NL8004781A - Werkwijze voor het kwantitatief bepalen van anorganisch fosfaat langs colorimetrische weg in een waterige oplossing. - Google Patents

Description

i * N/29.784-Kp/vD. -1- i f j Werkwijze voor het kwantitatief bepalen van anorganisch fosfaat'langs colorimetrische weg in een waterige oplossing.

(Deze aanvraag is een afsplitsing van octrooiaanvrage nr.

6807535).

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het kwantitatief bepalen van anorganisch fosfaat langs colorimetrische weg in een monster door reactie met molybdaat in een waterige oplossing met een zure pH onder vorming van een 5 molybdofosfaatcomplex.

De werkwijze volgens de uitvinding heeft het kenmerk, dat een hydroxylaminederivaat wordt toegevoegd voor het reduceren van het molybdo-fosfaatcomplex.

Reeds lang weet men, dat de bepaling van de hoeveel-10 heid fosfor een zeer belangrijk hulpmiddel is in de diagnose van een ziekte, omdat de hoeveelheid fosfor op karakteristieke wijze varieert bij bepaalde pathologische en fysiologische omstandigheden.

Reeds sedert 1887 (Osmond, M.F. Buil, Soc. Chim.

15 Parijs 47:745 (1887), geciteerd in Henry, R.J. Clinical

Chemistry, Harper & Row, 1964, biz. 414) heeft men zich bezig gehouden in klinische laboratoria met het probleem van de kwantitatieve bepaling van fosfor. Het te meten fosfor was bij deze bepalingen aanwezig in de vorm van fosfaten en in 20 het bijzonder in de vorm van anorganische fosfaten en niet zo zeer in de vorm van organische fosfaten. De te onderzoeken monsters waren bloedserum- en urinemonsters.

Fosfor in de fosfaatvorm is van kritische betekenis voor het lichaam in het algemeen en ook voor diverse delen 25 van het lichaam. Bijvoorbeeld maakt het fosfor een belangrijk deel uit van de beenderen en de tanden; het is een belangrijke, bufferende stof, waarmede de pH van het bloedserum geregeld wordt; fosfaatafscheiding in de nieren speelt een—ral- bij het handhaven van het zuur/base evenwicht in het lichaam 30 en het is het middel waardoor het hormoon, dat door de bij-schildklier wordt afgescheiden, het calciumgehalte van het serum regelt; fosfor wordt gebruikt bij de vorming van de meeste lipoïden, aanwezig in de hersenen en in de cytoplas- 8004781 -2- mische membranen van de cel? en het is de stof, die gebruikt wordt om uit het voedsel energie te halen.

Onder diverse pathologische en fysiologische omstandigheden kunnen ëên of meer van deze processen zo veranderd 5 zijn, dat deze verandering kenbaar wordt door een karakteristieke verandering in het fosfaatgehalte van het serum of van de urine.

Vandaar dat, ter illustratie van de waarde van de anorganische fosforbepalingen zijn deze geschikt voor de 10 diagnose en/of evaluatie van beendervorming en -afbraak, het metabolisme van de beenderen, de hormoonafscheiding uit de bij schildklier, diabetische acidose, pylorische verstoppingen, respiratoire alkalose, storingen in het zuur/base evenwicht, renale en andere nierstoringen (Best, C.H. en N.B. Taylor 15 The Physiological Basis of Medical Practice, Williams & Wilkins, 1961, biz. 4).

Behalve de betekenis van de bepaling van de hoeveelheid fosfor bij het meten van anorganisch fosfaat in serum en urine is deze bepaling ook van belang voor het vaststellen 20 van anorganisch fosfaat gevormd in procedures voor de bepaling van de kreatine fosfokinaseactiviteit (CPK).

(CPK is een enzyme, dat in het lichaam slechts aanwezig is in het spier- en hersenweefsel. Aangezien het hart een voorbeeld van een spier is, komt CPK in de bloedstroom 25 terecht als het hart beschadigd is; en,aangezien er onder normale omstandigheden geen CPK in de bloedbaan is, is de aanwezigheid hiervan in het bloed het meest specifieke bewijs van een hartinfarct, zie: "Duma, R.J. Arch. Intern. Med., 115:443, 1965, geciteerd in SIGMA Tentative Technical Bulle-30 tin No. 40-üV, Nov., 1965, blz. 1, van Sigma Chemical Company, 3500 DeKalb St., St. Louis, No. 63118").

