DE2736517A1

DE2736517A1 - Neue triazinverbindung, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung bei der eisenbestimmung in waessrigen systemen

Info

Publication number: DE2736517A1
Application number: DE19772736517
Authority: DE
Inventors: Jerry William Denney; Mark C Outcalt
Original assignee: American Monitor Corp
Current assignee: American Monitor Corp
Priority date: 1976-08-16
Filing date: 1977-08-12
Publication date: 1978-02-23
Also published as: US4154929A; IT1111665B; FR2362140A1; FR2362140B1; DE2736517C2; BE857724A; CA1089460A; JPS5323977A

Description

Patentanwälte:

Ο-Θ MÜNCHEN 99 · WIDEN MAYERSTRASSE 4« D-1 BERLIN-DAHLEM 33 · PODBIELSKIALLEE 08

BERLIN: DIPL.-INQ. R. MÜLLER-BÖRNER

MÜNCHEN: DIPL.-INQ. HANS-HEINRICH WEY DIPL.-INQ. EKKEHARO KÖRNER

München, den 12. August 1977

28 690

American Monitor Corporation, Indianapolis (USA)

Neue Triazinverbindung, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung bei der Eisenbestimmung in wässrigen

Systemen

Die Erfindung betrifft eine neue und verbesserte Triazinverbindung, nämlich 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho(l,2-e]-as-triazin oder seine sulfonierten Derivate, die sich für die Bestimmung von Msen in biologischen oder anderen wässrigen Systemen eignen, und zwar selbst von Eisenspuren, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Durch die erfindungsgemäße Synthese der vorstehend bezeichneten Verbindung entfällt die Notwendigkeit der nachteiligen Ätherextraktion bei der Erzeugung von Zwischenprodukten und wird ' durch Verwendung eines neuen Losungsmittelsystems in hohen Ausbeuten ein bislang unbekannter Eisen-Chelatbildner geschaf-

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MÜNCHEN: TELEFON (089) 290688 BERLIN: TELEFON (O3O) 8313088 KABEL: PROPINDUS · TELEX OS 94 944 KABEL: PROPINDUS -TELEX OI 84057

fen. Die Verwendung des neuen Eisen-Chelatbildners erhöht die Empfindlichkeit der bekannten Nachweise für Lisen und der ungesättigten Eisenbindefähigkeit und vermindert Störungen durch andere Chromogene und Trübungen.

Außer der Bestimmung von natürlich auftretendem Serumeisen ist die Bestimmung des Gesamteisens (nach Sättigung mit überschüssigem exogenem Eisen) als indirekte bestimmung der Menge an Transferrin, einem eisenbindenden Protein, das im Serum in unterschiedlichen Mengen vorhanden ist, erfindungsgemäiS möglich.

Einzelheiten der Erfindung werden nachstehend detailliert erläutert.

bin besonderes und lebenswichtiges Anwendungsgebiet des Eisennachweises, d.h. der Bestimmung der Menge von anwesenden Lisenionen, liegt in der Medizin, speziell in der klinischen Untersuchung von biologischen Flüssigkeiten.

Beispielsweise sind genaue und zuverlässige Eisenbestimmungen als sehr wünschenswert anzusehen angesichts von oftmals lebenswichtigen diagnostischen Faktoren, wie den nachfolgend erläuterten.

Im allgemeinen sind erhöhe Serumeisenspiegel begleitet von

a) akutem Blutverlust oder vermehrter Zerstörung der roten Blutkäperchen, wie bei Hämorrhagie, oder verminderter Lebensfähigkeit der roten Blutkörperchen,

b)akuten hepatitischen Zuständen, wie bei akuter hepatitis,

c) bestimmten sideroachrestischen Anämien, bei welchen zur Bildung von funktionellen Erythrozyten eine verminderte Ausnutzung der Eisenvorräte vorliegt,

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to

d) Aufnahme von abnormen Mengen an diätarischem Eisen und

e) bestimmten Defekten bei der Bevorratung von Lisen, wie perniziöser Anämie.

Verminderte i'lasmaeisenspiegel können begleitet sein von

a) diätarischem Msenmangel,

b) chronischen Blutverlustpathologien oder

c) erhöhten Anforderungen an den Körpervorrat, wie während normaler Schwangerschaften.

hrhöhte Spiegel an zirkulierendem Transferrin sind gewöhnlich begleitet von vermehrter Produktion von Globulin, die eine physiologische Reaktion auf verschiedene Zustände von chronischem Msenmangel darstellt (honald L. bearcy, Diagnostic Biochemistry, i>e?te 332, McGraw-Kill, 1969). Herabgesetzte öpiegel an eisenbindendem Globulin sind gewöhnlich die Folge von verminderter Produktion, wie sie bei Zirrhose oder als Folre von von Proteinverlust begleiteter Nephritis auftreten kann«

i>ies sind lediglich repräsentative Beispiele dafür, vie wichtig es fi»r den Arzt ist, Serumeisen und die hisenbindefähigkeit in biologischen Flüssigkeiten genau und zuverlässig bestimmen zu können, um ihm eine wertvolle klinische Hilfe für die Diagnose und Therapie von verschiedenen Krankheitszuständen zu geben. Die genaue Bestimmung dieser Parameter verbessert die ärztliche Behandlung und vendndert die Gefahr von potentiell lebensbedrohenden Zuständen, unter denen die Patienten unnötig leiden müssen und die die Behandlungskosten unnötig erhöhen.

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Fehlerhafte Auswertungen des £·!sennachweises des Patienten können zu einer Fehldiagnose und zu einer entsprechenden falschen Behandlung führen, was im günstigsten Fall eine unnötige kostspielige Therapie bedeutet und im schlimmsten Fall zu einer falschen Behandlung führt, die den Zustand des Patienten noch verschlechtert; und eine vorgenommene Fehlbehandlung kann eine anschließende richtige Diagnose verschleiern und somit die falsche Behandlung verlängern. Somit führt eine ungenaue Eisenbestimmung zu Verschwendung, Arbeitsaufwand, Unbequemlichkeit und einer großen potentiellen Gefahr für das Leben und das Wohlbefinden des Patienten.

