JPH03246285A

JPH03246285A - アゾレゾルシノールエステル誘導体および加水分解酵素基質

Info

Publication number: JPH03246285A
Application number: JP2041129A
Authority: JP
Inventors: Tetsuaki Kawanishi; 徹朗川西; Hiroyuki Asai; 裕之浅井; Hiroshi Suzuki; 宏鈴木
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1990-02-23
Filing date: 1990-02-23
Publication date: 1991-11-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規なアゾレゾルシノールエステル誘導体お
よびそれからなる加水分解酵素基質に関する。

本発明の酵素基質は、加水分解酵素、特に白血球中のエ
ステラーゼまたはプロテアーゼの検出に好適に利用され
る。

〔従来の技術〕

尿中に出現する白血球の量は、腎・尿路感染症の診断の
指標となる。さらに腹膜透析液中の白血球のモニタリン
グは、腹膜炎の早期発見の指標となる。これらの白血球
の検出は従来鏡検によって行われていたが、この方法は
高価な機器を必要とする、長い測定時間を必要とする、
複雑な測定操作を必要とする等の欠点を有している。こ
のような問題点を解決するため、白血球中のエステラー
ゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素を指標とした検出法
が普及してきた。この方法では、容易な操作でしかも短
時間で結果が得られる。また、酵素活性を指標とするた
め崩壊した白血球も検出可能である。すでに（Ａ）酵素
基質としてフェノキシアミノ酸エステルを、顕色剤とし
てジアゾニウム塩を含有する、蛋白質分解酵素の検出法
（特公昭６１−４５９８２）、（Ｂ）インドキシル−ア
ミノ酸エステル及びペプチドエステルを色原体として含
有する、エステル及び蛋白質分解酵素の検出法（特公昭
５９−３４７５）　、（Ｃ）５−フェニルピロールエス
テルを用いた加水分解対象物の検出法（特公昭６２−４
１７１０）が知られている。しかしながらこれらの方法
においても、使用する試薬が高価である、呈色安定性に
欠ける、感度が悪い等の問題点を有している。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、対象とする加水分解酵素に対して特異
性が高く、良好な呈色を示す基質を提供することにある
。

〔課題を解決するための手段〕上記目的は、以下の本発明によって達成される。

ＨＲ３（式中Ａはアミノ酸残基または２〜５個のアミノ酸から
なるペプチド残基を示し、Ｂはアミノ保護基を示し、Ｒ
，ＲおよびＲ３はそれぞれ２水素、ハロゲン、アルキル、アリール、アルコキシ、ア
シル、アミド、ニトロまたはアルキルメルカプトを示し
、あるいはＲ１とＲ２が一緒になってそれらが結合して
いるベンゼン環ととへで表わされるアゾレゾルシノールエステル誘導体。

２）１項に記載の式（Ｉ）で表わされるアゾレゾルシノ
ールエステル誘導体からなる加水分解酵素基質。

上記式（Ｉ）において、Ａはアミノ酸残基または２〜５
個のアミノ酸からなるペプチド残基を示す。アミノ酸残
基は、Ｌ−またはＤ−型またはラセミ形のα−アミノ酸
の残基が望ましく、特にグリシン、アラニン、バリン、
ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン
の残基が好ましい。上記アミノ酸は場合によって存在す
る遊離ヒドロキシル基はアシル化特にアセチル化されて
いてもよい。ペプチド残基は、上記アミノ酸の２〜５個
が結合したものが望ましい。

Ｂはアミノ保護基を示し、例として、アシル、オキシカ
ルボニル、チオカルボニル、スルホニル、スルフェニル
、ビニル、シクロへキセニル、ホスホリルまたはカルバ
モイル基があげられる。

Ｒ１−Ｒ３の定義における１１０ゲンとは、フッ素、塩
素、臭素およびヨウ素であり、特に塩素および臭素が好
ましい。Ｒ１−Ｒ３の定義におけるアルキル、アルコキ
シ、アシル、アルキルメルカプト基は炭素原子１〜５個
を有するものが望ましい。

本発明の式（Ｉ）を有するアゾレゾルシノールエステル
誘導体は新規化合物であって、式（ｎ）ＨＲ３（式中Ｒ１〜Ｒ３は前述したものと同一意義を有する）を有するレゾルシノール誘導体と式　　　Ｘ−ＮＥＮ　　Ｙ　　　　　　　　　　　　　
（ｍ）（式中Ｙは安定性アニオンを示し、Ｘは前述した
ものと同一意義を有する）を有するジアゾ化合物とをカップリングさせてＨＲ３を有するアゾレゾルシノールエステル誘導体を得、つい
でこれを式（Ｖ）ＨＯ−Ａ−Ｂ　　　　　　　　　　　（Ｖ）（式中Ａお
よびＢは前述したものと同一意義を有する）を有するアミノ酸またはペブタイド化合物あるいは適当
なそれらの反応性誘導体とをペプチド化学に慣用の方法
で反応させることによって得られる。

