DE2221158A1

DE2221158A1 - Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin

Info

Publication number: DE2221158A1
Application number: DE19722221158
Authority: DE
Inventors: Denney Jerry William
Original assignee: American Monitor Corp
Current assignee: American Monitor Corp
Priority date: 1971-04-30
Filing date: 1972-04-28
Publication date: 1972-11-16
Also published as: US3715188A; DE2221158C3; FR2136763A5; CA964174A; GB1393724A; DE2221158B2

Description

Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin

Die Erfindung betrifft ein Veifahren zur quantitativen kolorimetrischen oder spektrophotometrischen Bestimmung von Cholesterin in Serum, Plasma oder anderen zu untersuchenden biologischen Substanzen unter Verwendung eines■ Cholesterin-Reagens.

Cholesterin, das eines der im Blutserum gefundenen Fettsubstanzen ist und das vorwiegend in der Leber gebildet wird', ist allgemein als sehr bemerkenswerter Faktor bei verschiedenen Erkrankungsprozessen des menschlichen Körpers, einschließlich Erkrankungen des Herzens, des Vascularsystems uöw., bekannt·

Die Einbeziehung von Cholesterin in die A'tiologie und Prognose von Arteriosklerose und Herzkrankheiten hat zu einem enormen Wachstum der Literatur auf diesem G&biet

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angeregt, von denen die meisten sicherstellten und erkannten, daß eine statistisch bemerkenswerte Beziehung zwischen hohen Serumcholesterinspiegeln und dem Auftreten von Coronararterienerkrankungen auftritt; diese Beziehung läßt· es wünschenswert erscheinen, die Cholesterinspiegel in dem Serum auf einem niedrigen Niveau oder zumindest niedrigen Normalniveau zu halten.

Deshalb ist eine genaue Cholesterinmessung des Serumcholesterins sehr wünschenswert, weil, wenn bei einem Patienten fälschlich ein zu hoher Cholesterinspiegel diagnostiziert wird, er fälschlich auf eine unangenehme und teure Korrektivdiät gesetzt wird; oder wenn die Diagnose zu niedrig ausfällt, kann es vorkommen, daß ein Patient, der eine solche Diät nötig hätte, unbehandelt bleibt.

Eine korrekte Cholesterinmessung ist auch notwendig, um eine fälschlich hohe Cholesterindiagnose zu verhindern, was dazu führen kann, daß Schilddrüsenschäden unbeachtet bleiben oder übersehen werden, weil bestimmte Schilddrüsenerkrankungen charakteristischerweise einen niedrigen Cholesterinspiegel verursachen. Hyperthyroidisinus wird begleitet von Hypocholesterolämie in einem solchen Ausmaß, daß die Serumcholesterinmessung zur Überwachung des Schilddrüsenstatus herangezogen wurde. Auch hier ist die Notwendigkeit der Genauigkeit bei der Cholesterinmessung gegeben.

febererkrankungen verändern die Cholesterinspiegel, und die Messung des Serumcholesterins ergibt eine Information über die Leberfunktion, wie die Fähigkeit der Leberzellen zur Erzeugung verschiedener Verbindungen.

Nicht nur der Serumcholesterinspiegel eines Menschen ist von Bedeutung, sondern es ist auch wichtig, daß die Genauigkeit der Bestimmung groß genug ist, daß jede Änderung, die von Tag zu Tag, von Woche zu Woche oder von Monat zu Monat

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auftreten kann, zuverlässig festgestellt wird, weil es wichtig ist, die Arzneimittel- und DiättherapJe£u verfolgen und die dadurch hervorgerufenen Cholesterinänderungen und/oder Änderungen der Körperanspreehbarkeit zu ermitteln. Wenn die durchgeführte Untersuchung nicht ausreichend zuverlässig und spezifisch ist, kann eine Veränderung von einigen störenden Substanzen fälschlich als ein Trend des Cholesterinspiegels interpretiert werden, insbesondere, weil die störenden Substanzen selbst sich in ihrer Konzentration von Zeit zu Zeit ändern, und das keineswegs immer proportional zu irgendeiner Änderung des Cholesterins.

