DE1773537C3 - Methode zur quantitativen Bestimmung von anorganischem Phosphat - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Methode zur quantitativen Bestimmung von anorganischem Phosphat, bei der ein Molybdat-Phosphat-Komplex ausgebildet wird, d. h. die Messung des Spiegels oder der Menge an anorganischem Phosphat in einer gegebenen Mengeneinheit einer zu untersuchenden Probe oder Prüfsubstanz.

Es ist seit langem bekannt, daß die Bestimmung der Phosphormenge oder des Phosphorspiegels ein wertvolles diagnostisches Mittel ist, weil der Phosphorspiegel offenbar bei einer Vielzahl von pathologischen und physiologischen Zuständen charakteristisch schwankt.

Deshalb wurde zumindest seit 1887 (M. F. Osmond, Bull. Soc. Chim., Paris, 47:745 (1887), zitiert von R. J. Henry, Clinical Chemistry, Harper & Row, 1964, Seite 414) das Problem 4er quantitativen Bestimmung des Phosphors auf dem Gebiet der klinischen Untersuchung behandelt. Der bei diesen Be-Stimmungen zu messende Phosphor liegt in Form von Phosphaten vor, und zwar mehr in Form von anorganischen als von organischen Phosphaten. Die zu untersuchenden Proben oder Prüfsubstanzen sind Blutserum und Urin.

Phosphor ist in seiner Phosphatform für den Körper im allgemeinen sowie für verschiedene Körperteile von kritischer Wichtigkeit. Beispielsweise ist Phosphor ein erheblicher und lebenswichtiger Bestandteil von Knochen und Zähnen. Er ist ein wichtiger Puffer, der den pH-Wert des Blutserums steuert. Die Phosphatausscheidung gehört zur Steuerung des Säure-Base-Gleichgewichts des Körpers zu der Funktion der Nieren, und durch diesen Mechanismus reguliert das parathyroide Hormon das Serum-Calcium. Phosphor wird zur Bildung der meisten Lipoide des Gehirns und der Cytoplasmamembran der Zellen verwendet; und Phosphor ist die Substanz, die zur Energiegewinnung aus der Nahrung erforderlich ist.

Bei verschiedenen pathologischen und physiologischen Zuständen und Bedingungen wird einer oder mehrere dieser Prozesse auf solche Weise verändert, daß sich eine charakteristische Veränderung des Serum- und/oder Urinphosphatspiegels ergibt.

Um deshalb die Wichtigkeit der anorganischen Phosphorbestimmungen aufzuzeigen, wird nachstehend aufgezählt, für welche Diagnosen und Auswertungen sie angewendet werden: Knochenbildung und -zerfall, Knochenmetabolismus, parathyroide sekretorische Aktivität, diabetische Acidosis, pylorische Verstopfung, respiratorische Alkalosis, andere Säure-Base-Gleichgewichtsstörungen und renale Insuffizienz oder andere Nierenstörungen (H. S. Best und N. B. Taylor, »The Physical Basis of Medical Practice«, Williams & Wilkens, 1961, Seite 4).

Neben der Nützlichkeit der Bestimmung von anorganischem Phosphor durch Messen des anorganischen Serum- und Urinphosphats kann die Phosphorbestimmung auch zur Messung des anorganischen Phosphats angewendet werden, das sich bei den Bestimmungsmethoden der Creatin-Phosphokinase-Aktivität (CPK) gebildet hat.

(CPK ist ein Enzym, das im Körper lediglich im Muskel- und Gehirngewebe vorliegt. Da das Herz ein Muskeltyp ist, gibt es CPK in den Blutstrom ab, wenn das Herz erkrankt ist, und da normalerweise kein CPK im Blutstrom anwesend ist, bedeutet seine Anwesenheit einen höchst spezifischen Nachweis für einen myocardialen Infarkt (R. J. Duma »Arch. Intern. Med.«, 115:443, 1965, zitiert in SIGMA Tentative Technical Bulletin No. 40-UV, Nov. 1965, Seite 1, der Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo. 63118).

(Der CPK-Test wird auch angewendet, um Skelettmuskelerkrankungen, wie beispielsweise Muskeldystrophie, zu diagnostizieren (S. Ebasni, »J. Biochem.«, 46, 103 [1959], zitiert in Sigma, supra Seite 1).

