DE2943581C2 - D-oder L-Valyl-L-leucyl-L-lysinnaphthylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung - Google Patents

D-oder L-Valyl-L-leucyl-L-lysinnaphthylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

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DE2943581C2
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Mamoru Chiba Sugimoto
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Description

Aminosäure in Kontakt bringt, die verbliebene Estergruppe nach einer vorgegebenen Zeitspanne mit Hydroxylamin in eine Hydroxamsäure überfuhrt, diese mit Eisen-III-Chlorid reagieren läßt, um eine Farbe zu entwickeln und die Farbe als Extinktion mißt und die Fähigkeit des Enzyms zur Hydrolyse des Lsters, d. h. die Enzym-Aktivität, anhand der Extinktk-n bestimmt
Aus AnaL Biochem. 61 1974,200-208 (C A. 82 1975, 12776) ist es bekannt, Plasmin mittels «-N-Methyl-<x-N-tosyl-L-lysin-^-naphthylester durch Messung des freigesetzten ^-Naphthols zu bestimmen. Es gibt auch ein Verfahren, bei dem man ein p-Nitroanilid als Substrat einsetzt und die Fähigkeit zur Hydrolyse dieser Verbindung mißt (vgL Thromb. Res. 1978 13(5), 733-739;C A.901979,116846;DE-OS 26 29 067).
Bei diesen Arbeitsweisen ist jedoch eine beträchtliche
CH3
CH3 CHCH3 NH2
I Il
CHCH3 CH2 (CH2),
Menge an Enzym erforderlich, und wenn die Enzymkonzentration niedrig ist, oder das Enzym eine niedrige Aktivität aufweist, erweist es sich als schwierig, die Enzym-Aktivität zu bestimmen.
Zur Bestimmung der Enzym-Aktivität geeignete Verbindungen sollen den drei folgenden Bedingungen gerecht werden: Sie weisen eine Affinität gegenüber Enzymen auf, die Bestimmung der Menge des Enzyms ist einfach und die Empfindlichkeit der Bestimmung ist bei diesen Verbindungen als gut zu bezeichnen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Aminosäurederivate zu schaffen, welche diese Forderungen erfüllen.
Erfindungsgemäß werden D- oder L-Valyl-L-leucyl-L-lysin-naphthylester der allgemeinen Formel I geschaffen:
O)
R1NH CONH CONH COO
worin R1 für Wasserstoff oder Benzoyl steht.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man jeweils in an sich bekannter Weise A) ein D- oder L-Valyl-L-leucinderivat der allgemeinen Formel II
CH3
CH3 CHCH3
CHCH3 CH2
(Π)
R3-NH CONH COOH
in der R3 eine Benzoyl- oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, mit einem Nc-geschützten I^Lysin-naphthylester der allgemeinen Formel III
NHR4
(CH2),
H2N
COO
(ID)
in der R4 eine Aminoschutzgruppe bedeutet, kondensiert und B) aus der Verbindung der allgemeinen Formel IV
CH3
CH3 CHCH3 NH-R4
I I I
CHCH3 CH2 (CH2)4
R3-NH CONH CONH COO
in der R3 und R4 die vorstehenden Bedeutungen besitzen, die Aminoschutzgruppen abspaltet.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Substrate zur Bestimmung der Aktivität von Thrombin, Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Urokinase, Cl-Esterase und Faktor Xa.
Die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen I eingesetzten Ausgangsverbindungen II können hergestellt werden, indem man eine Verbindung der allgemeinen Formel V:
Gruppe R4 verschieden ist, naphthyliert, wobei man eine Verbindung der allgemeinen Formel IX erhält:
NHR4
(CH2J4
(IX)
R5NH COO-R2
CH3
CHCH3
R3NH COOH
worin R3 dieselbe Bedeutung wie zuvor besitzt, mit einer Verbindung der Formel VI:
CH3
CHCH3
CH2
H3N
25
COOEt
worin Et für Äthyl steht, zu einem Ester der allgemeinen Formel VII:
CH3
CH3
CHCH3
CHCH3 CH2
R3NH CONH COOEt
worin R3 und Et die zuvor genannten Bedeutungen besitzen, kondensiert und anschließend den Ester der allgemeinen Formel VII hydrolysiert.
