DE2943581A1 - Valylleucyllysinderivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung - Google Patents
Valylleucyllysinderivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendungInfo
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Description
PATENTANWÄLTE J. REITSTÖTTER 7 W. KINZEBACH
PROF. DR. DR. DIPL. ING. DR. PHIL. DIPL. CHEM.
W. BUNTE 0958-1976) K. P. HÖLLER
DR. ING. DR. RER. NAT. DIPL. CHBM.
TELEFONi (Οββ) 37 68 83
TELEXt S21B20S IBAR D
BAUERBTRASSE 22, 8O0O MÖNCHEN
München, 29. Oktober 1979
M/20 353
TORII & CO. , LTD.
3, Nihonbashi
Chuo-ku
3, Nihonbashi
Chuo-ku
Tokio / Jaoan
VaIyIleucyllysinderivate, Verfahren zu deren
Herstellung und deren Verwendung
030022/0582
Die Erfindung betrifft neue VaIyIleucyllysinderivate , ein Ver- \
fahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Messung
der Wirksamkeit von Enzymen, wobei man die Verbindungen als |
Derzeit sind zahlreiche Methoden zur Bestimmung der Wirksamkeit
von Enzymen bekannt. Eine Methode besteht darin, daß man einen j Alkylester einer Aminosäure als Substrat mit einem Enzym zusammenbringt und die Wirksamkeit des Enzyms aus dem Hydrolysegrad
des Alkylesters bestimmt. Ein Beispiel für diese bekannten Arbeitsweisen ist die allgemein bekannte Hestrin-Methode. Es
handelt sich hierbei um eine Arbeitsweise, bei der man ein Enzym mit einem Alkylester einer Aminosäure in Kontakt bringt,
die verbliebene Estergruppe nach einer vorgegebenen Zeitspanne mit Hydroxylamin in eine Hydroxamsäure überführt, diese mit
Eisen-III-Chlorid reagieren läßt, um eine Farbe zu entwickeln
und die Farbe als Extinktion mißt und die Fähigkeit des Enzyms zur Hydrolyse des Esters, d.h. die Wirksamkeit des Enzyms, anhand der Extinktion bestimmt.
Es gibt auch ein Verfahren, bei dem man ein p-Nitroani 1 id einer
Aminosäure als Substrat einsetzt und die Fähigkeit zur Hydrolyse dieser Verbindung als Index verwendet. Bei diesen Arbeitsweisen
ist jedoch eine beträchtliche Menge an Enzym erforderlich, und
wenn die Enzymkonzentration niedrig ist, oder das Enzym eine niedrige Wirksamkeit aufweist, erweist es sich als schwierig,
die Wirksamkeit des Enzyms zu bestimmen.
Erfindungsgemäß wurden ausgedehnte Untersuchungen nach Verbindungen vorgenommen, welche den drei folgenden Bedingungen gerecht werden: Sie weisen eine Affinität gegenüber Enzymen auf,
die Bestimmung der Menge des Enzyms ist einfach und die Empfindlichkeit der Bestimmung ist bei diesen Verbindungen als gut zu
bezeichnen. Erfindungsgemäß wurden Verbindungen geschaffen, die
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sich als Substrat sehr brauchbar erwiesen haben und im Vergleich
mit den üblichen Verbindungen die vorstehenden Bedingungen aus- j gezeichnet erfüllen. Es wurde auch eine einfache Arbeitsweise ί
zur Bestimmung der Wirksamkeit von Enzymen unter Verwendung dieser Verbindungen geschaffen. j
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Aminosäurederivate zu schaffen, welche als ausgezeichnetes Substrat für Enzyme
brauchbar sind. Die Erfindung soll auch ein Verfahren zur Herstellung der genannten Aminosäurederivate schaffen. Die Erfindung soll ferner ein Verfahren schaffen, mit dessen Hilfe die
Wiricsaffikeit eines Enzyms bestimmt wird, indem man die neuen
Aminosäurederivate als Substrat für das Enzym einsetzt.
Erfindungsgemäß werden somit Valylleucyllysinderivate der allgemeinen Formel I geschaffen:
CH,, CHCH. NH0
j -i j 3 j Z
CHCH., CH
3
R1-
worin R,. für Wasserstoff oder Benzoyl steht und R^ für Naphthyl
steht.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der durch die allgemeine Formel I dargestellten Valylleucyllysinderivate, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II:
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M/20 353 - /f -?
