DE1598135C3 - Indikator zur quantitativen Analyse von Losungen, Verfahren zur Herstellung des Indikators und Verwendung des Indi kators - Google Patents

Description

Sichtsmaßnahmen sind die Ergebnisse immer noch nicht reproduzierbar genug.

Der eingangs beschriebene Indikator zeichnet sich nach der Erfindung dadurch aus, daß er aus einem vorgebildeten Chelat aus nahezu vollständig an ein 2,2'-Bichinolin oder ein 2,9-subst.-l,10-Phenanthro!in gebundenem Kupfer besteht.

Ein Verfahren zur Herstellung des Indikators ist nach der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß ein Kupfersalz mit einem wasserlöslichen Salz des 2,2'-Bi chinolins oder 2,9-subst.-l,10-Phenanthrolins in Berührung gebracht wird.

Eine erfindungsgemäße Verwendung des Indikators ist dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator in die zu analysierende Lösung eingebracht wird, daß bei der Wertigkeitsänderung des Kupfers eine Färbreaktion erfolgt, daß das Maß der Wertigkeitsänderung über die Lichtdurchlässigkeit gemessen wird und daß die Konzentration der zu analysierenden Substanz durch Vergleich mit einer Vergleichslösung bestimmt wird.

Erfindungsgemäß werden somit Kupferphenanthrolin- oder Kupferbichinolinchelate als Indikatoren verwendet. Die speziell verwendeten Verbindungen oder Reagenzien zur Bildung der Phenanthrolin- und Bichinolinchelate sind für Kupfer spezifisch, d. h., sie bilden mit anderen Metallen keine Chelate. Die im Einzelnen verwendeten Chelate werden vorgebildet, so daß das gesamte Kupfer nahezu vollständig durch den Chelatbildner gebunden wird, wenn es sich in der Lösung befindet, die die zu analysierende Substanz enthält. Außerdem werden geeignete Bedingungen geschaffen, unter denen die oxydierenden oder reduzierenden Substanzen die Wertigkeit des gebundenen Kupfers verändern.

Die als Indikatoren verwendeten Chelate zeigen einen ausgeprägten Farbumschlag, wenn das gebundene Kupfer seine Wertigkeit ändert. Außerdem gehorcht die von ihnen in der Lösung hervorgerufene Farbe wenigstens im interessierenden Bereich dem Beerschen Gesetz. Die Menge der oxydierenden oder reduzierenden Substanz läßt sich daher leicht feststellen, wenn man Bedingungen schafft, unter denen der Kupferphenanthrolin- oder Kupferbfchinolin-Indikator von der zu analysierenden Substanz oxydiert oder reduziert wird. Der Gehalt an oxydierender oder reduzierender Substanz kann dann mit bekannten kolorimetrischen oder äquivalenten Verfahren festgestellt werden.

Bei einem Ausführungsbeispiel für ein Verfahren zur kolorimetrischen, quantitativen Analyse von Traubenzucker in entproteinisiertem Blutserum wird eine vorgewählte Menge entproteinisiertes Blutserum in einer wäßrigen alkalischen Lösung mit vorgewähltem Volumen und unter Bedingungen, bei denen das Kupfer reduziert wird, mit einem aus nahezu vollständig an 2,2'-Bichinolin oder2,9-subst.-l,10-Phenanthrolin gebundenem zweiwertigem Kupfer bestehenden Chelat-Indikator in Berührung gebracht. Anschließend wird diejenige Kupfermenge gemessen, die zum einwertigen Kupfer reduziert worden ist, indem die Lichtdurchlässigkeit der wäßrigen Lösung gemessen wird. Durch Vergleich mit einer in ähnlicher Weise auf die zu analysierende Substanz behandelten Traubenzuckervergleichslösung kann dann die Traubenzuckermenge berechnet werden.

Durch den erfindungsgemäßen Gebrauch von Kupferchelaten wird der Bedarf an Tartrat oder anderen in neuerer Zeit zum Inlösimghalten der zweiwertigen Kupferionen verwendeten Hydroxysäuren vermieden. Außerdem ist es nicht mehr notwendig, der Lösung zur Vermeidung der Reoxydation andere Salze, z. B. Sulfate, zuzugeben. Alles überschüssige Kupfer wird vor der Bestimmung der oxydierenden oder reduzierenden Substanz aus der Lösung entfernt, und das verbleibende Kupfer ist nahezu vollständig an den Komplexbildner gebunden.

Dabei wird die bisher stets störende Reoxydation vermieden, so daß die Verwendungeines Prüfrohrs mit geraden Wänden oder eines ähnlichen geeigneten Gefäßes möglich ist. Die Steuerung der Reoxydation der einwertigen Kupferionen, wie sie beispielsweise bei der Analyse von Traubenzucker auftritt, erlaubt sehr kurze Siedezeiten im Vergleich zu den bekannten Verfahren. Außerdem ist der entstehende Farbkomplex fünf Tage oder länger stabil, so daß sich wesentliche Vorteile bei der kolorimetrischen Analyse ergeben.

