DE3136511A1

DE3136511A1 - Leucylalanylargininderivate, verfahren zur deren herstellung und deren verwendung

Info

Publication number: DE3136511A1
Application number: DE19813136511
Authority: DE
Inventors: Setsuro Toyonaka Fujii; Mamoru Sakura Sugitomo; Takashi Funabashi Yaegashi
Original assignee: Torii and Co Ltd
Current assignee: Torii and Co Ltd
Priority date: 1980-09-16
Filing date: 1981-09-15
Publication date: 1982-04-01
Also published as: FR2490221A1; GB2086911A; DE3136511C2; US4418012A; JPS6342636B2; GB2086911B; FR2490221B1; JPS5753445A

Description

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTTER/: ""DR^ WEKNER KINZEBACH DR. ING. WOLFRAM BUNTE

REITSTÖTTER. KINZEBACH & PARTNER POSTFACH 7SO, D-BOOO MÜNCHEN 43

PATENTANWÄLTE ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT EUROPEAN PATENT ATTORNEYS

BETREFF: RE

telefon: (oa9) z 71 es 83 TELEX: OS21S2OS ISAR O BAUERSTRASSE 22. D-SOOO MÜNCHEN

15. September 1981

UNSERE AKTE:

OURREF: M/22 206

TORII & CO., LTD.

3, Nihonbashi-Honcho-S-chome

Chuo-ku

Tokio / Japan

Leucylalanylargininderivate, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

POSTANSCHRIFT; D-8OOO MÜNCHEN 43. POSTFACH 7BO

M/22 206 - 4*

Die Erfindung betrifft Leucylalanylargininderivate , ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen, wobei die erfindungsgemäßen Verbindungen als Substrat dienen.

Bislang gibt es zahlreiche Methoden zur Bestimmung der Wirksamkeit von Enzymen. Eine Methode besteht darin, daß man einen Alkylester einer Aminosäure als Substrat mit einem Enzym zusammenbringt und die Wirksamkeit des Enzyms anhand des Hydrolysegrads des Alkylesters bestimmt. Ein Beispiel für diese Methode ist die bekannte Hestrin-Methode. Es handelt sich hierbei um eine Arbeitsweise, bei der man ein Enzym mit einem Alkylester einer Aminosäure in Kontakt bringt, nach einem vorgegebenen Zeitraum die restlichen Estergruppen mit Hydroxylamin in Hydroxamsäure überführt, diese mit Eisen-III-Chlorid reagieren läßt, um eine Farbe zu entwickeln und die Farbe als Extinktion mißt. Hierdurch wird die Fähigkeit des Enzyms zur Hydrolyse des Esters bestimmt und somit ergibt sich aus der Extinktion auch die Wirksamkeit des Enzyms.

ι
Es gibt auch ein Verfahren, bei dem ein p-Nitroanilid einer Aminosäure als Substrat eingesetzt wird und die Fähigkeit zur Hydrolyse dieser Verbindung als Index dient. Bei diesen Arbeitsweisen ist eine beträchtliche Menge an Enzym erforderlich, und wenn die Enzymkonzentration niedrig ist oder das Enzym eine geringe Wirksamkeit besitzt, so stößt.die Messung der Wirksamkeit des Enzyms auf Schwierigkeiten.

Erfindungsgemäß wurden ausgedehnte Untersuchungen vorgenommen, um Verbindungen zu schaffen, welche den nachfolgenden drei Bedingungen entsprechen: Sie besitzen gegenüber den Enzymen eine Affinität, ihre Menge muß leicht bestimmbar sein und die Bestimmungsempfindlichkeit muß gut sein, überraschend wurden

M/22 206 - * -

Verbindungen geschaffen, die als Substrat brauchbar sind und im Vergleich mit den üblichen Verbindungen den drei Bedingungen in ausgezeichneter Weise gerecht werden. Es wurde auch eine einfache Arbeitsweise zur Bestimmung der Wirksamkeit von Enzymen unter Anwendung der genannten Verbindungen geschaffen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Aminosäurederivate zu schaffen, die sich als ausgezeichnetes Substrat für Enzyme eignen. Es soll auch ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Aminosäurederivate geschaffen werden. Ferner soll eine Methode zur Bestimmung der Wirksamkeit von Enzymen geschaffen werden, bei denen man die neuen Aminosäurederivate als Substrat für das bzw. die Enzyme einsetzt.

