JPS6126917B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は式()で示されるアミノ酸導体及びそ
の化合物を基質として酵素活性を測定する方法に
関する。 （式中R₁は水素、又はベンゾイル基を表わ
し、R₂はナフチル基を表わし、そしてバリン部
分はＤ体またはＬ体を表わし、ロイシン部分はＬ
体を表わし、およびリジン部分はＬ体を表わ
す。） 本発明物質()は新規な化合物であり、酵素活
性を測定するための試験薬として有用な化合物で
ある。 本発明物質()は化合物()とリジン誘導体
()との通常の脱水縮合反応により式()で示さ
れる化合物とし、次いでアミノ基保護基を除去す
ることにより製造することができる。 式中、R₂はナフチルを表わし、R₃はベンゾイ
ル、又はアミノ基保護基を表わし、R₄はアミノ
基保護基を表わす。 尚、化合物()は()と()を縮合し()を得、
次いでエステルを水解することによつて得ること
ができる。 リジン誘導体()は適当な保護基を有するリジ
ン誘導体()をナフチル化して化合物()とし、
次いでα位のみ選択的保護基とに脱離することに
より得ることができる。 式中R₅はR₄と異るアミノ基保護基を表わす。 次に上記製造方法を更に詳細に説明する。 化合物()を製造するにあたつては、化合物
()およびリジン誘導体()を適当な溶媒に溶解
し、DCC（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、
DPPA（ジフエニルフオスフオリルアジド）、ク
ロル炭酸アルキル等、通常用いられるエステル活
性化剤を加え、必要に応じトリエチルアミン等の
塩基を加え、かくはんすることにより製造するこ
とができる。 使用し得る溶媒は、クロロホルム、ジクロルメ
タン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラ
ン等通常使用されるもので、原料物質を溶解する
ものであれば良い。反応温度は０゜〜40℃で良
い。 反応終了後、通常行われる処理方法により、反
応液より化合物()を得ることができる。すなわ
ち、例えば、DCCをエステル活性化剤として用
いた場合、析出してくるDCU（ジシクロヘキシ
ル尿素）を、ろ過して除き、ろ液に酢酸エチルエ
ステル等の適当な抽出溶媒を加え、クエン酸水溶
液、飽和重そう水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫
酸マグネシウム等の乾燥剤で乾燥後、溶媒を留去
することにより化合物()を得ることができる。 化合物()より目的化合物()を製造する場合
のアミノ基保護基を除去するには通常の反応でよ
い。すなわち、例えばアミノ基保護基がベンジル
オキシカルボニル基の場合、化合物()を適当な
溶媒に溶解しパラジウム炭素等の触媒で還元的に
除去するか、化合物()を臭化水素酢酸溶液に加
え析出する目的化合物の臭化水素酸塩を取する
ことにより得ることができる。 本発明物質()は、酵素と接触させることによ
り基質として働き、一定時間後酵素により水解さ
れて遊離したナフトールを測定することにより、
酵素の活性を測定することが出来る。酵素の活性
を測定するということは酵素製剤の規格、定量、
血中酵素パターンの測定による診断、血中、又は
尿中酵素濃度の測定による診断等の為に非常に重
要なことである。 従来、酵素活性を測定するためには種々の方法
が知られている。その一つの方法として、アミノ
酸のアルキルエステルを基質として、酵素と反応
させ、そのエステルの水解の程度により活性を測
定するという方法がある。例えば、ヘステリン法
として良く知られている方法がその一つである。
これは、酵素とアミノ酸のアルキルエステルを反
応させ、一定時間後に残存するエステル部分をヒ
ドロキシルアミンによりヒドロキサム酸とし、過
クロル鉄と反応させ発色させ、その発色を吸光度
として測定し、その結果より、酵素のエステル水
解能、すなわち、酵素の活性を測定するという方
法である。 その他、アミノ酸のパラニトロアニリドを基質
として用い、その水解能を指標として測定する方
法があるがこれらの方法では、ある程度の酵素量
を必要とし、酵素が低濃度である場合、又は低活