Obwohl deshalb eine ausreichend genaue Messung des Cholesterins in Körperflüssigkeiten seit langer Zeit als wertvoller und lebensnotwendiger Faktor erkannt worden ist, ist seine Messung ständig problematisch. Es sind verschiedene Methoden zur Cholesterinbestimmung bekannt; aber ein anhaftendes und ständiges Problem ist, daß andere Stoffe in der zu untersuchenden Prüfsubstanz maskieren oder stören. So wurden bei direkten oder nicht mehrere Stufen umfassenden Methoden nicht die Ungewißheiten oder die Fehler ausgeschaltet, die auf diese anderen Substanzen zurückzuführen sind; und vielstufige Methoden zum Extrahieren der nichtcholesterinartigen Substanzen haben zu höheren Bestimmungskosten geführt, und ihre Komplexheit trägt zu einer Vermehrung der Fehlerquellen bei.

Als treffendes erläuterndes Kriterium dafür, daß die Cholesterinbestimmungen des Standes der Technik als gründlich unbefriedigend und unzuverlässig erkannt werden, kann die kürzlich gemachte Äußerung des Vorsitzenden der YaIe University School of Medicine (Abteilung Laboratory Medicine) gewertet werden: "Ich glaube, daß mehr als 90 % der laufend den Ärzten zugehenden Cholesterinwerte ungeeignet für die Praxis der medizinischen oder klinischen Forschung sind." (Vgl. New England Journal of Medicine, Seite 394, lü. Februar 1971).

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Vielleicht ist der Grund für diese Nichteignung die Tat- . sache, daß diese Methoden, die die bislang zuverlässigsten sind, auch die kompliziertesten und zeitraubendsten und folglich nicht weitgehend angewendeten sind. Daß diese Methoden trotz ihrer Unzuverlässigkeitsprobleme angewendet werden, kann durch die Tatsache erklärt werden, daß bei vielen Standardisierungs- und Gütekontrollprogrammen keine Störungsquellen bei den Standardisierungs- und Kontrollprüf substanzen bestehen; und oftmals ist die Durchführung im Vergleich zu anderen Laboratorien in den Programmen gerechtfertigt, die ebenfalls ungenaue Untersuchungen anstellen können.

Die Anzahl der zur Bestimmung des Cholesterins und seiner Ester zur Verfügung stehenden Methoden ist groß, und trotzdem kann die Grundlagenchemie, auf der sie beruhen, als im Grunde gleich oder in vieler Beziehung identisch angesehen werden. Es ist seit langer Zeit bekannt, daß die beiden reaktionsfähigen Zentren im Cholesterinmolekül die Doppelbindung und die Hydroxylgruppe sind; von diesen ist die Doppelbindung am wichtigsten für die Ausbildung einer Farbe oder des Chromophoren.

Cholesterin reagiert mit stark sauren Reagentien unter Bildung farbiger Substanzen, hauptsächlich Cholestadiensulfonsäuren. Bei buchstäblich allen Verfahren werden Essigsäure und Essigsäureanhydrid als Lösungsmittel und Dehydrierungsmittel verwendet, und Schwefelsäure oder Schwefelsäure und p-Poluolsulfonsäure werden als Dehydrierungsmittel und Oxydationsmittel eingesetzt. Beieinigen Verfahren wird die Reaktion dieser Mittel durch den Zusatz von verschiedenen Metallionen, wie u.a. Eisen-, Aluminiumoder Kobaltionen, weiter beschleunigt. Wie Vanzetti hervorhebt, wurden bis 1935 über 150 verschiedene Methoden vorgeschlagen, und seitdem sind noch mehr bekanntgeworden (vgl. G. Vanzetti, Clin. Chim. Acta, .LO, 389, 1964).

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Der allgemeine Reaktionsmechanismus der Farbuntersuchungen auf Cholesterin wird wie folgt angenommen:

Farbreaktionen von Cholesterin (vgl. N.W. Tietz, "Fundamentals of Clinical Chemistry'·, Seite 353 (W.B. Saunders, Philadelphia, 1970))

Cholesterin (2 Moleküle)

-H O 2

+ HX

3,5-Cholestadien (2 Moleküle)

-H

+ HX

Bls_T3,5-Cholestadien

Bis-cholestadienylmonosulfonsäure (Grünes Chromophores). (Li ebermann-Burchard)

2 H₂SO₄

Bi s-cholestadi enyldisulfonsäure (Rotes Chromophores) (Salkowski)

