DE3920364C2

DE3920364C2 -

Info

Publication number: DE3920364C2
Application number: DE3920364A
Authority: DE
Inventors: Klaus 6368 Bad Vilbel De Begemann
Original assignee: Technicon 6368 Bad Vilbel De GmbH
Current assignee: Technicon 6368 Bad Vilbel De GmbH
Priority date: 1989-06-22
Filing date: 1989-06-22
Publication date: 1993-04-29
Also published as: CA2019612A1; DK152690A; AU5777790A; JPH0335166A; DE3920364A1; DK152690D0; DK151190D0; IL94168A0; EP0404590A3; EP0404590A2; IL94846A0

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie ein Reagenz zur Verhinderung von Trübungen in Serum-, Plasma- und Liquor-Proben in der klinischen Chemie, insbesondere in Proben mit extremen Eiweiß- Konzentrationen und -Zusammensetzungen.

In der klinischen Chemie wird normalerweise mit Serum- und/oder Plasma-Proben gearbeitet. Das am häufigsten eingesetzte Meßverfahren ist die Photometrie. Bekanntermaßen werden photometrische Messungen durch Trübungen gestört. Trübungen können durch Ausfällungen von Proteinen in der Probe entstehen.

Die meisten Proteine sind amphotere Elektrolyte. Soweit sie löslich sind, bilden sie kolloidale Lösungen, aus denen man die Proteine mit Neutralsalzen ausfällen kann. Das ausgefallene Kolloid ist resolubel. Die Löslichkeit der Proteine ist sowohl von der Wasserstoffionenkonzentration als auch vom Salzgehalt der Lösung abhängig; am isoelektrischen Punkt ist sie am geringsten. Bei niedrigen pH-Werten, wie sie für manche photometrischen Bestimmungen zur Erzielung einer gut meßbaren Färbung erforderlich sind, werden Proteine häufig irreversibel denaturiert. Die dabei entstehenden Kolloide bewirken je nach Konzentration und Art der denaturierten Proteine unterschiedliche, die Messung verfälschende Extinktionsveränderungen bei der Meßwellenlänge.

Um derartige Störungen zu vermeiden, hat man vor Durchführung der photometrischen Messung die Proteine ausgefällt und abgetrennt (Anal. Biochem. 40, 450 (1971)). Dieses Vorgehen ist jedoch aufwendig und für automatisierten Betrieb ungeeignet.

Verfahren zur Verminderung bzw. Beseitigung von Trübungen ohne Ausfällung und ohne Abtrennung sind für Trübungen bekannt, die durch die Anwesenheit von Lipiden hervorgerufen werden. Hierfür werden den Serum- oder Plasmaproben Detergenzien zugesetzt, wie polyoxyäthylierte Laurinsäure (DE-OS 23 27 894) oder andere polyoxyäthylierte Fettsäuren (DE-AS 27 24 757) oder niedrigmolekulare organische Verbindungen, wie Ester Amine, in Kombination mit Detergenzien (DE-PS 28 16 229).

Lipide und Lipoproteine werden auch als Verursacher von Trübungen angesehen, die in Kontroll- bzw. Eichseren bei deren Rekonstitution nach vorheriger Lyophilisierung auftreten. Zur Beseitigung derartiger Trübungen ist es bekannt, den Seren vor der Lyophilisierung Protein und gegebenenfalls Natriumdesoxycholat (DE-OS 33 29 952) oder eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe Methanol, Natriumacetat, Triäthanolammoniumacetat, Tetramethyldiäthylen- ammoniumdiacetat, Natriumpropionat, Natriumlactat, Alanin, Natrium-2,2-bis(hydroxymethyl)-propionat, N-Methyldiäthanolammonium- 2,2-bis(hydroxymethyl)-propionat, 2,2- (Bishydroxymethyl)-propionsäureamid, Natrium-2-hydroxy- 2-methylbutyrat, Valin, 2-Methyläthanol, Triäthylenglykol, Tetraäthylenglykol und Tetramethylammoniumacetat (DE-OS 31 07 060) zuzusetzen.

Es sind auch schon einige Verfahren bekannt, mit denen die durch Proteine erzeugten Trübungen durch Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln ohne Abtrennung der Proteine vermieden werden (DE-PS 29 43 423; Clin. Chem. 30, 975 (1984)).

Auch aus der DE-OS 37 32 688 ist ein Verfahren zur Fructosaminbestimmung in Serum bekannt, bei dem zur Beseitigung trübungsverursachender Probenbestandteile, unter anderem von Proteinen, die Probe bei ungefähr neutralem pH-Wert mit einer Lösung inkubiert wird, die oxidierend wirkende sowie lipidspaltende Enzyme, SH-Gruppen blockierende Substanzen, Detergenzien und/oder Salze starker Säuren in einem nichtreduzierenden Puffer enthält.