ErfindungsgemäS werden Leucylalanylargininderivate der allgemeinen Formel (I) geschaffen:

worin R₁ Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, R₂ und R₃ Wasserstoff oder Guanidinoschutzgruppen bedeuten und R₄ Naphthyl (cc- und ß-Naphthyl ) bedeutet.

Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Herstellung der Leucylalanylargininderivate der allgemeinen Formel (I), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (II)

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H₃C

CH,

R₁₁NH \ CO-NH

COOH

(ID

worin R₁ ι für eine Aminoschutzgruppe steht, mit einem Arginin· derivat der allgemeinen Formel (III)

R₂.-

NH

NH-R₃,

(III)

worin R^i und R₃, für Guanidinoschutzgruppen stehen und R, für Naphthyl steht, in an sich bekannter Weise dehydratisierend kon· densiert, um eine Verbindung der allgemeinen Formel (IV) zu erhalten:

H₃C\^CH₃

^R2'-^N

'CH,

CH,

R₁₁-NH ^XCO-NH'

CO-NH

COOR,

(IV)

worin R₁,, R₉₁, R-, und R» die oben genannten Bedeutungen besitzen, und anschließend, falls nötig, die Aminoschutzgruppe

und/oder die Guanidinoschutzgruppen in an sich bekannter Weise aus der Verbindung der allgemeinen Formel (IV) entfernt.

Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Enzyms geschaffen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Leucylalanylargininderivat der allgemeinen Formel (I) als Substrat mit dem Enzym in Kontakt bringt.

Als Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel (II) zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) kann man jedwede verwenden, die im Handel erhältlich sind. Man kann die Ausgangsverbindungen auch herstellen, indem man eine Verbindung der allgemeinen Formel (V)

(V) COOH

worin R., dieselbe Bedeutung wie zuvor besitzt, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (VI)

NH₂ COOR₅

worin R₁- für Alkyl steht, zu einem Ester der allgemeinen Formel (VII) kondensiert:

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- JS -

CH,

(VII)

worin R-, und Rg dieselben Bedeutungen wie zuvor besitzen, und anschlieSend den Ester der allgemeinen Formel (VII) hydrolysiert.

Zu den Arginin-Ausgangsderivaten der allgemeinen Formel (III) gehören N^ ,N^-Dibenzyl oxycarbonyl-L-arginin-1-naphthylester und dergleichen. Diese Verbindungen können hergestellt werden, indem man ein Argininderivat mit einer geeigneten Schutzgruppe der allgemeinen Formel (III¹)

-N—<

NH

R₆-NH

NH-R

(in¹)

COOH

worin R„_r und R₃, dieselben Bedeutungen wie zuvor besitzen und Rf- für eine von- den R₉₁ und R^,-Gruppen verschiedene Aminoschutzgruppe steht, naphthyliert, um eine Verbindung der allgemeinen Formel (IH") zu bilden:

M/22 206 -Ji -

R₂,-N-X_n^

(CH.). CHI")

R₆-NH^^ COOR₄

worin R₂,, R₃₁, R₄ und R_g dieselben Bedeutungen wie zuvor besitzen, und anschließend lediglich die Aminoschutzgruppe in der ^-Position aus der Verbindung (IH") selektiv entfernt.

Zu den Aminoschutzgruppen in den Formeln (I), (II), (III), (III¹), (IH"), (IV), (V) und (VII) gehören allgemein in der Synthese von Peptiden verwendete Schutzgruppen, beispielsweise t-Butyloxycarbonyl , Benzyloxycarbonyl, Acetyl, Benzoyl , Tosyl und dergleichen, wovon Acetyl und Benzoyl bevorzugt sind. Zu den Guanidinoschutzgruppen gehören Nitro, Tosyl, Benzyloxycarbonyl oder dergleichen, oder die Guanidinogruppe kann durch Protonenaddition ein Säureadditionssalz bilden, wobei die Benzyloxycarbonylgruppe bevorzugt wird.

Zur Herstellung der Verbindung (IV)löst _man die Verbindung (II) und das Argin inder i va t (111) in einem geeigneten Lösungsmittel auf und qibt zur erhaltenen Lösung ein Aktivierungsmittel, das üblicherweise eingesetzt wird, beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diphenyl phosphoryl az.id (DPPA), ein Alkylchlorcarbonat oder dergleichen. Anschließend setzt man erforderlichenfalls eine Base zu, beispielsweise Triäthylamin oder derqleichen, und rührt die erhaltene Mischung, um die Verbindung (IV) herzustellen. Zu den eingesetzten Lösungsmitteln gehören übliche Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform, Dichlormethan,

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Dimethylformamid, Tetrahydrofuran und dergleichen, soweit die Ausgangsmaterialien darin löslich sind. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich von 0 bis 40⁰C liegen.

