DE2748857C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnstoff - Google Patents
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von HarnstoffInfo
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Description
NH-CH-(CH2) —N
X1
OR.
ist, worin bedeuten:
Ri ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe,
R2 ein Wasserstoffatom, die Methyl- oder Athylgruppe,
R] und R4
a) jeweils ein Wasserstoffatom oder die Mcihylgruppe
oder
b) jeweils zusammen mit dem Stickstoffatom die Morpholino- oder Piperidinogruppe, wobei in diesem
Fall b) R2 auch die n-Propylgruppe sein
kann, und
π den Zahlenwert 1, 2 oder 3.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chromogene Verbindung l!-<4-Amirto-1
-methylbutylaminoi-o-methoxychinolin verwendet
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chromogene Verbindung 8-(2-N-Morpholinoäthylamino)-6-methoxychinolin
verwendet wird.
4. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch I, bestehend aus einer sauren Lösung ::iner
chromogenen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß die chromogene Verbindung ein 6-Hydro;iy-8-amino-chinolin-Derivat
der allgemeinen Formel I
NH-CH-(CHi)-N:
Ra (I)
OR,
ist. in der R1. Rj, Ri. Rj und η die in Anspruch I
angegebenen Bedeutungen besitzen.
Die I-rlindung betrifft ein Verfahren zur quaniitali'.en
Bestimmung von Harns"i|| in einer llüssigen Probe
durch Behandeln der Probe mit einer sauren l.ö.sLnt! des
o-I'h'.hal.ikie'ivil-; iiivl einer sauren l.nsuim einer ehrriiiogenen
Verbindung, die mit dem Reaktionsprodukt des Harnstoffes und des o-Phthalaldehyds einen Chromophor
bildet, und Messen der Extinktion der so gebildeten sauren Lösung.
Viele Jahre wurde auf verschiedenen Wegen und mit unterschiedlichen Versuchen darum gerungen, ein vorteilhaftes
Verfahren zur Harnstoffbestimmung zu finden. Bekannte Versuche zum Auffinden einer zufriedenstellenden
Harnstoffbestimmung befaßten sich lange damit,
to die Reaktion zwischen Harnstoff und Aldehyd auszunutzen und ein gefärbtes Reaktionsprodukt oder ein Reaktionsprodukt
zu erhalten, das bei der Reaktion mit einem Chromogen gefärbt wird.
Eines der ersten dieser Verfahren, bei denen ein Aldehyd verwendet wurde, stammte offensichtlich von Brown, dereine Harnstoffbestimmung unter Anwendung dieser Reaktion mit p-Dimethylaminobenzaldehyd (DMAB) erprobte (Brown, H.H., Anal. Chem. 31 : 1844 [1959], S. 9).
Eines der ersten dieser Verfahren, bei denen ein Aldehyd verwendet wurde, stammte offensichtlich von Brown, dereine Harnstoffbestimmung unter Anwendung dieser Reaktion mit p-Dimethylaminobenzaldehyd (DMAB) erprobte (Brown, H.H., Anal. Chem. 31 : 1844 [1959], S. 9).
Jedoch waren trotz der Arbeiten vieler Forscher (Rcijers, A.F.M. und Tas, M.M., CHn Chem. Acta,
9: 197 [1964J, S. 10) Probleme bei der Methode von
Brown geblieben. So stellten sich durch die üblicherweise verwendeten Arzneimittel (mit der begleitenden Möglichkeit
der Fehldiagnose) Störungen ein. Ferner war die Empfindlichkeit der entwickelten Entfärbung gegen
Temperaturschwankungen (mit der Notwendigkeit des Einsatzes teurer Laborausrüstungen, um die Farbstabilität
während des Messens der Absorption bzw. der Extinktion sicherzustellen) festzustellen.
Während es noch 1973 versucht wurde, eine verbesserte, auf der Aldehydreaktion basierende Bestimmungsmethode zu finden, schlugen Morin und Prox (J., Clin.
Chem. Acta, 47 : 27 [1973], S. 10) ein auf der Umsetzung zwischen Harnstoff und p-Dimethylaminobenzaldehyd
(DMAB) beruhendes Verfahren vor, wobei sie versuchten. Harnstoff direkt durch Messen der Extinktion des
durch den Aldehyd gebildeten Chromophors quantitativ zu erfassen, ohne Protein aus der Probe zu entfernen.