Der normale Spiegel an im Plasma oder im Serum zirkulierendem Eisen ist relativ niedrig und beträgt nur Spuren, d.h. er liegt in der Größenordnung von nur etwa 70 bis 165 Mikrogramm pro Deziliter; folglich muß jedes Nachweissystem eine solche Empfindlichkeit der Indikatorverbindung gewährleisten, daß auch die genaue und zuverlässige Messung dieses Spurenelements ermöglicht wird. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Synthese und Anwendung einer Verbindung, die neben anderen Vorteilen eine große Empfindlichkeit gegenüber Eisenionen aufweist.

Ein praktischer Vorzug dieses Nachweises für Eisen und seines zugehörigen Transportglobulins besteht darin, daß die Methode schnell und leicht durchführbar ist und frei von potentiellen Störunge- und Fehlerquellen ist.

Bei den bekannten Synthesen der allgemeinen Klasse der Triazinverbindungen wird üblicherweise ein alkoholisches Lösungsmittel eingesetzt. Dies erforderte eine langwierige sowie gefährliche Ätherextraktionsstufe, weil das Zwischenprodukt 2-Pyridylhydrazidin in niederen aliphatischen Alkoholen löslich ist. Die Erfindung gestattet dagegen den völligen Verzicht auf Alkohol als Lösungsmittel und auf die Ätherextraktion.

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Lie bekannten Methoden für die Bestimmung von Eisen in biologischen Flüssigkeiten bleiben im allgemeinen in bezug auf eines oder mehrere Merkmale der Erfindung weit hinter dieser zurück.

Da im Plasma vorhandenes Eisen gewöhnlich komplex an eisenbindendes Protein gebunden ist (z.B. Transferrin), besteht eine erste Ausführungsform der Erfindung in der raschen Abtrennung des Eisens von dem Protein, damit es so von dem neuen für die Bestimmung verwendeten Eisen-Chelatbildner gebunden werden kann«

Gemäß sehr alten Methoden wurde der Komplex aufgebrochen durch Anwendung von stark sauren Bedingungen bei gleichzeitiger Ausfällung der in der Probe vorhandenen Proteine. Diese Methode ist jedoch nicht nur mühsam, zeitraubend und schwierig, sondern hat auch Nachteile in bezug auf die Qualität der Ergebnisse, als da sind:

1) Unter den angewendeten Bedingungen wird nicht sämtliches Eisen von dem Protein abgetrennt; folglich wird etwas Eisen gemeinsam mit dem Protein ausgefällt (k.J. Henry, D.C. Cannons, und J.W. Winkelman, Clinical· Chemistry: Principlex and Techniques, Seite 680, Harper & How, 2. Ausgabe, 1974). Die erzielten Ausbeuten sind zu niedrig, was einen Eisenmangel anzeigt, der möglicherweise gar nicht vorliegt, und zu anderen Fehldiagnosen führt.

2) Die Proteinfällung verursacht eine Abnahme des Volumens der Probe, was zu einer um 5 bis 10 % zu hohen Veranschlagung des in der ursprünglichen Probe vorhandenen Eisens führt, in Abhängigkeit von der Konzentration an vorhandenem Protein. Dies kann zu einer so hohen Ablesung führen, daß ein vorliegender Eisenmangelzustand maskiert wird.

3) Oftmals waren auch die angewendeten Bedingungen nicht ausreichend, um das gesamte Protein zu entfernen, was eine schwach trübe überstehende Lösung ergab, die weitere Analysefehler

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zeitigte. Diese Trübung führt zu einer wahrscheinlich überhohen Ablesung infolge der Lichtstreuungseigenschaften des trüben Materials, was wiederum zu einer möglichen überhohen Veranschlagung des Eisengehaltes und somit zu einer Fehldiagnose und folglich zu einer falschen Behandlung führt,

4) Durch die zahlreichen bei dieser Fällung vorgenommenen Verfahrensstufen ist die Probe der Gefahr einer möglichen Verunreinigung mit exogenem Eisen aus den Glas- oder anderen ^aborgeräten ausgesetzt, insbesondere unter Berücksichtigung der spurenweisen Mengen, die bei diesem Verfahren zu messen sind,

5) Blutfett (kolloidale Suspension von Fettmicellen) wird, wenn es in dem Serum vorhanden ist, nicht vollständig entfernt. Dies führt zu einer Trübung und Störung der nachfolgenden Eisenbestimmung.

6) Da die Hauptmenge des Körpereisens im Hämoglobin enthalten ist, kann eine Verunreinigung der Probe mit Hämoglobin aus roten Blutkörperchen (hämolyse) dazu führen, daß dieses Eisen infolge der Freisetzung von Eisen aus Hämoglobin, wenn dieses längere Zeit den stark sauren Bedingungen bei der Proteinfällungsstufe ausgesetzt ist, irrtümlich als Serumeisen gemessen werden (ibid, Seite 6b4).

Spätere Versuche haben zur Anwendung von weniger drastischen Maßnahmen bei der Freisetzung des Eisens vom Transferrln und zur Dialyse des freigesetzten Eisens in eine Aufnahmeflüssipkeit geführt, in der es bei Abwesenheit von störendem Protein quantitativ bestimmt werden kann. Wenn fliese .probe aucl· gewisse Vorteile gegenüber Methoden aufweist, bei denen die Proteinfällung notwendig ist, so hat sie doch aucli Nachteile, die mit den Effekten des Donnan-Gleichgewichts zusammenhängen (A.L. Babson & Kleinman, Clinical Chemistry, Band 13, Nr. 2, Seite 163 (1967)), das sich seinerseits mit den Wirkungen der Nichteisenbestandteile auf das Dialyseverhältnis der Eisenionen

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befaßt. Bei den Dialysemethoden kann die Einführung einer lipämischen (blutfetthaltigen) Probe die Eigenschaften der für die Dialyse verwendeten Membran ernstlich verändern, was zu Problemen nicht nur bei der beeinflußten Prüfsubstanz, sondern auch bei anderen Proben führt, die nach der Einführung der lipämischen Probe analysiert werden.