Das Lysinausgangsderivat III kann hergesieiit werden, indem man ein Lysinderivat VIII mit einer geeigneten Schutzgruppe entsprechend der Formel:
NHR4
(CHJ4
R5NH COOH
worin Rs dieselbe Bedeutung wie zuvor besitzt und R5 für eine Aminoschutzgruppe steht, die von der worin R2, R4 und R5 die zuvor genannten Bedeutungen Ji besitzen und anschließend nur die Aminoschutzgruppe
(V) in der «-Stellung der Verbindung IX selektiv entfernt
Zur Herstellung der Verbindung IV löst man die Verbindung II und das Lysinderivat HI in einem geeigneten Lösungsmittel auf und gibt zur erhaltenen Lösung ein Aktivierungsmittel, das üblicherweise eingesetzt wird. Hierzu gehören Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diphenylphosphorylazid (DPPA), ein Alkylchlorcarbonat, oder dergleichen. Anschließend gibt man erforderlichenfalls eine Base, beispielsweise Triäthylamin oder dergleichen, zu und rührt die erhaltene Mischung, um die Verbindung IV herzustelllen. Zu den verwendeten Lösungsmitteln gehören konventionelle Lösungsmittel wie Chloroform, Dichlormethan, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran und der-(VI) gleichen in dem Umfang, in dem das Ausgangsmaterial
darin löslich ist Die Reaktionstemperatur kann im Bereich von 0 bis 40° C liegen.
Nach Beendigung der Reaktion läßt sich die Verbindung IV aus der Reaktionsmischung durch übliche Behandlung isolieren. Wenn man DCC als Aktivierungsmittel einsetzt entfernt man den ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff (DCU) durch Filtrieren und gibt ein geeignetes Extraktionsmittel, beispielsweise Athylacetat zum Filtrat Danach wäscht man den Extrakt mit wäßriger Zitronensäurelösung, gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und dampft dann unter vermindertem Druck ein, um das Lösungsmittel zu entfernen und die Verbindung IV zu gewinnen.
Die Aminoschutzgruppe der Verbindung IV wird auf übliche Weise entfernt Wenn es sich bei der Aminoschutzgruppe um Benzyloxycarbonyl handelt wird die Verbindung IV in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst und ein Katalysator, beispielsweise Palladium-auf-Aktivkohle oder dergleichen werden zur erhaltenen Lösung zugesetzt um die Schutzgruppe reduktiv zu entfernen. Man kann auch die Verbindung IV zu einer Lösung von Bromwasserstoffsäure in Essigsäure geben und die in Form des Hydrobromids ausgefäiite Verbindung durch Filtrieren isolieren, um so die Verbindung der allgemeinen Formel I zwerhalten. Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I eignen sich als ausgezeichnete Substrate zur Bestimmung der Aktivität von Thrombin, Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Urokinase, Cl-Esterase und Faktor Xa. Wenn man die erfindungsgemäßen Verbindungen I mit dem Enzym in Kontakt bringt, dient die Verbindung als Substrat, und durch Hydrolyse mit dem Enzym wird Naphthol freigesetzt, welches nach einer vorgegebenen Zeitspanne gemessen wird, um die Enzym-Aktivität leicht gemessen werden kann, ist für die quantitative Analyse einer Enzympräparation, für die Diagnose durch Messung des Enzymspiegels im Blut, für eine Diagnose durch Messung des Enzymspiegels im Blut für eine Diagnose durch Messung der Enzymkonzentration
(VD)T
(Vffl)
in Blut oder Urin, oder dergleichen, von wesentlicher Bedeutung.
Wenn man die Enzym-Aktivität bestimmt, bringt man das Enzym mit einer vorgegebenen Menge der erfindungsgemäßen Verbindung I in einer geeigneten Pufferlösung in Kontakt und mißt nach einer vorgegebenen Zeit bei vorgegebener Temperatur die Menge an freigesetztem Naphthol, wodurch die Enzym-Aktivität bestimmt wird. Bei der Pufferlösung kann es sich um eine solche handeln, die den optimalen pH für das ι ο Enzym aufweist. Man kann die Reaktion unter geeigneten konstanten Bedingungen hinsichtlich Temperatur und Zeit durchführen, obgleich es bevorzugt ist, die bei einer Temperatur von 25 bis 37° C nach 30 Minuten freigesetzte Menge an Naphthol zu messen.
