DE69909238T2

DE69909238T2 - Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Bilirubinen

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Publication number: DE69909238T2
Application number: DE69909238T
Authority: DE
Inventors: Mohammad Zouheir Dr. Habbal
Original assignee: HABBAL MOHAMMAD ZOUHEIR
Current assignee: HABBAL MOHAMMAD ZOUHEIR
Priority date: 1999-04-21
Filing date: 1999-04-21
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2019-04-22
Also published as: EP1046914B1; EP1046914A1; ATE244410T1; DE69909238D1; ES2202959T3; WO2000065359A1; AU3573400A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Bestimmung von Bilirubinen in biologischen Sera, insbesondere ein neues Reagenz als Beschleuniger und eine neue Reagenzienzusammensetzung, beide für die Verwendung bei derartigen Bilirubin-Bestimmungen.
Es sind bereits verschiedene Verfahren für die Bestimmung von Bilirubinen bekannt, welche auf deren Reaktion mit Diazoverbindungen beruhen. Das Diazo-Verfahren liefert einen einzelnen Wert für die Gesamt-Bilirubin-Konzentration (TBR) in einer Probe und, bei bestimmten Modifikationen, wird ein zusätzlicher, kleinerer Wert erhalten, welcher der Konzentration der stärker löslichen Bilirubin-Ester oder – Konjugate, auch als direkte Bilirubine (DBR) bekannt, entspricht. Eines der bekann ten Verfahren ist das von Doumas et al. (Clin. Chem. 31, 1779–1789, 1985), bei welchem Koffein als Beschleuniger der Diazotierungsreaktion, der wegen der langsamen Reaktion des unkonjugierten Bilirubins notwendig ist, verwendet wird. Jedoch besitzt Koffein Nachteile, und zwar reduziert es den molaren Extinktionskoeffizienten von Azo-Pigmenten und reagiert mit dem Diazo-Derivat, Unter Bildung eines gelben Chromophors. Weiterhin haben alle diese Verfahren verschiedene Mängel und zwar die Umsetzbarkeit der Automatisierung, die komplexe Natur des Beschleunigers und der alkalischen Reagenzien und vor allem die Empfindlichkeit für die Interferenz von Hämoglobin, das unter anderen eine gängige Verunreinigung pediatrischer Serum-Proben ist.
Die Verwendung von Zinksulfat bei der Bestimmung von Bilirubin ist aus der EP-A-0 433 977 bekannt, wie auch die Verwendung von Dimethylformamid aus der WO-A-9 904 258 bekannt ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, neue Reagenzien für die Verwendung bei dem Verfahren zur Bestimmung von Bilirubinen bereitzustellen, die nicht die Nachteile und Mängel der bekannten Verfahren zeigen.
Erster Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Reagenz als Beschleuniger zur Verwendung bei der Bestimmung von Bilirubin in biologischen Sera, welcher aus Dimethylformamid besteht.
Zweiter Gegenstand der Erfindung ist eine Reagenzienzusammensetzung für die Verwendung bei der Bestimmung von Bilirubin in biologischen Sera, welche Dimethylformamid, Zinksulfat und 6-Hydroxy-2,5,7,8-Tetramethylchroman-2-carbonsäure umfasst.
Dritter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren für die Bestimmung von Bilirubinen in biologischen Sera, welches das Mischen einer Serum-Probe mit Natriumnitrit und Sulfanilsäure in Anwesenheit einer Reagenzienzusammensetzung, die Dimethylformamid als Beschleuniger der Diazotierungsreaktion und Zinksulfat als Chromophor-Stabilisator und 6-Hydroxy-2,5,7,8-Tetramethylchroman-2-carbonsäure umfasst, dann die Zugabe von 2-Aminoethanol oder einer Mischung aus 2-Aminoethanol und Dimethylformamid, und schließlich die Messung der Extinktion der erhaltenen Mischung, umfasst.
Die erfindungsgemäße Reagenzienzusammensetzung kann die folgende, insbesondere für die Verwendung bei der Bestimmung von Gesamt-Bilirubin; sein: 50 ml Dimethylformamid, 25 mg Zinksulfat und 1,5 ml einer 0,1 M Lösung von 6-Hydroxy-2,5,7,8-Tetramethylchroman-2-carbonsäure, mit Wasser bis auf 100 ml aufgefüllt.