Außerdem erfordert diese Methode teure Zusatzgeräte, die häufig beträchtliche Wartung erfordern.

In neuerer Zeit wurde bei direkten Serumuntersuchungen das Massenwirkungsprinzip zum Freisetzen des Eisens vom Transferrin angewendet. Wenn dadurch auch einige, aber nicht alle, der Nachteile der vorstehend erläuterten bekannten Methoden ausgeschaltet werden konnten, so hat doch die Anwendung von schwach sauren Bedingungen und eines hohen Verhältnisses von löslichem Chromogen zu Jbisen neue Störungen eingeführt, oder störende Substanzen, die bei den schon vorher bekannten Methoden anwesend waren, wurden veranlaßt, lediglich ihren Störungsmechanismus zu ändern. Endogene Serumchromogene, wie Bilirubin oder Carentoide, die bei den Proteinfällungs- oder Dialysemethoden nur geringfügige Störungen verursachten, rufen nun beachtliche Störungen und damit Fehlerquellen hervor.

Hämoglobin, das bei den Proteinfällungsmethoden Störungen durch Freisetzen von Eisen aus dem Hämoglobinmolekül verursachte, kann bei den direkten Serumverfahren infolge der ursprünglichen Farbe des Hämoglobins und seinem Beitrag zu der in dem Verfahren gemessenen Gesamtfarbe verfälschte Ergebnisse zeitigen, wobei dessen Farbe fälschlich der Anwesenheit von Eisen im Serum zugerechnet wird. Obwohl jedoch die Störung des Hämoglobins bei diesen Verfahren bis zu einem bestimmten Grad durch diese vorstehend erläuterten nationalen erklärt werden kann, legen die Ergebnisse, die durch die Verwendung von Serumblindproben in einigen bekannten Techniken erhalten werden, nahe, daß das

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Hämoglobin auch weitergehende Störungen hervorrufen kann, die Über die hinausgehen, die durch seine ursprüngliche Farbe verursacht werden.

Blutfett, das bei den früheren bekannten Methoden gestört hat, kann auch bei den direkten Serummethoden stören, weil die Trübung der Probe auch noch zu einem Testzeitpunkt anhält, bei dem die Farbmessung vorgenommen wird (Farbmessungen werden so durchgeführt, daß die Lichtmenge gemessen wird, die von den Chromophoren absorbiert wird, welche durch die Umsetzung von Eisen mit einem Cfetromogen erzeugt werden). Die Trübung hat einen lichtabsorbierenden Lffekt und kann als Chromophor und somit als Elsen interpretiert werden. Um diese Trübung zu korrigieren, wurden Serumblindprobenkorrekturen auf bekannte Weise vorgenommen, jedoch ist die Lichtmenge, die infolge der Trübung absorbiert wird, oftmals in hohem Maße relativ zu der Lichtmenge, die von dem Chromophoren absorbiert wird. So kann ein kleiner Fehler bei der Trübungskorrektur zu einer groften Wirkung auf die Chromophorenmessung führen, was wiederum zu einem Fehler bei der quantitativen Msenbestimmung in der lipämiechen Probe führt.

Bei Atomabsorptionsmethoden wird das Eisen durch Anwendung von hochgradig charakteristischen Atomresonanzbanden bestimmt; da jedoch das gesamte in der Probe anwesende Eisen solche Banden aufweist, verursacht das (eisenhaltige) Hämoglobin positive Störungen und entsprechende Fehler (Henry, op. cit., Seite 681)· Wegen der begrenzten Empfindlichkeit von Atomabsorptionsspektrophotometern und der relativ niedrigen Eisenkonzentration in biologischen Flüssigkeiten sind außerdem große Probenverdünnungen (die üblicherweise vorgenommen werden, um die Einwirkung der proteininduzierten Viskosität auf die Fließverhältnisse auf einem Minimum zu halten) zu vermeiden (ibid.). Folglich können schwankende Proteinkonzentrationen in der ursprünglichen Probe (die von einem Patienten zum anderen schwankt) zu irrtümlichen Testergebnissen infolge der

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Einwirkung von abweichenden Viskositäten auf das Fließverhältnis führen.

Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, die Nachteile und Fehlerquellen der bekannten Eisen-Chelatbildner und der Methoden, in denen sie zur Anwendung gelangen, auszuschalten.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine verbesserte Synthese für die allgemeine Klasse der als Triazine bekannten Verbindungen, durch das die mühevolle und gefährliche Ätherextraktionsstufe überflüssig wird und bei dem durch die Verwendung von N,N-Dimethylformamid als Lösungsmittel höherprozentige Ausbeuten erhalten werden} durch die Synthese von neuen Eisen-Chelatbildnern, d.h. 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho[l,2-e7-astriazin und seinen sulfonierten Analogen; durch die Verwendung des sulfonierten Chelatbildners zum Bestimmen von Elsen in wässrigen Systemen auf die Weise, daß die Wirkung von bestimmten störenden Substanzen auf einem Minimum gehalten oder völlig ausgeschaltet wird; durch die Verwendung von Dimethylsulfoxid zum Beschleunigen der Abtrennung des Eisens aus seinem Transferrlnkomplex, was die Zeit für die insgesamte Eisenbestimmung im Serum verkürzt und die Trübung infolge von Blutfett und/oder Protein vermindert; durch eine Methode, die bestimmte Störungen von Hämoglobin bei der Bestimmung auf einem Minimum hält; und durch Maßnahmen zur Standardisierung und Berechnung der Ergebnisse, die die Fehler bekannter Methoden ausschalten, wenn immer die Ueagentien schwach durch exogenes Eisen verunreinigt sind.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Formeln und einer bevorzugten Ausführungsform in bezug auf die stufenweise Synthese einer sulfonierten Triazinverbindung im ein-zelnen erläutert.*