CH0
I 3
CH- CHCH,
I 3 I 3 (II)
CHCH, CH9 Γ 3 Ϊ 2
worin R- für Benzoyi oder eine Aminoschutzgruppe steht, mit
einem Lysinderivat der allgemeinen Formel III:
NH-R4
4 (III)
COOR2
worin R2 dieselbe Bedeutung wie zuvor besitzt und R4 für eine
Aminoschutzqruppe steht, in an sich bekannter Weise einer dehydratisierenden Kondensation unterwirft, um eine Verbindung
der allgemeinen Formel IV zu erhalten:
CH,
I 3
CH, CHCH, NH-R. I 3 ,3 1 4
CH9
Jl c
worin R2, R3 und R4 die zuvor genannten Bedeutungen besitzen,
und anschließend in an sich bekannter Weise die Aminoschutzgruppe aus der Verbindung der allgemeinen Formel IV entfernt.
Erfindungsgema'ß wird auch ein Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Enzyms geschaffen, bei dem man ein Valylleucyllysinderivat der allgemeinen Formel I als Substrat mit
dem Enzym in Kontakt brinqt.
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j Die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen I
eingesetzten Ausgangsverbindungen II können hergestellt werden, indem man eine Verbindung der allgemeinen Formel V:
CH3
CHCH- (V)
J 3
R3NH^^COOH
R3NH^^COOH
worin R, dieselbe Bedeutunq wie zuvor besitzt, mit einer Verbindung
der Formel VI:
CH3
CHCH3
CH2 (VI)
worin Et für Kthyl steht, zu einem Ester der allgemeinen Formel
VII:
CH-
\
3
CH- CHCH-,
,3 ,3
,3 ,3
CHCH3 CH2 (VII)
worin R^ und Et die zuvor genannten Bedeutungen besitzen, kondensiert
und anschließend den Ester der allgemeinen Formel VII
hydrolysiert.
Das Lysinausgangsderivat III kann hergestellt werden, indem
man ein Lysinderivat VIII mit einer geeigneten Schutzgruppe ent sprechend der Formel:
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NHR4
(CH2)4 (VIII)
worin R- dieselbe Bedeutung wie zuvor besitzt und Rg für eine
Aminoschutzgruppe steht, die von der Gruppe R. verschieden ist
naphthyliert, wobei man eine Verbindung der allgemeinen Formel
IX erhält:
NHR4
(CH2)4 (IX)
worin R2, R4 und R,- die zuvor genannten Bedeutungen besitzen und
anschließend nur die Aminoschutzgruppe in der ctf-Stel1ung der
Verbindung IX selektiv entfernt.
Zur Herstellung der Verbindung IV löst man die Verbindung II und
das Lysinderivat III in einem geeigneten Lösungsmittel auf und gibt zur erhaltenen Lösung ein Aktivierungsmittel, das üblicherweise eingesetzt wird. Hierzu gehören Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC), Diphenylphosphorylazid (DPPA), ein Alkylchlorcarbonat,
oder dergleichen. Anschließend gibt man erforderlichenfalls
eine Base, beispielsweise Triethylamin oder dergleichen, zu und rührt die erhaltene Mischung, um die Verbindung IV herzustellen.
Zu den verwendeten Lösungsmitteln gehören konventionelle Lösungsmittel wie Chloroform, Dichlormethan, Dimethylformamid,
Tetrahydrofuran und dergleichen in dem Umfang, in dem das Ausgangsmaterial darin löslich ist. Die Reaktionstemperatur kann
im Bereich von 0 bis 400C liegen.
Nach Beendigung der Reaktion läßt sich die Verbindung IV aus
der Reaktionsmischung durch übliche Behandlung isolieren. Wenn
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man DCC als Aktivierungsmittel einsetzt, entfernt man den aus- ι
gefallenen Dicyclohexylharnstoff (DCU) durch Filtrieren und gibt j
ein geeignetes Extraktionslösimgsnittel, beispielsweise Äthyl- j
acetat, zum Filtrat. Danach wäscht man den Extrakt mit wäßriger ! Zitronensäurelösung, gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung, trocknet
über wasserfreiem Magnesiumsulfat und dampft dann unter vermindertem Druck ein, um das Lösungsmittel zu entfernen und die
Verbindung IV zu gewinnen.