Wenn auch vorstehend herausgestellt ist, daß die Phosphatform des Phosphors für den Körper lebenswichtig ist, so ist es doch eigentlich nur ein ziemlich enger Bereich des Phosphatspiegels (F. W. Sund ermann, »Normal Values in Clinical Medicine«, W. B. Saunders Company, Philadelphia, 1949, Seite 845), in dem diese Prozesse wirksam funktionieren. Wegen dieses begrenzten Bereiches und zur Verbesserung der diagnostischen Anwendbarkeit ist Genauigkeit bei der quantitativen Bestimmung des Phosphatspiegels oder der Phosphatmenge von höchster Wichtigkeit.

Auch erfordern es praktische Erwägungen bei klinischen und anderen Untersuchungen, daß die Prüfung relativ schnell und leicht durchgeführt werden kann, sogar durch Personen mit mäßiger Übung. In modernen klinischen Laboratorien hat beispielsweise ein medizinisch-technischer Assistent eine Vielzahl von unterschiedlichen und zahlreichen Tests und Untersuchungen durchzuführen.

Die gegenwärtig angewendeten Phosphorbestimmungsmethoden erfüllen eine oder melirere dieser Anforderungen an Genauigkeit, Schnelligkeit und leichte Durchführbarkeit nicht ausreichend. Auch schalten sie alle anderen Probleme, die den quantitativen Bestimmungen für anorganischen Phosphor anhaften und/oder allgemein gelten, nicht aus und lösen sie nicht.

Besondere Probleme der Phosphorbestimmung |₀

a) Protein: Protein stellt ein Problem bei der Phosphorbestimmung dar, weil es durch das Molybdän ausgefällt wird, welches bei vielen Methoden eingesetzt wird, und dadurch wird die Probe trüb. Die Trübung kann bei der nachfolgenden Analyse fälschlich für Phosphor gehalten werden. Deshalb wird bei manchen zur Zeit angewendeten Methoden das Protein in einer Vorstufe ausgefällt, wie nachstehend im einzelnen erläutert ist.

b) Proteinfällung: Um die sich durch Protein ergebenden Nachteile auszuschalten, werden bestimmte Fällungsmittel verwendet, wonach beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren in einem Schnellverfahren getrennt wird, um die Probe von ihrem Proteingehalt zu befreien. Jedoch führt diese versuchte 2:;. Lösung des Proteinproblems zu anderen Schwierigkeiten:

Die Wirksamkeit der Proteinfällungsentfernung ist unvollkommen, und jeder zurückbleibende Niederschlag, der oft unnachweisbar ist, oder der, wenn er nachgewiesen wird, schwierig zu entfernen ist, führt zu dem vorstehend erwähnten Trübungsfehler (R. J. Henry, »Clinical Chemistry«, Harper & Row, 1964, Seite 414).

Die Proteinfällung und -entfernung ist nicht leicht a automatisch durchzuführen, und diese Tatsache und andere Versuche, ihn zu umgehen, führen zu anderen Schwierigkeiten, die nachstehend erläutert werden.

Das Fällmittel ist gewöhnlich Trichloressigsäure, die den pH-Wert über einen längeren Zeitraum, der für die Proteinentfernung notwendig ist, herabsetzt. Von diesen Bedingungen ist bekannt, daß sie Phosphatester hydrolysieren, woraus sich die positiven Fehler ergeben, die vorstehend erwähnt wurden. Die Fällstufe, besonders mit ihrer außerdem notwendigen Zentrifugier- oder Filtrierstufe, ist zeitraubend und bereitet zusätzliche Kosten und Mühe in anderer Hinsicht.

c) Konzentrationen von Molybdän und Schwefelsäure: Um vorteilhaft rasche Reaktionsverhältnisse zu erzielen, werden die Reagenzien Molybdat und Schwefelsäure, die bei der Farbbildungsstufe der Untersuchung eingesetzt werden, entweder einzeln oder beide in höheren Konzentrationen verwendet (ibid, Seite 415). Höhere Molybdänkonzentrationen führen jedoch zur Abscheidung von Protein und zu den obenerwähnten Trübungsfehlern. Eine im Verhältnis zur Molybdatkonzentration hohe Säurekonzentration vermindert die Reaktionsgeschwindigkeit und verursacht, wie vorstehend erwähnt, Hydrolyse der organi- sehen Ester, wenn sie auch den Trübungseffekt herabsetzt.

d) Phosphatester: Es ist nochmals zu vermerken, daß eher anorganischer Phosphor als organischer diagnostisch ausgewertet wird. Jedoch liegt von dem ins- gesamt im Serum anwesenden Phosphor der größere Teil in organischer Form vor, hauptsächlich als Phosphatester (F. W. Sunderman, supra, Seite 845).