Gemäß der Erfindung wird das Kupfer mit einem substituierten Phenanthrolin, insbesondere mit 2,9-subst.-l,10-Phenanthrolin oder mit 2,2'-Bbhinolin, komplexiert. Erfindungsgemäß können alle organisehen Verbindungen mit der folgenden Formel verwendet werden:

C — C

wobei X irgendein organisches Radikal einschließlich

der Alkylradikale, z. B. die Methyl- oder Äthylgruppe und der aromatischen Radikale wie der Benzolring sein kann. Die offenen Valenzen der Kohlenstoffatome sind miteinander durch andere Kohlenstoffatome verbunden, so daß sich Ringstrukturen ergeben.

Als Komplexbildner wird vorzugsweise einer der Stoffe Cuproin (2,2'-Bichinolin), Neocuproin (2,9-Dimethyl-l,10-phenanthrolin), Bathocuproin (2,9-Dimethyl-4,7-diphenyl-l,10-phenanthrolin) oder eines der wasserlöslichen Salze dieser Stoffe, wie das Hydrochlorid- oder Hydrosulfatsalz, verwendet. Weitere Komplexbildner sind außerdem z. B. die oben aufgezählten bevorzugten Substanzen mit weiter substituierten Ringen. Beispielsweise können beim Neocuproin und Bathocuproin in der fünften und/oder sechsten Stellung Alkylgruppen, Hydroxygruppen, Nitrogruppen, Halogenatome od. dgl. substituiert sein.

Der Kupfer-phenanthrolin- oder Kupferbichinolin-Komplex ist in vielen Dingen dem Eisenphenanthrolin-Tndikatorsystem ähnlich und scheint genau so nützlich wie dieser zu sein, wobei er noch den Vorteil besitzt, daß er dem Farbkomplex in wäßriger Lösung besonders bei der Analyse von reduzierenden Substanzen eine größere Stabilität verleiht.

Im Gegensatz zum Eisenphenanthrolinsystem scheinen die zwei- und einwertigen Kupferionen fest im Chelat gebunden zu sein, .und keiner der Komplexe wird in heißer alkalischer Lösung stark angegriffen. Wenn außerdem unter diesen Bedingungen ein Teil des Kupfer(II)-chelats zum Kupfer(I)-chelat reduziert ist, dann ist der entstandene Farbkomplex bei Zimmertemperatur mehr als 5 Tage lang stabil, so daß kein: zusätzlichen Stabilisatoren oder andere Komp!e<bildner notwendig sind, um das zweiwertige Kupferion

zu suspendieren. Beim Verbinden des Kupferions mit dem substituierten Phenanthrolin oder Bichinolin in einem Molverhältnis von 1:2 dient das Chelat dann als quantitativer Oxydations- oder Reduktionsindikator, dessen Farbe je nach der Zahl der zweiwertigen oder einwertigen Kupferionen, die entsprechend den Versuchsbedingungen gebildet werden, intensiver oder weniger intensiv wird. Da das Chelat derart fest gehalten wird, tritt eine Reoxydation nicht mehr auf.

Die genannten Indikatoren sind bei der Analyse von oxydierenden und reduzierenden Substanzen aus der flüssigen Phase in weitem Maße verwendungsfähig. Besonders nützlich sind sie zur Analyse von Blut auf verschiedene reduzierende Substanzen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können sowohl der zellförmige Teil als auch der Plasmateil des Blutes analysiert werden. Im zellförmigen Teil können mit den erfindungsgemäßen Indikatoren beispielsweise Glutathion und im Plasmateil, der vorzugsweise in seine Serumform verwendet wird, eine Anzahl von Substanzen, z. B. Traubenzucker, Creatinin, Harnsäure und Ascorbinsäure, bestimmt werden.

Die entsprechenden Oxydations- und Reduktionsreaktionen werden bei dem Verfahren der Erfindung normalerweise in der flüssigen Phase durchgeführt, d.h. zum Beispiel in Wasser oder einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Aceton, Äthanol, Chloroform, Äthylacetat, Amylacetat, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol, Dioxan od. dgl. Der Indikator, der aus einem zur Chelatbildung geeigneten Phenanthrolin oder Bichinolin besteht, an das das Kupfer nahezu vollständig gebunden ist, wird dann dem die oxydierende oder reduzierende Substanz enthaltenden Lösungsmittel zugesetzt. Der Indikator kann in fester Form zugegeben werden, doch wird er vorzugsweise in gelöster Form zugegeben, wobei er in einem der geeigneten Lösungsmittel gelöst ist. Eine Indikatorlösung kann außerdem andere Substanzen, z. B. ein geeignetes Alkali, enthalten.