Die Aminoschutzgruppe der Verbindung IV wird auf übliche Weise
entfernt. Wenn es sich bei der Aminoschutzgruppe um Benzyloxycarbonyl handelt, wird die Verbindung IV in einem geeigneten
Lösungsmittel aufgelöst, und ein Katalysator, beispielsweise
Palladium-auf-Aktivkohle oder dergleichen werden zur erhaltenen
Losung zugesetzt, um die Schutzgruppe reduktiv zu entfernen* Man
kann auch die Verbindung IV zu einer Lösung von Bromwasserstoffsäure in Essigsäure geben und die in Form des Hydrobromids ausgefällte Verbindung durch Filtrieren isolieren, um so die Verbindung der allgemeinen Formel I zu erhalten.
Die erf induncisgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I
eignen sich als ausgezeichnete Substrate für verschiedene Enzyme beispielsweise Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Urokinase, C1-Esterase, Thrombin, und dergleichen. Wenn man die erfindungsgemäßen
Verbindungen I mit einem Enzym in Kontakt bringt, dient die Verbindung als Substrat, und durch Hydrolyse mit dem Enzym wird
iiaphthol freigesetzt, welches nach einer vorgegebenen Zeitspanne
gemessen wird, um die Wirksamkeit des Enzyms zu bestimmen. Der
Umstand, daß die Wirksamkeit eines Enzyms leicht gemessen werden kann, ist für die quantitative Analyse einer Enzympräparation,
für die Diagnose durch Messung des Enzymspiegels im Blut, für
eine Diagnose durch Messung asr Enzymkonzentration in Blut oder
Urin, oder dergleichen, von wesentlicher Bedeutung.
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M/20 353
Wenn man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Wirksamkeit
eines Enzyms bestimmt, bringt man das Enzym mit einer vorgegebenen Menge der erfindungsgemäßen Verbindung I in einer geeigneten Pufferlösung in Kontakt und mißt nach einer vorgegebenen
Zeit bei vorgegebener Temperatur die Menge an freigesetztem
Naphthol, wodurch die Wirksamkeit des Enzyms bestimmt wird. Bei der Pufferlösung kann es sich um eine solche handeln, die den
optimalen pH für das Enzym aufweist. Man kann die Reaktion unter geeigneten konstanten Bedingungen hinsichtlich Temperatur und
Zeit durchführen, obgleich es bevorzugt ist, die bei einer Tempe ratur von 25 bis 37°C nach 30 Minuten freigesetzte Menge an
Naphthol zu messen.
Die Messung der Menge an Naphthol kann durch irgendeine bekannte Arbeitsweise erfolgen, beispielsweise durch eine physikochemische Methode, z.B. Gaschromatographie, Dünnschichtchromatoqraphie oder dergleichen, oder durch eine chemische Methode,
beispielsweise eine Eisen-I II-Chloridreaktion, eine Diazokupplungsreaktion, unter Anwendung der Fast-Violet-B-Salz-(FVB)-Methode, oder dergleichen. Bevorzugter im Hinblick auf Einfachheit und Bestimmungsempfindlichkeit ist eine Methode, bei der
man das FVB zur Reaktionsmischung zugibt, um eine Farbe zu entwickeln und die Extinktion mit Hilfe eines Photometers mißt.
Wenn man die Wirksamkeit von Plasmin unter Verwendung von D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-1-naphthylester als Substrat mißt,
ist die Bestimmungsempfindlichkeit 15mal größer als bei D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroanilid, das als Enzymsubstraf bekannt
ist, und sogar ungefähr 62mal größer als bei Verwendung des N<x-Tosyl-L-arginin methyl esters.