Für die Bestimmung des Gesamt-Bilirubins wird die obige Reagenzienzusammensetzung (7 ml) zu einer Mischung aus 0,075 ml Natriumnitrit (5 g/l), (0,072 mol/l) und 1 ml Sulfanilsäure (hergestellt durch Lösen von 5 g Sulfanilsäure in Wasser, Hinzugeben von 5 ml konzentrierter HCl und Verdünnen mit Wasser auf 1 1) hinzugegeben; dann werden 0,7 ml der obigen Mischung mit 0,02 ml Serum-Probe gemischt und 0,1 ml 2-Aminoethanol hinzugefügt, bevor die Messung der Extinktion bei 600 nm, gegen Wasser, durchgeführt wird.
Die erfindungsgemäße Reagenzienzusammensetzung kann die folgende, insbesondere für die Verwendung bei der Bestimmung von direktem Bilirubin, sein: 12 ml Dimethylformamid, 37,5 mg Zinksulfat und 1 ml einer 0,1 M Lösung von 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure, mit Wasser bis auf 100 ml aufgefüllt.
Für die Bestimmung von direktem Bilirubin wird die obige Reagenzienzusammensetzung (7 ml) zu einer Mischung aus 0,075 ml Natriumnitrit und 1 ml Sulfanilsäure (wie bei der Bestimmung von Gesamt-Bilirubin) hinzugegeben; dann werden 0,35 ml dieser Mischung mit 0,02 ml Serum-Probe gemischt und 0,45 ml einer Mischung aus 7 ml Dimethylformamid und 2 ml 2-Aminoethanol hinzugegeben, bevor die Messung der Extinktion bei 600 nm, gegen Wasser, durchgeführt wird.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren reagiert Bilirubin (Bu, mBc, dBc und Bs) mit diazotierter Sulfanilsäure in Anwesenheit des Beschleunigers (Dimethylformamid) und des Stabilisators (Zinksulfat) unter sehr milden Bedingungen und mit kurzer Reaktionszeit, unter Bildung pinkfarbener Azopigmente. Die Letzteren werden durch die Zugabe des einzigen alkalischen Reagenzes (2-Aminoethanol) in stabile blaue Derivate überführt, wobei die Intensität dieser Derivate zur Quantifizierung verwendet wird.
Weiterhin beseitigt das Vorhandensein des anderen Bestandteils in der Reagenzienzusammensetzung, d. h. 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure, die Interferenz durch Hämoglobin vollständig, indem ein Schutzeffekt für das Bilirubin bereitgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, welche hier natürlich nur als solche gegeben werden, ohne den Umfang der Erfindung einzuschränken, und auf die beiliegenden Zeichnungen, beschrieben.
1 zeigt die Absorption der gebildeten Diazo-Bilirubin-Derivate.
2 zeigt die Extinktion über die Konzentration gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren und gemäß dem Verfahren von Doumas.
3 zeigt die Standard-Kurve des molaren Extinktionskoeffizienten der Bilirubin-Bestimmung unter den Reaktionsbedingungen des vorliegenden Verfahrens.
4 veranschaulicht den Effekt von Trolox auf die Interferenz des Hämoglobins an scheinbaren Bilirubin-Werten.
5 zeigt die entsprechenden erwarteten Werte des Gesamt-Bilirubins verschiedener Proben bei verschiedenen Konzentrationen
6 zeigt die Extinktion über die Konzentration gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren und gemäß dem Verfahren von Jendrassik.
7 veranschaulicht den Effekt von Trolox auf die Interferenz von Hämoglobin auf Bilirubin-Konzentrationen.
8 zeigt die entsprechenden erwarteten Werte des direkten Bilirubins verschiedener Proben bei verschiedenen Konzentrationen.
9 zeigt die Linearität des Verfahrens.
