DE19829707C2 - Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Leukozyten, Elastasen, Esterasen und Proteasen - Google Patents

Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Leukozyten, Elastasen, Esterasen und Proteasen

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein diagnostisches Mittel, mit dem Enzyme wie Esterasen, Elastasen und/oder Proteasen nachgewiesen werden können, und insbesondere auf ein dia­ gnostisches Mittel, das zum Nachweis von Leukozyten in Kör­ perflüssigkeiten, insbesondere im Harn, verwendet werden kann. Die Erfindung bezieht sich ferner auf einen neuen a- Hydroxyvaleriansäureester sowie auf dessen Verwendung als Substrat für diagnostische Mittel und auf dessen Herstel­ lung. Der neue a-Hydroxyvaleriansäureester wird im Verlauf der Nachweisreaktion zu einer detektierbaren Verbindung um­ gesetzt und kann sinnvollerweise in diagnostischen Schnell­ tests auf Teststreifenbasis verwendet werden.
Die Ausscheidung von Leukozyten über den Harn stellt ein wichtiges Leitsymptom bei Erkrankungen der Niere und des Urogenitaltraktes dar. Daher haben Verfahren zum Nachweis von Leukozyten im Harn im Rahmen der medizinischen Diagno­ stik eine hohe Bedeutung. Nachweismethoden für Leukozyten sind seit längerem bekannt. So kann der Nachweis mikrosko­ pisch erfolgen, indem die in einem bestimmten Harnvolumen enthaltenen Leukozyten ausgezählt werden. Diese Methode ist jedoch sehr zeit- und personalaufwendig und sehr ungenau, da andere feste Harnbestandteile eine exakte Bestimmung be­ einflussen können. Außerdem können lysierte Leukozyten auf diesem Weg nicht erfaßt werden. Da die Halbwertszeit von Leukozyten besonders in stark alkalischen Harnen relativ gering ist, kann diese Methode bei Harnen mit längerer Standzeit zu Fehlbestimmungen führen. Eine exaktere, einfa­ chere und sehr viel zuverlässigere Bestimmung kann erfol­ gen, indem man die Aktivitäten der Enzyme (Esterasen/Elastasen/Proteasen) ausnutzt, die in Leukozyten enthalten sind.
Bei derartigen Verfahren werden nicht oder nur wenig ge­ färbte Carbonsäureester eingesetzt, die durch die in den Leukozyten enthaltenen Enzyme zu einer Alkohol- und einer Säurekomponente hydrolysiert werden. Die bei der Hydrolyse freigesetzte (meist ebenfalls farblose) Alkoholkomponente (ROH) reagiert dann mit einem entsprechenden Nachweisrea­ genz (NW) zu einer detektierbaren (farbigen) Verbindung (NW-ROH) weiter, die visuell oder reflektometrisch bestimmt werden kann.
Obiges Verfahren wird allgemein in kommerziellen Leuko­ zytentests auf Teststreifenbasis verwendet.
Um einen Test mit hoher Spezifität und Nachweisempfindlich­ keit zu erhalten, müssen die eingesetzten Carbonsäureester optimal auf die nachzuweisenden Enzyme abgestimmt sein, d. h., sie müssen aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften besonders schnell von den vorliegenden Enzymen gespalten werden. Außerdem muß die nachfolgende Nachweisreaktion Ver­ bindungen liefern, die im Bereich des sichtbaren Lichts ei­ nen sehr hohen Extinktionskoeffizienten aufweisen, um eine intensive Färbung des Testfeldes zu erzielen. In diagnosti­ schen Tests werden bevorzugt Nachweisreaktionen auf der Ba­ sis von Diazoniumkupplungen verwendet.
Schmalzl/Braunsteiner (Klin. Wschr. 46, 642 (1968)) be­ schreiben einen Nachweis von Leukozyten-Esterase, der auf der Hydrolyse eines Carbonsäureesters und anschließender Kupplung der Alkoholkomponente mit einer Diazoniumverbin­ dung beruht. Sie verwenden z. B. Naphthol-AS-D-Chloracetat als Substrat. Das enzymatisch freigesetzte Naphtholderivat kuppelt mit dem Diazoniumsalz Echtgranatsalz GBC zu einer farbigen Diazoniumverbindung. Dieser Nachweis zeigt jedoch nur eine sehr geringe Empfindlichkeit, was vor allem auf den verwendeten Carbonsäureester zurückgeführt wird.