Die Messung der Menge an Naphthol kann durch irgendeine bekannte Arbeitsweise erfolgen, beispielsweise durch eine physikochemische Methode, wie Gaschromatographie, Dünnschichtchromatographie oder durch eine chemische Methode wie durch die Eisen-III-Chloridreaktion oder eine Diazokupplungsreaktion, unter Anwendung der Fast-Violet-B-Salz-(FVB)-Methode. Bevorzugter im Hinblick auf Einfachheit und Bestimmungsempfindlichkeit ist eine Methode, bei der man das FVB zur Reaktionsmischung zugibt, um eine Farbe zu entwickeln und die Extinktion mit Hilfe eines Photometers mißt
Wenn man die Aktivität von Plasmin unter Verwendung von D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-l-naphthylester als Substrat mißt, ist die Bestimmungsempfindlichkeit 15mal größer als bei D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroanilid, das als Enzymsubstrat bekannt ist, und sogar ungefähr 62ir:al größer als bei Verwendung des N*-Tosyl-L-argininmethylesters.
Die Menge des nach der genannten Methode bestimmten Naphthols entspricht der Enzym-Aktivität.
Mit den erfindungsgemäßen Verbindungen ist es möglich, die Enzymkonzentration im Blut oder Urin zu messen und die Menge eines Enzyms mit niedriger Aktivität oder eines Enzyms bei niedrigen Konzentrationen zu bestimmen.
Das Verfahren zur Bestimmung der Enzym-Aktivität läßt sich nicht nur auf ein System anwenden, welches nur ein einziges Enzym enthält sondern auch auf ein System, welches verschiedene Enzyme enthält Die Bestimmung der Enzymverteilung im Urin oder Blut ist zur Diagnose von Erkrankungen von Bedeutung, die eingangs genannten üblichen Methoden wurden jedoch nicht allzu häufig angewendet, weil sie sehr komplex sind. Erfindungsgemäß ist jedoch diese Komplexheit bzw. Kompliziertheit nicht mehr gegeben.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele und die Zeichnung weiter erläutert In der Zeichnung weiter erläutert In der Zeichnung stellt F i g. 1 Standardkurven für die Aktivität von Plasmin dar. Fig.2 ist eine graphische Darstellung, welche die Aktivität von Plasmin in Humanplasma zeigt
Beispiel 1
Herstellung von D-Valyl-L-leucyl-L-lysinl-naphthylester-dihydrochlorid
60
Man löst 1,8 g N-Benzylpxycarbonyl-D-valyl-L-leucin und 2j2 g NE-BenzyloxycarbonyI-L-lysm-l-naphthylester-hydrochlorid in 10 ml DMF und gibt dann 13 g DCC, 039 g 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 0,7 ml Triethylamin (ΓΕΑ) zur erhaltenen Lösung unter Eiskühhmg zu. Dann rührt man die erhaltene Mischung 3 Stunden bei derselben Temperatur und anschließend 24 Stunden bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion entfernt man den ausgefällten DCU durch Filtrieren und gibt Äthylacetat zum Filtrat.
Die erhaltene Mischung wird mit lO°/oiger Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge gewaschen und anschließend über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wird durch Eindampfen unter vermindetem Druck entfernt. Der Rückstand wird aus Äthylacetat umkristallisiert Man erhält 1,5 g (Ausbeute 39%) N-Benzyloxycarbonyl-D-valyl-L-leucyl-NE-benzyloxycarbonyl-L-lysin-1 -naphthylester in Form eines weißen Pulvers mit Schmelzpunkt 171 bis 174° C.
IRv I* cm-':33öö, i740,1680, i635.