Nach Beendigung der Reaktion läßt sich die Verbindung (IV) aus der Reaktionsmischung auf übliche Weise isolieren. Wenn man DCC als Aktivierungsmittel einsetzt, wird der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff (DCU) durch Filtrieren entfernt, und man gibt ein geeigntes Extraktionslösungsmittel, beispielsweise Äthylacetat, zum Filtrat. Danach wird der Extrakt mit einer wäßrigen Zitronensäurelösung, einer gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und/oder einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend dampft man unter verringertem Druck ein, um das Lösungsmittel zu entfernen und die Verbindung (IV) zu gewinnen.

Die Aminoschutzgruppe und/oder die Guanidinoschutzgruppen der Verbindung der allgemeinen Formel (IV) werden auf übliche Weise entfernt. Wenn es sich bei der Aminoschutzgruppe und den Guanidinoschutzgruppen um Benzyloxycarbonyl handelt, löst man die Verbindung der allgemeinen Formel (IV) in einem geeigneten Lösungsmittel und gibt einen Katalysator, beispielsweise Palladium-auf-Aktivkohle oder dergleichen, zur erhaltenen Lösung zu, um die Schutzgruppe oder -gruppen reduktiv zu entfernen. Man kann die Verbindung der allgemeinen Formel (IV) auch zu einer Lösung von Bromwasserstoffsäure in Essigsäure geben und das ausgefallene . Hydrobromidsalζ aer gewünschten Verbindung durch Filtrieren gewinnen, um die Verbindung der allgemeinen Formel (I) zu erhalten .

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind als ausgezeichnete Substrate für verschiedene Enzyme geeig-

31 365 Ί1

μ/22 206 - γ -

net, beispielsweise für Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Urokinase, C1-Esterase, Thrombin und dergleichen. Wenn man die erfindungsgemäße Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einem Enzym in Kontakt bringt, dient die Verbindung als Substrat und durch Hydrolyse mit dem Enzym wird Naphthol freigesetzt. Nach einer vorgegebenen Zeitspanne mißt man die Menge an Naphthol, um die Wirksamkeit des Enzyms zu bestimmen. Die Tatsache, daß die Wirksamkeit eines Enzyms äußerst leicht gemessen werden kann, ist für die quantitative Analyse einer Enzympräparation, für die Diagnose durch Messung des Enzymspiegels im Blut, die Diagnose durch Messung der Enzymkonzentration im Blut oder Urin, oder dergleichen, äußerst wichtig.

Wenn man die Wirksamkeit eines Enzyms nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt, so wird das Enzym mit einer vorgegegebenen Menge der Verbindung der allgemeinen Formel (I) in einer geeigneten Pufferlösung in Kontakt gebracht, und nach einer vorgegebenen Zeitspanne bei vorgegebener Temperatur wird die Menge an freigesetztem Naphthol gemessen, um die Wirksamkeit des Enzyms zu bestimmen. Bei der Pufferlösung kann es sich um eine geeignete Pufferlösung mit optimalem pH für das Enzym handeln. Die Reaktion kann unter geeigneten konstanten Bedingungen hinsichtlich Temperatur und Zeit durchgeführt werden, obgleich es bevorzugt ist, bei einer Temperatur von 25 bis 37°C nach 30 Minuten die Menge an freigesetztem Naphthol zu messen.

Die Messung der^ Menge an Naphthol kann nach irgendeiner bekannten Methode erfolgen, beispielsweise durch physiko-chemische Methoden, z.B. Gaschromatographie, Dünnschichtchromatographie oder dergleichen, oder durch chemische Methoden, beispielsweise durch die Eisen-III-chloridreaktion, die Diazokupplungsreaktion , die Fast-Violet-B-Salz(FVB)-Methodej oder dergleichen. Im Hinblick auf Einfachheit und Bestimmungsempfindlichkeit ist eine

M/22 206 -VL-

Methode bevorzugt, bei der man das FVB zur Reaktionsmischung zugibt, um eine Farbe zu entwickeln und die Extinktion mit Hilfe eines Photometers bestimmt.