Janoff/Basch (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 136, 1045 (1971)) beschreiben Alaninester als spezifische Substrate für Hu­ man-Leukozyten-Elastase. Sie setzen u. a. Boc-Alanin-p- nitrophenylester oder N-Aoetyl-alanyl-alanyl­ alaninmethylester als Substrate ein.
In der EP 0 157 326 wird die Verwendung von Alaninester von Pyrrol- und Thiophenderivaten als Substrat beansprucht. Nach der enzymatischen Hydrolyse reagiert das freigesetzte Pyrrol- oder Thiophenderivat mit einem Diazoniumsalz zu einer farbigen Verbindung. Die Alaninester stellen spezifi­ sche Substrate für die Human-Leukozyten-Elastase (HLE) dar. In einem auf dieser Druckschrift beruhenden kommerziellen Test wird der Alaninester eines Pyrrols eingesetzt.
Die US 4 278 763 offenbart die Verwendung von Indoxyl- und Thioindoxylester von Peptiden oder Aminosäuren als Substra­ te. Die Farbreaktion beruht auf einer Reaktion der Alkohol­ komponenten miteinander nach der enzymatischen Spaltung. Eine Kombination aus Aminosäure- oder Peptidestern mit Dia­ zoniumsalzen wird in der EP 0 039 880 beansprucht. Als Al­ koholkomponente werden Indoxyl- und Thioindoxylderivate (bekannt aus EP 0 012 957), aber auch Phenyl- und Naphthyl­ derivate verwendet. Die Farbreaktion beruht auf einer Dia­ zoniumkupplung zwischen speziell aufeinander abgestimmten Diazoniumsalzen, und der Alkoholkomponente des Substrates. In einem auf diesen Druckschriften beruhenden kommerziellen Test wird ein Indoxyl-Alaninester verwendet (Kutter et al., Ärztl. Lab. 28, 17, (1982)).
Die Analyse dieser beiden Tests, die am Markt eine bedeu­ tende Stellung einnehmen, zeigt, daß Alanin im Hinblick auf die Reaktivität bezüglich der in Leukozyten enthaltenen Enzyme offenbar das mit Abstand beste Aminosäurederivat dar­ stellt.
Die Verwendung von Lactatester als Substrat ist in der US 5 464 739 beschrieben. Diese Lactatester, die eine starke Analogie zu den entsprechenden Alaninderivaten aufweisen, sollen im Vergleich zu diesen eine verbesserte Reaktivität zeigen.
Um die Nachweisempfindlichkeit dieser diagnostischen Tests weiter zu erhöhen, werden den Tests sogenannte Aktivatoren oder Verstärker hinzugefügt. Durch diese Substanzen wird die Reaktionszeit der Nachweisreaktion deutlich verkürzt, was sich in einer erhöhten Nachweisempfindlichkeit nieder­ schlägt. Als Aktivatoren sind insbesondere Heteroaromaten vom Pyridin- oder Imidazol-Typ, aber auch spezielle Alkoho­ le und verschiedene Metallkomplexe geeignet. Solche Aktiva­ toren sind in der EP 0 014 929 offenbart.
Die diagnostische Mittel können neben den bereits erwähnten Komponenten ferner geeignete Zusatzstoffe enthalten, wie z. B. Netzmittel, Puffer, Stabilisatoren, Filmbildner, Quell­ mittel, galenische Zusatzstoffe oder ähnliches.
