DE2327894C3 - Verfahren zur Verminderung der Trübung in einer Serum- oder Plasmaprobe - Google Patents

Description

CH₃(CH₂)J₀ ~ C — O — (CH₈ — CH₈ — O)_nH

Il

O

worin η eine ganze Zahl von 9 bis 20 ist, vermischt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vermischen bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 60,5⁰C und insbeson- a» dere bei 37° C durchgeführt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die poiyoxyäthylierte Laurinsäureverbindung in Form einer Pufferlösung mit einem pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 11, als as wäßrige Lösung oder als Salzlösung eingesetzt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die poiyoxyäthylierte Laurinsäure in einer Menge verwendet wird, die etwa 0,5 bis etwa 20 Volumprozent und insbesondere 10 Volumprozent der gesamten Gemischmenge ausmacht.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine poiyoxyäthylierte Laurinsäureverbindung der Formel

Il

CH₃(CHi)₁₀ - C — O — (CH₂ — CH₂ — O —)₁₄H verwendet.

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45

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Verringerung der Trübung in einer Serum- oder Plasmaprobe für die Analyse durch Vermischen der Probe mit einem nichtionischem Netzmittel.

Das Vorhandensein erhöhter Konzentrationen an Enzymen und anderen Materialien im menschlichen und tierischen Blut ist häufig ein Anzeichen für bestimmte Funktionsstörungen und andere abnorme Zustände. Beispielsweise ist die erhöhte Konzentration an Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) ein wichtiger Hinweis auf den Zustand von Patienten mit schweren Herzschädigungen. Daher ist die Bestimmung der Aktivität dieses Enzyms im Körper ein wichtiges diagnostisches Hilfsmittel für den Mediziner.

Wenn eine Schädigung des Herzmuskels stattgefunden hat oder stattfindet, so zeigt dies in einer Erhöhung der GOT-Konzentrationen. Erhöhte GOT-Konzentrationen signalisieren aber nicht nur Herzstörungen, sondern auch die Möglichkeit schwerer Leberdisfunktionen, wie beispielsweise Zirrhose, Leberkrebs oder Hepatitis.

In ähnlicher Weise ist die erhöhte Konzentration an Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) kennzeichnend für die beschriebenen Leberdisfunktionen. Demzufolge kann die Prognose und auch die Ursache von Lebererkrankungen durch eine genaue GPT-Bestimmung ermittelt werden.

Bei den genannten Bestimmungen wird die erforderliche physikalische Messung wie bei vielen anderen Bestimmungen fotometrisch mit einem Kolorimeter durchgeführt.

Da die fotometrische Analyse von dem Prinzip der Lichtstreuung abhängt, ergibt sich für den Fall, daß eine Probe Verunreinigungen enthält, die die Lichtstreuungsmessungen kompensieren, daß die erhaltene Bestimmung der optischen Dichte und damit das Analysenergebnis verfälscht ist.

Die größte Fehlerquelle für die Messung der Lichtstreuung liegt in der Trübung innerhalb der Blutprobe. Ganz allgemein ist die Trübung im Serum und im Plasma auf die Anwesenheit von Lipiden zurückzuführen, die hauptsächlich aus Triglyceriden bestehen. Mit steigender Trübung steigt auch die optische Dichte an und führt zu einem fragwürdigen Meßergebnis.

Da gegenwärtig höchst komplizierte diagnostische Bestimmungen in einem kontinuierlichen Probenstrom durchgeführt werden, kumuliert sich außerdem die nachteilige Wirkung der Trübung durch Übertragung von Verunreinigungen, das sogenannte »carry over«. Eine derartige Übertragung von Verunreinigungen tritt auf, wenn eine stark trübe Probe eine dünne, jedoch nicht vernachlässigbare Schicht von Verunreinigungen im Röhrensystem der analytischen Vorrichtung ablagert. Die nächste Probe, die durch das Röhrensystem hindurchtritt, wird durch diese Schicht beeinflußt und die Ablesung ungenau.