性の酵素の測定には難があつた。そこで、発明者
は、酵素に対してアフイニテイを持ち、更に定量
法が簡便であり、かつ検出感度の良いという三つ
の条件を兼ね備えた基質としての化合物を検索す
ることにより、従来よりも、非常に優れた化合
物、及びその方法を見出すことができた。 本発明を実施するに当つては、酵素と一定量の
化合物()を、適当な緩衝液中で接触させ、一定
温度で、一定時間後に遊離したナフトールを測定
することにより、酵素の活性を測定することがで
きる。 緩衝液はその酵素の至適PHを有する適当な緩衝
液でよい。又、反応温度、反応時間ともに適当な
一定条件でよいが、25〜37℃で30分後に測定する
のが望ましい。 ナフトールを測定する方法は従来、良く知られ
たガスクロマトグラフイーまたは薄層クロマトグ
ラフイー等の物理化学的方法、過クロル鉄反応、
ジアゾカツプリング反応、FVB（フアーストバ
イオレツトＢソルト）法等の化学的方法のいずれ
の方法を使用してもよいが、反応液にFVBを加
え発色させ分光光度計により吸光度として測定す
る方法がその簡便さおよび検出感度においてより
好ましい方法である。本発明物質はトリプシン、
プラスシン、カリクレイン、ウロキナーゼ、C1
エステラーゼ、スロンビン等、種々の酵素の優れ
た基質として作用する例えば、この方法によりバ
リルロイシルリジンナフチルエステルを基質とし
てプラスミンの活性を測定した場合、従来、その
基質として知られたバリルロイシルリジンパラニ
トロアニリドを用いて測定した場合に比べ15倍の
検出感度を有していた。又、トシルアルギニンメ
チルエステルを用いて測定した場合にくらべ約62
倍の検出感度を有していた。 この方法によれば、低濃度または低活性の酵素
の定量、血中又は尿中酵素濃度の測定を行なうこ
とができる。次に実施例をあげ本発明をさらに詳
細に説明する。 実施例 １ Ｄ―バリル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―リジン―１―
ナフチルエステル二塩酸塩の製法 ベンジルオキシカルボニル―Ｄ―バリル―Ｌ―
ロイシン1.8ｇ、Ｎ〓―ベンジルオキシカルボニ
ル―Ｌ―リジン―１―ナフチルエステル塩酸塩を
ジメチルフオルムアミド（DMF）10mlに溶か
し、氷冷下DCC1.3ｇ、１―ヒドロキシベンゾト
リアゾール（HOBt）0.8ｇトリエチルアミン
（TEA）0.7mlを加え、３時間撹拌した後、室温
にもどしさらに24時間撹拌する。反応後析出した
DCUをろ過して除き、母液に酢酸エチルエステ
ルを加える。10％クエン酸溶液、飽和重そう水、
飽和食塩水で洗浄した後無水硫酸マグネシウムで
乾燥する。酢酸エチルエステルを留去し、残査を
酢酸エチルエステルより再結晶することにより無
色粉末を得る。融点171〜174℃。収量1.5ｇ、収
率39％。Ｉ_Rν^ＫＢｒ _ｎａｘ 3300、1740、1680、1635c
m
^-1。 ここで得られたベンジルオキシカルボニル―Ｄ
―バリル―Ｌ―ロイシル―Ｎ〓―ベンジルオキシ
カルボニル―Ｌ―リジン―１―ナフチルエステル
1.5ｇをDMF10mlに溶かし、10％パラジウム炭素
（Pd―Ｃ）1.0ｇ、塩酸―ジオキサン溶液1.6ｇ
（110mgECl／ｇ）を加え、水素ガスを通じながら
室温で３時間撹拌する。反応後ろ過してPd―Ｃ
を除き、母液に無水エーテル100mlを加えると油
状物が析出する。上橙液を傾斜して除き、油状物
をエーテルで洗浄する。収量0.8ｇ、収率73％。
Ｉ_Rν^ｎｅａｔ _ｎａｘ 2950、1750、1650cm^-1。 原料物質、ベンジルオキシカルボニル―Ｄ―バ
リル―Ｌ―ロイシンは次のように製造する。 ベンジルオキシカルボニル―Ｄ―バリン54ｇ、
ロイシンメチルエステル塩酸塩をテトラヒドロフ
ラン（THF）250mlに溶かし、氷冷下DPPA68
ｇ、TEA70mlを加え一昼夜撹拌する。反応液を
減圧濃縮し、残査に酢酸エチルエステルを加えて
溶解し、10％クエン酸溶液、飽和重そう水、飽和
食塩水で洗浄した後、溶媒を留去する。残査を酢
酸エチルエステル、ｎ―ヘキサンより再結晶し、
無色針晶を得る。収量30ｇ、収率37％、融点112
〜114℃ Ｉ_Rν^ＫＢｒ _ｎａｘ 3300、1730、1690、1640cm^-1。 ここで得られたベンジルオキシカルボニル―Ｄ