Entsprechend diesem Schema wird Cholesterin zunächst durch stark saure Reagentien angegriffen, die allgemein als "HX" bezeichnet sind, wobei X beispielsweise das Sulfation oder die Äcetylgruppe ist. Solche Reagentien entziehen zunächst ein Molekül Wasser und oxydieren dann das Zwischenprodukt zu 3,5-Cholestadien (zwei Doppelbindungen). Das Oxydationsmittel ist gewöhnlich Schwefelsäure, die zu Schwefeldioxid umgewandelt wird. Das Cholestadien wird zur Bildung des Dimeren, nämlich Bis-cholesta-3,5-dien, noch weiter angegriffen,

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und wird schließlich durch überschüssige Schwefelsäure zu einer Mono- oder Disulfonsäure umgewandelt, die ein stark gefärbtes Molekül ist. In Abhängigkeit von den relativen Konzentrationen des Oxydationsmittels Schwefelsäure erhält man entweder eine grüne Färbung (Liebermann-Burchard) infolge einer Monosulfonsäure oder eine rote Färbung (Salkowski) infolge der Bildung von Disulfonsäure. Der Zusatz von Eisen- oder anderen Metallionen begünstigt die Bildung der roten Farbe infolge von Cholestadien-disulfonsäure. Wie Vanzetti hervorhebt, sind die Reaktionen weder völlig spezifisch noch können sie mit ausreichender Genauigkeit gesteuert werden, um immer die genannten exakten Produkte zu erhalten, aber bei großer Sorgfalt können die Reaktionen die Basis für ein genaues, reproduzierbares Analysesystem sein. Aus chemischer Sicht gibt es wenig Gründe, eine "rote" gegenüber einer "grünen" Farbreaktion zu bevorzugen, mit der Ausnahme, daß die "roten" Reaktionen im allgemeinen eine Verbindung mit höherer molarer Extinktion liefern als die "gründ". Die Wahl eines spezifischen Verfahrens hängt deshalb von anderen Punkten ab. Zu diesen können die Störung durch Substanzen, wie Bilirubin, Überlegungen der Geschwindigkeit und der zur Verfügung stehenden Erleichterungen und Faktoren, wie die bei der Probenpräparierung erforderlichen Manipulationen, gehören.

Einstufige Verfahren:

Bei diesen Methoden wird die Probe nicht auf einen beliebigen Grad gereinigt, und die kolorimetrische Reaktion wird direkt am Serum oder Plasma vorgenommen. Diese Methoden sind mit verschiedenen Fehlerquellen behaftet. Zunächst kann das immer vorhandene Protein während der Farbentwicklung verkohlen, wodurch eine Farbe entsteht, die fälschlich dem Cholesterin zugeschrieben wird. Zweitens können diese Methoden auch Störungen infolge von nichtspezifischen farbbildenden Substanzen oder Chromogenen, wie Bilirubin, Hämoglubin und Protein, und durch die Instabilität des

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farbigen Endproduktes erleiden. Zu diesen Methoden kann gesagt werden, daß sie rasch vorgenommen werden können und daß. sie das geringste Maß an Manipulation erfordern, und daß sie vom prozeduralen Standpunkt aus gesehen vielleLcht am geeignetsten für die Automatisierung sind; wegen der vorstehend erläuterten Probleme sind sie jedoch für mehr als überschlägige Untersuchungen von zweifelhafter Genauigkeit. Beispiele für diesen Verfahrenstyp sind die Methoden von Pearson, Stern und McGavick (Anal. Chem., 25, 813, 1953) und von Zlatkis, Zak und Boyle (J. Lab. Clin. Med., 41, 486, 1953).

Zweistufige Verfahren;

Üiese Methoden führen eine Extraktionsstufe ein, bei der das Cholesterinchromogen vor der Chromophoren- oder Farbentwicklung extrahiert und teilweise isoliert wird. Aus diesem Grund sind einige der störenden Chromogenen, insbesondere Protein, entfernt, jedoch sind diese Methoden noch durch nichtspezifische Chromogene, wie Bilirubin, das zusammen mit Cholesterin extrahiert wird, und das auch zu einem Chromophoren führt, das fälschlich bei der Messung dem Cholesterinchromophoren zugeschrieben wird, mit Fehlerquellen behaftet. Von einigen Methoden dieser Klasse ist vielleicht das von Carr und Drekter (Clin. Chem., 2, 353, 1956) das beste. Mit Ausnahme von hochgradig ikterischen Proben (hohe Bilirubinspiegel) führt sie zu Ergebnissen, die denen von durch das präzisere dreistufige Verfahren erzielten nahezu entsprechen; jedoch kommen mit großer Häufigkeit ikterische Proben vor, die zu Problemen bei der ltoutineanalyse führen.