Jede Methode, bei der unabwendbar so kleine Mengen wie 5% organischer Phosphor anwesend sind, führt zu einem Fehler, der größer ist als der gesamte Bereich des normalen anorganischen Phosphorspiegels.

Anorganisches Phosphat resultiert aus der Spaltung oder der Hydrolyse solcher Ester; und jedes dieser resultierenden anorganischen Phosphate wird fälschlich als ein Teil des anorganischen Phosphats ausgelegt, das gemessen werden soll, was zu falschen Untersuchungsergebnissen führt. Dies ist ein wirkliches Problem, wenn man berücksichtigt, daß der organische Phosphorgehalt des Serums und/oder Urins nicht konstant ist. Beispielsweise schwankt der organische Phosphorgehalt bei Serum zwischen 5 und 14 mg/100 ml (F. W. Sunderman, »Monthly Report«, Mai 1967, des Institute for Clinical Science, Inc., Philadelphia, Pa.). Wenn deshalb Esterhydrolyse vorliegt, kann daraus zur Ermittlung richtiger Werte kein konstanter Anteil vorausgesetzt werden, weil der Anteil über einen weiten Bereich schwankt und nicht immer in Beziehung zu dem anorganischen Phosphorspiegel steht. Wie vorstehend erwähnt, beschleunigt eine hohe Konzentration an Säure oder Molybdat oder an beiden diese Hydrolyse (H. Weil, »Biochem. J.«, 49:286 [1951], zitiert in Henry, supra, 56116 415).

e) Zeit: Die für die Reaktion und die gesamte Methode erforderliche Zeit ist nicht nur aus Zeit- und Kostenerwägungen wichtig, sondern auch vom Standpunkt der Ausschaltung von Fehlerquellen aus gesehen, wie der Erhöhung der Esterhydrolyse, die begünstigt wird, wenn die Prüfsubstanz über eine längere Zeit den Bedingungen ausgesetzt ist, die solche Hydrolyse mit sich bringen. Esterhydrolyse und die daraus herrührenden Fehler sind der Zeitdauer direkt proportional.

f) Reduktionsmittelinstabilität: In dem Maße, wie die eingesetzten Reduktionsmittel instabil sind, entstehen erhebliche und sogar grobe Fehler, insbesondere dann, wenn die Instabilität nicht erkannt worden ist. Die wiederholte Überprüfung des Zustands des Reduktionsmittels ist ein mühsames und zeitraubendes Unternehmen. Obwohl von einigen Reduktionsmitteln bekannt ist, daß sie stabil sind, scheint es, daß gerade die am meisten angewendeten instabil sind, einschließlich Zinn(II)-chlorid, p-Aminonaphtholsulfonsäure und p-Semidin.

g) Mangelnde Übereinstimmung mit dem Beerschen Gesetz: Bestimmte Methoden der Phosphorbestimmung zeigen bei der photometrischen Analyse keine lineare Beziehung zwischen der Extinktion des gefärbten Produkts und der Phosphorkonzentration. Der Vorteil einer linearen Beziehung bei der Analyse ist im allgemeinen bekannt. Wenn jedoch eine solche lineare Beziehung nicht vorliegt, ist es oft so, daß auch mangelnde Konsistenz vorhanden ist. Darüber hinaus ermöglichtes eine lineare Beziehung dem Ausführenden, aus einer einzigen Kontrollprüfung, die sich auf den gesamten Konzentrationsbereich erstreckt, Schlüsse zu ziehen.

Bekannte Verfahren

Die bekannten Methoden der quantitativen Phosphatbestimmung können wie folgt klassifiziert werden: Proteinfällungsmethoden, Nichtproteinfällungs-stark saure Methoden und enzymatisch^ Methoden.

a) Proteinfällungsmethoden: Bei diesen Methoden

wird Protein ausgefällt, um die erwähnten Trübungsfehler so gut wie möglich auszuschalten, wobei gewöhnlich Trichloressigsäure als Fällmittel verwendet wird. Danach wird durch Zentrifugierei- oder Filtrieren getrennt. Das Phosphat wird dann in Gegenwart eines reduzierenden Mittels wie p-Aminonaphtholsulfonsäure mit Molybdationen umgesetzt, die gewöhnlich aus einer etwa 3 η Lösung von Ammoniummolybdat in verdünnter Schwefelsäure nerrühren.