Bisher hat man das Problem der Probentrübung gewöhnlich durch Verdünnungsmaßnahmen gemildert. Dies bedeutet, daß der Probe ein Verdünnungsmittel zugesetzt werden mußte, um die Trübung so weit zu verringern, daß die Analyse durchgeführt werden konnte. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens liegt in der Subjektivität, mit der es ausgeführt wird. Der als ausreichend angesehene Betrag wird allein der Entscheidung eines Menschen überlassen, was für eine diagnostische Untersuchung von äußerst zweifelhaftem Wert ist. Ein weiterer Nachteil der Verdünnungstechnik hängt mit dem aufgezeichneten Ergebnis zusammen. Eine Überverdünnung führt nämlich zu einem Ergebnis, das zwar allgemein befriedigend ist, jedoch Abweichungen zu viel Raum läßt, und es kann eine rechtzeitige Standardisierung erforderlich sein.

Zur Verringerung der Trübung in Blutproben sind auch schon chemische Substanzen verwendet worden, wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat, Alkylarylpolyätheralkohole, Sulfonate und Sulfate sowie Polyoxyäthylenderivate von partiellen Estern von Hexitanhydriden mit Fettsäuren. Diese Stoffe sind jedoch in ihrer Wirkung nicht ausreichend.

Weiter ist aus der Literaturstelle H. U. Bergmeyer, 2. Auflage 1970, Band 1 S. 547 bis 549 und 759 bis 763, die Verwendung, von polyäthoxyliertem Laurinalkohol zur Trübungsverminderung in Blutproben bekannt. Wie jedoch die im Anschluß an die Beispiele aufgeführten Vergleichsversuche zeigen, sind auch diese polymeren Substanzen in ihrer trübungs-

senkenden Wirkung nicht zufriedenstellend, obwohl Die Analyse von GOT, GPT, LDH, Hämoglobin,

sie strukturell den erfindungsgemäß eingesetzten nahe- Albumin und Bilirubin wird in praktisch neutralen

stehen. Lösungen durchgeführt

Aufgabe der Erfindung ist daher die Beseitigung Das Vermischen von Probe und polyoxyäthylierter oder beträchtliche Verringerung der Trübung in Blut- 5 Laurinsäure wird gewöhnlich in einem Temperaturproben, so daß genaue Analysen ermöglicht werden bereich von 20 bis etwa 6O,5°C durchgeführt, wobei und eine unerwünschte Übertragung von Verunreini- eine Temperatur von 37° C bevorzugt wird,
gungen vermieden wird. Die Proben, in denen die Trübung nach dem erfin-

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der ein- dungsgemäßen Verfahren praktisch beseitigt worden

gangs genannten Art dadurch gelöst, daß man die « ist, lassen sich der spektrofotometrischen Analyse

Probe mit einer polyoxyäthylierten Laurinsäurever- unterwerfen,
bindung der Formel

Beispiel I

— C — O — (CH, — CH₁ — O)»H 15 0,2 ml einer trüben Serumprobe wurden mit 3,0 ml

I einer lOvolumprozentigen Lösung von polyoxyäthy-

O lierter Laurinsäure (n = 14) in O.lmolarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 vermischt Das Vermischen dauerte etwa 1 min bei einer Temperatur von 37°C,

worin η eine ganze Zahl von 9 bis 20 ist, vermischt ^ao danach wurde die GPT-Aktivität der optisch geklärten

Bevorzugte Durchführungsformen des erfindungs- Probe im Autoanalyzer bestimmt

gemäßen Verfahrens sind dadurch gekennzeichnet, Wurden 0,2 ml der gleichen Serumprobe ohne vor-

daß eine polyoxyäthylierte Laurinsäureverbindung der herige Behandlung analysiert, bewegte sich der

obigen Formel verwendet wird, bei der η 14 ist; eine Schreibstift von der Anzeigefläche auf einen Wert

Mischtemperatur von etwa 37° C eingehalten wird und ^a5 jenseits einer meßbaren Absorption,
die polyoxyäthylierte Laurinsäureverbindung in Form

einer wäßrigen, salzhaltigen oder Pufferlösung züge- Beispiel II
setzt wird, wobei ihre Menge im Bereich von etwa 0,5

bis etwa 20 Volumprozent und insbesondere 10 Vo- Das Verfahren gemäß Beispiel I wurde mit vergleich-

lumprozent des Gesamtgemisches liegt 3° baren Ergebnissen für die GOT-Bestimmung wieder-