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^Ν/^ΟΞΝ

JH₂N

NIi₂

NHNH,

¹^

1) CISO₂OH

2) H₂O

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1.) Gewinnung von 2-Pyridylhydrazidin:

Durch Modifizierung des schon erläuterten Verfahrens von Case (ϊ'.ϋ. Case, Journal Organic Chem., Band 30, Seite 931 (1965)) wird 2-Pyridylhydrazidin hergestellt. Case verwandte Äthanol als Lösungsmittel; jedoch ist bei der erfindungsgemäßen Synthese vorgesehen, Hydrazin (ein hochgiftiger und explosiver Stoff, der in seiner Struktur keine sonderliche Beziehung zu den bislang verwendeten Lösungsmitteln zeigt) als Lösungsmittel zu verwenden, i.s wurde gefunden, daß Hydrazin, wenn es in stöchiometrischem Überschuß vorhanden ist, in einer Doppelfunktion sowohl als heaktionsteilnehmer als auch als Lösungsmittel wirkt.

Bei Abwesenheit von Äthanol, das bei dem Case-Verfahren als Lösungsmittel verwendet wurde, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren jedoch nicht eingesetzt wird, kristallisiert das Hydrazidin aus der Lösung aus, wenn das Keaktionsgemisch in Wasser gegossen wird; dies beugt der mühevollen, zusätzlichen und gefährlichen Ätherextraktion vor, die bei Verwendung von Äthanol wegen der hohen Löslichkeit des Produktes in einem Äthanol/Wasser-Gemisch notwendig war. Die Verwendung von Hydrazin als Lösungsmittel gestattet auch die V_erwendung von höheren Heaktionstemperaturen. Die erfindungsgemäße Verwendung von Hydrazin führt zu einer prozentualen Ausbeute, die größer ist als die, welche Case berichtet.

Bei der erfindungsgemäßen Synthese wird eine Menge von 728,77 g (7 mol) 2-Cyanopyridin langsam unter Rühren in 1000 ml 95 %iges Hydrazin gegossen. Wenn die schwach exotherme Reaktion beendet ist, was sich durch Absinken der Temperatur des Reaktionsgemisches anzeigt, werden die Reaktionsteilnehmer auf einem Wasserbad 5 Stunden lang auf 99 - 1° C erhitzt. Man läßt das keaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen, gießt es unter Rühren in 1500 ml kaltes Wasser und bewahrt es über Nacht (etwa 18 Stunden) bei 4° C auf. Die dabei gebildeten Kristall·

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«erden vakuumfiltriert, mit Eiswasser gewaschen und bei Raumtemperatur vakuumgetrocknet„ Man erhält 804,0 g trockenes Material (Fp. 95° C, Ausbeute 84 %).

2.) Gewinnung von 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho 1.2-e -as-triazin:

Diese neue Triazinverbindung, von der sich herausgestellt hat, daß sie außerordentlich wünschenswerte Eigenschaften als tisen-Chelatbildner bei der Eisenbestimmung aufweist, wird hergestellt durch Umsetzen des 2-Pyridylhydrazidins mit Acenaphthochinon (die Verfahrensstufen, die nachstehend noch im einzelnen erläutert werden, stellen wesentliche Modifikationen gegenüber denen des Case-Verfahrens dar, gemäß dem verschiedene andere Triazinprodukte erzeugt werden, die nicht die Vorteile der erfindungsgemäßen Triazlnverbindungen erbringen).

Außerdem wird N,N-Dimethy1formamid (ein Stoff, der in seiner Struktur keine nennenswerte Beziehung zu Xthanol hat und weniger gefährlichst) anstelle von Äthanol, das bei dem Case-Verfahren benutzt wird, als Lösungsmittel verwendet, was zu höheren Ausbeuten an dem gewünschten Kondensationsprodukt führt, als wenn Äthanol In gleicher Weise verwendet würde (dies ist mit größter Wahrscheinlichkeit auf die niedrigen Löslichkeiten des Reaktionsteilnehmers Acenaphthochinon und des Reaktionsproduktes 9-(2-Pyrldyl)-acenaphthoQl,2-e]-as-triazin in Xthanol zurückzuführen) .

Im einzelnen geht man so vor, daß einer Aufschlämmung von 1··3 g (6 mol) Acenaphthochinon in 6 1 N,N-DimethyIformamid 820 g (β mol) 2-Pyridylhydrazidin in kleinen Anteilen bei fortwährendem Durchmischen zugesetzt werden (der größte Teil der suspendierten Feststoffe hat sich bei Beendigung des Zusatzes aufgelöst). Wenn die anfänglich schwach exotherme Reaktion beendet ist, wird das Reaktionsgemisch durch Erhitzen 24 Stunden lang auf 105 bis 110° C gehalten.

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Das Reaktionsgemisch wird dann auf 45° C abgekühlt und unter Ktthren in 16 1 Eiswasser gegossen. Die gebildeten Feststoffe werden vakuumfiltriert und so trocken wie möglich ausgepreßt. Dieser Stoff, der Wasser begierig festhält, wird einige Wochen lang an der Luft getrocknet und dann zu feinem Pulver vermählen. Dieses wird in 4 1 siedendem Benzol aufgeschlammt und nach Abkühlen auf Kaumtemperatuxyf iltriert. Die letzte Stufe wird noch dreimal wiederholt und der erhaltene Feststoff vakuumgetrocknet.