Der Stand der Technik bei obigen diagnostischen Mitteln läßt sich daher so darstellen, daß als geeignete Substrate Aminosäureester, Peptidester oder Milchsäureester bekannt sind, wobei sich die chemische Variabilität auf zwei Stel­ len des Esters bezieht: 1. auf die Schutzgruppe an der Ami­ no- bzw. Hydroxyfunktion, 2. auf die Alkoholkomponente, die durch die Hydrolyse des Esters freigesetzt wird und zu ei­ ner nachweisbaren Verbindung weiterreagiert. Spezifische Tests mit hoher Nachweisempfindlichkeit benötigen als Substrat einen Alaninester oder einen strukturell sehr ähn­ lichen Milchsäureester (US 5 464 739; US 4 278 763). Bei allen bekannten Testverfahren müssen die Substrate in ge­ eigneter Weise ausgewählt werden, damit eine schnelle und spezifische Spaltung möglich ist, wobei die Substrate fer­ ner auch dahingehend ausgewählt werden müssen, daß die ab­ gespaltene Alkoholkomponente schnell und eindeutig nachge­ wiesen werden kann.
Um die Nachweisempfindlichkeit und die Spezifität derarti­ ger diagnostischer Tests weiter zu verbessern, werden wei­ tere Substrate benötigt, wobei insbesondere auch ein Bedarf nach diagnostischen Mittel besteht, die eine erhöhte bzw. verlängerte Stabilität aufweisen. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, diagnostische Mittel anzugeben, die gemäß den obigen Ausführungen geeignete Substrate aufwei­ sen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein diagnostisches Mittel nach Anspruch 1.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß Ester der a- Hydroxyvaleriansäure (Formel 1) Substrate mit hoher Reakti­ vität und hoher verbesserter Stabilität darstellen. Diese Tatsache war um so erstaunlicher, als gute Reaktivitäten bisher nur von Carbonsäurederivaten mit einer Methylgruppe in a-Stellung der Carbonsäurekomponente bekannt waren. Die verbesserte Stabilität zeigt sich insbesondere durch das geringere Auftreten von falsch-positiv Diagnosen gegenüber bekannten Substraten für diagnostische Mittel. Die erfin­ dungsgemäßen Substrate haben folgende Struktur:
wobei R eine Gruppe darstellt, die nach Spaltung des Esters 1 als ROH in einer Nachweisreaktion erfaßt werden kann, und R' eine Alkoholschutzgruppe ist. Mit einem diagnostischen Mittel, das als Enzymsubstrat einen Ester gemäß obenstehen­ der Struktur enthält, können schnell, sicher und eindeutig die o. g. Enzyme nachgewiesen werden und damit die Existenz von Leukozyten in einer entsprechenden Probe angezeigt wer­ den.
Die Alkoholkomponente RO- der Formel 1 liegt nach der Spal­ tung des Esters als ROH vor und stellt eine Verbindung dar, die mit einem entsprechenden Nachweisreagenz nachgewiesen werden kann. R umfasst bevorzugt Indoxyl-, Thioindoxyl-, Naphthol- und Phenolderivate, die alle in vielfältiger Wei­ se substituiert sein können. Geeignete Gruppen sind im Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise in US 5 464 739, EP 0 039 880, EP 0 157 326 oder US 4 278 763 of­ fenbart. Der Nachweis dieser Alkoholkomponenten erfolgt be­ vorzugt durch Reaktion mit einem Diazoniumsalz zu einer farbigen Verbindung.
Die als Alkoholschutzgruppe fungierende-Gruppe R' der For­ mel 1 kann jede nach dem Stand der Technik bekannte Schutz­ gruppe sein, die eine Alkoholgruppe schützt. Hierzu wird z. B. auf US 5 464 739 verwiesen. Besonders geeignet sind Sulfonylgruppen, wie z. B. Alkyl- oder Arylsulfonylgruppen, außerdem z. B. Benzoylgruppen.
Das diagnostische Mittel nach der Erfindung kann einen oder mehrere Aktivatoren enthalten, die die Hydrolyserate des o. g. Substrates durch die Enzyme beschleunigen. Besonders ge­ eignet sind aliphatische und araliphatische Alkohole. Ge­ eignete Verbindungen sind z. B. in EP 0 014 929 offenbart. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird in dem diagnostischen Mittel 6-Chlor-1-hexanol oder 11-Brom-1- undecanol als Aktivator verwendet.