Das Kupfer wird, je nachdem, ob die zu analysierende Substanz oxydierend oder reduzierend ist, in zweiwertiger oder in einweriger Form verwendet. Anschließend werden die geeigneten Bedingungen eingestellt, z. B. der genaue pH-Wert und die Temperatur, damit das Kupfer entsprechend reduziert oder oxydiert wird.

Die hier vorgeschlagenen Indikatoren unterliegen beim Übergang vom oxydierten in den reduzierten Zustand oder umgekehrt einer ausgeprägten Farbänderung. Cuproin ist beispielsweise in der Cuproform purpur und in der Cupriform hellgrün. Die Farbänderung der Indikatoren kann auch zur quantitativen Bestimmung der in der Lösung befindlichen oxydierenden oder reduzierenden Substanz dienen, indem auf bekannte Weise titriert oder kolorimetrisch vorgegangen wird.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, nämlich der Analyse von Traubenzucker im Blutserum, gehört zu den zur Reduktion geeigneten Bedingungen die Gegenwart einer alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von vorzugsweise mindestens etwa 10. Dies kann durch Zugabe eines Alkalis, z. B. Natriumhydroxid zur Indikatorlösung geschehen. Vorzugsweise wird jedoch der alkalische Zustand durch Zugabe eines Carbonates wie Natriumcarbonat hergestellt.

Wenn Natriumcarbonat verwendet wird, dann geht die Reduktion des Indikators im allgemeinen schneller vor sich, wenn die Lösung konzentrierter ist, d. h., die Reduktion verläuft in einer 4°/₀igen Natriumcarbonatlösung schneller als in einer 0,l°/₀igen Lösung. Zur schnellen Beendigung der Reduktion (in etwa 2,5 Minuten) ist eine etwa 1°/ο·8^ε Natriumcarbonatlösung ausreichend. Die dabei entwickelte Farbe wird nicht zerstört, wenn die Erwärmungszeit größer als diese Zeit bis zur maximalen Farbentwicklung ist.

Wenn an Stelle von Traubenzucker andere oxydierende oder reduzierende Substanzen analysiert werden, die auch in anderen Stoffen als Blut oder Blutserum enthalten sein können, dann sollte der pH-Wert in bekannter Weise eingestellt werden, damit die untersuchte Substanz eine Oxydation oder Reduktion des Kupfers hervorruft. In allen Fällen, auch im Falle der Traubenzuckeruntersuchung, kann eine Erwärmung notwendig sein (z. B. in einem Wasserbad), um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen.

Bei dem beschriebenen Verfahren wird das Kupferphenanthrolin oder Kupferbichinolin dsr Prüflösung in einer Menge zugegeben, die zur Abreaktion der gesamten reduzierenden oder oxydierenden Substanz .., in der Lösung ausreicht, wobei ein Überschuß vor- '! teilhaft ist. Im Falle der Analyse des Traubenzuckers im Blutserum wird der Blutserumprobe eine Indikatorlösung zugesetzt, die etwa 7,5 mg% hydratisiertes Kupfersalz enthält. Eine solche Indikatorlösung, die etwa 7,5 mg°/o hydratisiertes Kupfer(II)-sulfat enthält, eignet sich daher z. B. zur Reduktion einer Standardlösung mit 300 mg°/o Traubenzucker, wobei die beschriebenen Bedingungen eingestellt werden müssen.

Je nach den zu analysierenden Substanzen ist dis im Einzelfall zu verwendende Konzentration veränderbar. Eine zu geringe Indikatorkonzentration sollte jedoch vermieden werden, da bei den sehr geringen Konzentrationen eine Stearinhemmung auftritt. Obwohl daher eine 7,5 mg°/o Indikatorkonzentration des Kupfersalzes bei Verwendung einer 300 mg% Standardtraubenzuckerlösung geeignet ist, kann auch bei einer Indikatorkonzentration von 2,5 mg°/₀ Kupfersalz ein gutes Ergebnis erzielt werden. Bei einer Herabsetzung der Kupfersalzkonzentration auf weniger als 1 bis 1,5 mg°/o tritt jedoch in starkem Maße die Stearinhemmung in Erscheinung.

In jedem Fall muß jedoch genügend Chelatbildner zugegen sein, damit unabhängig von der verwendeten Kupfermenge das Kupfer nahezu vollständig gebunden wird. Das kann leicht ausgerechnet werden, da für jedes Kupferatom zwei Moleküle des Chelatbildners notwendig sind.