In diesem Beispiel sind die folgenden Ausrüstungsgegenstände, Materialien und Reagenzienarten verwendet worden:

– Geräte: UV 160 U Modell, UV-Visible Registrierspektrophotometer (Shimadzu, JP) und Suprasil (QS) "blackwall" Beckmann Zelle 900 (Beckman Instruments, US); Hitachi 704 automatischer Analysator (Boehringer Mannheim, DE) für den automatisierten Modus.
– Materialien: Bilirubine und Ditaurobilirubine von Calbiochem (La Jolla, CA, US).
– Reagenzien und Standards: Reagenzien analytischer Qualität von Fluka (Buchs, CH); Sera von Patienten ohne Befund (nicht gelbsüchtig, unhämolysiert) und von Patienten mit verschiedenen Störungen des Bilirubin- Metabolismus (sofort nach der Venenpunktion abgetrennt und bei –45°C gelagert).
(1) Reagenzien für Gesamt-Bilirubin:
– Natriumnitrit: 5,0 g/l, jeden Monat frisch zubereitet und bei 4°C aufbewahrt.
– Sulfanilsäure: 5,0 g/l, hergestellt durch Lösen von Sulfanilsäure in Wasser, Hinzufügen von 5,0 ml konzentrierter HCl und Verdünnen auf 1 l mit Wasser; gelagert bei Raumtemperatur.
– Erfindungsgemäße Zusammensetzung: 25,0 mg 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure und 1,5 ml einer 0,1 M Zinksulfat-Lösung werden zu 50,0 ml Dimethylformamid hinzugegeben und das Volumen wird mit entionisiertem Wasser auf 100,0 ml aufgefüllt; die Zusammensetzung kann bei +4°C gelagert werden und sollte verworfen werden, wenn sie entfärbt ist.
– R1-Reagenz: hergestellt durch Mischen von 0,075 ml Natriumnitrit, 1,0 ml Sulfanilsäure, gefolgt von der Zugabe von 7,0 ml der erfindungsgemäßen Zusammensetzung. R1 kann für 24 Stunden bei Raumtemperatur oder 120 Stunden lang bei +4°C verwendet werden.
– R2: alkalisches Reagenz, bestehend aus 2-Aminoethanol.
(2) Reagenzien für direktes Bilirubin:
– Erfindungsgemäße Zusammensetzung: 37,5 mg 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure und 1,0 ml einer 0,1 M Zinksulfat-Lösung werden zu 12,0 ml Dimethylformamid hinzugefügt und das Volumen wird mit entionisiertem Wasser auf 100,0 ml aufgefüllt; die Zusammensetzung kann bei +4 °C gelagert werden und sollte verworfen werden, wenn sie entfärbt ist.
– R1-Reagenz: siehe (1), aber mit obiger erfindungsgemäßer Zusammensetzung.
– R2: alkalisches Reagenz, erhalten durch Mischen von 7,0 ml Dimethylformamid mit 2,0 ml 2-Aminoethanol.
(3) Bilirubin-Standardlösungen: diese wurden durch Lösen einer kleinen Menge Dimethylsulfoxid und 0,1 M Na₂CO₃, gefolgt von der Verdünnung mit 40 g/l Albumin in 0,1 mol/l Tris-Puffer, pH 7,4 oder mit nicht gelbsüchtigem, unhämolysiertem, menschlichem Serum, hergestellt.
(4) Test-Verfahren für nicht-hämolysierte Proben:
A. Für Gesamt-Bilirubin: In einem kleinen Teströhrchen 0,020 ml der Serum-Probe mit 0,700 ml R1 mischen. Nach zwei Minuten 0,1 ml R2 hinzufügen und mischen. Die Extinktion bei 600 nm gegen Wasser messen. Eine Probe eines geeigneten Standards wird genauso behandelt und für die Berechnung verwendet.
B. Für direktes Bilirubin: In einem kleinen Teströhrchen 0,02 ml der Serum-Probe mit 0,350 ml R1 mischen. Nach fünf Minuten 0,450 ml R2 hinzufügen und mischen. Die Extinktion bei 600 nm gegen Wasser messen. Eine Probe eines geeigneten Ditaurobilirubin-Standards wird genauso behandelt und für die Berechnung verwendet.