Ferner kann das diagnostische Mittel einen Puffer enthal­ ten, der einen pH-Wert zwischen 7,0 und 9,0 hat. Weiterhin kann das Mittel weitere Zusatzstoffe enthalten, wie z. B. Netzmittel, Oxidationsmittel, Stabilisatoren, Filmbildner, Quellmittel, galenische Zusatzstoffe oder andere Substan­ zen. Derartige Zusätze sind bekannt und z. B. in EP 0 039 880, EP 0 157 326 oder US 5 464 739 offenbart.
Ein bevorzugter Träger für das erfindungsgemäße diagnosti­ sche Mittei ist Papier, insbesondere Filterpapier. Die Rea­ genzien können jedoch auch in andere Träger eingebracht werden, wie z. B. Vliese, Membranen, Filme, Tabletten, Ge­ webe oder ähnliches. Eine Verwendung als Flüssigreagenz ist ebenfalls denkbar.
Die Herstellung des erfindungsgemäßen diagnostischen Mit­ tels erfolgt durch Auflösen der o. g. Komponenten in einem geeigneten Lösungsmittel, Imprägnierung des Trägers mit diesen Lösungen und anschließende Trocknung des Trägers. Die Anzahl und Reihenfolge der Imprägnierschritte ist va­ riabel und kann im einzelnen an den verwendeten Träger an­ gepaßt werden. Bevorzugt ist eine Imprägnierung in zwei Schritten. In einer ersten (wäßrigen) Imprägnierung werden Puffer und andere wasserlösliche Substanzen auf den Träger aufgebracht. In einem zweiten (nichtwäßrigen) Schritt er­ folgt die Imprägnierung mit dem Substrat und anderen Rezep­ turbestandteilen, die eine schlechte Löslichkeit in Wasser aufweisen.
Ein bevorzugtes diagnostisches Mittel nach der Erfindung enthält als Substrat O-(4'-Toluolsulfonyl)-α- hydroxyvaleriansäure-3-indoxylester. Dieses Substrat mit verbesserter Stabilität kann wie folgt hergestellt werden kann:
a-Hydroxyvaleriansäure (2) wird mit Tosylchlorid umgesetzt. Der entstandene Ester (3) wird durch Hydrolyse der Ethyle­ sterfunktion in die entsprechende Carbonsäure (4) über­ führt. Diese wird mit Thionylchlorid zum Säurechlorid (5) umgesetzt. Die Reaktion des Säurechlorids (5) mit Indoxyl führt schließlich zur Zielverbindung (6).
Ein weiteres bevorzugtes, diagnostisches Mittel nach der Erfindung umfaßt als Substrat obige Substanz 6, als Aktiva­ tor 6-Chlor-1-hexanol oder 11-Brom-1-undecanol sowie als Diazoniumsalz 2-Methoxy-4-morpholinobenzol-diazoniuinchio­ rid-Zinkchlorid-Doppelsalz. Ein diagnostisches Mittel, das u. a. diese Substanzen enthält, hat sich bei Untersuchungen zum Nachweis von Leukozyten im Harn als besonders geeignet herausgestellt, da dieses diagnostische Mittel eine hohe Empfindlichkeit aufweist. So läßt sich beispielsweise eine Konzentration von ca. 10-25 Leukozyten/mL Harn nach 1-2 Minuten mit diesem diagnostischen Mittel sicher nachweisen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert:
Beispiel 1 Herstellung von Substraten Synthese von O-(4'-Toluolsulfony)-a-hydroxyvalerian-säure- 4-methoxy-1-naphthylester (7)
Die Verbindung wird in einer vierstufigen Synthese aus a- Hydroxyvalerian-säureethylester 2 hergestellt:
1) O-(4'-Toluolsulfonyl)-a-hydroxyvaleriansäureethylester 3
5,4 g (56 mmol) Tosylchlorid werden in Pyridin gelöst und bei 0°C werden 5,0 g (34 mmol) a-Hydroxy­ valeriansäureethylester 2 zugegeben. Nach ca. 12 Std wird mit Methylenchlorid verdünnt und ünter Eiskühlung wird Salzsäure zugegeben. Die wäßrige Phase wird mit Methylen­ chlorid extrahiert und die vereinigten organischen Phasen werden mit Molsieb (4 A) getrocknet und im Vakuum einge­ engt. Ausbeute: 7,7 g (92%) gelbes Öl.