Die Bestimmung von Enzymen, wie GOT und GPT, holt
in Blutproben bedient sich mit Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verringerung der Trübung. Beispiel III

Außer GPT und GOT können andere Enzyme oder

Substanzen, wie Hämoglobin, Albumin, Protein, 35 Das Verfahren von Beispiel I wurde mit einer trüben

Bilirubin, Lactatdehydrogenase, alkalische und saure Plasmaprobe mit vergleichbaren Ergebnissen wieder-

Phosphatase, die kolorimetrisch bestimmbar sind, holt.

nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in Proben Beispiel IV
bestimmt werden.

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah- *° Das Verfahren gemäß Beispiel I wurde mit der Abrens wird nach dem Vermischen der Blutprobe mit der weichung wiederholt, daß die polyoxyäthylierte Lauobengenannten polyoxyäthylierten Laurinsäurekompo- rinsäure (n — 14) in Form einer Salzlösung vorlag, nente anschließend zweckmäßigerweise gerührt, bis Es wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt,
die Probe optisch klargeworden ist; dies geschieht
in einer äußerst geringen Zeit. 45

Wie bereits erwähnt, ist die Trübung das Ergebnis Vergleichsversuche
einer Anhäufung von Lipiden, hauptsächlich von

Triglyceriden. Wegen der dadurch hervorgerufenen Bei Vergleichsversuchen zwischen den anmeldungs-

Lichtundurchlässigkeit eignet sich die Probe nicht für gemäß verwendeten polyäihoxylierten Laurinsäure-

kolorimetrische Bestimmungen, da das gemessene 5<> Verbindungen und dem aus der obenerwähnten Lite-

Ergebnis unbrauchbar ist, wenn die Trübung nicht raturstelle bekannten Produkt »Brij 35<i (polyäthoxy-

beseitigt wurde. lierte Laurinalkohole) sowie einem weiteren, aus der

Die normalerweise analysierten Blutproben sind US-PS 32 60 648 bekannten ungesättigten Produkt

entweder Serum- oder Plasmaproben. wurde derart vorgegangen, daß zunächst das Spektro-

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwen- 55 fotometer mit Luft bei 340 nm auf 0 eingestellt,

dete polyoxyäthylierte Laurinsäure kann in Form danach in die Küvette eine bestimmte Menge des zu

einer wäßrigen Lösung, einer Salzlösung oder einer untersuchenden Trübungsverringerers (angegeben in

Pufferlösung mit einem pH-Wert von 3,5 bis 11 vor- Volumprozent) einpipeticrt und die dadurch erhaltene

liegen. Im allgemeinen beträgt der pH-Wert der ge- Absorption abgelesen, daß drittens jeweils eine Menge

pufferten Lösung etwa 7, da bei diesem pH-Wert die ⁶° von 2,0 ml stark trüben Serumgemisches zugegeben

meisten Analysen durchgeführt werden. Wenn jedoch und unmittelbar darauf bei der Zeit / = 0 die Absorp-

die Analyse einen sauren pH-Wert verlangt, wie bei tion abgelesen und schließlich nach 5 min (/ = 5)

der Bestimmung der sauren Phosphase, wird ein saurer erneut die Absorption abgelesen wurde.

Puffer, wie Citrat oder Phosphat, verwendet. Wenn Die Ergebnisse für die Versuchsmaterialien gemäß

andererseits ein basischer pH-Wert erforderlich ist, ⁶5 dem Stand der Technik und zwei der Verbindungen,

wie bei der Bestimmung der alkalischen Phosphatase, wie sie anmeldungsgemäß verwendet werden (n = 9

wird ein basischer Puffer, wie Koffein oder 2-Amino- und η = 14), sind in der folgenden Tabelle zusammen-

2-methylpropanol, verwendet. gestellt:

(A) Brij 35

CH_s(Ct?i)ii — O — (CH₁ — CH, —

(B) Polyoxyäthylierte Laurinsäure (9 METO)
CH₃(CHj)₁₀ — C - O — (CH₁ — CH₁O)^i

Konzen- Absorptionen

tration des &s reinen der Ssrumprobe

Versuchs- Versuchs- zur Zeit

materials Materials in Volumprozent I = O

1 = 5 min %Änderung

3,0 0,048 1,319 1,307 — 1

1,0 1,757 - 1,776 ·)

(C) Polyoxyäthyüerte Laurinsäure (14 METO)
CH₈(CHj)₁₀ — C — O — (CH₁CH₁ — O)₁₄H

Il

0,070

— 0,132

= CH(CHi)₇C-O(CH₁CH₁-O)₉H 0,2

Il

1,22

1,84 180,

— 2

nach US-PS 32 60 648

*) Anmeikung für die Tabelle: Für die Substanz Brij 35 betrug die Verringerung der Tiübung 1%. Für die Verbindungen B und C war die Verringerung zur Zeit / = 0 trotz ihres Einsatzes mit geringeren Konzentrationen derart rasch erfolgt, d. n., die Absorption hatte derartig schnell abgenommen, daß zur Zeit ι = ii eine genaue Messung nicht vorgenommen werden konnte. Man erkennt aber zumindestens bei der Substanz B, daß die Absorption nach / = 5 min seit Zugabe der Serumprobe fast den gleichen niedrigen Wert besaß wie die Absorption des reinen Versuchsmaterials vor Zugabe des trüben Serums. Für die Probe C ergab eine kompliziertere Messung eine Trübungsänderung von —86,3%.

Als Serum wurde in sämtlichen Fällen eine Probe der gleichen Serumcharge von auf Grund von Hyperlipidämie getrübtem Serum verwendet

Aus den Versuchen ergibt sich, daß die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen trotz Einsatzes in geringsren Konzentrationen die Trübung einer Serumprobe wesentlich rascher und vollständiger verringern als sowohl die als Vergleichssubstanz herangezogene Verbindung Brij 35 wie auch mehr als 100 weitere untersuchte Verbindungen, darunter auch die als Verbindung D in der Tabelle angeführte Verbindung gemäß der US-PS 32 60 648, bei der die höchstkonzentrierte brauchbare Lösung wegen der starken Eigentrübung des Präparats nur 0,2 Volumprozent betrug, was jedoch dadurch korrigiert wurde, daß nur 0,2 ml getrübtes Serum zugegeben wurden.

Sämtliche Versuche wurden bei 37_V5°C in einer O.lmolaren Phosphatpufferlösung vom pH = 7,4 durchgeführt.

Beispiel V

Das Verfahren gemäß Beispiel I wurde mit der Abweichung wiederholt, daß statt der polyoxyäthylierten Laurinsäure mit η = 14 analoge Verbindungen mit « = 9 und η = 20 verwendet wurden. Es wurden vergleichbare Ergebnisse erhalten.

35 B e i s ρ i e 1 VI

Das Verfahren gemäß Beispiel I wurde mit der Abweichung wiederholt, daß das Vermischen bei 30 bzw. 45° C durchgeführt wurde.

Beispiel VII

Eine trübe Serumprobe, die auf alkalische Phosphatase hin analysiert werden sollte, wurde praktisch so behandelt, wie in Beispiel I beschrieben, mit der Abweichung, daß statt des Phosphatpuffers ein Aminomethylpropanolpuffer verwendet wurde, der einen pH-Wert von 10,25 herstellte.

Beispiel VIII

50 Eine trübe Serumprobe, die auf saure Phosphatase hin analysiert werden sollte, wurde im wesentlichen, wie in Beispiel I beschrieben, behandelt, mit der Abweichung, daß statt des Phosphatpuffers ein Citratpuffer, der einen pH-Wert von 6,0 ergab, verwendet wurde.

Claims (1)

Pateltansprüche:

1. Verfahren zur Verringerung der Trübung in einer Serum- oder Plasmaprobe für die Analyse durch Vermischen der Probe mit einem nichtionischen Netzmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit einer polyoxyäthylierten Laurinsäureverbindung der Formel