DE2920292A1 - L- gamma -glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid und dessen salze, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung zur bestimmung der aktivitaet von gamma -glutamyltranspeptidase - Google Patents

L- gamma -glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid und dessen salze, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung zur bestimmung der aktivitaet von gamma -glutamyltranspeptidase

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Description

32 134 o/fi
NITTO BOSEKI Co.,Ltd., Fukushima-shi/Japan IATRON LABORATORIES, Ine., Tokyo / Japan
L- y -Glutamyl-S-carboxy^-hydroxyanilid und dessen Salze, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von v7-Glutamyltranspeptidase
Die Erfindung betrifft die neue Verbindung L- y-Glutamyl 3-carboxy-4-hydroxyanilid, Säureadditionssalze davon oder Alkali- oder Aminsalze dieser Verbindung. Sie betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von ymyltranspeptidase unter Verwendung der neuen Verbindung oder eines Salzes davon und ein Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindung oder eines Salzes davon.
Es ist bekannt, das ^-Glutamyltranspeptidase (nachfolgend kurz mit ^-GTP bezeichnet) ein Enzym ist, welches in der Lage ist, y-Glutamylpeptid zu hydrolysieren und die $ -Glutamylreste in andere Peptide, Aminosäuren und dergleichen zu überführen. Dieses Enzym ist im lebenden
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Gewebe und im Blutserum vorhanden. Der y-GTP-Gehalt im Serum eines Patienten verändert sich merklich bei einer Reihe von Erkrankungen.
Der tf-GTP-Gehalt ist bei einem Patienten, der an cholangiolitischer Hepatitis, obstruktiver Gelbsucht oder primären oder metastatischen Hepatomen leidet, in dessen Serum sehr hoch. Chronische Hepatitis erhöht den Serum- ^-GTP-Gehalt im akuten Stadium, während der Gehalt auf einem niedrigen Nieveau bleibt, wenn die Krankheit im inaktiven Stadium ist. Im allgemeinen sind die Veränderungen im Serum- V -GTP-Gehalt spezifisch für chronische Lebererkrankungen und daher von diagnostischer Bedeutung. Die Bestimmung der Aktivität von Serum- y -GTP ist deshalb für die Diagnose der vorerwänten Krankheiten und für die Erkennung der Krankheitsbedingungen unabdingbar.
Für die Bestimmung der V-GTP-Aktivität sind verschiedene Methoden vorgeschlagen worden, bei denen synthetische Substrate verwendet werden und man die gebildeten Aminverbinaungen dann bestimmt. Alle diese Methoden haben Vor- und Nachteile und es besteht ein Bedürfnis nach einem neuen synthetischen Substrat. Zum Beispiel verwendet man bei einem der bekannten Methoden y -Glutamyl- (^, -naphthylamid als Substrat und das gebildete ^-Naphthylamin wird dann colorimetrisch nach der Umwandlung in ein Diazoniumsalz bestimmt (Clinica Chimica Acta, Band 7, 755 (1962) ). Dieses Verfahren ist jedoch wenig geeignet in der Praxis, weil Naphthylamin karzinogen ist und weil das Verfahren kompliziert und zeitraubend ist. Bei einem anderen Verfahren verwendet man
y-Glutamyl-p-nitroanilid als Substrat und bestimmt dann p-Nitroanilin, das gelb ist und aus dem Substrat gebildet wird,kolorimetrisch (Clinica Chimica Acta, Band 65, 21 (1975) ). Bei
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diesem Verfahren ist ein genauer Blindtest für jede Serumprobe erforderlich, um den Einfluß von Serumbestandteilen zu vermeiden, und die Ergebnisse dieser Versuche sind ungenau. Die kolorimetrische Bestimmung von p-Nitroanilinzinnamaldehid ist problematisch, weil die Empfindlichkeit der Farbentwicklung in erheblichem Maße durch die Temperatur beeinflußt wird, und daher eine nicht ausreichende Reproduzierbarkeit vorliegt. Bei einem anderen Verfahren wird p-Nitroanilin diazotiert und dann mit 3,5-Xylenol kondensiert und die dabei entstehende rote Farbe wird kolorimetrisch bestimmt (Japanische Offenlegungsschrift ("Kokai") 32 092/78). Dieses Verfahren ist nicht einfach genug, weil zahlreiche Stufen bei der Behandlung von p-Nitroanilin erforderlich sind. Kürzlich wurde versucht, die V -GTP-Aktivität zu bestimmten unter Verwendung von ^-Glutamylp-dimethylaminoanilid als Substrat, worauf man dann das gebildete p-Dimethylaminoanlin nach der Farbentwicklung mit einem Pentacyanoeisenkomplex kolorimetrisch bestimmte (Japanische Offenlegungsschrift ("Kokai") 146 693/77). Dieses Verfahren hat aber den Nachteil, daß die Lagerbeständigkeit der Farbentwicklerlösung aufgrund ihrer nicht ausreichenden Stabilität nur einige Tage beträgt, und die Menge an in dem Abwasser abgegebenen Cyan umweltverschmutzend ist. Außerdem haben alle die vorerwähnten Substrate nur eine schlechte Löslichkeit in Wasser und daher muß man löslich machende Mittel, wie oberflächenaktive Mittel, organische Lösungsmittel und dergleichen, die nicht leicht kontrollierbar sind, anwenden. Selbst bei Verwendung eines solchen Mittels reicht die Konzentration jedoch häufig nicht für die Umsetzung aus.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein Substrat für die Verwendung bei der Bestimmung von tf-GTP-Aktivität zu zeigen, das eine ausreichende Löslichkeit in Wasser aufweist, und Eigenschaften hat, welche die Schwierigkeiten bei den Produkten des Standes der Technik hinsichtlich der Anwendbarkeit, Sicherheit, Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Einfachheit, Stabilität und Umweltverschmutzung nicht aufweist.