(De CPK proef wordt ook gebruikt voor het diagnosti-seren van skeletspieren, bijvoorbeeld spierendystrophy, zie: "Ebashi, S., J. Biochem. 46, 103 (1959), geciteerd in Sigma, 35 hierboven vermeld, blz. 1").

Alhoewel de fosfaatvorm van het fosfor inderdaad van vitale betekenis is voor het lichaam beweegt de fosfaatcon-centratie in het serum zich slechts binnen nauwe grenzen. Gezien deze nauwe grenzen is voor een nauwkeurige diagnose ook 40 een grote nauwkeurigheid vereist bij de kwantitatieve bepa- 8004781 «- » -3- ling van het fosfaatgehalte.

Uit praktische overwegingen moet in het klinische laboratorium of in andere laboratoria, waar men deze bepaling verricht, de bepaling relatief snel en gemakkelijk kunnen ver-5 lopen, zelfs indien men laboranten gebruikt, die weinig getraind zijn. In moderne klinische laboratoria bijvoorbeeld moet een laborant dikwijls deze bepaling verrichten tegelijkertijd met een serie andere bepalingen.

De tot nu toe gebruikte fosforbepalingen voldoen niet 10 helemaal aan de eisen van nauwkeurigheid, snelheid en gemakkelijke uitvoerbaarheid; bovendien zijn er nog andere problemen verbonden aan de kwantitatieve bepaling van anorganisch fosfor, die eveneens nog grote moeilijkheden opleveren.

Bijzondere problemen verbonden aan de fosforbepaling; 15 a.Proteïne. Proteïne vormt een probleem bij de fosfor bepaling, omdat het geprecipiteerd wordt door het molybdeen, dat bij vele bepalingen wordt gebruikt en hierdoor wordt het mengsel troebel. Bij de analyse zou de troebeling geïnterpreteerd kunnen worden als aanwezig fosfor. Dientengevolge tracht 20 men bij de tegenwoordige werkwijzen veelal het proteïne in een eerste trap neer te slaan, zoals nu nog nader zal worden toegelicht .

b. Proteïneprecipitatie. Om het nadeel van aanwezigheid van proteïne in het te onderzoeken monster te ondervangen, 25 worden bepaalde precipitatiemiddelen gebruikt, waarna in een volgende trap dit proteïne bijvoorbeeld door centrifugeren of filteren wordt verwijderd. Deze poging echter om het proteïne kwijt te raken roept nieuwe problemen op.

De proteïneprecipitatieverwijdering is niet geheel reprodu-30 ceerbaar en het achterblijvende precipitaat, dat dikwijls onontdekt blijft, is moeilijk te verwijderen en hierdoor ontstaat dezelfde troebelheidsfout, waarop hierboven reeds werd gewezen (Henry, R.J., Clinical Chemistry, Harper & Row, 1964, biz. 414).

35 Proteïneprecipitatie en de verwijdering van dit preci pitaat kunnen niet gemakkelijk geautomatiseerd worden en dit feit en andere pogingen om dit probleem te ondervangen leveren opnieuw problemen op, zoals hierna nog nader zal worden toegelicht .

40 Als precipitatiemiddel gebruikt men gewoonlijk tri- 0 Ω A n O ! -4- chloorazijnzuur, dat de pH verlaagt gedurende de lange tijdsduur/ die vereist is voor de proteïneverwijdering. Onder deze omstandigheden bestaat het reële gevaar, dat de fosfaatesters worden gehydrolyseerd, waardoor positieve fouten gemaakt wor-5 den, zoals hierna nog nader zal worden toegelicht. Het precipiteren en het navolgende centrifugeren of filtreren neemt verder veel tijd in beslag en maakt de bepaling extra duur.

c. Concentraties van molybdeen en zwavelzuur. Om een snelle reactie te verkrijgen gebruikt men bij de kleurvorming 10 in het monster een hoge concentratie aan molybdaat en zwavelzuur gezamenlijk of afzonderlijk (Henry, R.J., Clinical Chemistry, Harper & Row, 1964, biz. 415). Hoge concentraties aan molybdaat veroorzaken echter een precipitatie van het proteïne, waardoor de hierboven gesignaleerde troebelheidsfout 15 optreedt; een hoge zuurconcentratie in vergelijking met de molybdaatconcentratie vermindert weliswaar de troebeling, die kan optreden, maar verlaagt de reactiesnelheid en veroorzaakt een hydrolyse van de organische esters, zoals hierna nog nader zal worden toegelicht.