2) O-(4'-Toluolsulfonyl)-a-hydroxyvaleriansäure 4
7,7 g (25 mmol) O-(4'-Toluolsulfonyl)-a-hydroxyvalerian­ säureethylester 3 werden mit Eis, Methanol und 1 N Natron­ lauge versetzt. Nach 2 Stunden intensiven Rührens wird mit Salzsäure angesäuert und mit Methylenchlorid mehrfach ex­ trahiert. Die organische Phase wird mit Molsieb (4 A) ge­ trocknet und im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 5,6 g (81%) fast farbloses Öl, das beim Abkühlen kristallisiert.
3) O-(4'-Toluolsulfonyl)-a-hydroxyvaleriansäurechlorid 5
4,0 g (15 mmol) O-(4'-Toluolsulfonyl)-a-hydroxyvalerian­ säure 4 werden mit Thionylchlorid 15 Minuten unter Rückfluß gekocht. Anschließend wird überschüssiges Thionylchlorid in der Wärme mit Stickstoff ausgetrieben. Ausbeute: 4.1 g (96 %) gelbes Öl.
4) O-(4'-Toluolsulfonyl)a-hydroxyvaleriansäure-4-methoxy- 1-naphthylester 7
Zu 1,04 g (6 mmol) 4-Methoxy-1-naphthol, 1,0 g Magnesium­ sulfat und 3,0 g Pyridin in Tetrahydrofuran werden bei 0°C 2,05 g (7 mmol, ca. 1,2 eq) O-(4'-Toluolsulfonyl)-a- hydroxyvaleriansäurechlorid 5 gegeben. Nach 60 Minuten wird die Reaktionsmischung im Vakuum eingeengt, in Methylenchlo­ rid aufgenommen und mit verd. Zitronensäure, gesättigter Natriumhydrogen-carbonatlösung und gesättigter Kochsalzlö­ sung gewaschen. Die organische Phase wird anschließend mit Magnesiumsulfat getrocknet, kurz mit Aktivkohle gerührt, filtriert und im Vakuum eingeengt. Man erhält ein grünes Öl, aus Methylenchlorid/Petrolether fallen in der Kälte cremefarbene Kristalle.
Ausbeute: 750 mg (29%).
1H-NMR (CDCl3): 0,95 (t, 3H), 1,55 (m, 2H), 2,08 (m, 2 H), 2,40 (s, 3H), 4,00 (s, 3H), 5,20 (t, 1H), 6,70 (d, 1 H), 7,02 (d, 1H), 7,30 (d, 2H), 7,50 (m, 2H), 7,70 (m, 1 H), 7,90 (d, 2H), 8,25 (m, 1H).