Der erhaltene Stoff hat einen Schmelzpunkt von 198-200° C (unkorriglert), ein grün-lich-gelbes Aussehen und wiegt 1093 g, was einer theoretischen Ausbeute von 65 % entspricht, Ein kleiner Teil dieses Stoffes wird zweimal aus Benzol umkristallisiert, wobei ein Produkt mit dem Fp, 201° C (Zers.) erhalten wird, dessen Elementaranalyse der Zielverbindung entspricht.

Elementaranalyse für ^cig^Hio^N4^:

Berechnet: C - 76,58 % H- 3,57 % N- 19,85 % Gefunden: C- 76,18 % H- 3,74 % N- 20,10 %

3.) Sulfonierung von 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho-Cl.2-e3-aatriazin;

Das folgende Verfahren dient dem Löslichmachen des auf vorstehende Weise bereiteten Triazins in einem wässrigen Syst·»·

1000 g (2,54 mol) 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho[l_f2-eJ-aa-triasln werden in kleinen Anteilen unter Kühren zu 3000 g (1,7 1) Chlorosulfonsäure (eisenfrei) zugegeben. Während der exothermen Reaktion wird das Gemisch durch Eintauchen in «in Eisbad auf 5 bis 10° C gehalten. Das Gemisch wird über Nacht bei Kaumtemperatur (etwa 18 Stunden lang) stehengelassen und dann 96 Stunden lang auf 150° C erhitzt. Das Gemisch wird danach

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auf 5 C abgekühlt und die erhaltene viskose Flüssigkeit vorsichtig auf 4000 g gemahlenes Ms, das aus entionisiertem Warser bereitet worden ist, gegossen (bei dieser letzteren Stufe muß extreme Vorsicht walten gelassen verden wegen der heftigen keaktion zwischen Chlorosulfonsäure und wasser und wegen der Entwicklung von Chlorwasserstoffgas).

Die gebildeten Feststoffe werden unter Vakuum auf einem äinterglastrichter abfiltriert und dann in 3 1 Wasser suspendiert und 30 Hinuten lang an Siedepunkt erhitzt. Der Feststoff wird erneut filtriert und viermal mit 500-ml-Anteilen Wasser gewaschen. Der feuchte Hockstand wird dann in einer minimalen Menge konz. Ammoniumhydroxid gelöst, und von der gebildeten dunkelbraunen Lösung werden nichtgelöste Bestandteile abfiltriert. Die Lösung wird mit konz. Salzsäure angesäuert, bis sich bei weiterer Säurezugabe keine Feststoffe mehr bilden. Die Feststoffe werden abfiltriert, erneut in 2 1 warmem Wasser suspendiert und noch einmal filxfert.

Dieser Waschvorgang wird dreimal wiederholt; jedesmal wird das Material so trocken wie möglich ausgepreßt. Nach dem letzten Waschen mit Wasser wird das Material in 2 1 Methanol suspendiert und zum Sieden erhitzt, auf üaumtemperatur abgetthlt und filtriert. Die erhaltenen Feststoffe werden bei Kaumtemperatur im Vakuum getrocknet, wobei 629 g eines Feststoffes mit den

erhalten gewünschten Löslicbkeitseigenschaften/werden.

Dieses Material ist wahrscheinlich ein Gemisch aus verschiedenen Sulfonsäureisomeren des Ausgangstriazins. Eine zufriedenstellende Analyse für eine Einzelverbindung mit 18 C-Atomen und 4 N-Atomen konnte nicht erhalten werden« Das etwas hygroskopische Material schmilzt bei 350° C unter Zersetzung und hat ein Molekulargewicht von 560, wie durch spektrophotometrische Titration mit Xisen(II)-ionen ermittelt wurde, unter Zugrundelegung eines Komplexes mit drei Molekülliganden pro Eisenatom.

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Es hat sich herausgestellt, daß die auf vorstehend erläuterte Weise hergestellte neue Triazinverbindung außerordentlich vorteilhafte Eigenschaften als Chelatbildner bei der quantitativen Bestimmung von £isen(II)-ionen in wässrigen Systemen aufweist«

Die Prüfung dieser Eigenschaften hat ergeben, daß die maximale Spektraleztinktion des Eisen-Chromogen-Komplexes bei 610 nm auftritt, Extinktionsmessungen dieser Wellenlänge schaffen einen sicheren Vorteil dahingehend, daß sie weit genug von den Absorptionsspitzen der üblicherweise im Serum auftretenden Störungen entfernt liegen. AuSerdem tragen sie dazu bei, daß falsche positive Extinktionen infolge von Trübung und Blutfett auf einem Minimm gehalten werden.

Im Vergleich und in Gegensatz zu bekannten Chelatblldnern zeigen die neuen Verbindungen nach der Erfindung extrem gute ijnpfindlicbkeitseigenschaften. Während einige bekannte Verbindungen eine gute Empfindlichkeit für Eisen besitzen und andere wieder gute Extinktionen in einem bevorzugten Spektralbereich zeigen, so besitzt doch keine einzige bekannte Verbindung diese Eigenschaften in Kombination.

Da außer de« die sulfonierte Form des Triazine in wässrigen Systemen gut löslich ist, werden durch Anwendung dieser Form in einem wässrigen System einige der Probleme ausgeschaltet, die bei den bekannten Methoden auftreten, welche infolge der Unverträglichkeit von in der Probe vorhandenem Protein mit den zum Solvatisieren des Chelatbildner verwendeten Chemikalien die Proteinfällung erfordern.

a) Erste AusfOhrungsform
Stufe I;

Bei der Durchführung der Erfindung gemäß einer bevorzugten Ausfübrungsforo ist vorgesehen, die Probe zu einem Dimethylsulfoxid

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und grenzflächenaktive Mittel enthaltenden sauren Puffersystem zuzusetzen« In dieser Stufe wird nicht nur an Transferrin gebundenes Eisen freigesetzt; die Verwendung von Dimethylsulfoxid und der grenzflächenaktiven Mittel bewirkt auch eine erhöhte Proteinauflösung, ein erhöhtes Maß an Eisenfreisetzung und verbilft dazu, daß die Wirkung von Trübungen und/oder Blutfett»

Minimum die in dem Serum vorhanden sein können, auf einem/gehalten

werden.