Dabei wird aus dem Molybdat und dem Phosphat ein Molybdän-Phosphat-Komplex gebildet, der in Gegenwart des reduzierenden Mittels zu einem blaugefärbten Phospho-Molybdat-Komplex reduziert wird, dessen Extinktion photometrisch gemessen wird und zu der Extinktion eines Standard-Phospho-Molybdats in Beziehung gesetzt wird, was die quantitative Bestimmung des Phosphors ergibt.

Ein Beispiel für diesen Bestimmungstyp ist von Fiske und Subbarow (J. Biol. Clrnn., 66:375 [1925]) beschrieben worden.

Die Methoden dieses Typs unterscheiden sich in erster Linie in den eingesetzten reduzierenden Mitteln, zu denen Eisen(II)-sulfat, Zinn(II)-chlorid, Semidin, Elon und andere Mittel gehören.

Diese Methoden dauern von etwa 25 Minuten bis zu einer Stunde, wovon etwa 10 bis 15 Minuten für die Bereitung eines proteinfreien Filtrats und 15 bis 45 Minuten für die Farbbildungsreaktion gebraucht werden. Während der gesamten Zeit sind die organischen Ester der Säure ausgesetzt, woraus sich Hydrolyse und dadurch Fehler ergeben, wie vorstehend auseinandergesetzt ist.

Die Nachteile dieser Methoden bestehen in der Proteinfällung, der Esterhydrolyse, der Zeit und in einigen Fällen der Reduktionsmittelinstabilität, die alle vorstehend diskutiert wurden.

b) Nichtproteinfällungs-stark saure Methoden: Wie durch eine Methode, die in einer technischen Literaturstelle der Hycel Inc. (»Hycel Phosphorus Determinations« [1965], Hycel Inc., Houston, Texas 77036) beschrieben ist, veranschaulicht ist, hat man versucht, das Problem der Proteinstörungen durch Anwendung einer hohen Säurekonzentration zu lösen, d. h. einer Säurekonzentration, die hoch genug ist, daß das Molybdän das Protein nicht ausfällen kann. Bei diesem Verfahren wird 0,2% Molybdat in 3%iger Schwefelsäure in Kombination mit Ferro-Ammoniumsulfat als Reduktionsmittel verwendet.

Obwohl diese Methode vom Durchführungsstandpunkt her gesehen einfach ist, werden 35 Minuten benötigt, und deshalb liegt ein Nachteil in der erforderlichen Zeit sowie darin, daß die Phosphatester längere Zeit der Hydrolyse ausgesetzt sind. Darüber hinaus wird in der genannien Hycel-Literaturstelle festgestellt, daß Glukosespiegel von mehr als 200 mg/% die Prüfung stören, und da Phosphorbestimmungen häufig in Zusammenhang mit Prüfsubstanzen von Diabetikern durchgeführt werden, beeinträchtigt dies erheblich die Anwendbarkeit der Methode.

Das bei dieser Methode angewendete Reduktionsmittel ist nur unter Kühlung ein Jahr stabil.

Die in der Hycel-Literaturstelle beschriebene Ausführungsform der Methode gehorcht auch nicht dem Bcerschen Gesetz, was einen weiteren Nachteil dieser Methode bedeutet.

c) Enzymatische Methoden: Bei diesen Methoden werden vielfache Enzymsysteme eingesetzt, die zur Bildung von Koenzym (NADPH) führen, dessen Extinktion im Ultraviolettbereich gemessen wird. Instrumente dieser Art sind jedoch in vielen Laboratorien nicht vorhanden. Außerdem bedeutet die Verwendung einer Vielzahl von Enzymen eine hohe Reagenzienstabilität und führt zu pH-Wert- und Temperaturkriterien. Außerdem ist sie relativ teuer. Wenn deshalb auch diese Methode in der Forschung brauchbar ist, ist sie für routinemäßige Laboruntersuchungen nicht geeignet.