Dennoch litt das Verfahren von Morin und Prox unter dem Problem der Störung durch üblicherweise verwendete
Arzneimittel.
Nach Jungetal. InClIn. Chem. 21 : 1136 (1975), S. 10
und dem US-Patent 38 90 099 wurde Harnstoff mit einem anderen Aldehyd, nämlich dem o-Phthalaldehyd.
umgesetzt. Hier ging man einen Schritt weiter und kuppelte das Produkt dieser Reaktion mit N-(l-Naphthyi)-äthylendiamindihydrochlorid.
Obwohl dieser Vorschlag gewisse Vorteile bot, indem zuminder.!, keine erhöhten
Temperaturen zur Entwicklung des Chromophors erforderlich waren, zeigte er dennoch die nachfolgend wiedergegebenen
Nachteile.
Zunächst erforderte dieses Verfahren N-(l-Naphthyl)-äthylendiamindihydrochlorid.
Hierbei handelt es sich um
ein aus jr-Naphthylamin synthetisiertes Material. Somit
kann es wahrscheinlich mindestens Spuren an jr-Naphthyl-imjn
enthalten, el. h. an einer Verbindung, die nach
allgemeiner Kenntnis ein starkes Karzinogen darstellt (ein krebserregendüs Mittel) (Merck Index. 8. Auflage.
S. 717. Merck [19691, S, II), Des weiteren ist das erforderliche
N-( I-Naphthylläthylendiamindihydrochlnriii
ueaen dessen unbekannter Wirkungen bei der Lagerung
in der im Reagenz erforderlichen Säure nachteilig, wobei
das N-( 1 -NaphthyD-alhylendiamindirndrochlorid zerfallen
kann, wobei das vorgenannte karzinogene .r-Naphthvlamin
anfällt Die mogliehe deguvAjrl \<>n jr-Naphthylamin
in den l.aborräumcn gefährdet aufgrund der
unmittelbaren oder lanLvei'iuen linwirkuns' die <
icMind-
heit des Laborpersonals. Darüber hinaus zeigt dieses Verfahren die bedeutsame Störung durch eine Klasse von
Arzneimitteln, insbesondere den Sulfa-Arzneimitteln, die
gewöhnlich verwendet werden, um spezielle Krankheiten zu behandein, bei denen die Bestimmung von Harnstoff
ein entscheidender diagnostischer Test ist. Hierbei wird bis zu einem gewissen Ausmaß die Harnstoffmenge
infolge der Gegenwart dieser Arzneimittel fehlerhaft überbewertet, d. h. sie wird unzuverlässig und ungenau.
Die oben aufgezeigten Nachteile der bekannten Vorschläge werden auch nicht durch das Verfahren behoben,
das sich aus der US-PS 38 90 099 ergibt und dem eingangs beschriebenen entspricht.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das eingangs beschriebene Verfahren so zu verbessern, daß die
quantitative Bestimmung von Harnstoff einfacher, exakter, billiger und ohne Gefährdung des damit befaßten
Personals möglich ist. Des weiteren soll die Erfindung ein besonders geeignetes Reagenz zur Durchführung
eines derartigen Verfahrens vorschlagen.
Diese Aufgabe \rird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die chromogene Verbindung ein 6-Hydroxy-8-amino-chinolin-Derivat
der allgemeinen Formel I
-R3
NH-CH- (CH2) „ — Κ
OR1
ist, worin bedeuten:
R, ein Wasserstoffatom oder die Methv'gruppe.
Rj ein Wasserstoffatom, die Methyl- oder Äthylgruppe,
R, und R4
a) jeweils ein Wasserstoffatom oder die Methylgruppe oder
b) jeweils zusammen mit dem Stickstoffatom die Morphollno- oder Piperidinogruppe, wobei in diesem
Fall b) R2 auch die n-Propylgruppe sein kann, und
// den Zahlenwert 1, 2 oder 3.
Die Erfindung betrifft des weiteren ein Reagenz zur Durchführung des obigen Verfahrens, bestehend aus
einer sauren Lösung einer chromogenen Verbindung, wobei die chromogene Verbindung ein 6-Hydroxy-8-amino-chinolln-Derlvat
der obigen allgemeinen Formel I ist.