Die mit der Luft in Berührung befindliche Flüssigkeitsoberfläche ist im Gegensatz zu den bekannten Verfahren unkritisch, bei denen ein mit einer Verengung versehenes Prüfrohr für den Traubenzucker verwendet oder auf andere Weise verhindert werden mußte, daß die einwertigen Kupferionen während des Siedens oder anderer Bedingungen, die zum Reduzieren erforderlich sind, wieder reoxydiert wird. Das hat sich durch Versuche mit drei verschiedenen Siedegefäßen ergeben, bei denen verschieden große Fiüssigkeitsoberfiächen mit der Luft in Berührung gebracht werden. Obwohl sich ergibt, daß bei den Gefäßen mit kleinerer Berührungsfläche Flüssigkeit-Luft die Farbeinstellung des Indikators sc!'n;llcr erfolgt, führen die Reaktionen in allen Prüfgefäßen letzten Endes zur gleichen Farbdichte, wenn man bis zur Beendigung der Reaktion wartet. Daraus folgt, daß der Unterschied der Geschwindigkeit der Farbentwicklung und

der Unterschied der zur Erwärmung der Lösungen in den verschiedenen Reaktionsgefäßen auf die Reduktionstemperatur des Kupfers voneinander abhängig sind und daß eine noch bemerkbare Reoxydation nicht von der Flüssigkeitsoberfläche abhängt, die der Luft ausgesetzt ist. Diese Eigenschaften ergeben sich aus der F i g. 1, in der drei Proben A, B und C zugrunde gelegt worden sind. Die Probe A wird in einem 13 · 100-mm-Prüfrohr, B in einem 17 · 150-mm-Prüfrohr und C in einem 30-ml-Gefäß mit rundem Boden nach K j e 1 d a h 1 untersucht. Dabei wird eine 300 ml Traubenzuckerstandardlösung mit geeigneten Vergleichslösungen verwendet, Der Indikator und das angewendete Verfahren sind im anschließend beschriebenen Beispiel I beschrieben.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren an Hand einiger Beispiele beschrieben, die sich mit der Bestimmung von Traubenzucker im Blutserum beschäftigen.

B ei s ρ i e 1 I

Analyse von Traubenzucker mit Kupferneocuproin als Indikator

Konzentrierte Indikatorlösung

15 mg hydratisiertes Kupfer(II)-sulfat werden 50 ml einer wäßrigen Lösung zugesetzt, die 100 mg Neocuproinhydrochlorid enthält. Hierzu wird Wasser verwendet, welches frei von Metallionen und reduzierten Substanzen ist. Es entsteht grünes Kupfer(II)-chelat. Das Kupfer(II)-Ion verbleibt in Lösung, wenn man es einem alkalischen Medium zuführt. Das Konzentrat ist bei Zimmertemperatur mindestens zwei Monate stabil.

Das Chelat dient in dieser Form als Indikator bei der quantitativen Reduktion und kann entweder einer alkalischen oder sauren Lösung zugeführt werden, um die Gegenwart oder die Konzentration von reduzierenden Substanzen unter den gegebenen Bedingungen zu bestimmen. Wenn das Kupfer in der einwertigen Form erhalten wird, dann kann es mit einem geeigneten Oxydationsmittel in die zweiwertige Form überführt werden. Wenn umgekehrt die zweiwertige Form erhalten und der Indikator zum Nachweis von oxydierenden Substanzen verwendet wird, dann kann es durch ein geeignetes Reduktionsmittel in die einwertige Form überführt werden.

Reaktionsmittel für die Analyse von
Traubenzucker

5 ml der konzentrierten Indikatorlösung werden 95 ml einer einprozentigen wäßrigen Natriumkarbonatlösung zugefügt. Das Reaktionsmittel besitzt eine sehr schwach bläulichgrüne Farbe und bleibt bei Zimmertemperatur einige Tage lang klar, ohne daß eine wesentliche Selbstreduktion der Kupfer(II)-Ionen eintritt. Der pH-Wert der Lösung ist 10,8.

Anwendung auf Blutserum

Es wird in der üblichen Weise oxaliertes Blut gesammelt. Es kann z. B. ein Tropfen Blut vom Finger verwendet werden, wenn letzteres sofort in Natriumoder Bariumhydroxyd gegeben wird, um die Proteine auszufällen. Es wird ein Filtrat aus Barium- oder Natriumhydroxyd und Zinksulfat im Verhältnis von 1:200 oder 1:100 hergestellt, wobei die Reaktionsmittel sorgfältig eingestellt werden, damit eine neutrale Lösung entsteht. Die Lösungen werden dazu verwendet, ein entproteinisiertes Filtrat herzustellen, wie es das Verfahren nach N. S ο m ο g y i, »A Method for the Preparation of Blood Filtrates for the Determination of Sugar«, J. Biol. Chem., 86, S. 655 bis 663, 1930, angibt.

1. 1 ml eines l:200-Filtrats (oder einer bekannten Traubenzuckervergleichslösung als Äquivalent) wird in einem sauberen Prüfrohr zu 6 ml der Indikatorlösung gegeben. Eine geeignete Vergleichslösung ist ebenfalls vorgesehen.

2. Die Prüfrohre werden 2,5 Minuten lang in heftig kochendes Wasser gegeben und dann in Leitungswasser auf Zimmertemperatur abgekühlt.

Es werden spektrophotometrische Messungen in der Nähe der Wellenlänge Maximalabsorption (454 μ) durchgeführt. Die Traubenzuckerkonzentration ist proportional der optischen Dichte, wie es die F i g. 2 zeigt.