Dreistufige Verfahren:

üiese umfassen eine Extraktion des Cholesterins und danach eine Verseifung der Ester vor der Farbentwicklung. Folglich sind sie nicht mit so schwerwiegenden Fehlerquellen behaftet, die vom Protein herrühren. Außerdem neigt die Versei-

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fungsstufe zu einer Zerstörung der nichtspezifischen Chromogene, wie Bilirubin, was gegenüber den zweistufigen Verfahren zu einer beträchtlich verbesserten Genauigkeit führt. Für diese Verfahrensklasse ist das beste Beispiel die Methode von Abell et al. (J. Biol. Chem., 195. 357, 1952, und R.J. Henry, Clin. Chem., Prinziples and Technics, New York, Hoeber Division, Harper and Row Publishers, 1964), die trotz ihrer Komplexheit in vielen Laboratorien als Standardmethode gilt, weil sie die bislang am wenigsten komplizierte Methode ist, die frei von Fehlerquellen 'infolge von Fremdchromogenen ist.

Vierstufige Verfahren;

Diese sind die kompliziertesten, aber auch die zuverlässigsten Verfahren des Standes der Technik, wenn ihre Komplexheit nicht zu Fehlerquellen führt, die durch eben diese starke Komplexheit bedingt werden. Das Cholesterin wird extrahiert, die Ester werden verseift, und das Gesamtcholesterin wird dann weiter durch Auffangen als Digitonid gereinigt. Das Digitonid wird durch Verseifung zersetzt, wodurch das Cholesterin erneut freigesetzt wird, und das Produkt dieser Stufe wird der Farbentwicklung unterworfen.

Durch Einführen der Digitoninstufe wird der Effekt der nichtspezifischen Chromogene beträchtlich vermindert oder ausgeschaltet, jedoch muß dann das Cholesterindigitonid zersetzt und das Digitonin entfernt werden; andererseits ergibt es ebenfalls eine positive Reaktion mit den üblichen Reagentien, weil die Digitondnstruktur ebenso wie das Cholesterin einen Sterinring aufweist. Cholesterin und Digitonin haben jedoch nicht dieselbe Chromogenität, und deshalb ist es angezeigt, das Digitonin vor der Durchführung der chrompgenen Reaktion zu entfernen. Vierstufige Verfahren umfassen viele separate Stufen, von denen jede mit größter Sorgfalt durchgeführt werden muß; nichtsdestoweniger sind vielstufige Verfahren von hoher Genauigkeit,

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und sowohl die Methode von Schoenheimer und Sperry

(J. Biol. Chem., 106. 745, 1934) als auch die von Sperry und Webb (J. Biol. Chem., 187 t 97, 1950) sind die am weitesten verbreiteten Bezugsmethoden zur Bestimmung von Cholesterin.

(Zu jeder der vorstehend genannten Kategorien könnten zahlreiche andere Methoden zitiert werden, von denen die meisten leichte Modifikationen der genannten fundamentalen Methoden darstellen.)

Während vielstufige Cholesterinmessungen bei genauer Anwendung angemessene Ergebnisse haben können, können infolge unvollständiger Extraktion, was zu einer zu geringen Cholesterinmenge führt, und durch volumetrische Fehler infolge der Anzahl der gemachten volumetrischen Messungen schwerwiegende Fehler auftreten. Darüber hinaus haben vielstufige Verfahren offensichtlich den Nachteil, daß sie mühevoll und zeitraubend sind, und deshalb übersteigen sie die Möglichkeiten eines vielbeschäftigten klinischen Laboratoriums in einem solchen Maße, daß gegenwärtig direkte Methoden am weitesten verbreitet sind, sogar trotz ihres Mangels an Spezifität und sogar trotz ihrer Subjektivität gegenüber Fehlern durch andere chromogene Substanzen als Cholesterin, die im Serum vorhanden and. Die wünschenswerteste Methode wäre eine solche, die direkt am Serum vorgenommen werden könnte, die jedoch komplizierten vielstufigen Methoden, wie der von Abe11, näher kommt.