Diese Verfahren versagen jedoch bei den meisten Plasmaproben und bei Proben mit extremen Eiweiß-Konzentrationen und -Zusammensetzungen. Auch können bei Bestimmungen mit einem sehr hohen Probenvolumen an sich schwache Trübungen gegenüber der photometrischen Reaktion einen beachtlichen Anteil einer Gesamtextinktion ergeben und damit die gesamte Messung stören. Es gibt auf dem Markt einige Analysensysteme, die mit festen Verhältnissen von Probenvolumen/Reagenzvolumen arbeiten und daher störempfindlich sein können.

Außerdem gibt es Analysensysteme, die aufgrund des Strahlenganges des Photometers empfindlicher auf Trübungen reagieren als die meisten anderen Systeme.

Trübungen durch Eiweißausfällungen treten bei selten vorkommenden Krankheiten, z. B. Plasmazytose, und in Plasmaproben regelmäßig auf. Diese Eiweiße werden auch als Paraproteine bezeichnet. Das Problem der Trübungen hat sich ferner bei der Einführung eines neuen Analysensystems, das nach dem Prinzip der Kapselchemie (Capsule Chemistry Technology for High Speed Clinical Chemistry Analyses - Firmenschrift Technicon Instruments Corporation, Tarrytown, N. Y. 1985) arbeitet, gehäuft gezeigt.

Bei diesem Verfahren werden Probe und Reagenz mit einem Inertflüssigkeitsfilm ummantelt und in dieser Form in einer Leitung zu Inkubations-, Misch-, Reaktions- und Meßstationen transportiert. Dieses System ist gegenüber Trübungen besonders empfindlich. Als Grund wird der optische Strahlengang und die sehr kleine Schichtdicke der Zylinderküvetten des Photometers angenommen (Diplomarbeit M. Schmidt, Fachhochschule Frankfurt/Main, 1988 "Modellrechnungen an Zylinderküvetten"). Das Problem der Störungen durch Trübungen hat sich an diesem System vor allem bei Methoden mit niedriger Farbextinktion gezeigt (z. B. bei der kolorimetrischen Eisenbestimmung).

Bei dieser kolorimetrischen Eisenbestimmung ist es bekannt, Harnstoff oder seine Derivate, wie Guanidin, zur Freisetzung des Eisens vom Serumtransferrin zu verwenden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei allen Analysenverfahren, vor allem bei solchen, die nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses (S. Amer. J. Clin. Path. 28, 311 bis 322 (1957)) und der Kapselchemie arbeiten und bei denen extreme Eiweißkonzentrationen und Eiweißzusammensetzungen in der Probe vorliegen, das Auftreten von Trübungen zu verhindern, ohne daß das Protein vor der Durchführung der Analyse aus der Probe entfernt werden muß.

Diese Aufgabe wird durch das in Anspruch 3 gekennzeichnete Verfahren sowie das in Anspruch 3 angegebene Reagenz gelöst.

Die Erfindung fußt auf folgender Erkenntnis: Werden Serum- oder Plasmaproben in mit Detergenzien versetzten Lösungen von Harnstoff oder Harnstoffderivaten mit einem Eiweißfällungsmittel, wie Trichloressigsäure, Perchlorsäure oder Uranylacetat, versetzt, so entstehen keine Trübungen, d. h. die Eiweißfällungsmittel fällen kein Eiweiß aus.

Als Erklärung für diese Erscheinung bietet sich folgende Überlegung an: Strukturell bestehen die Proteine aus mehreren, zum Teil identischen Peptidketten, die jeweils bis zu einigen Hundert Aminosäuren enthalten. Innerhalb der Proteinmoleküle werden die einzelnen Peptidketten durch Disulfidbrücken, Wasserstoffbindungen oder Ionen-Bindungen (zwischen sauren und basischen Aminosäureseitenketten) zusammengehalten. Aufgrund der Denaturierung des Proteins durch den Harnstoff oder die Harnstoffderivate in Gegenwart oberflächenaktiver Mittel erfolgt eine Änderung der Struktur, so daß im sauren Medium oder mit Eiweißfällungsmitteln keine Trübung entstehen kann. Es werden die Peptidketten entfaltet, vorhandene Disulfidbrücken und Ionen-Bindungen zum Teil gespalten und anhaftende Elektrolyte als Ionen abgespalten. Durch dieses Verfahren bleiben die im Untersuchungsmaterial enthaltenen Proteine durch strukturelle Veränderungen der Eiweißmoleküle molekulardispers verteilt.