Die Menge des nach der genannten Methode bestimmten Naphthols entspricht der Wirksamkeit oder der Menge des Enzyms.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, die Enzym-;
konzentration im Blut oder Urin zu messen und die Menge eines Enzyms mit niedriger Wirksamkeit oder eines Enzyms bei niedrigen
Konzentrationen zu bestimmen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit
eines Enzyms läßt sich nicht nur auf ein System anwenden, welches nur ein einziges Enzym enthält, sondern auch auf ein
System, welches verschiedene Enzyme enthält. Die Bestimmung der Enzymverteilung im Urin oder Blut ist zur Diagnose von Erkrankunqen
von Bedeutung, die eingangs genannten üblichen Metho den wurden jedoch nicht allzu häufig angewendet, weil sie sehr
Komplex sind, £rfindungsqemäß ist jedoch diese Komplexheit
bzw. Kompliziertheit nicht mehr gegeben.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele und die anliegende Zeichnung weiter erläutert. In der Zeichnung stellt
Figur 1 Standardkurven für die Konzentration von Plasmin dar. Figur 2 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirksamkeit
von Plasmin in Humanplasma zeigt.
Beispiel 1
Herstellung von Ü-Valyl-L-leucyl-L-lysin-i-naphthylester-dihydrochlorid.
Man löst 1,8 g N-Benzyloxycarbonyl-D-valyl-L-leucin und 2,2 g
f^-Benzylcxycarbonyl-L-lysin-J-naphthylester-hydrochlorid in
1Ö ml DMF und gibt dann 1„3 g DCC, 0,89 g 1-Hydroxybenzotriazol
(HOBt) und 0,7 ffll Triäthylamin (TEA) zur erhaltenen Lösung unter
Eiskühlen zu. Dann rührt man die erhaltene Mischung 3 Stunden bei derselben Temperatur und anschließend 24 Stunden bei
Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion entfernt man den ausgefällten
DCU durch Filtrieren und gibt Äthylacetat zum Filtrat
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Die erhaltene Mischung wird mit 10 %-iger Zitronensäurelösung,
gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge gewaschen und anschließend
über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wird durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der
Rückstand wird aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält
1,5 g (Ausbeute 39 %) N-Benzyloxycarbonyl-D-valyl-L-leucyl-Nf -benzyloxycarbonyl-L-lysin-1-naphthylester in Form eines weißen
Pulvers mit Schmelzpunkt 171 bis 174°C.
IR/)KBr cm"1: 3300, 1740, 1680, 1635.
Πΐα Χ
1,5 g des obigen Esters werden in 10 ml DMF aufgelöst. Dann gibt man 1,0 g 10 % Pal 1adium-auf-Aktivkohle (Pd-C) und 1,6 g
Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung (110 mg HCl/g) zu. Die erhaltene Mischung wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt,
während man Wasserstoffgas durchleitet. Nach beendeter Reaktion entfernt man das Pd-C durch Filtrieren und gibt 100 ml
wasserfreien Diäthyläther zum Filtrat, wobei eine ölige Substanz ausfällt. Die überstehende Flüssigkeit wird durch Dekantieren entfernt und die ölige Substanz wird mit Diäthyläther
gewaschen. Man erhält 0,8 g (Ausbeute 73 %) D-Valyl-L-leucyl-L
lysin-1-naphthylester-dihydrochlorid.
Das als Ausgangsmaterial eingesetzte N-Benzyloxycarbonyl-D-valyl-L-leucin wird wie folgt hergestellt:
Man löst 54 g N-Benzyloxycarbonyl-D-valin und 39 g Leucinmethy
ester-hydrochlorid in 250 ml Tetrahydrofuran (THF) auf und
gibt dann 68 g DPPA und 70 ml TEA zur erhaltenen Lösung unter Eiskühlung zu. Die erhaltene Mischung wird 24 Stunden bei Raum
temperatur gerührt. Man konzentriert die Reaktionsmischung
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unter vermindertem Druck und gibt Äthylacetat zum Rückstand zu,
um diesen aufzulösen. Die erhaltene Lösung wird mit 10 %-iger Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und
gesättigter Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge gewaschen und dann unter verringertem Druck destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Man kristallisiert den Rückstand aus Äthylacetat/n-Hexan um. Man erhält 30 g (Ausbeute 37 %) N-Benzyloxycarbonyl-D-valyl-L-leucinmethylester in Form farbloser, nadeiförmiger Kristalle mit Schmelzpunkt 112 bis 114°C.
lIl cm"1: 3300, 1730, 1690, 1640.