1,5 g des obigen Esters werden in 10 ml DMF aufgelöst. Dann gibt man 1,0 g 10% Palladium-auf-Aktivkohle (Pd-C) und 1,6 gChlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung (110 mg HCl/g) zu. Die erhaltene Mischung wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, während man Wasserstoffgas aurchleitet. Nach beendeter Reaktion entfernt man das Pd-C durch Filtrieren und gibt 100 ml wasserfreien Diäthyläther zum Filtrat, wobei eine ölige Substanz ausfällt. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Dekantieren entfernt und die ölige Substanz wird mit Diäthyläther gewaschen. Man erhält 0,8 g (Ausbeute 73%) D-Valyl-L-leucyi-L-lysin-l-naphthylester-dihydrochlorid.
IRv S'ich cm-1:2950,1750,1650.
Das als Ausgangsmaterial eingesetzte N-Benzyloxycarbonyl-D-valyl-L-leucin wird wie folgt hergestellt:
Man löst 54 g N-Benzyloxycarbonyl-D-valin und 39 g Leucinmethylester-hydrochlorid in 250 ml Tetrahydrofuran (THF) auf und gibt dann 68 g DPPA und 70 ml TEA zur erhaltenen Lösung unter Eiskühlung zu. Die erhaltene Mischung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man konzentriert die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck und gibt Äthylacetat zum Rückstand zu, um diesen aufzulösen. Die erhaltene Lösung wird mit 10%iger Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge gewaschen und dann unter verringertem Druck destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Man kristallisiert den Rückstand aus Äthylacetat/n-Hexan um. Man erhält 30 g (Ausbeute 37%) N-Benzyloxycarbonyl-D-valyl-L-leucinrnethylester in Form farbloser, nadeiförmiger Kristalle mit Schmelzpunkt 112 bis i 140C
IRv ££ cm-l:3300,1730,1690,1640.
Man löst 30 g des obigen Esters in 400 ml Methanol und gibt zur erhaltenen Lösung 120 ml IN Natriumhydroxidlösung zu. Dann wird die erhaltene Mischung 3 Stunden lang gerührt Nach beendeter Reaktion wird das Methanol unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur verdampft Dann gibt man Äthylacetat zum Rückstand zu und schüttelt die erhaltene Mischung. Die wäßrige Schicht wird mit 10%iger Chlorwasserstoff säure schwach sauer gemacht Dann wird die auf diese Weise ausgefällte ölige Substanz mit Äthylacetat extrahiert Man wäscht den Extrakt mit Wasser, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und
9 10
destilliert dann unter vermindertem Druck, um das N-Benzoyl-L-valyl-L-leucyl-Ne-benzyloxycarbonyl-L-
Lösungsmittel zu entfernen. Den Rückstand kristallisiert lysin-1-naphthylester in Form eines farblosen Pulvers
man aus Äthylacetat/n-Hexan um, wobei man 19,0 g mit Schmelzpunkt 153 bis 156°C.
(Ausbeute 66%) N-Benzyloxycarbonyl-D-valyl-L-leucin
in Form farbloser, nadeiförmiger Kristalle mit Schmelz- 5 1 Rv ** cm -': 3300,1750,1690,1630.
punkt 134 bis 136° C erhält.
Man löst 1,4 g des obigen Esters in 10 ml DMF und IRv S; cm-·:3350,3300,1730,1640. gibt dann 0,5 g 10%iges Pd-C und 1,0g Chlorwasser
stoffsäure-Dioxanlösung (98 mg HCl/g) zur Lösung. Die
Das als Ausgangsmaterial eingesetzte Nj-Benzyloxy- io erhaltene Mischung wird 4 Stunden bei Raumtemperacarbonyl-L-lysin-1-naphthylester-hydrochlorid wird fol- tür gerührt, während man Wasserstoffgas durchleitet, gendermaßen hergestellt: Nach der Reaktion entfernt man das Pd-C durch
In einer Mischung aus 25 ml Toluol und 25 ml Pyridin Filtrieren und gibt 100 ml wasserfreien Diäthyläther löst man 11,4g N*-t-Butoxycarbonyl-NB-benzyloxycar- zum Filtrat Das auf diese Weise ausgefällte weiße bonyl-L-lysin und gibt dann unter Eiskühlen 5,2 g 15 Pulver wird gesammelt Man erhält 910 mg (Ausbeute Benzolsulfonylchlorid zur Lösung und rührt dann die 73%) N-Benzoyl-L-valyl-L-leucyl-L-lysin-l-naphthylerhaltene Mischung bei derselben Temperatur 30 ester-hydrochlorid mit Schmelzpunkt 190 bis 192°C Minuten lang. Zur Mischung gibt man 4,2 g 1-Naphthol (Zers.). und rührt die erhaltene Mischung 3 Stunden lang. Dann