Gemäß einer besonders günstigen Ausführungsform sind Mengen und andere Einzelheiten wie folgt:

0,5 ml Serum oder Standard werden zu 2 ecm eines 0,5-molaren Acetatpuffers mit dem pH-Wert 4,5 zugesetzt, enthaltend 10 Vol.-% Dimethylsulfoxid, 5 ml/1 Brij 35, 3 ml/1 Triton X-100 und 0,384 g/l Magnesiumacetat, was eine Dimethylsulfoxidkonzentration in dem Endreaktionsgemisch von annähernd 7,0 Vol.-% ergibt. Das Reduktionsmittel besteht aus 0,1 ml einer 25 Gew.-%igen Lösung von Ascorbinsäure.

Nachdem man das Gemisch 5 Minuten stehengelassen hat, wird die Extinktion bei 610 nm gemessen.

Wenn die Probe Hämoglobin enthält, wurde festgestellt, daß

eine 5-minütige Inkubation vor der ersten Extinktionsmessung _r. die Störungen durch Hämoglobin wirkungsvoll ausschaltet, und ^ zwar sowohl die von seiner ursprünglichen Farbe herrührenden als auch die durch andere Faktoren verursachten, im Gegensatz zu bekannten Serumblindprobenverfahren, bei denen nicht ermittelbar ist, wie groß die kritische Zeit sein muß.

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Stufe II;

Nachdem die Extinktion des vorstehenden Gemisches aufgezeichnet worden ist, wird in einer zweiten Stufe die Lösung eines Chromogene zugesetzt, das die in der Lösung vorhandenen Eisen(II)-lonen komplex bindet, wobei das Chromogen erfindungsgemäß eine wässrige Lösung von 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho[l,2-eJ-as-triazinsulfonat ist, wie es vorstehend erläutert wurde. Zur Bereitung dieser Lösung wird eine geeignete Menge des Chelatbildner zu Wasser zugesetzt und der pH-Wert mit verdünntem Natriumhydroxid eingestellt, bis Auflösung eintritt, d.h. üblicherweise bei Erreichen eines pH-Wertes von 4,5. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform werden 0,1 ml einer 0,01-molaren Lösung (0,02 Gew.-% in dem Endreaktionsgemisch) von 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho-(,l,2-eJ-as-triazinsulfonat zu der Lösung der vorstehenden Stufe I zugesetzt und etwa 5 Minuten lang reagieren gelassen. Schließlich wird die Lndextinktion bei einer Wellenlänge von 610 Nanometern abgelesen*

Stufe III;

Das in der ursprünglichen Probe vorhandene Gesamteisen wird berechnet durch Subtrahieren der Ertinktionsmessung gemäß Stufe I von der gemäß Stufe II, wobei dieser Unterschied die Menge des Eisen-Chelat-Komplexes in der Lösung darstellt· Dieser Extinktionsunterschied wird dann verglichen mit der Extinktion, die sich für eine Lösung mit bekanntem Eisengehalt ergibt, die derselben Behandlung unterzogen worden ist, um den erhaltenen Extinktionswert in einen Eisenkonzentrationswert übertragen zu können.

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b) Andere alternative Ausführungsformen

Die Arbeitsbedingungen bei der Methode, die vorstehend als erste Ausführungsform der berumeisenbestimmung erläutert ist, kann mit Erfolg auch bei anderen Ausführungsformen der üisenbestimmung in wässrigen Systemen angewendet werden.

Beispielsweise wird in der vorstehenden Stufe I die eisenhaltige Prüfsubstanz bei pH 4,5 mit einem Acetatpuffer umgesetzt, der Dimethylsulfoxid enthält, um gebundenes Msen freizusetzen. Während das Vorhandensein von Dimethylsulfoxid bei einigen PrüfSubstanzen einen beträchtlichen Vorteil erbringt, ist dies zu einer ordnungsgemäßen Durchführung mit den meisten Prüfsubstanzen nicht wesentlich, und sein Wegfall beeinträchtigt nicht die Durchführung des Versuches in Abhängigkeit von der Matrix, an die das tisen gebunden war. Bei der ersten Stufe des Verfahrens herrschen saure Bedingungen, um die Entfernung des Eisens von dem Transferrin zu erleichtern. Bei der vorstehend beschriebenen ersten vorteilhaften Ausfuhrungsform wird zu diesem Zweck ein Acetatpuffer mit dem pH-Wert 4,5 verwendet. Es können aber auch andere Puffersysteme, wie Maleat, Luccinat und Glycin, eingesetzt werden, ohne daß der Bereich der Erfindung verlassen wird.

Während Brij 35 und Triton X-IOO die grenzflächenaktiven Mittel bei dieser vorstehend beschriebenen ersten bevorzugten Ausführungsform sind, können mit gleichem Erfolg auch andere grenzflächenaktive Mittel verwendet werden.

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Versuchssystem für die quantitative Bestimmung der ungesättigten Msenbindefähigkeit

a) Erste Ausführungsform
Stufe I;

Um die ungesättigte Eisenbindefähigkeit im Serum auszuwerten, wird in einer ersten erfindungsgemäßen Stufe das Transferrin enthaltende Serum mit einer gepufferten alkalischen Lösung von überschüssigem Eisen(II) kombiniert, d.h. überschüssigen Eisen(II) ionen in bezug auf die absolute Bindefähigkeit der Serumprobe. Diese Kombination wird mit einem Reduktionsmittel versetzt. Nachdem man ausreichend Zeit für die Sättigung des Transferrins mit Lisen(II)-ionen gelassen hat, wird eine anfängliche optische Dichte der Lösung bei 610 nm aufgezeichnet. Diese Extinktionsmessung wird von der Endextinktionsmessung subtrahiert und dient zum Korrigieren der fehlerhaften Extinktionsmessungen, die auf die schwankende Extinktion des Serums selbst zurückzuführen sind.