―バリル―Ｌ―ロイシンメチルエステル30ｇをメ
タノール400mlに溶解し、Ｎ―カセイソーダ溶液
120mlを加えて、３時間撹拌する。反応後低温で
メタノールを留去し、酢酸エチルエステルを加え
て振とうする。水層を10％塩酸で弱酸性とした
後、析出する油状物を酢酸エチルエステルで抽出
し水洗する。無水硫酸マグネシウムで乾燥後溶媒
を留去し、残査を酢酸エチルエステル―ｎ―ヘキ
サンより再結晶することにより無色針晶を得る。
収量19.0ｇ、収率66％、融点134〜136℃。 Ｉ_Rν^ＫＢｒ _ｎａｘ 3350、3300、1730、1640cm^-1。 原料物質、Ｎ〓―ベンジルオキシカルボニル―
Ｌ―リジン―１―ナフチルエステル塩酸塩は次の
ように製造する。 Ｎ〓―ｔ―ブトキシカルボニル―Ｎ〓―ベンジ
ルオキシカルボニル―Ｌ―リジン11.4ｇをトルエ
ン25ml、ピリジン25mlの混合溶媒に溶かし氷冷下
ベンゼンスルホニルクロリド5.2ｇを加えて30分
撹拌する。１―ナフトール4.2ｇを加えてさらに
３時間撹拌した後室温にもどして一昼夜撹拌す
る。反応後酢酸エチルエステルを加え、10％クエ
ン酸溶液飽和重そう水、飽和食塩水で洗浄した後
無水硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を留去し
無色油状物を得る。収量13.2ｇ、収率87％ Ｉ_Rν^ｎｅａｔ _ｎａｘ 3300、1750、1690cm^-1。 ここで得られたＮ〓―ｔ―ブトキシカルボニル
―Ｎ〓―ベンジルオキシカルボニル―Ｌ―リジン
―１―ナフチルエステル13.2ｇを塩酸―ジオキサ
ン溶液25ｇ（110mgHCl／ｇ）に溶かし室温で１
時間30分撹拌する。反応後減圧乾固し残査に無水
エーテルを加えて一夜放置し、析出する無色粉末
を集める。 収量11.0ｇ、95％。 融点80〜82℃。 Ｉ_R ν^ＫＢｒ _ｎａｘ 3300、2800、1750、1680cm^-1。 実施例 ２ ベンゾイル―Ｌ―バリル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―
リジン―１―ナフチルエステル塩酸塩の製法 ベンゾイル―Ｌ―バリル―Ｌ―ロイシン1.7
ｇ、Ｎ〓―ベンゾイルオキシカルボニル―Ｌ―リ
ジン―１―ナフチルエステル塩酸塩2.2ｇを
DMF15mlに溶かし氷冷下、DCC1.33ｇ、HOB_t
675mg、TEA1.0mlを加え３時間撹拌した後室温
にもどしてさらに24時間撹拌する。反応後析出し
たDCUをろ過して除き、母液に酢酸エチルエス
テルを加えて、10％クエン酸溶液、飽和重そう
水、飽和食塩水で洗浄した後無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥する。溶媒を留去した後、残査をクロロ
ホルム―エーテルから再結晶して無色粉末を得
る。収量1.7ｇ、収率41％、融点153〜156℃。 Ｉ_R ν^ＫＢｒ _ｎａｘ 3300、1750、1690、1630cm^-1。 ここで得られたベンゾイル―Ｌ―バリル―Ｌ―
ロイシル―Ｎ〓―ベンジルオキシカルボニル―Ｌ
―リジン―１―ナフチルエステル1.4ｇをDMF10
mlに溶かし、10％Pd―Ｃ 0.5ｇ、塩酸―ジオキ
サン溶液1.0ｇ（98mgHCl／ｇ）を加え、水素ガ
スを通じながら室温で４時間撹拌する。反応後ろ
過してPd―Ｃを除き、母液に無水エーテル100ml
を加え、析出する無色粉末を集める。収量910
mg、収率73％、融点190〜192℃。 Ｉ_R ν^ＫＢｒ _ｎａｘ 3300、2950、1750、1630cm^-1。 原料物質、ベンゾイル―Ｌ―バリル―Ｌ―ロイ
シンは次のように製造する。 ベンゾイル―Ｌ―バリン11.0ｇ、Ｌ―ロイシン
エチルエステル塩酸塩9.0ｇをジクロルメタン100
mlに溶かし、氷冷下DPPA15.0ｇ、TEA15mlを加
えて一昼夜撹拌する。反応液を10％クエン酸溶
液、飽和重そう水、飽和食塩水で洗浄した後、無
水硫酸マグネシウムで乾燥する。減圧乾固して溶
媒を留去し、残査クロロホルム―エーテル―ヘキ
サンより再結晶する。無色針晶6.0ｇ、収率35