Smp: 80-85°C, Rf-Wert: 0,66 (Ether/Petrolether 2 : 1, Ma­ cherey-Nagel Polygram SIL/G UV254, Detektion: UV 254 nm)
Es wurden ferner folgende Verbindungen in analoger Weise synthetisiert:
O-(4'-Toluolsulfonyl)-a-hydroxyvaleriansäure-3-indoxylester 6
1H-NMR (CDCl3): 0,92 (t, 3H), 1,48 (m, 2H), 2,00 (m, 2 H), 2,35 (s, 3H), 5,12 (t, 1H), 7,08 (t, 1H), 7,20 (in, 2 H), 7,28 (m, 3H), 7,40 (d, 1H), 7,8.5 (d, 2H), 8,42 (br s, 1H). Smp: 57-59°C, Rf-Wert: 0,48 (Ether/Petrolether 2 : 1, Macherey-Nagel Polygram SIL/G UV254, Detektion: NH3- Gas, blau)
O-(4'-Toluolsulfonyl)-a-hydroxyvaleriansäure-1-naphthyl­ ester 8
Smp: 87-88°C, Rf-Wert: 0,73 (Ether/Petrolether 2 : 1, Ma­ cherey-Nagel Polygram SIL/G UV254, Detektion: UV 254 nm)
O-(Propylsulfonyl)-a-hydroxyvaleriansäure-3-indoxylester 9
Smp: 87°C, Rf-Wert: 0,55 (Ether/Petrolether 2 : 1, Macherey- Nagel Polygram SIL/G UV254, Detektion: NH3-Gas, blau)
O-(Methylsulfonyl)-a-hydroxyvaleriansäure-3-indoxylester 10
Smp: 73°C, Rf-Wert: 0,39 (Ether/Petrolether 2 : 1, Macherey- Nagel Polygram SIL/G UV254, Detektion: NH3-Gas, blau)
O-Benzoyl-a-hydroxyvaleriansäure-3-indoxylester 11
1H-NMR (CDC13): 1,05 (t, 3H), 1,68 (in, 2H), 2,18 (m, 2 H), 5,55 (t, 1H), 7,10 (m, 1H), 7,15 (m, 1H), 7,25 (m, 2 H), 7,45 (m, 3H), 7,58 (m, 1H), 7,92 (br s, 1H), 8,15 (d, 2H). Smp: 123-125°C, Rf-Wert: 0,60 (Ether/Petrolether 2 : 1, Macherey-Nagel Polygram SIL/G UV254, Detektion: NH3-Gas, blau)
Die Verbindungen 6-11 stellen nur einige Beispiele dar. Die Synthese weiterer Substrate mit veränderter Substitution für die diagnostischen Mittel gemäß Anspruch 1 ist dem Fachmann anhand dieser Beispiele ohne weiteres möglich.
Beispiel 2 Diagnostisches Mittel
Filterpapier (z. B. MN 215, Macherey-Nagel) wird nacheinan­ der mit den folgenden Lösungen imprägniert und nach jeder Imprägnierung mit IR-Strahlern getrocknet:
  • 1. 50 ml 1,0 mol/l Borsäurepuffer pH 8,0
    10 g Phosphorsäuretrimorpholid
    ad 100 ml Methanol
  • 2. 15 mg 2-Methoxy-4-morpholinobenzoldiazoniumchlorid- Zinkchlorid-Doppelsalz
    30 mg O-(4'-Toluolsulfonyl)-a-hydroxyvaleriansäure-3- indoxylester 6
    200 mg 6-Chlor-1-hexanol (alternativ 100 mg 11-Brom-1- undecanol)
    20 ml Aceton
Das imprägnierte Papier wird nach dem Trocknen zu Test­ streifen mit 5 × 5 mm großen Testfeldern verarbeitet. Das Testfeld ergibt beim Eintauchen in leukozytenhaltigen Harn bereits bei einem Leukozytengehalt von 10-25 Leuko­ zyten/mL Harn nach 1-2 Minuten eine rosa Färbung. Mit stark leukozytenhaltigem Harn (< 500 Leukozyten/ml Harn) entsteht nach kurzer Zeit ein intensiv violett gefärbtes Testfeld. Die Auswertung des Testfeldes kann sowohl visuell als auch remissionsphotometrisch vorgenommen werden. Zur remissionsphotometrischen Auswertung (z. B. mit URICOLOR von Macherey-Nagel) ist die Verwendung einer grünen LED (560 nm) bevorzugt.
Unter Verwendung der anderen unter Beispiel 1 erwähnten In­ doxylester 9- 11 anstelle von 6 erhält man beim Eintau­ chen in leukozytenhaltigen Harn ebenfalls violett gefärbte Testfelder.
Obige Rezeptur für ein diagnostisches Mittel ist eine von vielen möglichen Ausführungsformen. Neben Variationen von pH-Wert, Puffer, Konzentration der Rezepturbestandteile und Lösungsmittel ist der Einsatz weiterer geeigneter Hilfsmit­ tel (z. B. Stabilisatoren, Detergentien, etc..) möglich, die dem Fachmann bekannt sind. Außerdem ist die Reihenfolge sowie die Anzahl der Imprägnierungen und das imprägnierte Medium nicht festgelegt.