Aufgabe der Erfindung ist es, die den bekannten Bestimmungsmethoden anhaftenden Probleme zu beseitigen und die Methode der eingangs genannten Art weiterzuentwickeln, daß die Genauigkeit und die Geschwindigkeit dieser Bestimmung erhöht wird. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß bei der Methode der eingangs genannten Art erfindungsgemäß zur Beschleunigung der Bildung des Molybdat-Phosphat-Komplexes Polyvinylpyrrolidon oder ein Polypeptid zugesetzt wird.

Dabei ist angebracht, daß zumindest eine Spur Polyvinylpyrrolidon, vorzugsweise mindestens 3%, zugesetzt werden. Als Reduktionsmittel für den Molybdat-Phosphat-KompIex wird vorzugsweise Hydroxylamin in Form einer Hydroxylaminverbindung zugefügt, wobei es besonders vorteilhaft ist, den gebildeten Molybdat-Phosphat-Komplex durch Zusetzen von Hydroxylamin in Form einer Hydroxylaminverbindung zu der Polyvinylpyrrolidonlösung zu reduzieren. Es hat sich auch als zweckmäßig erwiesen, pro Mikrogramm des zu messenden Phosphors mindestens 0,75 Mikrogramm Hydroxylamin zuzusetzen. Der gebildete Molybdat-Phosphat-Komplex wird zur Ablösung des Hydroxylamins aus seiner Verbindung und zur Erreichung von dessen reduzierender Wirkung alkaiisch gemacht, wobei zweckmäßigerweise in einer ersten Stufe ein Molybdat-Phosphat-Komplex in Lösung gebildet wird, die schwach sauer ist und weiche Polyvinylpyrrolidon oder ein Polypeptid enthält, und in einer zweiten Stufe die Lösung des Molybdal-Phosphat-KompIexes alkalisch gemacht wird.

Die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode wird nachstehend im einzelnen erläutert:

a) Erste Ausführungsform

5 Stufe I: Bei der Durchführung der Methode nach der Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform wird in einer ersten Stufe eine Lösung von Polyvinylpyrrolidon in Hydroxylamin-Hydrochlorid der Moiybdatlösung zugesetzt, und der erhaltenen Lösung so wird Serum oder eine andere Prüfsubstanz zugefügt. Bei einer besonders vorteilhaften Form sind die Mengen und andere Einzelheiten wie folgt:

2 ecm 5%iges Polyvinylpyrrolidon in 2%iger Hydroxylaminhydrochloridlösung (vorzugsweise mit einer Spur Dichlorophen als Schutzmittel)

1 ecm einer 1 %igen Lösung von Ammoniummolybdat in 5%iger Schwefelsäure
0,3 ml Serum oder Standardsubstanz
Stufe II: In einer zweiten Stufe wird eine starke Base zugesetzt, nachdem man die obengenannte Mischung eine Minute stehen oder ruhen ließ, bei einer bevorzugten Ausführungsform 0,2 ecm 10 η NaOH. In dieser Stufe wird das Hydroxylamin-Hydrochlorid aktiviert, damit sich das Hydroxylamin als Reduktionsmittel ablösen kann. Hydroxylamin bewirkt bei alkalischem pH-Wert die Reduktion des gelben Phosphatkomplexes zu dem blauen, zu messenden Komplex. Der stark alkalische pH-Wert schaltet auch Trü-

billigen durch Auflösen des Proteins aus.

Nach Stehenlassen für fünf Minuten wird bei dieser Ausführungsform die Extinktion bei der üblichen Wellenlänge für Molybdänblau, d. h. bei 650 mu, abgelesen.

Im Gegensau, zu den vorstehend genannten bekannten Methoden zur Messung von Molybdänblau, die aus einer Zweistufcninethode, wobei die erste Stufe eine Proteinfällungsstufe und die zweite Stufe eine Säurestufe ist, und aus einer Einstufenmethode (Hycel) mit lediglich einer Säurestufe bestehen, besteht die Methode nach der Erfindung in der beschriebenen Ausführungsform in einer Zweistufenmethode, bei der die erste Stufe eine saure oder schwach saure und die zweite Stufe eine aikaiische Stufe ist. Darüber hinaus wird bei der ersten Stufe der Methode nach der Erfindung das anorganische Phosphat in den gelben Molybdatkomplex umgewandelt, dessen Reduktion in die meßbare blaue Form in der zweiten Stufe geschieht.