％。融点159〜160℃。 Ｉ_R ν^ＫＢｒ _ｎａｘ 3300、3250、1750、1630cm^-1。 ここで得られたベンゾイル―Ｌ―バリル―Ｌ―
ロイシンエチルエステル5.0ｇをとりメタノール
150mlに溶かし、Ｎ―カセイソーダ溶液20mlを加
えて室温で８時間撹拌する。反応液を低温で濃縮
し、酢酸エチルエステル、蒸留水を加えて振とう
し水層を集めて10％塩酸溶液で弱酸性とする。析
出する油状物を酢酸エチルエステルで抽出し、水
洗後無水硫酸マグネシウムで乾燥する。溶媒を留
去することにより無色油状物を得る。収量3.0
ｇ、収率65％。 Ｉ_R ν^ｎｅａｔ _ｎａｘ 3300、1720、1630、2950cm^-1
。 実施例 ３ バリルロイシルリジンナフチルエステルを基質
としたプラスミンの活性測定法 50mMリン酸緩衝液（PH7.0）1.7mlに各種濃度
のプラスミン溶液0.1mlおよびバリルロイシルリ
ジンナフチルエステル溶液（1.5mM）0.2mlを加
え37℃で30分間インキユベートする。 氷冷後、これに１％フアーストバイオレツトＢ
ソルト（FVB）0.1mlを加え０℃で10分間放置し
更に氷酢酸１mlを加え発色を分光光度計により吸
光度（505nm）として測定し、酵素により水解さ
れて遊離したナフトールを定量する。対照として
はプラスミンの代りに緩衝液を加えたものを用い
る。この遊離したナフトール量が酵素の活性度に
相当する。 尚、ベンゾイルバリルロイシルリジンナフチル
エステルを基質として用いた場合にもこの方法と
同様に測定する。 参考例 １ Ｎ〓―トシルアルギニンメチルエステルを基質
としたプラスミンの活性測定法 プラスミン溶液0.2mlにＮ〓―トシルアルギニ
ンメチルエステル溶液（10μ_nple／0.4ml５％
DM_SO）0.3ml、及びホウ酸緩衝液（PH8.5）0.5ml
を加える。37℃で30分間インキユベーシヨンした
後、ヒドロキシルアミン溶液（2M―NH₂OH・
HClおよび3.5MNaOHの等量混合物）1.5ml加え
室温で15分間放置する。これに18％トリクロル酢
酸１ml、4N塩酸１ml、及び10％塩化第二鉄１ml
を加え充分にかくはんした後3000r.p.m.で10分間
遠心分離する。上橙液の発色を分光光度計により
吸光度（530nm）として測定する。この値はプラ
スミンによつて水解されずに残つた基質の量に相
関するもので酵素の活性は基質のみの値（対照）
から酵素反応を行なつた後に得られる値を引いた
値に相当する。 参考例 ２ バリルロイシルリジンパラニトロアニリドを基
質としたプラスミンの活性測定 0.1M Tris HCl 緩衝液（PH8.0）2.15mlに各
種濃度のプラスミン溶液0.1ml、バリルロイシル
リジンパラニトロアニリド溶液（1mM／H₂O）
0.25mlを加え37℃で30分間インキユベーシヨンす
る。氷酢酸0.3mlを加え発色を分光光度計により
吸光度（405nm）として測定する。 実施例３、参考例１、及び参考例２による測定
結果を第１図に示すが実施例３の方法は参考例１
の方法に比べ約60倍、参考例２の方法に比べ約15
倍の検出感度を有していることが分る。 第１図中〇印は実施例３、●印は参考例１、×
印は参考例２の方法による標準曲線を示す。な
お、横軸のカツコ内の数字は●印の曲線の場合の
酵素濃度を示す。 実施例３及び参考例２の方法により他の酵素の
活性を測定した場合における、相対感度を第１表
に示す。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は標準曲線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式() （式中R₁は水素、又はベンゾイル基を表わ
   し、R₂はナフチル基を表わし、そしてバリン部
   分はＤ体またはＬ体を表わし、ロイシン部分はＬ
   体を表わし、そしてリジン部分はＬ体を表わ
   す。）で示されるアミノ酸誘導体。 ２ 式() （式中R₁は水素、又はベンゾイル基を表わ
   し、R₂はナフチル基を表わし、そしてバリン部
   分はＤ体またはＬ体を表わし、ロイシン部分はＬ
   体を表わし、およびリジン部分はＬ体を表わ
   す。）で示されるアミノ酸誘導体を基質として酵
   素と反応させることを特徴とする酵素活性の測定
   方法。