Erfindungsgemäß werden als chromogene Verbindung bevorzugt 8-(4-AmInO-I -methyIbutylamino)-6-methyI-oxychinoün
und 8-(2-N-Morphollnoäthylamino)-6-methoxychinolin verwendet.
Erfindungsgemäß Ist demzufolge die Bestimmung von Harnstoff empfindlicher und spezifischer und genauer
durchzuführen. Indem eine chromogene Verbindung, die
mit dem Kondensationsprodukt des Harnstoffs und des o-Phthalaldehyds reagiert, eingesetzt wird, wodurch
letztlich ein Chromophor gebildet wird, der die
erwünschten Eigenschaften im Hinblick auf die klinische Untersuchung auf Harnstoff zeigt. Dieser Chromophor
ist nicht lichtempfindlich und damit stabil
Erflndungsgcmiili lassen sich Harnstorf und nicht freie
Animoniumionen messen, so daß das erflndungsgcmäßc Verfahren ohne die durch Vorbehandlung einer Probe
hervorgerufenen Kosten schnell zur Messung von aus I rin stammendem llanisiufl geeignet ist So kann die
i liirn-Huffanalvse extrem schnell durcrmel'ühri werden
und erfordert weniger als fünf Minuten. Die Anwendung erhöhter Reaktionstemperaturen sowie der Einsatz unüblicher
Laboreinrichtungen sind nicht erforderlich. Schließlich genügt die Reaktion, die beim erfindungsgemäßen
Verfahren abläuft, dem Beerschen Gesetz über einen weiten Konzentrationsbereich des Harnstoffs, d. h.
die Konzentrations/Extinktions-Ablesungen stehen in direkt linearem Verhältnis, so daß die Fehlermöglichkeit
vermindert und damit das wiederholte Durchfüh^n von Analysen verringert werden kann. Hierdurch erhält der
klinische Mediziner mit einem Minimum an Kosten verläßlichere Ergebnisse. Weiterhin zeigt das erfindungsgemäße
Verfahren eine sehr kleine Störanfälligkeit gegenüber Arzneimitteln, die gewöhnlich zur Behandlung von
Krankheiten verwendet werden, bei denen die Messung von Harnstoff zu deren Auffinden und Überwachen herangezogen
wird.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Probe einer Körperflüssigkeit,
die Harnstoff enthält, in ein Reaktionsrohr gegeben. Hierzu werden eine saure Lösung des o-Phthalaldehyds
und eine weitere saure Lösung gegeben, die eine chromogene Verbindung enthält, die der vorstehend genannten
allgemeinen Formel I unterzuordnen ist. Die Bildung des Chromophors beginnt sofort. Die Genauigkeit der Farbbildung
kann, wenn gewünscht, durch Inkubation der Reaktionsmischung tvsi 37° C beschleunigt werden.
Innerhalb von 3 bis 5 min wird genug Farbe gebildet, so daß das üblicherweise in klinischen Labors vorhandene
Photometer verwendet werden kann, um die gebildete Farbmenge zu vermessen. Die Menge des in der
ursprünglichen Probe vorhandenen Harnstoffs wird durch Vergleich der Extinktion bzw. der Absorption der
Probe des Patienten mit der Extinktion berechnet, die eine in gleicher Weise behandelte Standardlösung genau
bekannter Harnstoffkonzentration zeigt.
Das o-Phihalaldehyd-Reagenz wird dadurch hergestellt,
indem 200 bis 2000 mg o-Phthalaldehyd zu einer aliquoten Menge einer näherungsweif: 3,75 η Schwefelsäure
gegeben werden. Zu dieser Mischung wird zweckmäßigerweise eine solche Menge eines Polyoxyäthylenlauryläthers
oder eines Alkylarylpolyäthers oder eines anderen nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels
gegeben, daß die endgültige Konzentration des grenzflächenaktiven Mittels etwa 1 bis 3% (Gew./Vol.) Ist. Die
Mischung wird dann auf das endgültige Volumen von 1 I gebracht.
Auf die oben beschriebene Weise erhält man ein Reagenz
mit einer Konzentration des hauptsächlich reaktiven Bestandteils, o-Phthalaldehyd, die eine genaue und
empfindliche Untersuchung des Harnstoffs in Blutflüssigkeiten schafft.