Beispiel 3 Diagnostisches Mittel
Filterpapier (z. B. MN 818, Macherey-Nagel) wird nacheinan­ der mit den folgenden Lösungen imprägniert und nach jeder Imprägnierung mit IR-Strahlern getrocknet:
  • 1. 80 ml 1,0 mol/l Borsäurepuffer, pH 7,6
    10 g Phosphorsäuretrimorpholid
    ad 100 ml Methanol
  • 2. 15 mg Diazoniumsalz (siehe folgende Tabelle)
    50 mg O-(4'-Toluolsulfonyl)-a-hydroxyvaleriansäure- 4-methoxy-1-naphthylester 7
    400 mg Decanol
    20 mL iso-Propanol
Das imprägnierte Papier wird nach dem Trocknen zu Test­ streifen mit 5 × 5 mm großen Testfeldern verarbeitet. Das Testfeld ergibt bei Eintauchen in stark leukozytenhaltigen Harn je nach verwendetem Diazoniumsalz folgende Färbungen:
Diazoniumsalz
Farbe
2-Methoxy-4-morpholinobenzol-diazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz blau
4-Benzoylamido-2-methoxy-5-methylbenzoldiazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz rotviolett
4-Benzoylamido-2,5-diethoxybenzoldiazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz braunviolett
4-Benzoylamido-2,5-dimethoxybenzoldiazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz violett
Beispiel 4 Stabilitätsvergleich von Substraten
Es wurden folgende Lösungen hergestellt:
  • 1. 0,5 mol/l Boratpuffer, pH 8,5;
  • 2. 2,5 mmol/l O-(4'-Toluolsulfonyl)-α- hydroxyvaleriansäure-3-indoxylester ("Valeriansäureester"), ein Substrat nach der Erfindung, in Methanol; und
  • 3. 2,5 mmol/l O-(4'-Toluolsulfonyl)-milchsäure-3- indoxylester ("Lactatester"), ein Substrat nach dem Stand der Technik (US 5 464 739), in Methanol.
Die Lösungen wurden durch Rühren an der Luft mit Sauerstoff gesättigt und auf 25°C temperiert. Jeweils 1 ml der Lösung (1) wurde zu je 2 ml der Lösungen (2) und (3) gegeben. Die Zunahme der Extinktion bei 610 nm (Bildung von Indigo) wur­ de gemessen, und der Bereich von 100-130 Sekunden (linearer Extinktionsanstieg) wurde ausgewertet:
ΔE/min. (Valeriansäureester) = 0,04
ΔE/min. (Lactatester) = 0,82
Der Anstieg der Extinktion und somit die Hydrolyse erfolgt bei dem Lactatester, dem Substrat nach dem Stand der Tech­ nik, etwa 20-fach schneller als bei dem Valeriansäureester, dem Substrat nach der Erfindung, das somit im alkalischen Medium deutlich stabiler ist als der Lactatester.
Beispiel 5 Stabilitätsvergleich von diagnostischen Mittel
Es wurden diagnostische Mittel mit den unter (2) und (3) gemäß obigem Beispiel 4 genannten Substraten hergestellt. Filterpapiere (MN 215, Macherey-Nagel) wurden jeweils mit den folgenden Lösungen imprägniert und nach jeder Imprä­ gnierung mit IR-Strahlern getrocknet:
50 ml 1,0 mol/l Boratpuffer, pH 8,5; 10 g Phosphorsäuretrimor­ pholid; ad 100 ml Methanol;
0,25 mmol/l Substrat Valeriansäureester (2a) oder Lactatester (2b); 42 mg 2-Methoxy-4-morpholinobenzoldiazoniumchlorid- Zinkchlorid Doppelsalz; 800 mg 6-Chlor-1-hexanol; 65 ml Aceton.