Die vorliegende Erfindung erreicht eine Lösung von Aufgaben, von denen es bisher den Anschein hatte, daß sie in ihrer Wirkung einander widersprechen; die vorliegende Erfindung erreicht nämlich, wie nachstehend erläutert wird, weitgehend die Einfachheit einer direkten Untersuchung, während nichtsdestoweniger Spezifität und Genauigkeit erreicht werden, die denen von Vielfächextraktionsmethoden vergleichbar sind.

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Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß, wenn Formamid in der richtigen Konzentration einem Cholesterinreagens, wie es zur Bestimmung einer Serumprobe verwendet wird, unter den richtigen Bedingungen zugesetzt wird, das von dem Cholesterin des Serums gebildete Chromophore zerstört wird, während die Bilirubin-, Hämoglobin- und Protein-Chromogene der Prüfsubstanz in genau demselben Maße mit dem Cholesterinreagens reagie«ren, wie wenn sie allein.vorliegen würden. Erfindüngsgemäß wird deshalb bei dem Verfahren der eingangs genannten Art so vorgegangen, daß man einen ersten Teil der zu untersuchenden Substanz als Blindprobe zum Blockieren der Bildung eines Chromophoren aus dem Cholesterinchromogenen mit Formamid und dann mit dem Cholesterinreagens versetzt, daß man dem zweiten Teil der zu untersuchenden Substanz zur Bildung der Chromophoren aus dem Cholesterinchromogenen und den nichtcholesterinartlgen Chromogenen der Substanz das Cholesterinreagens zusetzt und daß man das Meßergebnis der Blindprobe von dem mit dem zweiten Teil der zu untersuchenden Substanz erhaltenen Meßergebnis subtrahiert.

Indem eine solche Blindprobe durchgeführt wird, wird der durch die nichtcholesterinartigen chromogenen Substanzen hervorgerufene Fehler bei der Bestimmung auf ein ausreichendes Minimum herabgesetzt, wobei eine zufriedenstellende Präzision und Genauigkeit der Cholesterinmessung selbst, unmaskiert durch die Chromophoren der anderen chromogenen Substanzen, die vorhanden sind, erreicht wird, jedoch ohne vielstufige Extraktion.

(Es wurden auch andere Substanzen gefunden, die irgendwie die Farbstoffbildung des Chromophoren aus dem Cholesterinchromogen verhindern. Wenn beispielsweise Alkohole in derrichtigen Konzentration verwendet werden, haben sie diesen Effekt. Wenn jedoch Alkohole allein eingesetzt werden, verhindern sie auch die Bildung eines Chromophoren aus dem Bilirubinchromogen, und wenn man deshalb nur alkohol in

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einem Blindversuch einsetz-t, verbleibt die Bilirubinstörung als Fehlerquelle bei der Prüfung; und ein Vergleich einer Blindmessung mit einer Testmessung ergibt die Gesamtsumme von Bilirubin und Cholesterin anstelle der spezifisch gewünschten Messung von Cholesterin selbst.)

Wenn in einem Cholesterinreagens Formamid anwesend ist, verhindert es die das Chromophore bildende Reaktion des Cholesterinchromogens bei Raumtemperatur; das Bilirubinchromogen bildet jedoch bei Raumtemperatur nicht vollständig sein Chromophores, wie es für eine genaue Blindkorrektur erforderlich ist. Es wurde festgestellt, daß das Formamid-Cholesterin-Reagens eine erhöhte Temperatur von etwa 80 C erreichen muß, ehe eine ausreichende Chromophorenbildung aus dem Bilirubinchromogen stattfindet. Wenn deshalb Formamid und das Cholesterinreagens in einem Wasserbad bei konstanter Temperatur gemischt werden, wie es bei bestimmten weit verbreiteten Cholesterinmethoden üblicherweise verwendet wird, kann es passieren, daß sich das Bilirubinchromophore nicht entwickelt, und so kann der Beitrag des Bilirubinchromogenen nicht festgestellt und folglich auch nicht subtrahiert werden. Es wurde jedoch gefunden, daß, wenn das Formamid der Blindprobe bei Raumtemperatur ohne Inkubationszeit bei konstanter Temperatur zugesetzt wird, die gewünschte Reaktion abläuft, d.h. daß sich das grüne Bilirubinchromophore bildet, während das Cholesterinchromophore ausgeschaltet wird. In diesem Fall dient das Formamid zwei Funktionen: Erstens besteht ein Effekt seiner Reaktion mit dem Cholesterinreagens darin, daß es die Temperatur des Gemisches auf den für die Reaktion richtigen Bereich erhöht und somit auf eine Inkubationszeit in einem hochtemperaturigen Bad verzichtet werden kann, und zweitens hat es den gewünschten Effekt auf die Bilirubin- und Cholesterinchroraogenbildung.