Im weiteren Gegensatz zu den anderen Methoden wird bei der Untersuchung gemäß der beschriebenen Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung als Reduktionsmittel Hydroxylamin-Hydrochlorid verwendet, obwohl es bei den anderen Verfahren als Reduktionsmittel völlig unwirksam ist und obwohl von ihm bekannt ist, daß es bei alkalischem pH-Wert instabil ist, also bei einer Bedingung, die bei dieser Methode herrscht.

b) Wesentliche Vorteile der Erfindung

Die Untersuchung gemäß der Methode nach der Erfindung schafft eine quantitative Bestimmung von anorganischem Phosphor und zahlreiche Vorteile gegenüber anderen Bestimmungsmethoden. Besondere Vorteile werden nachstehend aufgeführt:

1. Genauigkeit und Bezugsmöglichkeit: Die Methode nach der Erfindung besteht im Gegensatz zu den anderen Methoden darin, daß die Kopplung von Molybdat und anorganischem Phosphat bei der Ausbildung des gelben Komplexes katalysiert wird. Dies erlaubt die Anwendung sehr schwach saurer Bedingungen, so daß die säureanfälligen Ester nur eine Minute der Hydrolyse ausgesetzt sind im Gegensatz zu 20 bis 60 Minuten bei anderen Methoden. Deshalb ist die Methode besonders vorteilhaft für die Bestimmung von anorganischem Phosphor, wobei der vorhandene organische Phosphor unangetastet bleibt.

Der letzte pH-Wert bei der Untersuchung in Stufe II ist stark alkalisch. Obwohl es gut bekannt ist, daß Alkalien Phosphatester hydrolysieren und deshalb alkalische pH-Werte im Hinblick auf das gut bekannte, vorstehend diskutierte Esterhydrolyseproblem scheinbar im Widerspruch stehen, findet bei der Methode nach der Erfindung eine solche Hydrolyse nicht statt, weil nur der gelbe Molybdat-Komplex, der in Stufe I gebildet worden ist, in der alkalischen Stufe Π an der Umwandlung in die blaue Form teilnimmt. Deshalb reagieren jegliche Ester, selbst wenn solche in Stufe Π hydrolysiert werden, nicht auf irgendeine farbbildende Weise in der letzten alkalischen Stufe der Methode. Tatsächlich können organische Phosphatester in hoher Konzentration bei der alkalischen Stufe Π ohne jegliche Wirkung zugesetzt werden.

Die Trübung, die ebenso wie bei stark sauren Methoden bei den Methoden zu Ungenauigkeiten führt, bei welchen versucht worden ist, proteinfreie Filtrate zu bereiten, stört nicht bei der Methode nach der Erfindung, denn der Katalysator läßt die Reaktion von Phosphat und Molybdat weitgehend vollständig ablaufen, wobei die nachfolgende Anwendung eines alkaiischen pH-Wertbereiches Proteintrübungen aus schaltet. Deshalb wird die Notwendigkeit der Proteinentfernung oder jegliche Bemühung dazu überflüssig.

Auch Glukose stört nicht bei der Untersuchung

nach der Erfindung, wie sie bei der stark sauren Methode stört (»Hycel Phosphorus Determinations« [1965], Hycel, Inc.).

Die Extinktionseigenschaften der gefärbten Verbindung, die bei der Untersuchung nach der Erfin- dung gebildet wird, gehorchen dem Beerschen Gesetz.

2. Geschwindigkeit: Die Methode nach der Erfindung läuft schneller ab als alle vorstehend diskutierten. Während andere Methoden 25 Minuten bis eine Stunde dauern, kann die Untersuchung nach der Erfindung in sieben Minuten vollzogen werden.

3. Leichte Durchführbarkeit: Die Methode nach der Erfindung ist einfach, selbst für einen Techniker mit begrenzter Übung, weil kein Versuch unternom men werden muß, ein proteinfreies Filtrat zu erzielen. Nur die Hycel-Methode ist vom handwerklichen aus gesehen genauso leicht durchzuführen, jedoch hat diese Methode andere Nachteile, die vorstehend erörtert wurden.

4. Reagenzienstabilität: Die bei der vorstehend beschriebenen Methode nach der Erfindung verwendeten Reagenzien können bei Raumtemperatur mindestens ein Jahr gelagert werden, ohne daß sie merklich zersetzt werden. Bei vielen bekannten Methoden wird ein instabiles Reduktionsmittel eingesetzt. Bei der Methode nach der Erfindung wird, wie vorstehend erläutert, als Reduktionsmittel Hydroxylamin-Hydrochlorid verwendet, welches in Lösung stabil ist. Das Hycel-Reagens ist nur unter Kühlung stabil.