(5) Test-Verfahren für hämolysierte Proben:
– Die Volumina der Probe und der Reagenzien sind die gleichen wie oben aber es sind die unter "Ergebnisse" dargelegten Gleichungen für die Berechnung zu verwenden.
(6) Test-Verfahren unter Verwendung des automatischen Analysators Hitachi 704. Die Volumina der Probe, R1 und R2 werden um 50 % ihrer beim obigen manuellen Modus erwähnten Werte reduziert.

Ergebnisse
I. Manueller Modus für Gesamt-Bilirubin.
1 zeigt die Absorption von Diazo-Bilirubin-Derivaten, die unter den experimentellen Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens gebildet werden, welche ein Chromophor besitzen, das bei 600 nm maximal absorbiert.
Es wurde bestätigt, dass das Diazo-Derivat der Sulfanilsäure das violette/pinkfarbene Diazo-Pigment des Bilirubins erzeugt und dass dieses Pigment durch die Zugabe des Reagenzes 2-Aminoethanol in ein blaues Chromophor überführt wird.
2 bestätigt, dass die Relation zwischen Extinktion und Konzentration linear ist. Im Vergleich zum Doumas-Verfahren ist das vorliegende Verfahren bis zu einer Extinktion von 2,5 A ideal linear, wohingegen das Doumas-Verfahren daran scheitert, bei niedrigeren Extinktionswerten linear zu sein. Weiterhin ist der Pearson-Koeffizient (r2) beinahe 1,0.
Die aus Proben (n = 20), unter Verwendung von "Dade^® L-Sta-Bil Lot No. BIC-983K", die ungefähr 20 mg Bilirubin/dl enthält, berechnete In-der-Serie-Präzision ist mit einem C. V. von 1,95% und einer S. D. von 4,72 g × 10^–3 exzellent. Eine andere Gruppe von Proben (n = 18), die ungefähr 5 mg/dl enthielten, zeigte einen C. V. von 2,74% und eine S. D. von 2,77 g × 10^–3. Die Zwischen-den-Tagen-Präzision von Proben, die bei –45°C aufbewahrt wurden (n = 12), zeigte einen C. V. von 4,48% und eine S. D. von 1 × 10^–2.
Die als ein Ergebnis der erfindungsgemäßen Reaktion erzeugte Farbe ist sehr stabil, sowohl bei einem sehr hohen O. D. von 1,4 als auch bei einem niedrigen O. D. von 0,1. Die d A/min bewegt sich über einen Zeitraum von 20 Minuten in einem Bereich von 0,0 bis 0,0001.
Die untere Detektionsgrenze dieses Verfahrens, basierend auf 2 × S. D. des Messwertes der niedrigen Kontrollmessung, ist 0,2 mg/dl.
3 stellt die Standard-Kurve der molaren Extinktion der Bilirubin-Bestimmung unter den Reaktionsbedingungen des vorliegenden Verfahrens dar, das um ungefähr 20% empfindlicher ist als das von Doumas und das sich bis auf den berechneten Wert der molaren Extinktion (E) des Azo-Bilirubins erstreckt.
Es ist weiterhin gefunden worden, dass das Verhältnis von Serum zu Reagenz R1, das keine Proteinausfällung bewirkt, 1 : 15 betrug. Sogar bei höheren Konzentrationen von 1 : 7,5, wo einige Ausfällungen stattfinden, unterstützt das alkalische Reagenz 2-Aminoethanol die Auflösung.
Wie schon erwähnt, hat Hämoglobin einen störenden Effekt auf die Messungen, und die scheinbaren Bilirubin-Werte sinken mit steigenden Hämoglobin-Konzentrationen. 4 zeigt diesen Effekt, wie auch den Schutzeffekt von Trolox CR (d. h. 6-Hydroxy-2,5,7,8-frtramethylchroman-2-carbonsäure), welche tatsächlich den negativen Hämoglobin Einfluss total beseitigt.