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Während für sich allein verwendetes Formamid den Effekt der Chromophorenbildung aus dem Bilirubin und anderen nichtcholesterinartigen Chromogenen bewirkt und die Cholesterinchromophorenbildung unterdrückt, so wurde doch festgestellt, daß bei dem Blindversuch bei Vorliegen von bestimmten Seren ,durch diese eine gewisse Trübung entwickelt wird, und daß diese Trübung durch Erhöhung der Extinktion des Blindversuchs während der kolorimetrischen oder spektrophotometrischen Messung fälschlich das Ergebnis des Blindversuchs vergrößert, so daß die Trübung dazu mißbraucht wird,· die Chromogenen zu überschneiden, wenn nicht die Trübung irgendwie ausgeschaltet oder ihr Rehnung getragen wird.

Dieses Problem wurde erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß dem Gemisch ein hochmolekularer Alkohol (mit 8 bis 16 Kohlenstoffatomen pro Molekül) zugesetzt wird. Wenn, wie vorstehend diskutiert wurde, Alkohol allein bei der Blindprobe? zugesetzt wird, zerstört er das Cholesterinchromophore, hat" jedoch den unerwünschten Effekt, daß er außerdem auch die gewünschte Bildung des Bilirubinchromophoren verhindert; es wurde jedoch gefunden, daß, wenn ein hochmolekularer Alkohol zusammen mit Formamid verwendet wird, das gewünschte Bilirubinchromophore sich' in der gewünschten Weise bildet und daß die Bildung von Trübungen verhindert wird.

Formamid und ein hochmolekularer Alkohol haben somit die gewünschte Funktion, daß die Entwicklung des Cholesterinchromophoren verhindert wird, während die Entwicklung des Bilirubinchromophoren in einer Weise gestattet wird, in der Trübungen nicht mehr beobachtet werden; weil sich jedoch die hochmolekularen Alkohole nicht mit Formamid mischen, müssen Formamid und Alkohol in zwei getrennten Stufen der Blindprobe zugesetzt werden. Dieses Trennen von Verfahrensstufen wird bei dem Verfahren der Erfindung dadurch vermieden, daß der hochmolekulare Alkohol dem Eisessig/Essigsäure/

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Schwefelsäure-Reagens zugegeben wird. Es wurde gefunden, daß eine Endkonzentration von etwa 2 % (Vol./Vol.) an Alkohol, bezogen auf Cholesterinreagens, wirksam ist zur Ausschaltung der Trübung, die manchmal bei der formamidhaltigen Blindprobe beobachtet wird, und daß"das Vorhandensein des Alkohols in diesem Reagens das Verfahren gegenüber denen, bei denen der Alkohol getrennt zugesetzt wird, in hohem Maße vereinfacht.

Verschiedene hochmolekulare Alkohole unterscheiden sich in ihrer Wirksamkeit zur Ausschaltung der Trübung; allgemein ist es so, daß, je höher die Molekulargewichte sind, desto größer die Wirksamkeit ist und desto niedriger die anzuwen-? denden Konzentrationen sind.

Beispiel 1

Blindreagens: Formamid

Cholesterinreagens: 166 ml H₃SO₄

500 ml Eisessig (Raumtemperatur) dazu 500 ml Essigsäureanhydrid, dazu 12 ml Tridecylalkohol.

Die Reagentien werden bei der folgenden Bestimmung/in einem Blindprobenreagensglas und in einem Testreagensglas wie folgt eingesetzt:

In beide Reagensgläser werden 0,1 ml Serum gegeben. In das Blindprobenreagensglas wird 1,0 ml Blindreagens gegeben. In das Blindprobenreagensglas werden 2 ml und in das Testreagensglas 3 ml Cholesterinreagens gegeben. Das Blindprobenreagensglas wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, während das Testreagensglas 10 Minuten lang bei 37° C inkubiert wird, wonach die Extinktion des Testreagensglases bei 620 mju gegen das Blindprobenreagensglas gemessen wird, das auf Null-Extinktion eingestellt wird.