Bei einer besonders bevorzugten Form sind Mengen und andere Einzelheiten wie folgt:

a) 0,5 ml Serum, das Transferrin enthält, wird mit 2,0 ml eines gepufferten Eisen(II)-reagens kombiniert, das 150 mg/1 Eisen und eine Menge Zitronensäure enthält, die der Menge Eisen äquimolar ist, das in einem Trispuffer zugesetzt wird. Der pH-Wert beträgt 8,4. Es wird gründlich durchmischt.

b) Zu diesem Gemisch wird eine 25 Gew.-%ige wässrige Ascorbinsäurelösung zugesetzt, das Gemisch wird mindestens 5 Minuten stehengelassen, und die Extinktion bei 610 nm wird aufgezeichnet.

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Stufe II;

Das freie Transferrin sättigt sich mit Elsen, und der überschüssig· Eisengehalt (d.h. nicht an Transferrin gebundenes Elsen) der zugesetzten Lösung wird ermittelt. Somit wird in dieser zweiten Stufe lediglich das nicht an Transferrin gebundene in dem Gemisch zurückgebliebene Elsen durch den Zusatz einer Lösung des neuen erfindungsgemäßen Chelatbildner quantitativ bestimmt. Man läßt durch 5-mlnUtlge Inkubation bei Kaumtemperatur die Chelatbildung sich vollziehen. Der meßbare Elsengehalt des Gemisches wird dann berechnet durch Ermitteln der sich ergebenden Extinktion bei einer Wellenlänge von 610 nm.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform sind Mengen und andere Einzelheiten wie folgt:

0,1 ml einer 0,01-molaren Lösung von 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho- £l,2-V]-ae-triazinsulfonat, pH-Wert 4,8, werdemzu dem Gemisch der vorstehenden Stufe I zugesetzt, was zu einer Konzentration von 0,02 Gew.-% in dem Endreaktionsgemisch führt. Dann läßt man etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur reagieren. Das entwickelte Chromophore wird dann bei 610 nm gemessen und die Extinktion aufgezeichnet.

Stufe III χ

Di· ungesättigte Eisenbindefähigkeit im Serum wird dann berechnet durch Subtrahieren der Extinktion von Stufe I von der Extinktion von Stufe II und Vergleichen des erhaltenen Wertes mit den Extinktionen von Lösungen mit bekannter Sisenmenge. Die erhalten· Zahl 1st dann ein Ausdruck für die Menge an Elsen, die in Lösung verblieben ist und nicht an Transferrin gebunden wurde.

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Die Menge an Elsen, die anfänglich durch die lteagentien bei dem Versuch zugesetzt wurde, wird gemessen, indem man »Ine Probe von eisenfreiem Wasser denselben vorstehend erläuterten Verfahrensstufen unterzieht, wie sie für einen unbekannten Gehalt in den Stufen I und II vorgenommen wurden, wobei diese Messung nachstehend als "Wasserbezugsmessung" bezeichnet ist»

Die Subtraktion der Menge des nicht an Transferrin gebundenen Eisens von der zugesetzten Menge (wie durch die Wasserbezugsmessung bestimmt wird), ergibt, gemessen als ungesättigte Elsenbindeffihlgkeit in Werten für aufgenommenes Eisen, eine direkte Messung des ungesättigten Transferrins.

Noch deutlicher gesagt, wird die ungesättigte Eisenbindefählgkeit anhand der folgenden Formel berechnet:

S_n _tx - E₀ - E, - Extlnktlonsäqulvalent für gebunden·· Elsen In der vorstehenden Formel 1st E_{H Q} die Extinktion der Wasser-

bezugsmsBsung, Eg dl· Extinktion des Unbekannten gemäft der vorstehenden S
g«mäft Stuf· I.

vorstehenden Stufe II und I, die Extinktion des Unbekannten

Die Anwendung dieser mathematischen Methode durch den Ausfuhrenden korrigiert automatisch mögliche 8puren von Verunreinigungen der Reagentien mit Eisen. Durch eine Wasserbezugsmessung bei jedem Versuch und deren Einsatz in der vorstehenden Berechnung werden zugesetztes Elsen ebenso wie Spuren von Verunreinigungen, die die Wirkung von zusätzlichem Eisen haben, gemessen und in Rechnung gesetzt, wodurch die Notwendigkeit einer jedesmaligen ReStandardisierung bei Anwendung des Verfahrens überflüssig wird.

Di· Erfindung hat somit folgenden Umfang:

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a) eine neue Triazinverblndung, nämlich 9-(2-Pyriüyl)-acenaphthori,2-e^]-as-triazin, und dessen sulfonierte Form;

b) Die Verwendung dieser Triazinverblndung sowohl als Chelatbildner als auch als Indikator für fcisen(II)-ionen, wobei der Vorteil darin besteht, daß in Kombination sowohl eine gute Empfindlichkeit als auch eine maximale Extinktion gegeben ist in einem Bereich, der weit entfernt ist von dem, in welchem die üblichen Störungen auftreten, wodurch die Zuverlässigkeit der Untersuchung verbessert wird;

c) die Verwendung von Hydrazin sowohl als Reaktionsteilnehmer als auch als Lösungsmittel bei der Bereitung des Hydrazidinzwischenproduktes, wodurch die Verwendung von Äthanol und die Notwendigkeit der Ätherextraktion überflüssig werden und wodurch auch die Nachteile ausgeschaltet werden, die durch diese zusätzlichen Extraktionsstufen eingebracht werden;

d) Die Verwendung von N,N-Dimethylformamid als Lösungsmittel bei der Gewinnung der Triazlnverbindung, was zu höheren Ausbeuten an dem gewünschten Triazin führt;

e) die Verwendung von Dimethylsulfoxid in einem wässrigen System für die quantitative Bestimmung von Eisen und ungesättigter Eisenbindefähigkeit, was zu einer erhöhten Eisenfreisetzung führt, die Einwirkung von Trübung und/oder Blutfett auf einen Minimum hält und die Proteinauflösung verbessertι

f) 4Ie Yerfshrensstufe bei der Bestimmung von Eisen in biologischen Systemen, bei der die Inkubationszeit ausgedehnt wird, was su einer Verminderung von Störungen führt, die auf· tretes, wem» bfmolysierte Prüfsubstanzen verwendet werden;