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Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung der v?-GTP-Aktivität unter Verwendung des Substrates zu zeigen. Schließlich betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Substrates.
Die üblichen Verfahren für die Bestimmung von l?-GTP-Aktivitäten haben Nachteile und die Erfindung betrifft Verbesserungen dieser Verfahren. Als Ergebnis wurde ein neues Substrat mit ausgezeichneten Eigenschaften gefunden, und die vorliegende Erfindung betrifft dieses neue Substrat.
Die Erfindung betrifft L- l^-Glutamyl-3-carboxy—4-hydroxyanilid der allgemeinen Formel (I),
COOH
/CH. - CH2 - CH2 - CONH -/ VOH (I)
dessen Säureadditionssalze oder Alkali- oder Aminsalze. Diese Verbindung ist für Tests für die V-GTP-Aktivität ein geeignetes Substrat. Wie aus der vorhergehenden Beschreibung hervorgeht, liegt die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung auf dem Gebiet der Bestimmung von ^-GTP-Aktivität. Bei der Durchführung der Bestimmungsmethode wird das erfindungsgemäße Substrat mit fl-GTP eines Serums in einer Pufferlösung vom pH 7,5 bis 9,5 umgesetzt und das 3-Carboxy-4-hydroxyanilin, das sich bei dieser Umsetzung bildet, wird mit einem geeigneten Kuppler oxydativ kondensiert unter Ausbildung einer gefärbten Substanz, welche dann zur Bestimmung der V-GTP-Aktivität des Serums kolorimetrisch bestimmt wird.
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Geeignete Kuppler zur Entwicklung der Farbe im sauren Gebiet sind Anilinverbindungen, wie z.B. Ν,Ν-Diäthylanilin, und für die Entwicklung im alkalischen Gebiet Phenol- und Naphtholverbindungen, wie beispielsweise 2,6-Xylenol und 2,5-Xylenol.
Das am meisten geeignete Oxidationsmittel für die vorerwähnte oxidative Kondensation ist Natriummetaperjodat, jedoch können auch verschiedene andere Verbindungen, wie Wasserstoffperoxid, Persulfate und dergleichen verwendet werden.
Die gefärbte Substanz, die durch oxidative Kondensation zwischen 3-Carboxy-4-hydroxyanilin und einem Kuppler gebildet wird, zeigt eine maximale Absorption in dem breiten Wellenbereich von 560 bis 770 nm, je nach der Art des Kupplers. Die Farbentwicklung ist sehr konstant und wird nur wenig durch Temperaturänderungen beeinflußt und ist deshalb für die Bestimmung der 5^-GTP-Aktivität geeignet.
Da L-)?-Glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid hydrophile funktionelle Gruppen hat, ist diese Verbindung leicht in Wasser löslich, ohne daß löslichmachende Verbindungen, wie oberflächenaktive Mittel oder organische Lösungsmittel benötigt werden. Deshalb ist die Zubereitung der Reagenzien und das Meßverfahren sehr leicht durchzuführen und das Substrat kann in einer für die Reaktion ausreichend hohen Konzentration verwendet werden. Dies sind die Hauptvorteile der Erfindung.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, daß die Bestimmung der V -GTP-Aktivität kaum durch Verunreinigungen, die sich in dem von einem lebenden Körper entnommenen Proben befinden, beeinflußt wird. Dies liegt daran, daß die erfindungsgemäße Untersuchungsmethode in einem Wellengebiet von mehr als 560 nm durchgeführt wird, im Gegensatz zu der L-\? Glutamyl-p-nitroanilid-Methode, bei der die Messung bei Wellenlängen von kleiner als 560 nm durchgeführt wird. Daher
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ist auch keine Blindprobe für jede Probe erforderlich und dies ermöglicht eine schnelle Bestimmung. Reduzierende Substanzen, wie Harnsäure und Ascorbinsäure, in der Probe werden durch einen Überschuß des Oxidationsmittels zersetzt und haben daher keinen Einfluß auf die Genauigkeit der Messung.