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Die so gemessene Extinktion des Testreagensglases ist proportional zu der Konzentration des Cholesterins im Serum, weil die störenden Chromogene in gleichem Maße sowohl zu dem Test wie zu der Blindprobe beitragen; und weil die Blindprobe auf Null-Extinktion eingestellt ist, ist die Extinktion des Tests eine Messung der Differenz zwischen (oder im Effekt eine Subtraktion) der Blindprobe von dem Test.

Beispiel 2

Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß anstelle von Tridecylalkohol 20 ml Isonony!alkohol verwendet werden.

Beispiel 3

Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, daü anstelle von Tridecylalkohol 15 ml Decylalkohol verwendet werden.

Beispiel 4

Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß anstelle von Tridecylalkohol 10 ml Hfexadecylalkohol verwendet werden.

Beispiel 5

Blindreagens I: Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Tridecyl- oder

Hexadecylalkohol

Blindreagens II: Formamid

Cholesterinreagens: Wie bei Beispiel 1, nur mit der Ausnahme,

daß der Alkohol weggelassen wird.

Die Reagentien werden bei der folgenden Untersuchung in einem Blindprobenreagensglas und in einem Testreagensglas eingesetzt:

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In das Blindprobenreagensglas werden 0,5 ml Blindreagens I

und 0,5 ml Blindreagens II eingegeben. Dann wird wie bei Beispiel 1 fortgesetzt, beginnend mit dem Zusatz des Cholesterinreagens.

Das Verfahren der Erfindung ist dahingehend vielfach vorteilhaft, daß es die Einfachheit der direkten oder einstufigenMethoden und die Genauigkeit der vielstufigen oder Vielfachextraktionsmethoden aufweist und daß bestimmte Fehlerquellen der mehrstufigen Methoden ausgeschaltet werden. So sind die oftmals als unvereinbar miteinander erachteten Ziele von Geschwindigkeit und Genauigkeit gegeben, außerdem ist das Testverfahren relativ leicht und bequem durchführbar, die Arbeitszeit ist geringer, und die Fehlerquellen der Extraktionsstufen werden ausgeschaltet. Dennoch werden solche Ergebnisse erhalten, als wenn diese Extraktionen zum Ausschalten von maskierenden oder anderen Effekten der anderen ehromophorenbildenden Chromogenen, die üblicherweise in einer zu untersuchenden Probe oder Prüfsubstanz anwesend sind, vollständig durchgeführt worden wären.

Aus der vorstehenden Beschreibung der Ausführungsformen der Erfindung wird somit deutlich, daß durch das Verfahren der Erfindung eine neue und nützliche quantitative Bestimmijngsmethode für Cholesterin in Serum, Plasma oder anderen biologischen zu untersuchenden Stoffen erstellt wird.

An der beschriebenen Erfindung können zahlreiche, für den Fachmann naheliegende Abänderungen und Modifikationen vorgenommen werden, ohne daß der Bereich der Erfindung verlassen wird.

Patentansprüche:

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Claims

IB -

Patentansprüche

l.jVerfahren zur quantitativen kolorimetrisehen oder spektrophotometrischen Bestimmung von Cholesterin in Serum, Plasma oder anderen zu untersuchenden biologischen Substanzen unter Verwendung eines Cholesterinreagens, dadurch gekennzeichnet, daß man einen ersten Teil der zu untersuchenden Substanz als Blindprobe zum Blockieren der Bildung eines Chromophoren aus dem Cholesterinehromogen mit Formamid und dann mit dem Cholesterinreagens versetzt, daß man dem zweiten Teil der zu untersuchenden Substanz zur Bildung der Chromophoren aus dem Cholesterinchromogen und den nichtcholesterinartigen Chromogenen der Substanz das Cholesterinreagens zusetzt und daß man das Meßergebnis der Blindprobe von dem mit dem zweiten Teil der zu untersuchenden Substanz erhaltenen Meßergebnis subtrahiert.
2. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Blindprobe zur Ausschaltung von durch das Formamid entstehenden Trübungen einen hochmolekularen Alkohol zusetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der hochmolekulare Alkohol ό bis 16 Kohlenstoffatome pro Molekül aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol Tridecylalkohol ist.
5. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkohol Hexadecy!alkohol ist.

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6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der hochmolekulare Alkohol dem Cholesterinreagens zugesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daS der das Formamid enthaltende zu untersuchende Teil vor der spektrophotometr,i sehen Messung- zur ausreichenden
Bildung des Chromophoren aus dem Bilirubinchromogen
eine Temperatur von etwa 80° C erreicht.

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