Als oberflächenaktive Mittel werden vorzugsweise solche verwendet, die bereits für die biochemische Analyse bekannt sind, wie Ethoxylate des 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)- phenols (z. B. Triton X-100®) oder Benzyltrimethylammoniumhydroxid (z. B. Triton B®). Es können aber auch andere Tenside, wie p-tert. Oktyl-phenoxy-polyethoxy- ethanol, Polyoxyethylenether von Laurylalkohol, Polyethylen-sorbitan-monolaurat, Polyoxyethylen-14-laurat oder Polyethylen-sorbitan-monopalmitat verwendet werden.

Als Harnstoffderivate kommen insbesondere Thioharnstoff und Guanidin (Iminoharnstoff) und dessen Säureadditionssalze in Betracht. Ein weiteres verwendbares Harnstoffderivat ist Methylharnstoff.

Die erfindungswesentliche Kombination von Harnstoff bzw. Harnstoffderivaten einerseits und oberflächenaktiven Mittel andererseits wird der zu untersuchenden Serum- oder Plasmaprobe zweckmäßigerweise in Form eines fertigen Reagenzgemisches zugesetzt, das vorteilhafterweise auch weitere, für die jeweilige Bestimmung erforderliche Hilfsstoffe und/oder Reagenzien enthält.

Beispielsweise enthält bei der Eisenbestimmung das fertige Reagenzgemisch außerdem ein Reduktionsmittel, wie Hydroxylamin, Ascorbinsäure oder Thioglykolsäure, ein Maskierungsmittel für Kupfer, wie Thiosemicarbazid oder 2,9-Dimethyl-1,10-phenanthrolin (Neocuproin), und ggf. einen Puffer, wie Natriumacetat. Bei der Phosphat- und Chloridbestimmung erfolgt ein Säurezusatz zu dem Gemisch aus Harnstoffderivat und Tensid.

Harnstoff bzw. Harnstoffderivate werden in einer Endkonzentration von 1,0 bis 5,0 Mol/l eingesetzt.

Netzmittel werden in einer Endkonzentration von 10 bis 50 g/l eingesetzt.

Das Volumenverhältnis von Probe zu Reagenz beträgt etwa 1 : 10 bis 1 : 20, vorzugsweise etwa 1 : 14.

Die kolorimetrische Bestimmung kann erfolgen, indem man in bekannter Weise mit einem Gemisch aus einem Teil der Probe und des obenerwähnten Reagenzgemisches (Leerwertreagenz) den Leerwert an dem automatischen Analysiergerät ermittelt und den anderen Teil der Probe mit einem eine kolorimetrisch meßbare Färbung ergebenden Reagenz (Farbreagenz), gelöst im Leerwertreagenz, versetzt und die Absorption bzw. Extinktion dieses Gemisches bestimmt, von der der Leerwert abgezogen wird. So wird beispielsweise bei der Eisenbestimmung mit einem Triazinderivat, wie "Ferene S" oder "Ferrozin", und der Chloridbestimmung mit Eisen(III)nitrat vorgegangen. Das Farbreagenz kann in anderen Fällen, beispielsweise bei der kolorimetrischen Phosphat- oder Albuminbestimmung, auch von vornherein im Gemisch mit dem oberflächenaktiven Mittel und dem Harnstoff bzw. Harnstoffderivat und ggf. den Hilfsstoffen und/oder anderen Reagenzien der Probe zugesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann eingesetzt werden bei der Bestimmung der Konzentration von Bestandteilen von Serum-, Plasma- und Liquorproben mit manuellen Analysenverfahren sowie an diskreten Analysensystemen (Haeckel: Rationalisierung des medizinischen Laboratoriums, Seite 136 bis 162 (1979)), Analysensystemen nach dem Continuous-flow-Verfahren und Analysensystemen nach dem Verfahren der Kapselchemie.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 Bestimmung der Eisenkonzentration in Serum- und Heparin- Plasmaproben Herstellen der Reagenzien Reagenz 1 (Leerwertreagenz)

108 g Iminoharnstoff · HCl werden in 200 ml bidestilliertem Wasser gelöst. Nachdem sich der Iminoharnstoff gelöst hat und die Lösung Raumtemperatur erreicht hat, werden
8 g Hydroxylamin · HCl,
104 mg Neocuproin,
6,25 g Triton X-100® zugegeben und vollständig aufgelöst. Danach wird mit 0,1 N Natronlauge auf pH 4,5 eingestellt und auf 250 ml mit bidestilliertem Wasser aufgefüllt.