Wenn man die Aktivität von Thrombin mißt und hierbei Benzoyl-L-leucylalanyl-L-arginin-1-naphthylester als Substrat gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, ist die Sensitivität davon ungefähr 50mal größer als wenn man N«i-Tosyl argininmethylester oder Benzoylargininäthylester in dem Hestrin-Verfahren verwendet.

Die Menge des mit der erfindungsgemäßen Methode bestimmten Naphthols entspricht der Wirksamkeit oder der Menge des Enzyms.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich eine Änderung der Enzymkonzentration im Blut ader Urin aufgrund verschiedener Erkrankungen ohne weiteres feststellen.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele und die anliegenden Zeichnungen näher erläutert. Die Zeichnungen zeigen Standardkurven der Thrombinkonzentration. Dabei zeigt die Ordinate die Absorption und die Abszisse die Thrombinmenge (internationale Einheiten) an. Die Zahlen in den Klammern betreffen die Thrombinmenge im Fall von No(-Tosyl argininmethylester. Die Kurve A betrifft Leucylalanylarginin-naphthylester, Kurve B betrifft Benzoylleucylalany!arginin-naphthylester und Kurve C betrifft Ntf-Tosylarginin-methylester.

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Beispiel 1_

Herstellung von L-Leucyl-L-alanyl-argininil-naphthylester-ptoluolsulfonat

Man löst 1,01 g Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-alanin und 2,05 g N^N^-Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-i-naphthylester-trifluoracetat in 15 ml N ,N-Dimethylformamid (DMF), gibt dann unter Kühlen mit Eis 742 mg DCC, 446 mg 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 0,41 ml Triäthylamin (TEA) zu der Lösung, rührt die erhaltene Mischung 3 Stunden bei derselben Temperatur und rührt dann 24 Stunden bei Raumtemperatur. Nach Beendigung der Reaktion entfernt man das ausgefallene DCU durch Filtrieren, gibt fithylacetat zu dem Filtrat, wäscht die erhaltene Mischung mit 10 %-iger Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung, gesättigter Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und verdampft dann das Lösungsmittel bei vermindertem Druck. Den so erhaltenen Rückstand absorbiert man auf einer SiIicalgel säule und reinigt mit Chloroform, das 0,3 Gew.-% Methanol enthält. Den gereinigten Rückstand kristallisiert man aus ChIoroform-Diäthyläther um, wobei man 1,2 g (Ausbeute 45 %) eines weißen Pulvers von Benzyloxycarbonyl -L-leucyl -L-al any! -Ν«*" ,N ^ü-di benzyl oxy carbonyl L-arginin-1-naphthylester erhält, Fp. 179 bis 183⁰C.

IR v5* cm"¹: 3400, 3250, 1740, 1715, 1640.

ITi ei X

NMR δ ppm (CDGl₃+DMSO-dg) : 0.9 (6H₃ d, CH₃-^CH₃ )

1.3 (3H, d₃ ^^Η3 ), 1.7 (6H, b, -CHp-), -CH-

2.0 (3H, b, /CH₂, /CH-), 4.2 (3H, b, -NHCHCO- x 3), 5.1 (4h, s, -0-CH₂-^o) x 2), 5.3 (2H, s, -0-CH₂-^C))), 7.2-8.2 (22H, m, aromatische Protonen).

M/22 206

Man löst 886 mg des obigen Esters in 10 ml DMF, gibt 100 mg 5 % Palladium-auf-Aktivkohle (Pd-C) und 571 mg p-Toluolsulfonsäure-monohydrat zu der Lösung, rührt die erhaltene Mischung 2 Stunden, während man Wasserstoffgas hindurchleitet, entfernt dann die Pd-C durch Filtrieren, gibt wasserfreien Diäthyläther zu dem Filtrat und sammelt das so ausgefällte weiße Pulver, wobei man 690 mg (Ausbeute 83 %) L-Leucyl-L-alanyl-L-arginin-1-naphthylester-p-toluolsulfonat erhält, Fp. 71°C (Zers.).

: 3400, 1750, 1650

/^CH3

NMR δ ppm (DMSO-dg): 0.9 (6H, b,-\ ^J ), 1.3 (3H₁ d

CH₃

CH₃-CH-), 1.3-2.3 (7H, b, -CH₂-, -CH-), 3.2 (2H, b, -CH₂-NH-), 4.0-4.8 (3H, b, -NHCHCO- χ 3), 7.2-8.2 (17H, m aromatische Protonen)..