20 d. Fosfaatesters. Er moge op worden gewezen, dat het bij de diagnose in de eerste plaats gaat om het in anorganische vorm aanwezige fosfor en niet zo zeer om het in organische vorm aanwezige fosfor. Het grootste gedeelte echter van het fosfor aanwezig in het serum is organisch gebonden fosfor 25 en bestaat in hoofdzaak uit fosfaatesters. Elke bepaling die ongewild niet meer dan 5% van het organisch gebonden fosfor zou omvatten, zou een fout bevatten, die hoger is dan de normale concentratie van het anorganische fosfor binnen de grenzen, waarin zich deze concentratie normaal beweegt.

30 Veroorzaakt dus de gebruikte bepalingsmethode een hydrolyse van in het serum aanwezige esters, dan wordt anorganisch fosfaat gevormd en dit fosfaat zou op onjuiste wijze beschouwd kunnen worden een deel te vormen van het normale anorganische fosfaat, dat in het' te onderzoeken monster aan-35 wezig is. Dit is daarom zo belangrijk, omdat het organische fosforgehalte van het serum of de urine niet constant is; het organisch gebonden fosforgehalte kan namelijk variëren tussen 5-14 mg per 100 ml serum (Sunderman, F.W., Monthly Report, May, 1967 van het "Institute for Clinical Science, Ine." te 8004781 -5-

Philadelphia 3, Pennsylvania). Indien dus bij de bepaling esterhydrolyse optreedt, dan levert deze esterhydrolyse geen constante bijdrage aan fosfaat, waarmee men rekening zou kunnen houden bij de bepaling van het anorganisch gebonden 5 fosfaat, omdat de bijdrage, die het organisch gebonden fosfaat levert sterk kan variëren en er niet altijd een correlatie bestaat met de concentratie anorganisch gebonden fosfaat. Zoals hierboven reeds vermeld, versnellen hoge zuur- of molybdaatconcentraties of beide een dergelijke hydrolyse 10 (Weil, H., Biochem. J. 49:286 (1951), geciteerd in Henry, R.J. Clinical Chemistry, 1964, biz. 415).

e. Tijd. De duur die een bepaling vereist speelt ook een belangrijke rol niet alleen vanuit een oogpunt van efficiency en kostprijs, maar ook omdat de tijdsduur bepalend is 15 voor de mogelijkheid tot het ontstaan van fouten, die bijvoorbeeld te wijten kunnen zijn aan een toegenomen esterhydrolyse, die kan optreden indien in een monster lange tijd omstandigheden heersen, die deze hydrolyse in de hand werken. Esterhydrolyse en bijgevolg de fout, die hierdoor kan optreden 20 zijn recht evenredig aan de duur van de hierboven gesignaleerde omstandigheden.

f. Instabiliteit van het gebruikte reductiemiddel. Gezien het feit, dat alle reductiemiddelen instabiel zijn kunnen grove fouten optreden, indien deze instabiliteit niet wordt 25 herkend. Het herhaalde onderzoek naar de conditie, waarin het reagens verkeert, neemt echter veel tijd in beslag. Alhoewel in de literatuur vermeld wordt, dat sommige reductiemiddelen stabiel zijn, schijnen echter de meest gebruikelijke onstabiel te zijn, met inbegrip van stannochloride, para-aminonaftol-30 sulfonzuur en N-fenylfenyleendiamine.

g. Gebrek aan aanpassing aan de wet van Beer. Bij bepaalde fosforzuurbepalingen bestaat er geen lineaire relatie tussen het absorptievermogen van het gekleurde produkt en de fosforconcentratie bij de fotometrische analyse. De wenselijk- 35 heid van lineaire betrekkingen is echter bij elke analys-e- zeer voor de hand liggend, omdat als dergelijke betrekkingen niet bestaan er dikwijls ook een gebrek aan reproduceerbaarheid bestaat. Lineaire betrekkingen maken het voor de onderzoeker mogelijk conclusies te trekken uit één enkele proef, 40 die betrekking hebben op het gehele concentratiegebied.

