、５００ｆｆ１Ｍ金属塩（全て塩化物）
を添加し反応させた後、溶液の吸光度を測定した。

吸光度測定は、分光光度計Ｕ−２０００（日立製作所源
）にて行った。結果を表１に示す。

表＊１ＴＡＲ：チアゾリルアゾレゾルシノール＊２ＰＡＲ
：ピリジルアゾレゾルシノールλ　　は極大吸収波長（
ｎｍ）、ＡＢＳはその波ａＸ長での吸光度（＋ｗｏｌ−１・ｃｍ−１＞を示す実施例
　２濾紙（アトバンチツクＮｏ、　１６５０）を、２．ｈＭ
塩化亜鉛を含有する２００５Ｍボラックスー塩酸緩衝液
（ｐＨ＝８．０）に含浸し、６０℃で５０分間通風乾燥
した。

更にこの濾紙を、１．５ｍＭの基質、２％エチレングリ
コールモノヘキシルエーテルを含有するアセトン溶液に
含浸し、４０℃で２０分間通風乾燥した。

これを５ｍｍＸ５關に切断し、末梢血より常法で単離し
た顆粒球画分のリン酸緩衝懸濁液（２００個／ｍ）を滴
下し、３分後の試験紙表面の呈色変化を反射吸光度の測
定によって観察した。測定′は大塚電子のＭＣＰＤ−２
００を用いて行った。結果を表２に示す。

〔効　　果〕

前記式（１）を有するアゾレゾルシノールエステル誘導
体を基質として使用する本発明の加水分解酵素検出方法
および検出器具は、種々の試料中の加水分解酵素、特に
白血球中のエステラーゼまたはプロテアーゼの種々にａ
利に使用される。

従って本発明の検出方法および検出器具は、尿や体液中
の白血球の検出あるいは定量に利用され、腎・尿路感染
症の診断に好適に使用される。

Claims

【特許請求の範囲】１）基質および金属イオンと加水分解酵素を含む試料溶
液とを混合させてキレート呈色させ該溶液の色調の変化
により試料中の加水分解酵素の存在を検出する方法にお
いて、基質として、式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）（式中Ａはアミノ酸残基または２〜５個のアミノ酸から
なるペプチド残基を示し、Ｂはアミノ保護基を示し、Ｒ
＿１、Ｒ＿２およびＲ＿３はそれぞれ水素、ハロゲン、
アルキル、アリール、アルコキシ、アシル、アミド、ニ
トロまたはアルキルメルカプトを示し、あるいはＲ＿１
とＲ＿２が一緒になってそれらが結合しているベンゼン
環とともに縮合芳香族環を示し、Ｘは式▲数式、化学式
、表等があります▼ または▲数式、化学式、表等があります▼を有する基を
示す）で表わされるアゾレゾルシノールエステル誘導体を使用
することからなる方法。２）基質および金属塩を担持させた吸水性担体からなる
加水分解酵素検出試験片において基質が請求項１に記載
のアゾレゾルシノールエステル誘導体からなることを特
徴とする検出試験片。３）金属塩が銅、亜鉛、ニッケル、鉄またはコバルトの
ハロゲン化物である請求項２に記載の検出試験片。４）吸水性担体がろ紙または布帛である請求項２または
３に記載の検出試験片。５）吸水性担持体に界面活性剤または湿潤剤を添加して
なる請求項２に記載の検出試験片。６）対象の加水分解酵素の反応に適するｐＨを有する緩
衝剤を添加してなる請求項２に記載の検出試験片。７）請求項２に記載の検出試験片を支持体に固定してな
る加水分解酵素検出器具。