反応性誘導体としては例えば、酸クロリド、クロルギ酸
エチルエステル、活性エステルが使用される。

上記反応において、レゾルシノール誘導体（ｎ）とジア
ゾ化合物（ｍ）との反応は、ピリジン、アルカリ水溶液
のような溶媒中、０〜１０℃で１〜２時間両化合物を接
触させることによって実施される。反応終了後、反応混
合物から常法に従ってアゾレゾルシノールエステル誘導
体（ＩＶ）を採取し、必要により精製する。例えば再結
晶によって化合物（ｒＶ）を反応混合物中から採取する
。アゾレゾルシノール誘導体（ｒＶ）とアミノ酸または
ペブタイド化合物（Ｖ）との反応は、塩化メチレン、テ
トラヒドロフランのような溶媒中、０〜２５℃で５〜Ｉ
Ｏ時間両化合物を接触させることによって実施される。

反応終了後、所望の生成物（Ｉ）は常法に従って反応混
合物中から採取し、精製する。

例えば、反応混合物をシリカゲルを担体とするカラムク
ロマトグラフに供することによって所望の生成物を採取
する。

本発明におけるアゾレゾルシノールエステル誘導体（Ｉ
）の好適な例としては次のものがあげられる。

２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルー
Ｌ−アラニルオキシ）チアゾリルアゾベンゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
し−アラニルオキシ）−６−メドキシチアゾリルアゾベ
ンゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
し−アラニルオキシ）−６−アセチルチアゾリルアゾベ
ンゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
し−アラニルオキシ）−６−クロロチアゾリルアゾベン
ゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルー
Ｌ−アラニルオキシ）ピリジルアゾベンゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルー
Ｌ〜アラニルオキシ）−６−メドキシピリジルアゾベン
ゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルー
Ｌ−アラニルオキシ）−６−アセチルピリジルアゾベン
ゼン２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルー
Ｌ−アラニルオキシ）−６−クロロピリジルアゾベンゼ
ン〔作　　用〕本発明のアゾレゾルシノールエステル誘導体は、エステ
ラーゼ、プロテアーゼ等加水分解酵素、特に好中球−顆
粒球中に存在するものに特異性が高い。本発明の化合物
は、加水分解酵素によって式（式中Ｒ１〜Ｒ３およびＸは前述したものと同一意義を
有する）に変換され、このものは金属イオンと反応してキレート
化合物を生成し、呈色する。例えばＸが式（Ｍｅｔ）と下記のキレート化合物を生成する。

酵素切断前のエステル基質も金属と反応してキレート化
合物を生成し、呈色するが酵素反応後のレゾルシノール
型がつくるキレート化合物と波長が異なるので、色の変
化として識別することができる。多くはオレンジ色から
赤色系の呈色変化となる。この呈色の変化を目視で読み
取ったり、分光光度計にて吸光度を測定することにより
、加水分解酵素の定量が可能である。

本発明のアゾレゾルシノールエステル誘導体を用いて、
加水分解酵素を測定するに際しては、上記化合物を基質
として含有し、場合によっては緩衝剤やその他の反応助
剤を含有する溶液と、被測定試料とを混合して反応させ
る。その後、金属イオンを加えてキレート呈色させた後
、溶液の色調変化を目視ないしは、分光光度計による透
過吸光度の測定によって読み取る。また、基質、金属イ
オン、緩衝剤とその他の反応助剤を適当な担体に吸着し
た試験具を用いることによって、より簡便な操作で測定
が可能となる。この場合被測定試料は該試験具の上に滴
下するか、該試験具を被１１３定溶液中に浸漬した後、
色調変化を目視ないしは、分光光度計による反射吸光度
の測定によって読み取る。

金属イオンとしては、Ｃｕ　”、　　Ｚ　ｎ　””、　
Ｎ　ｉ　２”Ｆｅ２＋　Ｆｅ３＋　Ｃｏ２＋　Ｃｄ２＋
等があげられ、塩化物等の形で添加するのが好ましい。

次に実施例および試験例を示して本発明をさらに具体的
に説明する。

実施例　１２−チアゾリルアゾレゾルシノールの合成２−アミノチ
アゾール２．０ｇ　（２０，０ｓｓｏｌ）、ｎ−ブチル
ニトリル２．８ｍｌ　（２２，０ｓｓｏｌ）を乾燥エー
テル１５ｍ１に溶解し、ｌ１１５ｇｍｇ　（２２，０ｓ
ｓｏｌ）のナトリウムアミドを加え撹拌すると発熱し反
応する。