ma χ
Man löst 30 g des obigen Esters in 400 ml Methanol und gibt zur
erhaltenen Lösung 120 ml 1f! Natriumhydroxid lösung zu. Dann wird
die erhaltene Mischung 3 Stunden lang gerührt. Nach beendeter Reaktion wird das Methanol unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur verdampft. Dann gibt man Äthylacetat zum Rückstand zu und schüttelt die erhaltene Mischung. Die wäßrige
Schicht wird mit 10 ^-iger Chlorwasserstoffsäure schwach sauer
gemacht. Dann wird die auf diese Weise ausgefällte ölige Substanz mit Äthylacetat extrahiert, Man wäscht den Extrakt mit
Wasser, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und destilliert dann unter vermindertem Druck, um das Lösungsmittel zu
entfernen. Den Rückstand kristallisiert man aus Äthylacetat/n-Hexan um» wobei man 19,0 g {Ausbeute 66 %) N-ßenzyloxycarbonyl-D-valyl-L-leucin in Form farbloser, nadelförmiger Kristalle
mit Schmelzpunkt 134 bis 136°C erhält.
1* V^?!I cm"1: 3350, 33QG, 1730, 1640.
Das als Ausgangsmaterial eingesetzte Hg«
lysin-1-naphthylester-hydrochlorid wird folgendermaßen hergestellt:
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-_ 29A3 581
In einem gemischten Lösungsmittel aus 25 ml Toluol und 25 ml Pyridin löst man 11,4 g Na-t-Butoxycarbonyl-Nf-benzyloxycarbonyl-L-lysin
und gibt dann unter Eiskühlen 5,2 g Benzolsulfonylchlorid
zur Lösung und rührt dann die erhaltene Mischung bei derselben Temperatur 3 0 Minuten lang. Zur Mischung gibt man 4,2
1-Naphthol und rührt die erhaltene Mischung 3 Stunden lang. Dann rührt man 24 Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach beendeter
Reaktion gibt man Äthylacetat zur Mischung zu und wäscht die Mischung mit 10 %-iger Zitronensäurelösung, gesättigter
Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat
und verdampft dann unter vermindertem Druck, um das Lösungsmittel zu entfernen. Auf diese Weise erhält man 13,2 g (Ausbeute 87 %)
Na-t-Butoxycarbonyl-Nf-benzyloxycarbonyl-L-lysin-i-naphthylester
in Form einer farblosen öligen Substanz.
1^ vfeUtlich cm"1: 3300, 1750, 1690.
max
13,2 g des obigen Esters werden in 25 g Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung
(110 mg HCl/g) gelöst und die Lösung wird 1,5
Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man dampft die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck zur Trockne ein und gibt
wasserfreien Diäthylather zum Rückstand. Die erhaltene Mischung
wird 24 Stunden lang stehengelassen und das auf diese Weise ausgefallene farblose Pulver wird gesammelt. Man erhält 11,0 g
(Ausbeute 95 %) Nt-Benzyloxycarbonyl-L-lysin-i-naphthylesterhydrochlorid
mit Schmelzpunkt 80 bis 82 0C.
IR vKBr cm"1: 3300, 2800, 1750, 1680.
niclX
030022/0582
Herstellung von N-Benzoyl-L-valyl-L-leucyl-L-lysin-1-naphthylester-hydrochlorid.
Man löst 1,7 g N-Benzoyl-L-valyl-L-leucin und 2,2 g Ng -Benzyloxycarbonyl-L-lysin-i-naphthylester-hydrochlorid in 15 ml DMF
und gibt dann unter Eiskühlung 1,33 g DCC, 675 mg HOBt und 1,0 ml TEA zur Lösung zu und rührt dann die erhaltene Mischung
3 Stunden bei derselben Temperatur und anschließend 24 Stunden bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion wird der ausgefallene DCU durch Filtrieren entfernt und man gibt Äthylacetat
zum Filtrat. Die erhaltene Mischung wird mit 10 %-iger Zitronen säurelösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge gewaschen, über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet tmd dann unter vermindertem Druck eingedampft, um das Lösungsmittel zu entfernen.
Man kristallisiert den Rückstand aus Chloroform/Diäthyläther um Man erhält hierbei 1,7 g (Ausbeute 41 %) a-Benzoyl -L-valyl -L-leucyl-%-benzyloxycarbonyl-L-lysin-i-naphthylester in Form
eines farblosen Pulvers mit Schmelzpunkt 153 bis 156°C.