rührt man 24 Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach 20 IRv ™; cm-':330ο, 2950,1750,1630. beendeter Reaktion gibt man Äthylacetat zur Mischung
zu und wäscht die Mischung mit 10%iger Zitronensäu- Das als Ausgangsmaterial eingesetzte N-Benzoyl-L-
relösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und valyl-L-leucin wird wie folgt hergestellt: gesättigter Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge, Man löst 11,0 g N-Benzoyl-L-valin und 9,0 g L-Leucin-
trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und 25 äthylesterhydrochlorid in 100 ml Dichlormethan und verdampft dann unter vermindertem Druck, um das gibt dann 15,0 g DPPA und 15 ml TEA unter Eiskühlung Lösungsmittel zu entfernen. Auf diese Weise erhält man zur Lösung. Dann rührt man die erhaltene Mischung bei 13,2 g (Ausbeute 87%) N*-t-ButoxycarbonyI-Ne-benzyl- derselben Temperatur 24 Stunden lang. Man wischt die oxycarbonyl-L-lysin-1-naphthylester in Form einer Reaktionsmischung mit 10%iger Zitronensiurdösung, farblosen öligen Substanz. 30 gesättigter Natriumcarbonatlösung und gesättigter
Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge, trocknet IRv USf* cm-':3300,1750,169ο. über wasserfreiem Magnesiumsulfat und dampft dann
unter vermindertem Druck ein, um das Lösungsmittel zu
13,2 g des obigen Esters werden in 25 g Chlorwasser- entfernen. Der Rückstand wird aus Ojloreform/Diithylstoffsäure-Dioxanlösung (110 mg HCl/g) gelöst und die 35 äther/n-Hexan umkristaUistert, wobei nun 6jOjf (Aus-Lösung wird 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. beute 35%) N-Benzoyl-L-valyl-L-teucmithyiester in Man dampft die Reaktionsmischung unter verminder- Form farbloser nadeiförmiger Kristalle mit Schmelztem Druck zur Trockne ein und gibt wasserfreien punkt 159 bis 1600C erhält Diäthyläther zum Rückstand. Die erhaltene Mischung
wird 24 Stunden lang stehengelassen und das auf diese 40 IRv Si cm-':3300,3250,1750,1630. Weise ausgefallene farblose Pulver wird gesammelt
Man erhält 11,0 g (Ausbeute 95%) N£-Benzyloxycarbo- Man löst 5,0 g des obigen Esters in 150 ml Methanol
nyl-L-lysin-l-naphthylester-hydrochlorid mit Schmelz- und gibt 20 ml 1 N-N»triumhydroxidiösung zur Lösung, punkt 80 bis 82° C. Man rührt die Mischung 8 Stunden bei Raumtempera-
45 tür. Die Reaktionsmischung wird bei tiefer Temperatur
IRv "ί cm-':3300,2800,1750,1680. konzentriert, anschließend werden Äthylacetat und
destilliertes Wasser zum Rückstand zugegeben. Die -■ B e i s ρ i e 1 2 erhaltene Mischung wird geschüttelt und die wäßrige
¥ ' „ ., _ .. ... . . Schicht wird abgetrennt und mit lOSicer Chlorwasser-
Herstellung von N-Benzoyl-L-valyl-L-leucyl- 50 stoffsäurelösun7 schwach ΜϋβΓ *micht Κβ so L-lysm-l-naphthylester-hydrochlond auSgefällte ölige Substanz wird mit Äthylacetat
Man löst 1,7 g N-Benzoyl-L-valyl-L-leucin und 2£ g extrahiert Den Extrakt wäscht man mit Wasser und N^-Benzyloxycarbonyl-L-lysijs-l-naphthylester-hy- trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat Danach
drochlorid in 15 ml DMF und gibt dann unter wird unter verringertem Druck eingedampft, um das Eiskühlung 133 g DCC 675 mg HOBt und 1,0 ml TEA 55 Lösungsmittel zu entfernen. Auf diese Weise erhält man zur Lösung zu und rührt dann die erhaltene Mischung 3 3,0 g (Ausbeute 65%) N-Benzoyl-L-valyl-L-leucin in Stunden bei derselben Temperatur und anschließend 24 Form einer farblosen öligen Substanz. Stunden bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion wird der ausgefallene DCU durch Filtrieren IRv ^1* αα-^:3300,1720,1630,2950.