Beispiel 2

Herstellung von Benzoyl-L-leucyl-L-alanyl-L-arginin-1-nap htjiy_l_- ;^: ester-p-toluolsulfonat

Man löst 920 mg Benzoyl-L-leucyl-L-alanin und 2,05 g N^.N^Di- benzyl oxycarbonyl-L-arginin-1-naphthylester-trifluoracetat in ; 15 ml DMF, gibt dann unter Kühlen mit Eis 742 mg DCC, 446 mg ν HOBt und 0,42 ml TEA zu der erhaltenen Lösung, rührt die erhaltene Mischung 3 Stunden bei derselben Temperatur und rührt ; dann 24 Stunden bei Raumtemperatur. Man entfernt das ausge- ; fallene DCU durch Filtrieren, gibt Äthylacetat zu dem Filtrat,

M/22 206 - ψ -

wäscht dann die erhaltene Mischung mit 10 Gew.-%-iger Zitronensäure, gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge und trocknet dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat. Man entfernt das Lösungsmittel durch Verdampfen und kristallisiert den Rückstand 3mal aus ChIoroform-Diäthyläther um, wobei man 1,8 g

(Ausbeute 70,0 %) eines weißen Pulvers von Benzoyl-N-leucyl-N^,N^dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-1-naphthylester erhält, Fp. 178 bis 187⁰C.

IR v5i cm"¹: 3380, 3270, 17²K), 1718, I630

lila X

NMR δ ppm (CDCl₃): 0.9 (6h, d), 1.3 (3H, d), 1.5-2.2 (7H₅ m), 4.0 (2H, m), 4.2-5.0 (3H,

m), 5.1 (2H, s), 5.2 (2H₃ s), 7.0-8.0 Aromatische

Protonen).

Man löst 1,28 g des obigen Esters in 15 ml DMF, gibt dann •200 mg 10 % Pd-C und 342 mg p-Toluolsulfonsäure-monohydrat hinzu, rührt die erhaltene Mischung 3 Stunden unter Kühlen mit Eis, während man Wasserstoffgas hindurchleitet, filtriert die Reaktionsmischung, um die Pd-C zu entfernen, und gibt wasserfreien Diäthyläther zu dem Filtrat. Das ausgefallene weiße Pulver sammelt man, wobei man 1,0 g (Ausbeute 88 %) Benzoyl-L-leucyl-L-alany!-L-arginin-1-naphthyles ter-p-toluolsuIfonat erhält, Fp. 86'⁰C (Zers.).

M/22 206 -ti

lt

IR v*?^ cm"¹: 3^00, 1750, 1635.

Hid Λ

CH NMR δ ppm (DMSO-dg): 0.9 (6H, b,

1.3 (3H, d), 1.5-2.3 (7H, b, -CH₂ χ 3, -CH-), 2.3 (3H, s, CH--VÖVso_qH), 3.3 (2H, b, -CH₂N\), 4.6 (3H, b,-NHCHCO-) , 7.0-8.1 (17H₉ b, aromatische Protonen).

Beispiel 3

Messung der Wirksamkeit von Thrombin unter Verwendung von Benzoyl-L-leucyl-L-alanyl-L-arginin-1-naph thyTester als Substrat

Zu 1,7 ml einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gibt man 0,1 ml Thrombin in verschiedenen Konzentrationen und 0,2 ml einer Benzoyl-L-leucyl-L-alanyl-L-arginin-1-naphthylesterlösung (1 mM), gelöst in einer 10 %-igen wäßrigen Dimethylsulfoxidlösung. Man inkubiert die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 25°C, gibt danach 20 Mikroliter einer 8 Gew.-%-igen wäßrigen Natriumlaurylsulfatlösuhg/, kühlt die Mischung mit Eis und gibt dann 0,2 ml 1 % FVB hinzu. Man läßt die erhaltene Mischung 10 Minuten bei 0⁰C stehen, gibt 2 ml Eisessig hinzu und mißt.die Absorption (505 nm) des gebildeten Azofarbstoffs mit Hilfe eines Spektrophotometers, womit man die durch Hydrolyse mit dem Enzym freigesetzte Naphtholmenge bestimmt. Zur Kontrolle ersetzt man die Mischung aus der Pufferlösung und dem Thrombin durch 0,1 ml derselben Pufferlösung, die jedoch kein Thrombin enthält. Die freigesetzte Naphtholmenge entspricht der Wirksamkeit des Enzyms.