Ifi^ cm'1; 3300, 1750, 1690, 1630.
ma χ
«an löst 1,4 g des obigen Esters in 10 ml OMF und gibt dann 5,5 g 1Ö I-i^es Pd-C und 1,0 g Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung (98 mg HCl/g) zur Lösung. Die erhaltene Mischung wird
4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, während man Wasserstoffgas durchleitet. Nach der Reaktion entfernt man das Pd-C durcn
Filtrieren und gibt 100 ml wasserfreien Diäthylä'ther zum
Filtrat. Das auf diese Weise ausgefällte weiße Pulver wird gesammelt. Man erhält 910 mg (Ausbeute 73 %) N-Benzoyl-L-valyl-L-leucyl-L-lysin-i-naphthylester-hydrochlorid mit Schmelzpunkt
190 bis 192°C (Zers.).
030022/0582
m/20 353 -y/- 4f' 29A3581
IR^i?« cm"1: 3300, 2950, 1750, 1630.
ma X
Das als Ausgangsmaterial eingesetzte N-Benzoyl-L-valyl-L-leucin
wird wie folgt hergestellt:
Man löst 11,0 g N-Benzoyl-L-valin und 9,0 g L-Leucinäthylesterhydrochlorid in 100 ml Dichlormethan und gibt dann 15,0 g DPPA
und 15 ml TEA unter Eiskühlung zur Lösung. Dann rührt man die erhaltene Mischung bei derselben Temperatur 24 Stunden lang.
Man wäscht die Reaktionsmischung mit 10 55-iger Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösüng und gesättigter
Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und dampft dann unter vermindertem
Druck ein, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wird aus Chloroform/Diäthyläther/n-Hexan umkristallisiert, wobei man
6,0 g (Ausbeute 35 %) N-Benzoyl-L-valyl-L-leucinäthylester in
Form farbloser nadeiförmiger Kristalle mit Schmelzpunkt 159 bis 1600C erhält.
IR v^C cm"1: 3300, 3250, 1750, 1630.
ιΠα Χ
Man löst 5,0 g des obigen Esters in 150 ml Methanol und gibt 20 ml 1N Natriumhydroxidlösung zur Lösung. Man rührt die Mischung 8 Stunden bei Raumtemperatur. Die Reaktionsmischung wird
bei tiefer Temperatur konzentriert, anschließend werden Äthylacetat und destilliertes Wasser zum Rückstand zugegeben. Die
erhaltene Mischung wird geschüttelt und die wäßrige Schicht wird abgetrennt und mit 10 %-iger Chlorwasserstoffsäurelösung
schwach sauer gemacht. Die so ausgefüllte ölige Substanz wird mit Äthylacetat extrahiert. Den Extrakt wäscht man mit Wasser
und trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat.""Danach wird
unter verringertem Druck eingedampft, um das Lösungsmittel zu entfernen. Auf diese Weise erhält man 3,0 g (Ausbeute 65 %)
030022/0582
N-Benzoyl-L-valyl-L-leucin in Form einer farblosen öligen Substanz.
IRv)deutlich cn|-1. 330()>
1720) 1630>
2950#
max
Messung der Wirksamkeit von Plasmin unter Verwendung von D-Valyl-L-leucyl-l-lysin-i-naphthylester-dihydrGchlorid als Substrat.
Zu 1,7 ml 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gibt man 0,1 ml
Plasmin in verschiedenen Konzentrationen und 0,2 ml 1,5 mM D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-i-naphthylesterlösung zu. Anschließend
inkubiert man die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 37°C.
Nach dem Kühlen in Eis gibt man 0,1 ml einer 1 «-igen FVB-Lösunj
zur Mischung. Man läßt die Mischung 10 Minuten bei G0C stehen
und gibt dann 1 ml Eisessig zu. Die auf diese Meise entwicfcelte
Farbe wird als Extinktion {505 nm) mit Hilfe eines Spektrophoto
meters gemessen, um die Menge an Naphthol zu bestimmen, welche durch Hydrolyse mit dem Enzym freigesetzt wurde. Als Kontrolle
verwendet man dieselbe, plasminfreie Pufferlösung. Die Menge
an freigesetztem Naphthol entspricht der Wirksamkeit des Enzyms
Bei Verwendung von N-Benzoyl-L-valyl-L-leucyl-L-lysin-1-naphthy
ester-hydrochlorid als Substrat wurde dieselbe Arbeitsweise wie zuvor angewendet» tms die Wirksamkeit ues Enzyms zu «essen*
030022/0582
Messung der Wirksamkeit von Plasmin unter Verwendung von Ne-Tosyl-L-argininmethylester-hydrochlorid als Substrat.