Wie oben beschrieben, werden die chelierten Indikatoren einfach dadurch hergestellt, daß man das Kupfer vorzugsweise in der flüssigen Phase mit dem Cheliermittel in Berührung bringt.

Beispiel II

Analyse von Traubenzucker mit Kupferbathocuproin als Indikator

Konzentrierte Indikatorlösung

50 mg hydratisiertes Kupfer(II)-sulfat werden 50 ml einer wäßrigen Lösung zugegeben, die 200 mg Bathocuproinnatriumsulfonat enthält. Das Wasser hierzu sollte frei von reduzierenden Substanzen und Metallionen sein. Aus dieser Kombination bildet sich hellgelbes Kupferchelat. Das Kupfer(II)-Ion verbleibt in Lösung, wenn die konzentrierte Indikatorlösung einem alkalischen Medium zugeführt wird. Das Konzentrat ist bei Zimmertemperatur mehrere Tage lang stabil und kann zur Bestimmung der Gegenwart oder der Konzentration von reduzierenden Substanzen entweder einer alkalischen oder einer sauren Lösung zugeführt werden.

Reaktionsmittel

5 ml der konzentrierten Indikatorlösung werden 95 ml einer einprozentigen wäßrigen Natriumkarbonatlösung zugegeben. Das Reaktionsprodukt besitzt einen sehr schwach gelblichen Farbton und zeigt bei Zimmertemperatur in 2 Tagen keine merkliche Selbstreduktion. Der pH-Wert der Lösung ist 10,8.

Analysierverfahren

Es wird auf bekannte Weise oxaliertes Blut aus einer Vene gesammelt. Dazu kann ein Tropfen Blut von der Fingerspitze verwendet werden, wenn das letztere sofort in das Natrium- oder Bariumhydroxyd gegeben wird, um die Proteine auszufällen. Gemäß dem Verfahren nach S ο m ο g y i (s. Beispiel 1) wird ein Filtrat von Barium- oder Natriumhydroxid und Zinksulfat im Verhältnis von 1:400 hergestellt, wobei die Reagenzien sorgfältig eingestellt werden, damit sich Neutralität ergibt.

309 511/460

1. 1 ml des Filtrats oder einer bekannten Traubenzuckervergleichslösung wird in einem sauberen Prüfrohr mit 6 ml der Indikatorlösung versetzt. Eine geeignete Vergleichslösung ist ebenfalls vorgesehen.

2. Die Prüfrohre werden 2,5 Minuten lang in heftig kochendes Wasser gegeben und anschließend unter Leitungswasser auf Zimmertemperatur abgekühlt.

3. Es werden spektrophotometrische Messungen in der Nähe der Wellenlänge der Maximalabsorption (479 μ) durchgeführt. Die Traubenzuckerkonzentration ist proportional der optischen Dichte, wie es in der F i g. 3 gezeigt ist.

Beispiel III

Analyse von Traubenzucker mit Kupfercuproin
als Indikator

Wie in den vorherigen Beispielen wird eine Indikatorlösung hergestellt, wobei jedoch Cuproin als Cheliermittel verwendet wird. Nach dem Verfahren von S ο m ο g y i wird Blutserum entproteinisiert und wie in den vorherigen Beispielen auf Traubenzucker analysiert. Die Ergebnisse sind in der F i g. 4 gezeigt.

Bei dem bisher bekannten Verfahren bestand stets das Problem der Reoxydation des Kupfers. Damit die Verwendung eines Prüfrohres mit einer Verengung vermieden werden kann, ist bereits vorgeschlagen worden, der Lösung z. B. in Form von Natriumsulfat Sulfationen zuzugeben. Die Zugabe von mehr als 18°/₀ Natriumsulfat dient bei den Indikatoren, die hier beschrieben werden, zur Vergrößerung der Dichte der endgültig erhaltenen Färbung. Das Sulfation wirkt reduzierend, doch ändert sich die Wirkung bei Abwesenheit anderer reduzierender Substanzen mit der Konzentration an Natriumsulfat, d. h., je größer die Sulfatkonzentration ist, um so größer ist die reduzierende Wirkung auf den Kupferindikator. Da erfindungsgemäß die Gegenwart von Sulfationen nicht erforderlich ist, kann auf diese Weise der Traubenzucker im Blutserum genauer als nach den bekannten Verfahren analysiert werden.

Das Verfahren nach der Erfindung hat den Vorteil, daß in Gegenwart von· Traubenzucker auch eine Analyse auf Harnsäure und Creatinin möglich ist. Wenn nämlich die zu untersuchende Probe Traubenzucker enthält, dann ist es nur notwendig, eine genügende Menge an Acetationen zuzufügen, damit der pH-Wert auf 5 bis 8 eingestellt wird. Der Traubenzucker kann dann die Bestimmung nicht mehr stören.