Reagenz 2 (Farbreagenz)

10 mg Ferene S werden in 10 ml Reagenz 1 (Leerwertreagenz) gelöst.

Die Eisenbestimmung ist mit dem automatischen Analysiergerät "TECHNICON CHEM 1" durchgeführt worden. Als Untersuchungsmaterial wurden Plasmaproben mit hoch pathologischen Eiweißfraktionen und Eiweißkonzentrationen von über 8,5 g/dl eingesetzt. Trotzdem wurden exakte Eisenwerte gemessen, wie sich durch folgenden Vergleich mit manuell ermittelten Werten ergibt:

Die manuelle Bestimmungsmethode wurde wie folgt durchgeführt:

400 µl der Plasmaprobe wurden mit
200 µl 1,0 N-Salzsäure versetzt und das Ganze vermischt und 20 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Gemisch wurde mit
200 µl Trichloressigsäure (1,2 Mol/l) gefällt. Der Niederschlag wurde mit einem Glasstab verteilt und 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert.

Leerwert, Standard und Überstand wurden nach folgendem Schema pipettiert

Nach dem Vermischen wurden Extinktion der Probe (E_Probe) und Extinktion des Standards (E_Standard) bei 600 nm in einer 1-cm-Küvette gegen den Leerwert gemessen.

Beispiel 2 Bestimmung der Phosphatkonzentrationen in Serum- und Heparin-Plasmaproben Reagenzherstellung

25 g Thioharnstoff werden in 200 ml bidestilliertem Wasser gelöst. Nachdem die Lösung Raumtemperatur hat, werden darin
87 mg Ammonium-Molybdat (Farbreagenz) gelöst und
7 ml konz. Schwefelsäure (98%) vorsichtig dazugegeben. Anschließend wird noch
6,5 g Triton X-100® darin gelöst und mit bidestilliertem Wasser auf 250 ml aufgefüllt.

Gemessen wurden Plasmaproben mit pathologischen Eiweißfraktionen mit dem TECHNICON-Analysenautomaten RA-XT mit Proben-Blank. Als Proben-Leerwertreagenz wurde 0,9%ige Kochsalzlösung mit Wetting Agent W eingesetzt.

Beispiel 3 Bestimmung der Albuminkonzentration in Serum und Heparin- Plasmaproben Reagenzherstellung

75 g Harnstoff werden in 200 ml bidestilliertem Wasser gelöst. Nachdem die Lösung Zimmertemperatur hat, wird
50 mg Bromkresolgrün (Farbreagenz) und
6,25 g Triton X-100® hintereinander gelöst. Der pH-Wert wird auf 4,2 eingestellt und auf 250 ml mit bidestilliertem Wasser aufgefüllt.

Gemessen wurden Plasmaproben mit pathologischen Eiweißfraktionen mit dem TECHNICON-Analysenautomaten RA-100.

Claims

1. Verfahren zur Verhinderung von Trübungen in Serum-, Plasma- oder Liquorproben durch Zusatz von oberflächenaktiven Mitteln zu der Probe, dadurch gekennzeichnet, daß der Probe außerdem Harnstoff oder ein Harnstoffderivat zugesetzt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Harnstoffderivat Guanidin oder ein Säureadditionssalz davon ist.

3. Reagenz zur Verhinderung von Trübungen in Serum-, Plasma- oder Liquorproben, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einem oberflächenaktiven Mittel und Harnstoff oder einem Harnstoffderivat besteht.

4. Reagenz gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem Hilfsstoffe enthält.

5. Reagenz nach Anspruch 4 zur kolorimetrischen Direktbestimmung von Eisen, dadurch gekennzeichnet, daß es als Harnstoffderivat Guanidiniumchlorid und als Hilfsstoffe ein Reduktionsmittel, ein Kupfermaskierungsmittel, einen Puffer und ein Triazinderivat enthält.

6. Reagenz nach Anspruch 4 zur kolorimetrischen Direktbestimmung von Phosphat, dadurch gekennzeichnet, daß es als Harnstoffderivat Thioharnstoff und als Hilfsstoffe Schwefelsäure sowie Ammoniummolybdat enthält.

7. Reagenz nach Anspruch 4 zur kolorimetrischen Direktbestimmung von Albumin, dadurch gekennzeichnet, daß es als Hilfsstoff Bromkresolgrün enthält.

8. Verwendung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 oder 2 bei Analysen zur Bestimmung der Konzentration von Bestandteilen in Serum-, Plasma- oder Liquorproben.