Die Konzentration des o-Phtalaldehyds kann innerhalb
der hier gegebenen Parameter schwanken, was von dem besonderen Anwendungsbereich des Reagenzsystems
abhängt. So ist es z. B. gefunden worden, daß die Erhöhung der Konzentration des o-Phthalaldehyds In diesem
Reagenz zu einem bedeutenden Anstieg der Farbbildungsgeschwindigkeit führt. Somit würde es für den
Laboranalytiker, dereinen Hochgeschwindfgkeltsanalysator
zur Bestimmung chemischer Verbindungen besitzt, erstrebenswert sein, die Konzentration des Reagenzes zu
erhöhen, so daß die Farbe schnell gebildet und gemessen werden kann, um hierdurch die Produktivität und den
Durchlauf der Analysen zu erhöhen.
Wenn jedoch das Verfahren manuell durch einen Labortechniker betrieben wird, wird es umgekehrt erstrebenswert
sein, die Konzentration dieses Reagenzes zu
^niedrigen, um genügend Zelt für die Analyse zu haben
und um die Schritte zu vollziehen, die zu einer planmäßigen Behandlung einer Vielzahl von Proben erforderlich
Es ist demzufolge ersichtlich, daß die endgültige Konzentration
des eingesetzten Reagenzes von dem jeweiligen besonderen Anwendungsgebiet abhängt, obwohl alle
Konzentrationen innerhalb der gegebenen Parameter zu einer genauen und richtigen Untersuchung führen.
Das chromogene Reagenz wird durch Auflösung einer geeigneten Menge der zu verwendenden chromogenen
Verbindung in einer Lösung hergestellt, die etwa 4 Mol/l Schwefelsäure und zweckmäßigerweise etwa 80 Mol/l
Borsäure und ein grenzflächenaktives Mittel wie PoIyoxyäthylenlauryläther
oder Alkylarylpolyäther oder ein anderes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel, in
einer endgültigen Konzentration von etwa 1 bis 3% enthält. Die genaue Menge der zu verwendenden chromogenen
Verbindung wird durch die Molarität des o-Phthalaldehyd-Reagenzes,
das für den besonderen Anwendungsz,veci;
vorgesehen ist, bestimmt. Als aligemeine Richtlinie
kann gelten, daß die Molarität der chrom', genen Verbindung idealerweise etwa bei 0,1 bis 1,0 mal so viel wie
die Konzentration des o-Phthalaldehyds in der fertigen
Reaktionsmischung sein sollte.
Die Erfindung kann eine Vielzahl von Modifikationen erfahren, ohne daß damit der Rahmen verlassen wird. So
wurde vorstehend erwähnt, daß das o-Phthalaldehyd-Reagenz
in einer 3,75 η Schwefelsäurelösung vorliegt. Es hat sich hierbei gezeigt, daß diese Schwefelsäurekonzentration
bezüglich der angestrebten Reaktionsgeschwindigkeit und der Wahl der starken Säure das erfindungsgemäße
Verfahren optimiert. Es kann jedoch auch von dieser Konzentration abgewichen werden, wobei sich
dennoch die mit der Erfindung angestrebten Ergebnisse einstellen. Auch können beliebige bekannte nicht-ionische
grenzflächenaktive Mittel bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens herangezogen werden.
Bei den oben beschriebenen Ausgestaltungen der Erfindung wird die chromogene Verbindung in einer 8 η
Schwefelsäurelösung eingesetzt. Aber auch hier sind Abweichungen möglich. Als allgemeine Richtlinie hilt,
daß entweder das Erhöhen oder Vermindern der Säurekonzentration des Reagenzes zu einer Verminderung der
Geschwindigkeit der in der fertigen Reaktionsmischung beobachteten Farbbildung führt. Während beträchtliche
Schwankungen der Säurekonzentration toleriert werden können, können ziemlich große Abnahmen der Säurekonzentration
zu einer beträchtlich verminderten Farbbildungsgeschwindigkeu führen. Ziemlich große Erhöhungen
der Säurekonzentration können zu einer verminderten Stabilität und zu unerwünschten Auswirkungen
auf das Laborpersonal und die Ausrüstung, die den starken
Säuren ausgesetzt wird, führen.