5. Wirksamkeit bei der automatischen Analyse: Die Methode nach der Erfindung ist neben ihrer größeren Genauigkeit aus folgenden Gründen für automatische Verfahren besonders geeignet:

Viele automatische Verfahren haben keine Mög-

lichkeit, auf automatische Weise zu der Bereitung eines proteinfreien Filtrats zu gelangen. Diese Stufe muß von Hand durchgeführt werden. Außerdem arbeiten solche Instrumente nur schwierig, wenn Trübungen vorliegen. Bei der Methode nach der Erfin- dung ist dagegen kein proteinfreies Filtrat erforderlich, und Trübungen treten nicht auf.

Das einzige automatische Teil bei der für die Bestimmung von anorganischem Phosphor verwendeten Vorrichtung, bei dem keine proteinfreien Filtrate er forderlich sind, wendet Dialyse an, um das Protein problem zu umgehen. Dialyse hat eine Reihe von Schwierigkeiten im Gefolge, wozu Sensitivitätsverluste, starkes Ansteigen der Konstanthaltungsprobleme in der Dialysierungseinheit und Einbringungs- probleme in den Dialysator, was ein langdauerndes Waschen des Dialysators erfordert, gehören. Weil die angewendeten Reaktionen langsam ablaufen, muß zur Beschleunigung der Reaktion ein Heizbad verwendet werden.

Bei der Methode nach der Erfindung kann auf einen Dialysator und auf ein Heizbad verzichtet werden, wodurch die Methode einfach ist und Konstanthaltungsprobleme vermindert.

c) Bereiche, Proportionen usw.

1. Konzentration an Polyvinylpyrrolidon: Um bei der Methode nach der Erfindung die gewünschte Reaktionsfähigkeit zu erzielen, muß eine mindestens 3%ige Lösung verwendet werden; aber auch Spuren dieser Verbindung wirken offensichtlich katalytisch und können deshalb eingesetzt werden.

2. Konzentration an Molybdat: Bei der Methode nach der Erfindung sind Konzentrationen an Molyb- ι ο dat von 0,85% bis 3% optimal. Bei unterschiedlichen Serummengen kann die Molybdatmenge schwanken, und weil ein katalytischer Effekt erzielt wird, ist ein sehr weiter Bereich von Molybdatkonzentrationen möglich, wenn die Konzentration der anderen Bestandteile verändert wird.

3. Säurekonzentration: Bei dem Molybdatreagens können Säurekonzentrationen von 0,2% bis 6% angewendet werden. Wegen der Phosphatesterspaltung sind jedoch niedrige Konzentrationen angebracht.

4. Konzentration der Hydroxylaminverbindung: Bei der beschriebenen Ausführungsform können Konzentrationen von 0,5% bis zur Sättigung verwendet werden. Mit steigenden Konzentrationen wird die für die Stufe II der Methode benötigte Zeit abgekürzt, und die Farbe ist über einen langen Zeitraum stabil. Es können auch Konzentrationen unter 0,5% verwendet werden, jedoch sind diese nicht optimal. Mit unterschiedlichen Zusammenstellungen der anderen Reagenzien und der Mengen der Proben bei anderen jo Ausführungsformen können diese Konzentrationen schwanken. Es ist jedoch festgestellt worden, daß die Menge an Hydroxylamin bei der verwendeten Hydroxylaminverbindung mindestens 0,75 Mikrogramm pro Mikrogramm Phosphor, der bei dem Test gemessen werden soll, betragen sollte. Es kann eine Vielzahl von Hydroxylaminverbindungen eingesetzt werden, beispielsweise Hydroxylaminsulfat.

5. Basekonzentration: Die Basekonzentration muß so sein, daß die Lösung in Stufe II einen alkalischen pH-Wertbereich erreicht. 10 bis 50% sind bei dieser Ausführungsform am zweckmäßigsten, jedoch schwankt die genaue Menge mit der Menge an Schwefelsäure in dem Molybdatreagens. Nahezu jede Base kann verwendet werden, beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid usw.

Die Durchführungseinzelheiten, die in der vorstehenden ersten oder allgemeinen Ausführungsform der Methode nach der Erfindung beschreiben sind, können mit Erfolg auch auf andere Ausführungsformen der Phosphorbestimmungsuntersuchung angewendet werden.