発熱終了後、更に１時間加熱還流する。生じた沈殿を濾
過し、乾燥してチアゾールジアゾ化合物を得た。これを
エタノール１０ｍ１に溶解せしめ、レゾルシノール１．
９８（１８８ｓｓｏｌを加え、室温で２０時間撹拌反応
した。反応混合物を蒸発乾固し、エーテルより再結晶を
行い目的物２．９６ｇ　（１３，４ａ＋ｍｏｌ）を得た
。

２−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−
し−アラニルオキシ）チアゾリルアゾベンゼンの合成２−チアゾリルアゾレゾルシノール３００ｍｇ（１，４
ｍｔａｏＩ）　ｓ　Ｎ　−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ
〜アラニン３Ｂ５ｍｇ（１，５ｓｓｏｌ）　、ジメチル
アミノピリジン６１ｍｇ（０，５ｇｍｏｌ）をテトラヒ
ドロフラン５．０ｍｌに溶解し、０℃で撹拌しながら、
ジシクロへキシルカルボジイミド３０９■（１，５＋ａ
＋＋＋ｏｌ）を加えて１時間反応後、更に室温で５時間
撹拌反応を続ける。反応混合物を吸引濾過して生成した
尿素を除去した後、濾液を減圧濃縮し粗生成物を得た。

これを、酢酸エチル３　／　ｎ−ヘキサン７を溶出溶媒
とするシリカゲルフラッシュクロマトグラフに供し、目
的物４９１■（１，１ｇｍｏｌ）を得た。

同様にして、２−アミノチアゾールの代わりに２−アミ
ノピリジンを用いることによりビリジルアゾレルシノー
ルエステルが、またレゾルシノールの代わりに置換フェ
ノールを用いることにより相当するアゾレゾルシノール
エステル誘導体が得られる。

試験例　１本発明のアゾレゾルシノールエステル誘導体の呈色試験
を種々の金属を用いて行った。

〈方　法〉０．１Ｍボラックスー塩酸緩衝液（ｐＨ−８，０）中に
、２５０＋１Ｍアゾレゾルシノールエステル誘導体（ア
ルコールに溶解）　、５００ｍＭ金属ＦＡ（全て塩化物
）を添加し反応させた後、溶液の吸光度を測定した。

吸光度測定は、分光光度計Ｕ　−２０００（日立製作所
製）にて行った。

結果を表１に示す。

表ＨＴＡＲ：チアゾリルアゾレゾルシノール＊２ＰＡＲ：
ビリジルアゾレゾルシノールλ　　は極大吸収波長（ｎ
Ｉｌ）、ＡＢＳはその波ｌａＸ長での吸光度（ＩＩｏｌ−’　・ｃｍ−’）を示す試験
例　２１０ｄ基質（ジメチルスルホキシド溶液にて添加）を含
有する１００＋ｅＭボラックスー塩酸緩衝液（ｐＨ−８
，０）　２．０ｍｌに、末梢血より常法で分離した１０
００個／パ顆粒球画分のリン酸緩衝懸濁液２００Δを加
えて３７℃でｌＯ分反応後、５０ｍＭ塩化亜鉛水溶液１
．０ｍｌを添加し１分間攪拌反応させ、反応溶液の５０
０１１吸光度を分光光度計Ｕ　−２０００（日立製作所
製）にて測定した。結果を表２に示す。

〔効　　果〕

前記式（Ｉ）を有するアゾレゾルシノールエステル誘導
体は、加水分解酵素、特に白血球中のエステラーゼまた
はプロテアーゼの検出のための基質として有用である。

従って本発明の化合物は尿や体液中の白血球の検出ある
いは定量に利用され、腎・尿路感染症の診断に有利に使
用される。

Claims

【特許請求の範囲】１）式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）（式中Ａはアミノ酸残基または２〜５個のアミノ酸から
なるペプチド残基を示し、Ｂはアミノ保護基を示し、Ｒ
＿１、Ｒ＿２およびＲ＿３はそれぞれ水素、ハロゲン、
アルキル、アリール、アルコキシ、アシル、アミド、ニ
トロまたはアルキルメルカプトを示し、あるいはＲ＿１
とＲ＿２が一緒になってそれらが結合しているベンゼン
環とともに縮合芳香族環を示し、Ｘは式▲数式、化学式
、表等があります▼ または▲数式、化学式、表等があります▼を有する基を
示す）で表わされるアゾレゾルシノールエステル誘導体。２）請求項１に記載の式（ I ）で表わされるアゾレゾ
ルシノールエステル誘導体からなる加水分解酵素基質。