Wenn andererseits eine Analyse auf Traubenzucker vorgenommen werden soll und die ursprüngliche Probe Creatinin, Harnsäure und unter Umständen weitere reduzierende Substanzen enthält, dann können diese zweckmäßigerweise dadurch entfernt werden, daß man z. B. das Verfahren nach S ο m ο g y i wählt. Das Somogyi-Filtrat enthält im wesentlichen Reduktionsmittel für Monosaccharide und nur geringe Mengen anderer Reduktionsmittel. Harnsäure und Creatinin brauchen aus der Lösung, aus der Traubenzucker bestimmt werden soll, nicht entfernt zu werden, wenn die Traubenzuckerbestimmung wie bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel in einer alkalischen Carbonatlösung vorgenommen wird. Wenn Harnsäure und Creatinin in physiologischen Konzentrationen direkt der zu untersuchenden Traubenzuckerlösung zugegeben werden, dann beeinflussen sie die Analyse der Monosaccharide nur unwesentlich. Das geht aus der F i g. 5 hervor, in der die Versuchsergebnisse eingetragen sind, die sich ergeben, wenn ähnlich wie im Beispiel 1 vorgegangen wird und nur die angegebenen zusätzlichen Reduktionsmittel verwendet werden.

Wenn auf Creatinin und Harnsäure analysiert wird, dann können die Reduktionseigenschaften des einen

ίο Stoffes in Gegenwart des anderen dadurch unterschieden werden, daß man verschiedene reduzierende Bedingungen schafft. Wenn beispielsweise die zu analysierende Probe sowohl Harnsäure als auch Creatinin enthält, dann kann sie mit einem Indikator wie im Beispiel 1 kombiniert werden. Bei geeigneter Einstellung der reduzierenden Bedingungen kann dann wahlweise die Reduktion der Harnsäure allein bestimmt werden.

Zur wahlweisen Einstellung der reduzierenden Bedingungen, die vorzugsweise zur Reduktion allein der Harnsäure führen, gehört die Einstellung des pH-Wertes auf 5 bis 6. Bei Erwärmung wird die Reduktion beschleunigt. Wenn der pH-Wert auf 7 bis 8 einstellt wird, dann verändern sowohl die Harnsäure als auch das Creatinin den Indikator. Die Menge an Harnsäure kann daher zuerst dadurch bestimmt werden, das ausgewählte Bedingungen geschaffen werden, und wenn dann die Gesamtmenge bestimmt wird, dann erhält man den Anteil an Creatinin aus der Differenz dieser beiden Werte. Die oben beschriebene Einstellung der Bedingungen zur selektiven Reduktion sind nur als Beispiel aufzufassen, und auch Modifikationen können zu gleichen Ergebnissen führen.
Wenn zur Analyse auf Blutzucker Blutserum verwendet wird, dann sollte sich vorzugsweise das Verfahren nach Somogy.i zur Entproteinisierung anschließen. Bei diesem Verfahren entsteht ein klares Filtrat, welches zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung äußerst geeignet ist. Wenn das Blutserum jedoch auf Harnsäure oder andere reduzierende Substanzen analysiert wird, dann kann das Somogyi-Filtrat nicht verwendet werden, weil es im wesentlichen nur Substanzen zur Reduktion der Monosaccharide enthält. Infolgedessen wird in diesem

+5 Fall z. B. ein Filtrat nach dem Verfahren von F ο 1 i η und W u hergestellt, welches in J. Biol. Chem., 38, S. 81 (1919), beschrieben ist und bei dem Wolframsäure verwendet wird. Verglichen mit den Somogyi-Filtraten sind jedoch die Filtrate nach F ο 1 i η und W u manchmal etwas trüb, Die Trübung wird jedoch nicht beobachtet, wenn wäßrige Standardlösungen von Harnsäure oder Traubenzucker den Indikator- und Acetatoder Carbonatlösungen zugegeben werden.
Die Trübung kann durch Zugabe eines kationischen, oberflächenaktiven Reagenzmittels zum wolframsauren Filtrat vermieden werden. Die zugegebene Menge sollte so groß sein, daß die Lösung klar wird. Zur Klärung des Filtrats kann unter anderem beispielsweise einprozentiges Methylbenzethoniumchlorid (Octylcresoxi - äthoxyäthyldimethylbenzylammoniumchloridmonohydrat) zugegeben werden. In dieser Weise behandelte Filtrate bleiben ohne Trübung und können zur Harnsäurebestimmung oder zur Bestimmung anderer reduzierender Substanzen verwendet werden, z. B. auch zur Bestimmung der Monosaccharide, wenn das Somogyi-Filtrat nicht verwendet wird. Das folgende Beispiel zeigt die Bestimmung von Harnsäure und Creatinin.