Beispielsweise ist die Verwendung von Polyvinylpyrrolidon ein Merkmal, das mit Vorteil für die Beschleunigung der Bildung des Phospho-Molybdat-Komplexes eingesetzt werden kann, was das gesamte Verfahren schneller macht.

Die Phosphatbestimmung kann so durchgeführt werden, daß die vorstehend als Stufe I beschriebene Methode angewendet wird, wobei jedoch die Schwefelsäurekonzentration so hoch gehalten wird, daß Trübungen ausgeschaltet werden und wobei auf die Verwendung eines Reduktionsmittel verzichtet werden kann. Bei dieser Methode wird der in Stufe I gebildete gelbe Komplex gemessen, im Gegensatz zu dem in Stufe II gebildeten blauen Komplex. Die gelbe Farbe wird im Bereich von 410 mu gemessen (zur Berücksichtigung der gelben Eigenfarbe des Serums muß eine Blindprobe gemacht werden).

Wie vorstehend erwähnt, wirkt das Hydroxylamin auf den gelblichen Phosphatkomplex nicht reduzierend, bis die Lösung in Stufe II einen alkalischen pH-Wert erhalten hat. Es scheint jedoch selbst im sauren pH-Bereich des Polyvinylpyrrolidonreagens eine stabilisierende Wirkung auf Polyvinylpyrrolidon zu haben, und wenn Hydroxylamin-Hydrochlorid in der Polyvinylpyrrolidonlösung anwesend ist, braucht sie durch die ausführende Person nicht extra zugesetzt zu werden; deshalb wurde es als zweckmäßig befunden, das Hydrcxylamin-Hydrochlorid und das Polyvinylpyrrolidon zu einem einzigen Reagens zu vereinigen, wie vorstehend erläutert ist.

Es wurde auch festgestellt, daß an Stelle von Polyvinylpyrrolidon für die Bildung des Phospho-Molybdat-Komplexes eine 5 %ige stabilisierte Lösung eines langkettigen Polypeptides verwendet werden kann, wenn auch das Polypeptid schwieriger zu einem voll zufriedenstellenden Reagens zu stabilisieren ist, das in Stufe I eingesetzt wird. Die Wirkung von Polyvinylpyrrolidon und von Polypeptid auf die Bildung des Molybdat-Phosphat-Komplexes scheint von der Tatsache abzuhängen, daß sie Makromoleküle mit hoher Ladungs- und/oder Polaritätsheterogenität sind.

Deshalb schafft die Untersuchung nach der Erfindung zahlreiche Vorteile wie Genauigkeit, Schnelligkeit, leichte Durchführbarkeit, Ausschaltung der Notwendigkeit der Proteinentfernung, Herabsetzung der Phosphatesterhydrolyse auf ein Minimum und hohe Reagensstabilität.

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Methode zur quantitativen Bestimmung von anorganischem Phosphat, bei der ein Molybdat-Phosphat-Komplex ausgebildet wird, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beschleunigung der Bildung des Molybdat-Phosphat-Komplexes Polyvinylpyrrolidon oder ein Polypeptid zugesetzt wird.

2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine Spur Polyvinylpyrrolidon, vorzugsweise mindestens 3%, zugesetzt werden.

3. Methode nach Anspruch 1 oder 2, dadurch '⁵ gekennzeichnet, daß der gebildete Molybdat-Phosphat-Komplex durch Zusetzen von Hydroxylamin in Form einer Hydroxylaminverbindung zu der Polyvinylpyrrolidonlösung reduziert wird.

4. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 3, -° dadurch gekennzeichnet, daß pro Mikrogramm des zu messenden Phosphors mindestens 0,75 Mikrogramm Hydroxylamin zugesetzt werden.

5. Methode nach einem der Ansprüche 3 oder

4, dadurch gekennzeichnet, daß der gebildete Molybdat-Phosphat-Komplex zur Ablösung des Hydroxylamins aus seiner Verbindung und zur Erreichung von dessen reduzierender Wirkung alkalisch gemacht wird.

6. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 5, w dadurch gekennzeichnet, daß in einer ersten Stufe ein Molybdat-Phosphat-Komplex in Lösung gebildet wird, die schwach sauer ist und welche Polyvinylpyrrolidon oder ein Polypeptid enthält, und daß in einer zweiten Stufe die Lösung des Molybdat-Phosphat-Komplexes alkalisch gemacht wird.