Zu 0,2 ml Plasmin gibt man 0,3 ml N«-Tosyl-L-argininmethylester
hydrochloridlbsung (10 Mikromol/0,4 ml 5 % DMSO) und 0,5 ml
einer Boratpufferlösung (pH 8,5) und inkubiert die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 37°C. Dann gibt man 1,5 ml alkalische
Hydroxylaminlösung (eine Mischung gleicher Mengen von 2 M NH2OH-HydrochloHd und 3,5 M NaOH) zu. Die erhaltene Mischung wird
15 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Man gibt 1 ml 18 %-ige Trichloressigsäure, 1 ml 4N Chlorwasserstoffsa'ure und
1 ml 10 %-ige Eisen-I II-Chloridlbsung zu und rührt die erhalten«
Mischung gründlich. Dann wird die Mischung 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Die Farbe der überstehenden Flüssigkeit
wird als Extinktion (530 nm) mittels eines Spektrophotometers gemessen. Der so erhaltene Wert entspricht der Menge an unhydrolysiertem Substrat, und die Wirksamkeit des Enzyms entspricht dem Unterschied zwischen dem Wert, den man ohne Verwendung eines Enzyms erhält (Kontrolle) und dem Wert, den man nach
der Enzymreaktion erhalt.
Messung der Wirksamkeit von Plasmin unter Verwendung von D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroanilid-dihydrochlorid als Substrat.
Zu 2,15 ml einer 0,1 μΜ tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gibt man
0,1 ml Plasmin in verschiedenen Konzentrationen und 0,25 ml D-VaIyl-L-Ieucyl-L-Iysin-p-n1troanilId-dihydrochloridlösung
(1 mM/H20) und inkubiert dann die erhaltene Mischung 30 Minuten
bei 37°C. Dazu gibt man 0,3 ml Eisessig, und die entwickelte
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M/20 353
- \y-io
29A3581
Farbe wird als Extinktion (405 nm) mit Hilfe eines Spektrophotolmeters gemessen.
Vergleichsbeispiel 2 erzielten Ergebnisse sind in Figur 1 dar- ί
gestellt. Der Figur 1 ist zu entnehmen, daß die Methode gemäß Beispiel 3 eine Bestimmungsempfindlichkeit aufweist, die ungefähr 60mal größer als die Methode des Vergleichsbeispiels 1
und ungefähr 15mal größer als die Methode des Vergleichsbeispiels 2 ist.
In Figur 1 stellt Kurve A eine Standardkurve dar, die anhand der Methode gemäß Beispiel 3 erhalten wurde. Kurve ß 1st eine
Standardkurve, die nach der Methode des Vergleichsbeispiels erhalten wurde und Kurve C ist eine Standardkurve, die nach
der Methode des Vergleichsbeispiels 2 erhalten wurde. Die Zahlei
in den Klammern auf der Abszisse beziehen sich auf die Enzymkonzentrationen für die Kurve B.
Die nachfolgende Tabelle führt die erzielten relativen Empfindlichkeiten auf, wenn die Wirksamkeiten anderer Enzyme mit Hilfe
der Methoden des Beispiels 3 bzw. des Vergleichsbeispiels 2
gemessen werden.