Als allgemeine Richtlinie für die Herstellung der vorstehend beschriebenen beiden Reagenzien gilt, daß beide
zweckmäßigerweise ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthalten. Dieses Mittel kann zwei Zwecken
dienen, was von der verwendeten besonderen chromogenen Verbindung abhängt. Zum Beispiel verleiht im allgemeinen
die Einverleibung eines grenzflächenaktiven Mittels dem Reaklionssysiem bessere Strömungseigenschaften,
wodurch ein akzeptableres Reagenz für jene analytischen Verfahren zur Verfügung steht, bei denen die
Extinktiop in einem Photometer abgelesen wird, das mit einer durchströmten Zelle versehen ist. Hierbei kann es
sich z. B. um ein System handeln, bei dem eine Einzelzelle verwendet wird, um alle Extinktionswerte mittels
eines automatischen Mittels zum Füllen und Entleeren des Zelleninhaltes zu messen.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren grenzflächenaktiven
to Mittel dienen des weiteren dazu, das Auflösen der jeweils verwendeten besonderen chromogenen Verbindung zu
erleichtern. Es hat sich gezeigt, daß die Einverleibung eines grenzflächenaktiven Mittels geeigneter Konzentration
erforderlich sein kann, um das Auflösen der verwendeter,
besonderen chromogenen Verbindung zu unterstützen, um auf diese Weise das erfindungsgemäße Verfahren
zu optimieren.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Beispiels noch näher erläutert.
Herstellung des Reagenzsystems
Ein o-Phtha!aldehydreagenz wurde hergestellt, indem 2000 mg o-Phthalaldehyd in etwa 800 ml 3,75 η Schwefelsäu;c
gelöst wurden, die 1 ml einer 25%igen Lösung des Polyoxyäthylenlauryläthers enthielt. Das Reagenz
wurde dann mit einer 3,75 η Schwefelsäure auf ein Volumen von 1 I gebracht. Das Aufnahmereagenz wurde
durch Lösen von 500 mg 8-(4-Amino-l-methylbutylamino)-6-methoxychinolinphosphat
in 800 ml einer Lösung hergestellt, die 5,0 g Borsäure, 222 ml konzentrierte
Schwefelsäure und 0,9 ml einer 25%igen Lösung des Polyoxyäthylenlauryiäiiiers enthielt. Die erhaltene
Lösung wurde durch Zugabe von Wasser auf ein Volumen von 1 I gebracht.
Analytische Verfahren
Das obige Reagenzsystem führte zu einer sehr schnel-
"0 len Farbbildung, die sehr gut für eine automatisierte
Analyse geeignet war.
Bei der Verwendung dieses Reagenzsystems wurden etwa 30 μΐ einer Körperflüssigkeit in ein Reaktionsrohr
gegeben. Gleichzeitig wurden etwa 1,8 ml jedes der oben
4S beschriebenen Reagenzien zugegeben. Die erhaltene
Mischung wurde zwecks Homogenisierung sorgfältig gemischt. Die Reaktionsmischung wurde dann bei 37° C
einer Inkubation unterzogen, um die Farbbildung während einer Dauer von 3 min zu beschleunigen. Die Reaktionsmischung
wurde dann in ein Spektralphotometer überführt und cK; Extinktion der erhaltenen Farbe bei
520 nm gemessen. Der Harnstoffgehalt der Probe der Körperflüssigkeit des Patienten wurde dann automatisch
anhand der Extinktion berechnet, die bei einer in gleicher Weise behandelten Standardlösung des Harnstoffs abgelesen
worden war.
Dieses besondere Reagenzsystem und dessen Anwendung zeigten, daß mit Serumproben, die 150 mg/dl Harnstoffstickstoff
enthalten, linerare Ergebnisse erhalten werden. Tatsächlich trat durch Sulfaarzneimittsl, die
gewöhnlich zur Behandlung von Nierenfunktionsstörun=
gen verwendet werden, keine Beeinträchtigung ein.
Claims (1)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnstoff in einer flüssigen Probe durch Behandeln
der Probe mit einer sauren Lösung des o-Phthalaldehyds
und einer sauren Lösung einer chromogenen Verbindung, die mit dem Reaktionsprodukt des Harnstoffes
und des o-Phthalaldehyds einen Chromophor bildet, und Messen der Extinktion der so gebildeten
sauren Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß die chromogene Verbindung ein 6-Hydroxy-8-aminochinoIin-Derivat
der allgemeinen Formel I
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