8004781 -6-

Bekende werkwijzen:

Men kan de bekende kwantitatieve fosforzuurbepalingen waarbij molybdaat wordt gebruikt verdelen in: proteïneprecipi-tatiemethoden en sterk-zuurmethoden, waarbij het proteïne niet 5 wordt geprecipiteerd.

a. Proteïneprecipitatiemethoden. Bij deze methoden wordt het proteïne vooraf neergeslagen met het doel zo veel mogelijk de troebelheidsfout te vermijden. Voor het precipiteren wordt gewoonlijk trichloorazijnzuur gebruikt, waarna het 10 precipitaat wordt verwijderd door centrifugeren of filtreren. Het fosfaat wordt dan omgezet met een molybdaation, gewoonlijk door het fosfaat in aanraking te brengen met een oplossing van ammoniummolybdaat in verdund zwavelzuur (3 N) in de aanwezigheid van een reducerend middel, zoals para-aminonaftolsulfon-15 zuur. In deze reactie wordt een molybdeenfosfaatcomplex gevormd, dat door het reducerende middel gereduceerd wordt tot een blauw gekleurd molybdo-fosfaatcomplex, waarvan het absorptievermogen fotometrisch wordt bepaald en vergeleken wordt met het absorptievermogen van een standaard molybdo-fosfaatcomplex 20 uit welke vergelijking de hoeveelheid fosfor wordt berekend. Een voorbeeld van een dergelijke bepaling is de methode beschreven door Fiske, C.H. en Subbarow, J. Biol. Chem. 66:375 (1925) .

Methoden van dit type verschillen onderling in het 25 gebruikte reductiemiddel. Als reductiemiddel kan bijvoorbeeld ferrosulfaat, stannochloride, N-fenylfenyleendiamine of p-methylaminofenolsulfaat worden gebruikt.

De duur van deze bepalingen bedraagt ongeveer 25-60 minuten, waarvan 10-15 minuten gebruikt worden voor de berei-30 ding van het proteïne-vrije filtraat en ca. 15-45 minuten voor de kleurvormende reactie. Gedurende deze gehele periode staan de organische esters bloot aan de inwerking van een zuur met de daaraan verbonden gevaren, namelijk dat zij gehydrolyseerd kunnen worden, waardoor in de bepalingen fouten kunnen inslui-35 pen.

De nadelen verbonden aan de precipitatiemethode zijn dus de mogelijkheid van esterhydrolyse, de lange duur van de bepaling en in sommige gevallen de instabiliteit van het reductiemiddel.

40 b. De sterk-zure methode, waarbij geen proteïne wordt 8004781 -7- geprecipiteerd. Een voorbeeld van deze methode, die in de technische literatuur wordt vermeld is beschreven in "Hycel Phosphorus Determinations" (1965) Hycel, Inc., te Houston, Texas. Bij deze methode heeft men getracht het probleem van de storen-5 de invloed van het proteïne te ondervangen door gebruik te maken van een sterke zuurconcentratie, dat wil zeggen een zuur-concentratie, die zo hoog is, dat het molybdeen het proteïne niet precipiteert. In deze methode wordt 0,2% molybdaat opgelost in 3% zwavelzuur gebruikt met ferroammoniumsulfaat als 10 reductiemiddel.

Wat manipulaties betreft is de werkwijze vrij eenvoudig, maar neemt nog altijd ongeveer 35 minuten in beslag, waardoor nog altijd het nadeel bestaat, dat gedurende deze lange tijd veel fosfaatesters kunnen hydrolyseren. Bovendien wordt 15 in de bovengenoemde literatuur vermeld, dat glucoseconcentra-ties boven 200 mg-% de bepaling storen en aangezien fosfor-bepalingen dikwijls verricht worden in monsters afkomstig van diabetici, beperkt deze storende invloed sterk de bruikbaarheid van deze methode.

20 Het reagens, dat in deze methode wordt gebruikt is slechts één jaar stabiel indien het in de koude wordt opgeslagen.

Ook deze in de Hycel-publicatie beschreven uitvoeringsvorm gehoorzaamt de wet van Beer niet, hetgeen, zoals 25 hierboven reeds werd vermeld moet worden beschouwd als een ernstig nadeel van deze werkwijze.

8004781

Claims (1)

1. -8- Werkwijze voor het kwantitatief bepalen van anorganisch fosfaat langs colorimetrische weg in een monster door reactie met molybdaat in een waterige oplossing met een zure pH onder vorming van een molybdo-fosfaatcomplex, met het 5kenmerk , dat een hydroxylaminederivaat wordt toegevoegd voor het reduceren van het molybdo-fosfaatcomplex. 8004781