Beispiel IV

Bestimmung von Harnsäure und Creatinin im
Blutserum

Indikatorlösung

Für die Reaktion kann irgendeines der obenerwähnten substituierten Phenantroline oder Bichinoline verwendet werden. In diesem Beispiel wird das Kupfer(II)-chelat von Neocuproinhydrochlorid verwendet und in der gleichen Konzentration wie bei der Analyse von Monosaccharid nach Beispiel I einer einprozentigen Natriumacetatlösung zugegeben.

Filtratreagens

Zur Herstellung eines wolframsauren Filtrats gemäß der Vorschrift von F ο 1 i η und W u wird eine 1/12 normale Schwefelsäure verwendet, der soviel Methylbenzethoniumchlorid zugegeben wird, bis eine 0.3°/₀ige Lösung entsteht. Außerdem wird für das wolframsaure Filtrat 10°/₀iges Natriumwolframat verwendet.

Verfahren

Das wolframsaure Filtrat wird hergestellt, indem 8 Volumprozent Schwefelsäurelösung mit einem Volumen Blutserum vermischt werden. Anschließend wird zur Ausfällung der Proteine 1 ml 10%iges Natriumwolframat zugegeben. Der Niederschlag wird in bekannter Weise abfiltriert.

1. 2 ml des auf diese Weise hergestellten Filtrats werden mit 5 ml des Farbreagens in Acetatlösung zugegeben. Geeignete Vergleichslösungen werden in ähnlicher Weise behandelt.

2. Die Mischung wird eine Minute lang in kochendes Wasser gegeben und dann auf Zimmertemperatur abgekühlt und in einem Spektrophotometer quantitativ analysiert.
5

Zwischen der optischen Dichte und der Konzentration der Harnsäure und des Creatinins wird eine lineare Beziehung beobachtet. Unter den besonderen hier eingestellten Bedingungen, d. h. bei Gegenwart ίο von Acetationen und bei einem pH-Wert von etwa 7 bis 8, werden die beobachteten Ergebnisse bei Gegenwart von Traubenzucker nicht beeinflußt. Die Harnsäure kann bestimmt werden, indem der pH-Wert auf 5 bis 6 eingestellt wird, wobei weder der Traubenzucker noch das Creatinin stören. Die Creatininkonzentration wird als Differenz der beiden erhaltenen Werte bestimmt.

Im folgenden Beispiel wird die Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung auf andere reduzierende Substanzen beschrieben.

B e i s ρ i e 1 V
Bestimmung von Ascorbinsäure

Aus Neocuproin und zweiwertigen Kupferionen in einem Molverhältnis von 2:1 wird (ähnlich wie im Beispiel 1) eine Indikatorlösung hergestellt, wobei die Lösung jedoch angesäuert wird. 2 ml Proben einer im Verhältnis 1:10 verdünnten Ascorbinsäure-Vergleichslösung in den angegebenen Konzentrationen werden mit 5 ml Teilen des Indikators versetzt. Nach 4 Minuten werden spektrophotometrische Messungen bei 454 μ vorgenommen, wobei eine 10-mm-Cuvette verwendet wird. Die Ergebnisse sind in der F i g. 6 gezeigt.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (11)

Patentansprüche:

1. Indikator zur quantitativen Analyse von Lösungen, die reduzierende oder oxydierende Substanzen enthalten, mit Ausnahme von Harnsäure enthaltenden Essigsäurelösungen und von alkalischen glukosehaltigen Carbonat-Blut-Filtraten, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einem vorgebildeten Chelat aus nahezu vollständig an ein 2,2'-Bichinolin oder ein 2,9-subst.-1,10-Phenanthrolin gebundenem Kupfer besteht.

2. Indikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Kupferchelat von Cuproin, Neocuproin oder Bathocuproin ist.

3. Verfahren zur Herstellung des Indikators nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kupfersalz mit einem wasserlöslichen Salz des 2,2'-Bichinolins oder 2,9-subst.-l,10-Phenanthrolins in Berührung gebracht wird.

4. Verwendung des Indikators nach Anspruch 1 oder 2 zur quantitativen Analyse von Lösungen, die reduzierende oder oxydierende Substanzen enthalten, mit Ausnahme von Harnsäure enthaltenden Essigsäurelösungen und von alkalischen glukosehaltigen Carbonat-Blut-Filtraten, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator in die zu analysierende Lösung eingebracht wird, daß bei der Wertigkeitsänderung des Kupfers eine Farbreaktion erfolgt, daß das Maß der Wertigkeitsänderung über die Lichtdurchlässigkeit gemessen wird und daß die Konzentration der zu analysierenden Substanz durch Vergleich mit einer Vergleichslösung bestimmt wird.

5. Verwendung des Indikators nach Anspruch 1 oder-2 zur Analyse von aus dem zellförmigen Teil und/oder Plasmateil bestehender Blutlösung. ■

6. Verwendung des Indikators nach Anspruch 1 oder 2 zur Analyse von entproteinisiertem Blutserum.

7. Verwendung des Indikators nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung vorbehandelt wird, bis sie praktisch frei von anderen reduzierenden Substanzen als Traubenzucker ist, und daß die Analyse im alkalischen Bereich vorgenommen wird. · '

8. Verwendung des Indikators nach Anspruch 6 zur Analyse der Lösung auf Traubenzucker, durch Einstellung eines pH-Werts von 10 mit einem Carbonat.