Die mit obigen Substraten imprägnierten Filterpapiere ver­ färbten sich nach ihrer Herstellung beim Eintauchen in leu­ kozytenhaltigen Harn violett, während die gelblich-weiße Farbe der Papiere in Abwesenheit von Leukozyten nach dem Eintauchen erhalten blieb.
Um die Stabilität der Filterpapiere zu testen, wurden diese für 5 Tage einer Temperatur von 55°C ausgesetzt. Ein nach­ folgender Test mit verschiedenen Harnproben ergab, daß das Filterpapier mit dem Lactatester (2b) bereits beim Eintau­ chen in leukozytenfreien Harn eine deutliche Verfärbung zu rosa-violett zeigte, während das Filterpapier mit dem Vale­ riansäureester (2a) seine gelbliche Farbe behielt. Die Re­ aktivität gegenüber leukozytenhaltigen Harn war in etwa gleich bei beiden Filterpapieren.
Das diagnostische Mittel nach der Erfindung mit dem Valeri­ ansäureester (2a) als Substrat zeigte somit im Stabili­ tätstest einen deutlichen Vorteil gegenüber dem Kontrollpa­ pier mit dem bekannten Lactatester als Substrat, da bei dem Kontrollpapier die Gefahr von falsch-positiven Diagnosen besteht.

Claims (11)

1. Diagnostisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Substrat einen Ester der α-Hydroxy­ valeriansäure mit der allgemeinen Formel umfaßt:
in der R eine Gruppe darstellt, die nach Spaltung des Esters als R-OH in einer Nachweisreakton erfaßt werden kann, und R' eine Alkoholschutzgruppe ist.
2. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß R eine substituierte oder unsub­ stituierte Indoxyl-, Thioindoxyl-, Phenyl- oder Naphtylgruppe umfaßt.
3. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1 oder 2, da­ durch gekennzeichnet, daß R' eine Sulfonylgruppe, insbesondere eine Arylsulfonylgruppe oder Alkylsul­ fonylgruppe, oder eine Benzoylgruppe, umfaßt.
4. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner einen Akti­ vator umfaßt.
5. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Aktivator 6-Chlor-1-hexanol oder 11-Brom-1-undecanol ist.
6. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner ein Diazo­ niumsalz umfaßt.
7. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Diazoniumsalz aus der Gruppe ausgewählt ist, die 4-Benzoylamido-2-methoxy-5- methylbenzoldiazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppel­ salz, 4-Benzoyl-amido-2,5-diethoxy-benzoldiazonium­ chlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz, 4-Benzoyl-amido-2,5- dimethoxybenzoldiazoniumchlorid-Zinkchlorid-Doppel­ salz und 2-Methoxy-4-morpholinobenzol-diazonium­ chlorid-Zinkchlorid-Doppelsalz umfaßt.
8. Diagnostisches Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner einen Trä­ ger, Puffer, Lösungsmittel sowie weitere Hilfsmittel umfaßt.
9. Diagnostisches Mittei nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat O-(4'- Toluolsulfonyl)-α-hydroxyvalerian-säure-3-indoxyl­ ester ist.
10. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß es als Aktivator 6-Chlor-1-hexanol oder 11-Brom-1-undecanol umfaßt.
11. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 9 oder 10, da­ durch gekennzeichnet, daß es ferner als Diazonium­ salz 2-Methoxy-4-morpholinobenzol-diazoniumchlorid- Zinkchlorid-Doppelsalz umfaßt.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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US4278763A (en) * 1978-12-20 1981-07-14 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostic agents for the detection of proteolytic enzymes
US5464739A (en) * 1994-08-22 1995-11-07 Bayer Corporation Composition method for determining the presence of leukocyte cells, esterase or protease in a test sample

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4278763A (en) * 1978-12-20 1981-07-14 Boehringer Mannheim Gmbh Diagnostic agents for the detection of proteolytic enzymes
US5464739A (en) * 1994-08-22 1995-11-07 Bayer Corporation Composition method for determining the presence of leukocyte cells, esterase or protease in a test sample

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