entfernt und man gibt Äthylacetat zum Filtrat Die 60 ^
erhaltene Mischung wird mit 10%iger Zitronensäurelö- B e i s ρ i e 1 3
sung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesät- Messung der Aktivität von Plasmin
tigter Natnumchlondlosung m dieser Reihenfolge unter Verwendung von D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-
gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat ge- l-naphthylester-dihydrochlorid als Substrat j
trocknet und dann unter vermindertem Druck emge- 65 '
dampft, um das Lösungsmittel zu entfernen. Man . Zu 1,7 ml 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gibt kristallisiert den Rückstand aus Chloroform/Diäthyl- man 0,1 ml einer wässerigen Plasmim-Lösung in äther um. Man erhält hierbei 1,7 g (Ausbeute 41%) unterschiedlichen Konzentrationen (1,65; 3;13; 4,70 und
6,25 χ ΙΟ-2 Casein-Einheiten in 0,1 ml) und 0,2 ml 1,5 mM D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-l-naphthylesterlösung zu. Anschließend inkubiert man die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 37° C.
Nach dem Kühlen in Eis gibt man 0,1 ml einer 1 %igen FVB-Lösung zur Mischung. Man läßt die Mischung 10 Minuten bei 0°C stehen und gibt dann 1 ml Eisessig zu. Die auf diese Weise entwickelte Farbe wird als Extinktion (505 nm) mit Hilfe eines Spektrophotometers gemessen, um die Menge an Naphthol zu ι ο bestimmen, welche durch Hydrolyse mit dem Enzym freigesetzt wurde. Als Kontrolle verwendet man dieselbe, plasminfreie Pufferlösung. Die Menge an freigesetztem Naphthol entspricht der Enzym-Aktivität
Bei Verwendung von N-Benzoyl-L-valyl-L-leucyl-L-lysin-1-naphthylester-hydrochlorid als Substrat wurde dieselbe Arbeitsweise wie zuvor angewendet, um die Enzym-Aktivität zu messen.
In F i g. 1 stellt Kurve A eine Standardkurve dar, die anhand der Methode gemäß Beispiel 3 für D-Val-L-Leu-L-Lys-l-naphthylester-2 HCl erhalten wurde. Kurve B ist eine Standardkurve, die nach der Methode des Vergleichsbeispiels 1 erhalten wurde, und Kurve C ist eine Standardkurve, die nach der Methode des Vergleichsbeispiels 2 erhalten wurde. Die Zahlen in den Klammern auf der Abszisse beziehen sich auf die Enzym-Aktivität für dieKurve B. Kurve D bezieht sich aufN-Benzoyl-L-Val-L-Leu-L-Lys-naphthylester-HCl.
Die nachfolgende Tabelle führt die erzielten relativen Empfindlichkeiten auf, wenn die Aktivität anderer Enzyme mit Hilfe der Methoden des Beispiels 3 bzw. des Vergleichsbeispiels 2 gemessen werden.