Es ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Verbindung bei ihrer Verwendung als Substrat bei der Bestimmung von tf-GTP-Aktivität den üblichen Substraten weit überlegen ist. Wie aus dem später noch beschriebenen Bestimmungsbeispiel hervorgeht, besteht eine befriedigende Übereinstimmung zwischen den unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung erzielten Werten und solchen ,die in den bisher verwendeten üblichen Verfahren erzielt wurden.
Die Herstellung der Verbindung der Formel (I) kann in folgender Weise erfolgen:
Glutaminsäureanhydrid, dessen Aminogruppen geschützt sind, läßt man mit 3-Carboxy-4-hydroxyanilin reagieren und entfernt dann die Schutzgruppen von dem Reaktionsprodukt.
Geeignete Schutzgruppen, die unter milden Bedingungen leicht entfernt werden können, sind solche, wie sie bei der üblichen Peptidsynthese verwendet werden, z.B. Phthalylgruppen, die durch Hydrazin, tert.-Butoxycarbonylgruppen und Formylgruppen, die unter schwach sauren Bedingungen, Trifluoracetylgruppen, die unter schwach alkalischen Bedingungen und Benzyloxycarbonylgruppen, die durch Bromwasserstoff oder katalytische Reduktion entfernt werden können. Die Kondensation wird in einfacher Weise durch Erhitzen in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. einem inerten organischen Lösungsmittel, durchgeführt. Erforderlichenfalls kann das freie Aminosäureanilid,
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dessen Schutzgruppen entfernt wurden, in ein Salz überführt werden, durch Zugabe von verschiedenen anorganischen oder organischen Säuren, oder in ein Alkalisalz durch Umsetzung mit einer Alkaliverbindung oder die Verbindung wird in ein Aminsalz überführt.
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
TESTBEISPIEL
Bestimmung der ^-GTP-Aktivität in einem Serum unter Verwendung einer 2,6-Xylenol-Natriummetaperjodat-Entwicklungslösung.
0,5 g Glycylglyzin und 1,3 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan wurden in 80 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf pH 8,2 mit 3n Chlorwasserstoffsäure eingestellt und dann durch Zugabe von Wasser auf 100 ml unter Herstellung einer Pufferlösung aufgefüllt. Eine Substratpufferlösung wurde erhalten durch Auflösen von 113 mg L- y-Glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid in der vorerwähnten Pufferlösung.
0,02 ml einer Serumprobe wurden in ein Reagensglas gegeben, welches 1,0 ml der bei 37°C gehaltenen Substrat-Pufferlösung enthielt. 20 Min. nach der Inkubierung wurde die Mischung mit 3,0 ml einer Lösung versetzt, die hergestellt worden war durch Auflösen von 86 mg 2,6-Xylenol und 32 mg Natriummetaper j odat in 100 ml einer 0,2n wäßrigen Kaliumhydroxidlösung. Man ließ die Mischung 10 Min. bei Raumtemperatur stehen und dann wurde die Absorption bei 615 nm gemessen. Ein Blindtest wurde in gleicher Weise wie vorher beschrieben, ausgeführt, mit der Ausnahme, daß 0,02 ml Wasser anstelle
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des Serums verwendet wurden. Die Serum- j?-GTP-Aktivität wurde berechnet aus dem Unterschied der Absorptionen der beiden vorher beschriebenen Messungen und der Absorption an der 0,02 ml Standardlösung, enthaltend eine bekannte Menge an 3 Carboxy-4-hydroxy-anilin, die in gleicher Weise wie vorher beschrieben, behandelt worden war.
In der folgenden Tabelle werden zum Vergleich Meßwerte gezeigt, die die Ergebnisse gemäß der vorliegenden Erfindung und solchen, die unter Anwendung einer üblichen Methode, bei welcher L-y-Glutamyl-p-nitroanilid als Substrat verwendet wurde, erzielt wurden.