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θ) eine neue Methode zur Bestimmung der ungesättigten Eisenbindefähigkeit, die Fehler infolge von Verunreinigungen des Reaktionssystems mit exogenem Eisen ausschaltet und

h) die Verwendung einer neuen Triazinverblndung oder ihrer sulfonierten Form bei der Bestimmung von Gesamt- und/oder reduziertem Eisen in einer Vielzahl von Matrices.

Wenn auch die Erfindung vorstehend im Zusammenhang mit der Bestimmung von Eisen(II)-ionen in Serum erläutert ist, so können die erfindungsgemäßen Prinzipien und Grundsätze ohne weiteres auch mit Erfolg auf die Bestimmung von Eisen in anderen wässrigen Systemen, wie Abwasser, Meerwasser und anderen wässrigen chemischen Lösungen, angewendet werden.

Patentansprüche;

•otiot/oao!

Claims

Patentansprüche

)
/l/ Triazin, dadurch gelennzeichnet, daß es 9-(2-Pyridyl)-acenaphtho(_l,2-e J-as-triazin oder sein sulfoniertes Derivat ist.
2. Verfahren zum herstellen des Triazine fiemäß Anspruch 1, bei dem 1) hydrazin und 2-Cyanopyridin in Gegenwart eines Lösungsmittels zu 2-Pyrit'ylhydrazidin umgesetzt werden und 2) das 2-Pyridylhyärazidin mit einem 1,2-Diketon in Gegenwart eines Lösungsmittels kondensiert und das Kondensationsprodukt gegebenenfalls sulfoniert wird, dadurch gekennzeichnet, daß das lösungsmittel in ükife 1) ein stöchiometrischer Überschuß an Hydrazin ist und daß das Lösungsmittel in btufe 2) H,N-Dimethylformamid und das 1,2-Diketon Acenaphthochinon ist.
3. Verwendung des Triazine gemäß Anspruch 1 als Indikator und Chelatbildner für Eisen(II)-ionen bei der qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Eisen(II)-ionen in einem wässrigen oder organischen Medium, insbesondere einer biologischen Probe.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfonierte Produkt in dem Endreaktionsgemisch in einer Konzentration von mindestens etwa 0,02 Gew.-%, vorzugsweise in mindestens der dreifachen molaren Menge an durch die Probe eingebrachtem ^isen, vorhanden ist.
5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Keektionsgemisch mit Dimethylsulfoxid versetzt wird.

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ORIGINAL INSPECTED
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Dimethylsulfoxid in dem Lndreaktionsremisch mindestens 7,0 Vol.-% beträgt.
7. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 6_f dadurch gekennzeichnet, daß die Methode für die Bestimmung von ungesättigtem oder Gesamt-Transferrin angewendet wird.
it. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daü> die Methode zur quantitativen Bestimmung von Msen(Ii )-ionen in Serum angewendet wird.
9. Verwendung des Triazine gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung des Oxydationszustandes von Eisenionen in einer Lösung und/oder Bestimmung des Verhältnisses von seiner oxydierten zu seiner reduzierten Form als Indikator für den Oxydationszustand der Eisenionen in der Lösung.
10. Verwendung des Triazins gemäß Anspruch 1 zur quantitativen Bestimmung der ungesättigten Eisenbindefähigkeit einer Serumprobe, wobei die Probe in einem Puffersystem für einen ausgedehnten Zeitraum gehalten wird, der ausreichend ist, um durch hämolysierte Proben auftretende Störungen auf einem Minimum zu halten.
11. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der ausgedehnte Zeitraum mindestens etwa 5 Minuten beträgt.
12. Methode zur Bestimmung der ungesättigten Eisenbindefähigkeit in einer Serumprüfsubstanz, bei der die Schwankungen des Eisengehaltes in den Keagentien automatisch korrigiert werden, dadurch gekennzeichnet, daA

a) eine eine unbekannte Menge Transferrin enthaltende Serumprüfsubstanz mit einen Reagens gesättigt wird, das Eisen(II)-ionen im UberschuB, bezogen auf die absolute Bindefähigkeit des in der Prebe vorhandenen Transferrins enthält,

lOllOI/Ollt

b) daß die in Stufe a) nicht durch Transferrin gebundene Eisenmenge durch Umsetzung mit einem eine Eisenindikatorverbindung enthaltenden Reagens bestimmt wird,

c) daß an die Stelle der Probe der vorstehenden Stufe a) eine Probe von eisenfreiem Wasser gesetzt und der Gesamteisengehalt ermittelt wird, der sich durch die Reagentlen durch Anwendung der in den Stufen a) und b) eingesetzten Reagentien ergibt, und

d) daß die Eieenmenge, die nach Umsetzung mit der Serümprobe in der Lösung zurückbleibt und wie sie in Stufe b) erhalten wird, von der zugesetzten Eisenmenge substrahiert wird, wie sie in Stufe c) gemessen wird, wobei sich eine direkte Messung der gesättigten Kisenbindefähigkeit der ursprünglichen SerumprUfsubstanz ergibt.

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