Tabelle
Enzym
25
Vergleichsbeispiel 1 20 Substrat Messung der Aktivität von Plasmin
unter Verwendung von N"-Tosyl-L-argininmethyl-
ester-hydrochlorid als Substrat
Zu 0,2 ml Plasmin-Lösung, welche 15,6; 313; 47,0 oder 62£xlO-2-Casein-Einheiten an Plasmin enthält, gibt man 03 ml N*-Tosyl-L-argininmethylester-hydrochloridlösung (10 Mikromol/0,4 ml 5% DMSO) und 0,5 ml einer Boratpufferlösung (pH 8,5) und inkubiert die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 37° C. Dann gibt man 1,5 ml alkalische Hydroxylaminlösung (eine Mischung gleicher Mengen von 2 M NH2OH-Hydrochlorid und 3,5 M NaOH) zu. Die erhaltene Mischung wird 15 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Man gibt 1 ml 18%ige Trichloressigsäure, 1 ml 4 N-Chlorwasserstoffsäure und 1 ml 10%ige Eisen(III)-Chloridlösung zu und rührt die erhaltene Mischung gründlich. Dann wird die Mischung 10 Minuten bei 3000UpM zentrifugiert Die Farbe der überstehenden Flüssigkeit wird als Extinktion (530 nm) mittels eines Spektrophotometers gemessen. Der so erhaltene Wert entspricht der Menge an unhydrolysiertem Substrat, und die Eezytn-Aktivität entspricht dem Unterschied zwischen a Wert, den man ohne Verwendung eines Enzyms k (Kontrolle) und dem Wert, den man nach der Faktor Xa Kallikrein
Plasma
Gewebe
D-Valyl-L-leucyl- 30,0 30,0 8,5 L-lysin-1-naphthyl-
ester-dihydrochloiid
D-Valyl-L-leucyl- 1,0 1,0 1,0 L-lysin-p-nitroanilid-
dihydrochlorid
Beispiel 4 Vergfeicksbeispiel 2 Messung der Aktivität von Plasmin
after Verwendung von D-Varyl-L-leucyl-L-Iysin-p-ni troanilid-dihydrochlorid als Substrat
Zu 2,15 ml einer 0,1 uM tris-HCl-Pufferlösung (pH Ml f«bt nun 0,1 ml einer wässerigen Plasmin-Lösung, «riebe 1,56; 3,13; 4,70 oder 6^5 χ 10~2 Casein-Einheiten •Mhih, und 425 ml D-Varyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroani- dfldiloridlOtung (ImMZH2O) und inkubiert SÜAeötakeae Mischung 30 Minuten bei 37°C Dazu gfet man 03 ml Eisessig, und die entwickelte Farbe wird ab Extinktion (405 nm) mit Hufe eines Spektrophotometen gemessen.
Die Ergebnisse der in Beispiel 3, Vergleichsbeispiel 1 und Vergleichsbeispiel 2 ersehen Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt Der Fig. 1 ist zu entnehmen, daß die od» gcmlB Beispiel 3 eine Bestimmungsempfind-
bM fi die ungefähr eOmal gröBer als die fergfeichsbeispieb 1 und ungefähr 15mal ilidfeMctfej6iedesVergleichsbetspieh2ist
Bestimmung der Aktivitäten von Plasminogen in Humanplasma
Zu 5 Mikrolitern zitriertem Humanplasma gibt man
0,8 ml 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) und rührt die erhaltene Lösung gründlich. Danach gibt man 0,1 ml einer Streptokinaselösung zu (100 Einheiten Streptrokinase werden in 0,1 ml 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) aufgelöst). Die erhaltene Mischung wird 30 Minuten bei 37°C inkubiert, und man gibt 0,1 ml einer wäßrigen Lösung eines Substrats (D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-lnaphthylester-dihydrochlorid) (0,1 Mikromol/0,1 ml H2O) zu, um Probe (i) herzustellen. Als Kontrolle wurden 03 ml der obigen 50 mM Phosphatpufferlösung und 0,1 ml der obigen wäßrigen Lösung von Substrat zu 5 Mikroliter des obigen zitrierten Humanplasmas zugegeben, um Probe (II) herzustellen. Dann gab man 0,1 ml der obigen wäßrigen Lösung des Substrats zu 03 ml der obigen 50 mM Phosphatpufferlösung, um die
Probe (iii) herzustellen. Jede der Proben wurde 30 Minuten bei 25° C inkubiert Und Unmittelbar Hanaoh ΐτι EisWESSCr Eb**ekÜhlt- riann
gab man 0,1 ml 1% FVB zu. Die erhaltene Mischung wurde 30 Minuten lang in Eiswasser stehengelassen, und anschließend wurden 1 ml Eisessig zugesetzt Einige Stunden später wurde die Extinktion jeder Probe bei 515 nm gemessen, und die Aktivität von Plasminogen im Humanplasma wurde berechnet, indem man die Gesamtsumme der Extinktionen von Probe (ii) und von Probe (iii) von der Extinktion der Probe (i) abzog. Die . Aktivität von Plasminogen in der Probe wird anhand der Standardkurve (Kurve A) für Humanplasmin gemäB Fig. 1 auf die Piasminaktivität reduziert und aufgetragen. Die Ergebnisse der Bestimmungen des Plasmino- gens in Humanplasma nach dieser Methode sind in F i g. 2 dargestellt Die dort verwendeten Plssmaproben wurden als Proben Nr. 1 bis 4 von vier verschiedenen minnlichen Personen erhalten.