Die erfindungsgemäß erzielten Meßwerte wurden auf der Ordinate aufgetragen und die nach der L- V?-Glutamyl-p-nitroanilidmethode erzielten auf der Abzisse, wobei sich folgende Regressionsgleichung ergab:
y = 1,07x - 1,50
Die Übereinstimmung war befriedigend, der Korrelationskoeffizient betrug O= 0,992.
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TABELLE
Vergleich der nach der erfindungsgemäßen Methode gemessenen Vierte mit denen, die nach der L- ^ -Glutamyl-pnitroanilidmethode gefunden wurden unter Anwendung eines Human s erums.
Probe Nr. Erfindungsgem.
Methode		 # -Glutamyl-p-
nitroanilidmethode
1 205 209
2 58 - 58
3 206 196
4 529 : 495
• 5 91 " .81
6 85 114
7 144 143
8 53 /49
9 32 31
10 9 9
11 22 19
12 21 19
13 6 6
14 11 11
15 10 . 10
16 62 61
17 26 26
18 21 20
19 7 9
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TABELLE (Fortsetzung)
Probe Nr. Erfindungsgem.
Methode		 y -Glutamyl-p-
nitroanilidmethode
20 5 7
21 72 60
22 326 289
23 164 142
211 392 354
25 13 .14
26 16 17
27 22 20
28 42 40
29 8 8
30 17 16
31 9 . 8
32 9 9 .
33 13 14
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BEISPIEL
Herstellung von L- \! -Glutamyl-S-carboxy^-hydroxyanilid
Zu einer Mischung aus 25,9 g (0,1 Mol) Phthaloylglutaminsäureanhydrid und 15,3 g (0,1 Mol) 3-Carboxy-4-hydroxyanilin wurden 60 ml Essigsäure gegeben. Die Mischung wurde unter Rühren 30 Min. auf 60°C erhitzt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur gekühlt und zu 500 ml Äther gegossen und unter Abkühlen 2 Stunden stehengelassen und der Niederschlag wurde durch ein Glasfilter abfiltriert. Das Filtrat wurde langsam unter Rühren zu einem Liter η-Hexan in einen 2 1 Kolben gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit η-Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man 41,0 g (99,5 %) des rohen Phthaloyl-L- \? -glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilids erhielt. Das Rohprodukt wurde in 431 ml Methanol gelöst, mit 26,8 ml 100 %-igem Hydrazinhydrat vermischt und 24 Stunden zur Entfernung der Phthalylgruppe bei Raumtemperatur stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat vollständig eingedampft. Der Rückstand wurde in 212 ml Wasser gelöst und filtriert. Das Filtrac wurde auf pH 1 bis 2 eingestellt und über Nacht stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser und Aceton gewaschen und dann vakuumgetrocknet. Ausbeute: 11,5 g (41 %) ; Schmelzpunkt: 175 bis 177°C (Zersetzung); spezifische Drehung:^]j?0= +8,6 (C= 1,005 n-NaOH).
Elementaranalyse: c-j2H14N2°6 3H2° (Molekulargewicht 288,3)
Gefunden: C %
49,78		 4 H %
,90		 9 N%
,69
Berechnet: 50,00 5 ,13 9 ,71
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Claims (3)

  1. 29*0292
    32 134 o/fi
    NITTO BOSEKI Co.,Ltd., Fukushima-shi / Japan IATRON LABORATORIES, Inc., Tokyo / Japan
    L- y-Glutamyl-S-carboxy^-hydroxyanilid und dessen Salze , Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von y-Glutamyltranspeptidase
    Patentansprüche : . L- γ -Glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid der Formel
    H Ν." .COOH
    2 \. ζ
    .CH - CH0 - CH0 - CONH —\% OH (I)
    HOC ^ 2 X=/
    und dessen Säureadditionssalze oder Alkali- oder Aminsalze.
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  2. 2. Verfahren zur Herstellung von L- y-Glutamyl-S-carboxy-4-hydroxyanilid der Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Glutaminsäureanhydrid, dessen Aminogruppen geschützt sind, mit 3-Carboxy-4-hydroxyanilin umsetzt, und die. Schutzgruppen in an sich bekannter Weise entfernt und gegebenenfalls in an sich bekannter Weise das Anilid in ein Säureadditionssalz oder ein Alkali- oder Aminsalz überführt.
  3. 3. Verwendung der Verbindung gemäß Anspruch zur Bestimmung der Aktivität von \7-Glutamyltranspeptidase.
    — 3 —
    030021 /0562
DE2920292A 1978-11-16 1979-05-18 L-γ -Glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid und dessen Säureadditions- oder Alkalisalze, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von γ-Glutamyltranspeptidase Expired DE2920292C3 (de)

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