9. Verwendung des Indikators nach Anspruch 5 oder 6 zur Analyse der Lösung auf Ascorbinsäure und/oder Creatinin.

10. Verwendung des Indikators nach Anspruch 1 oder 2 zur Analyse einer Lösung, die auch andere reduzierende Substanzen enthalten kann, auf den Gesamtanteil an Harnsäure und Creatinin, durch Einstellung eines pH-Werts von 7 bis 8 und Zugabe von Acetationen.

11. Verwendung des Indikators nach Anspruch 10 zur Bestimmung des Anteils an Harnsäure durch Einstellung eines pH-Werts von 5 bis 6 und Berechnung des Anteils an Creatinin als Differenz des Gesamtanteils von Harnsäure und Creatinin und des Anteils an Harnsäure allein.

Die Erfindung bezieht sich auf einen Indikator zur quantitativen Analyse von Lösungen, die reduzierende oder oxydierende Substanzen enthalten, mit Ausnahme von Harnsäure enthaltenden Essigsäurelösungen und von alkalischen glukosehaltigen Carbonat-Blut-Filtraten. Ferner befaßt sich die Erfindung mit einem Verfahren zur Herstellung des Indikators sowie mit der Verwendung des Indikators.
Verfahren zur Bestimmung des Bluttraubenzuckers

ίο sind etwa seit 1920 bekannt, als F ο I i η und Wu ein laboratoriumsreifes Verfahren entwickelten, welches eines der gebräuchlichsten chemischen Verfahren bei klinischen Versuchen geworden ist. Den wesentlichsten Beitrag zur Traubenzuckerbestimmung in Körperflüssigkeiten liefert dieses Verfahren durch den Nachweis, daß Monosaccharide die Fähigkeit besitzen, gewisse Metallionen in heißen alkalischen Lösungen zu reduzieren und daß die Reduktion mit einer derartigen Genauigkeit gesteuert werden kann, daß diese Eigenschaft der Monosaccharide auch medizinisch und industriell verwertbar ist.

Obwohl nachweislich' auch andere Metallionen durch Traubenzucker reduziert werden können, werden für diesen Zweck am häufigsten zweiwertige Kupferionen verwendet, wie sich aus den vielen bekannten Varianten des ursprünglichen Verfahrens ergibt. Den meisten Varianten liegt die Hauptaufgabe zugrunde, ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Traubenzucker zu entwickeln, das für Traubenzucker spezifischer ist und eine größere Stabilität der Reagenzien und der abschließenden Farbreaktion ergibt. Andere Varianten des ursprünglichen Verfahrens stellen einen Versuch dar, ein bei diesem Verfahren notwendiges, mit einer Einengung versehenes, Prüfrohr unnötig zu machen, das bei den ersten Traubenzuckeranalysen zur Steuerung der Reoxydation des Kupfers diente.

Bisher ist man bei der Traubenzuckeranalyse immer vor das Problem gestellt, das Kupfer in Lösung zu halten und die Reoxydation des Kupfers zu vermeiden. Hierzu ist es üblich, zusammen mit dem Kupfer ein Tartrat und/oder Sulfat und andere Reagenzien in Lösung zu bringen.

Es ist jedoch auch schon vorgeschlagen worden, das reduzierte Kupfer, ähnlich wie bei einigen der bis dahin verwendeten Stoffe, in einer alkalischen Tartratlösung, die Sulfationen enthält, mit einer Phenanthrolinverbindung zu komplexieren. Diese Verfahrensweise ist in einer Veröffentlichung von Mayo E.

B r ο w n, M. S., in der Zeitschrift »The Journal of the American Diabetes Association«, Januar/Februar 1961, Bd. 10, Nr. 1, S. 60 bis 62, beschrieben. Danach wird der alkalischen Kupfertartratlösung ununterscheidbar ein Komplexbildner für das Kupfer zugesetzt. Es ergibt sich, daß wegen der Gegenwart des Tartrats und wegen eines Überschusses an Kupfer(II)-Ionen nicht alle Kupfer(II)-Ionen an den Komplexbildner gebunden werden.

Ein Überschuß an Kupfer(Il)-Ionen und/oder die Gegenwart von Tartrationen und/oder die Gegenwart von Chlorionen verursachen eine Reoxydation der Kupfer(il)-Ionen während des primären Reduktionsschrittes. Folglich kann trotz der unternommenen Anstrengungen zur Unterdrückung der Reoxydation kein gewöhnliches Prüfrohr verwendet werden. Statt dessen sind mit einer Einengung versehene Prüfrohre, die beim Kopfpunkt betrieben werden, und/oder die Gegenwart von Sulfationen notwendig. Trotz aller Vor-