μ/22 206 -^:-"*^: -S^ ^:-^: -- 3136511

Die Ergebnisse der Absorptionsmessungen bei jeder Thrombinkonzentration gemäß der obigen Methode sind in den begleitenden Zeichnungen (Kurve B) gezeigt. Die Messung der Wirksamkeit von Thrombin unter Verwendung von L-Leucyl-L-alanyl-L-arginin-1-naphthylester führt man in derselben Weise aus, wie es für den Benzoyl-L-leucyl-L-alanyl-L-arginin-1-naphthylester (Kurve A) beschrieben ist.

Vergleichsbeispiel 1

Messung der Wirksamkeit von Thrombin unter Verwendung von N^-Tosyl-L-arginin-methylester als Substrat

Zu 0,1 ml Thrombin gibt man 0,3 ml einer N<x-Tosyl -L-argininmethylesterlösung (10 Mikromol/0,4 ml 5 % DMSO) und 0,6 ml einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,4). Man inkubiert die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 37°C, gibt dann 1,5 ml einer Hydroxylaminlösung (eine Mischung von gleichen Anteilen 2 M NH₂0H-Hydrochlorid und 3,5 M NaOH) hinzu und läßt die erhaltene Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dazu gibt man 1 ml einer 18 Gew.-%-igen Trichloressigsäurelösung, 1 ml 4 N ChI orwasserstoffsäure und 1 ml einer 10 Gew.-%-igen Eisen-III-chloridlösung. Die erhaltene Mischung rührt man kräftig und zentrifugiert dann 10 Minuten bei 3000 U.p.m. Die so entwickelte Farbe der überstehenden Flüssigkeit mißt man als Absorption (530 nm) mit Hilfe eines Spektrophotometers Der erhaltene Wert entspricht der verbleibenden Substratmenge, die nicht mit Thrombin hydrolysiert wurde. Die Wirksamkeit des Enzyms entspricht daher dem Unterschied zwischen dem Wert, den man erhält, wenn kein Enzym verwendet wird (Kontrolle) und dem nach der Enzymreaktion erhaltenen Wert (Kurve C).

111/V.

Claims

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Patentansprüche

1Λ Leucylalanylargininderivate der allgemeinen Formel (I)

worin

R₁ für Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe steht, R₂ und R₃ für Wasserstoff oder Guanidinoschutzgruppen stehen, und

R₄ für Naphthyl steht.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ für Wasserstoff steht.
3. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R> für Acetyl, Benzoyl oder Benzyloxycarbonyl steht.
4. Verbindungen nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ und R₃ für Benzyloxycarbonyl stehen
5. L-Leucylalanyl-L-arginin-1-naphthy!ester.
6. Benzoyl-L-leucylalanyl-L-arginin-1-naphthylester.

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7. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (II)

CH,

COOH

(II)

worin R., für eine Aminoschutzgruppe steht j mit einem Argininderivat der allgemeinen Formel (III)

R₀, -N <f

NH

NH-R₃₁

(CH₂)₃

H₂N

(III)

worin R_?I und

für Guanidinoschutzgruppen stehen, und

R» für Naphthyl steht, in an sich bekannter Weise dehydrati sierend kondensiert, um eine Verbindung der allgemeinen Formol (IV) zu erhalten:

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,-NH

CH,

CONH-

CH,

(CH₂)

NH NH-R₃,

• CONH

COOR,

(IV)

worin

un

d R. die oben gegebenen Bedeutungen besitzen, und dann gewünschtenfal1s die Aminoschutzgruppe und/oder die Guanidinoschutzgruppen in an sich bekannter Weise aus der Verbindung der allgemeinen Formel (IV) LmI-fernt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dab man die dehydratisierende Kondensationsreaktion bei einer Temperatur von 0° bis 40⁰C in einem Lösungsmittel durchführt.
9. Verwendung der Leucylalanylargininderivate gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 als Substrat zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Enzyms.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Leucylalanylargininderivate der allgemeinen Formel (I) während eines vorbestimmten Zeitraums mit dem Enzym in Kontakt bringt und anschließend die durch Hydrolyse mit dem Enzym freigesetzte Naphtholmenge mißt.
11. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man Thrombin als Enzym verwendet.