13 14
ν ι · h κ. · · ι ^ Stimmung von vier verschiedenen Enzymen verglichen
vergieicnsDeisnieu (Methode nach Beispiel 3). Wie die nachstehende
Es werden die Reaktionsgeschwindigkeiten von Tabelle zeigt, sind die mit der erfindungsgemäßen
«-N-Methyl-iX-N-tosyl-L-lysin-/J-naphthylester (Verbin- Verbindung 2 erhaltene Reaktionsgeschwindigkeiten
dung 1) und von dem erfindungsgemäßen D-Valyl-L- 5 wesentlich höher als bei der Verbindung 1. leucyl-L-lysin-l-naphthylester (Verbindung 2) zur BeTabelle
i hrombin Kallikrein 10"3 1,1 x 1(T4 Plasmin Urokinase
Verbindung (1) 1,3 x 10~2 7,1 x 10"2 UXlO"2 1,2XlO"6
Verbindung (2) 3,2 x μΜοΙ/min/IU bei 25°C 7,7XlO"2 1,5XlO"5
Einheiten: Thrombin: μΜοΙ/min/KU bei 25°C
Kallikrein: μΜοΙ/min/CU bei 25°C
Plasmin: μΜοΙ/min/IU bei 25°C
Urokinase:
Mit der erfindungsgemäßen Verbindung werden also sehr geringe Enzym-Aktivitäten zuverlässiger und wesentlich höhere Reaktionsgeschwindigkeiten der leichter bestimmen laf sen. Hydrolyse durch das Enzym erhalten, wodurch sich auch
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

1 2
Patentansprüche: 1. D- oder I/Valyl-L-leucyl-L-lysinnaphthylester der allgemeinen Formel I
CH3
CH3 CHCH3 NH2
CHCH3 CH2 (CH2J4 (I)
R.NH CONH CONH COO
worin R1 für Wasserstoff oder Benzoyl steht
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise A) ein D- oder L-Valyl-L-leucinderivat der allgemeinen Formel II
CH3 CH3 CHCH3
I I
CHCH3 CH2 (Π)
R3-NH CONH COOH
in der R3 eine Benzoyl- oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, mit einem Nc-geschützten L-Lysin-naphthylester der allgemeinen Formel III
NHR4 (CH2),
H2N COO-
in der R4 eine Aminoschutzgruppe bedeutet, kondensiert und B) aus der Verbindung der allgemeinen Formel IV
CH3
CH3 CHCH3 NH-R4
CHCH3 CH2 (CHz)4 (IV)
R3-NH CONH CONH COO
in der R3 und R4 die vorstehenden Bedeutungen besitzen, die Aminoschutzgruppen abspaltet. 3. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 als Substrat zur Bestimmung der Aktivität von Thrombin, Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Urokinase, Cl-Esterase und Faktor Xa.
Die Erfindung betrifft neue ValylleucyUysinnaphthyl- darin, daß man einen Alkylester einer Aminosäure als
ester ein Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Substrat mit einem Enzym zusammenbringt und die
Verwendung zur Bestimmung der Aktivität der in Enzym-Aktivitit aus dem Hydrolysegrad des Alkyln Anspruch 3 genannten Enzyme, wobei man die 65 esters bestimmt Ein Beispiel für diese bekannten
'■■' Naphthylester als Substrat einsetzt Arbeitsweisen ist die allgemein bekannte Hestrin-Me-
■ 1 Derzeit sind zahlreiche Methoden zur Bestimmung thode. Es handelt sich hierbei um eine Arbeitsweise, bei
;;■; von Enzym-Aktivitäten bekannt Eine Methode besteht der man ein Enzym mit einem Alkylester einer
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