| Enzym Substrat |
Faktor Xa | KallikrBin | Gewebe |
| D-Valyl-L-leucyl-L-lysin- 1-naphttvylester-diftyidro- chiorid |
30,0 | Plasma | 8,5 |
| D-Valyl-L-leucyl-L-lysin- p-nitroanilid-dihydro- chlorid |
1,0 | 30,0 | 1.0 |
| 1.0 |
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M/20 353
Zu 5 Mikrolitern zitriertem Humanplasma gibt man 0,8 ml 50 mM
Phosphatpufferlösung (pH 7,0) und rührt die erhaltene Lösung
gründlich. Danach gibt man 0,1 ml einer Streptokinase! ösung zu (100 Einheiten Streptokinase werden in 0,1 ml 50 mM Phosphat-
pufferlösung (pH 7,0) aufgelöst). Die erhaltene Mischung wird j
30 Minuten bei 37°C inkubiert, und man gibt 0,1 ml einer wäßrigein Lösung eines Substrats (D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-1-naphthylester-dihydrochlorid) (0,1 Mikromol/0,1 ml HpO) zu, um Probe (i)
herzustellen. Als Kontrolle wurden 0,9 ml der obigen 50 mM Phosphatpufferlösung und 0,1 ml der obigen wäßrigen Lösung von
Substrat zu 5 Mikroliter des obigen zitrierten Humanplasmas zugegeben, um Probe (ii) herzustellen. Dann gab man 0,1 ml der
obigen wäßrigen Lösung des Substrats zu 0,9 ml der obigen 50 mM Phosphatpufferlösung, um die Probe (iii) herzustellen.
Jede der Proben wurde 30 Minuten bei 25°C inkubiert und unmittel
bar danach in Eiswasser abgekühlt. Dann gab man 0,1 ml 1 % FVB zu. Die erhaltene Mischung wurde 30 Minuten lang in Eiswasser
stehengelassen, und anschließend wurden 1 ml Eisessig zugesetzt. Einige Stunden später wurde die Extinktion jeder Probe bei 515 nm
gemessen, und die Menge an Plasminogen im Humanplasma wurde berechnet, indem man die Gesamtsumme der Extinktionen von Probe
(ii) und von Probe (iii) von der Extinktion der Probe (i) abzog. Die Menge an Plasminogen in der Probe wird anhand der Standardkurve (Kurve A) für Humanplasmin gemäß Figur 1 auf die Plasminmenge reduziert und aufgetragen. Die Ergebnisse der Bestimmungen des Plasminogens in Humanplasma nach dieser Methode sind in
Figur 2 dargestellt. Die dort verwendeten Plasmaproben wurden al Proben Nr. 1 bis 4 von vier verschiedenen männlichen Personen
erhalten.
— 24 /W
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Claims (8)
1. / VaIyIleucyllysinderivate der allgemeinen Formel I
CH3
CH, CHCH, NH0
I 3 I3I2 (I)
CHCH3 CH2 (CH2J4
CONH
worin R. für Wasserstoff oder Benzoyl steht und R2 für
Naphthyl steht.
2. D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-i-naphthylester.
3. N-Benzoyl-L-valyl-L-leucyl-L-lysin-1-naphthyTester.
4. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine
Verbindung der allgemeinen Formel II:
CH, CHCH,
,3 ,3
CHCH3 CH2 (II)
CONH^ ^COOH
worin R3 für Benzoyl oder eine Aminoschutzgruppe steht,
mit einem Lysinderivat der allgemeinen Formel III:
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M/20 353 - 2 -
NHR4
(CH2)4 (III)
worin R2 für Naphthyl steht und R4 eine Aminoschutzgruppe
darstellt,
in an sich bekannter Weise einer dehydratisierenden Kondensation
unterwirft, um eine Verbindung der allgemeinen Formel IV zu erhalten:
CH,
I 3
CH, CHCH0 NH-R-
I I I
CHCH3 CH2 ^CH2J4
CONH^ ^CONH^ ^COOR2
worin R2. R3 und R4 die vorstehenden Bedeutungen besitzen,
und
in an sich bekannter Weise die Aminoschutzgruppe von der Verbindung der allgemeinen Formel IV entfernt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man
die dehydratisierende Kondensation bei einer Temperatur
zwischen 0° und 400C in einem Lösungsmittel durchführt.
6. Verwendung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Enzyms durch in
Kontakt bringen der Verbindung als Substrat mit dem Enzym,
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym mit einer Verbindung nach einem der Ansprüche
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1 bis 3 während eines vorgegebenen Zeitraums in Kontakt bringt und anschließend die durch Hydrolyse mit Hilfe des
Enzyms freigesetzte Menge an Naphthol bestimmt.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Plasmin verwendet.
030022/0582
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| JP13339478A JPS5559149A (en) | 1978-10-30 | 1978-10-30 | Aminoacid derivative |
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| Chem. Abstracts 90, 1979, Referat Nr. 116 846 * |
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