Wenn jedoch die Bilirubin-Konzentration abfällt, wird ein Anstieg an scheinbarem Bilirubin mit steigendem Hämoglobin beobachtet. Das wird durch die Tatsache erklärt, dass Hämoglobin eine Extinktion bei ungefähr 536 nm besitzt, welche sich auf den Bereich des Maximums des alkalischen Diazo-Bilirubins bei 600 nm ausdehnt. Deshalb kann Hämoglobin sogar in Anwesenheit von Trolox CR einen positiven Überlagerungseffekt besitzen. Diese Eigenschaft kann verwendet werden, um die Bilirubin-Konzentration bei allen Hämoglobin-Werten zu berechnen.
Die Berechnung der Bilirubin-Konzentration unter Anwendung der Prinzipien der spektrophotometrischen Mehrkomponenten-Analyse: Da die Spektren des Hämoglobins und des alkalischen Diazo-Bilirubins übertappen, können die beiden folgenden Gleichungen verwendet werden, um die Bilirubin-Konzentration zu berechnen: A1600 = a1HbcHb + a1BRcBR A2536 = a2HbcHb + a2BRcBR
Durch den Durchsatz vieler Proben mit steigender Hämoglobin-Konzentration, kann von Bilirubin unter den vorliegenden Bestimmungsbedingungen, unter Mittelwertbildung der molaren Extinktionskoeffizienten beider, die Konzentration von Gesamt-Bilirubin in einer Probe in Anwesenheit einer jeden Hämoglobin-Konzentration unter Verwendung der folgenden Gleichung ermittelt werden: CTBR = 2,43A1 – A2 × 13,84 in mg/dl
Wie in 5 gezeigt, bleiben die erwarteten Werte des Gesamt-Bilirubins in vielen Proben bei sehr unterschiedlichen Konzentrationen sogar in Anwesenheit von 2500 mg/dl Hämoglobin konstant. Die In-der-Serie-Präzision dieses Verfahrens ist für Proben, die ein Gesamt-Bilirubin von bis zu 5,0 mg/dl enthalten, exzellent. Gleiche Resultate wurden erhalten, gleichwohl ob Hb adulten oder auch fötalen Ursprungs war. Es hat sich gezeigt, dass das Verfahren bei bis zu ungefähr 55 mg Bilirubin in 100 ml Serum linear war.
II. Manueller Modus für direktes Bilirubin.
Im Fall des direkten Bilirubins ist die Reaktion nach 5 Min. abgeschlossen. 6 zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren dem von Jendrawik und auf Hitachi 911 angepassten überlegen ist. Es ist bei hohen Konzentrationen ideal linear und um ungefähr 50% empfindlicher.
Das Verhältnis von Serum zu R1 kann ohne Aussalzen der Proteine bis auf 1 : 35 erhöht werden.
7 zeigt, dass die Anwesenheit von ungefähr 500 mg/dl Hämoglobin im Serum die Bilirubin-Konzentration auf ungefähr 50% senkt, aber dass dieser negative Effekt durch die Zugabe von Trolox CR vollständig vermieden werden kann, welches demnach einen wirksamen Schutzeffekt hat.
Ditaurobilirubin und Hämoglobin, frisch aus R.B.C.-Hämolysaten zubereitet, wurden verwendet, um die für die Berechnung der Konzentration des direkten Bilirubins geeignete Gleichung aufzustellen. Das verfolgte Verfahren war das gleiche wie das vorher erwähnte für Gesamt-Bilirubin: CDBR = 2,615A1 – A2 × 19,0, mg/dl als DTB CDBR = 2,615A1 – A2 × 13,0, mg/dl als BR
Diese Gleichung wurde modifiziert, um die Interferenz des unkonjugierten Bilirubins nachzuweisen, das im direkten Modus wie folgt reagiert: CDBR = 2,615A1 – A2 × 9,0, mg/dl als DBR
Das Verfahren ist bis zu 30 mg direktem Bilirubin in 100 ml Serum linear und hat weiterhin eine exzellente In-der-Probe-Präzision.
Wie in 8 gezeigt, bleiben die erwarteten Werte des direkten Bilirubins in vielen Proben sogar in Anwesenheit von mehr als 3000 mg Hämoglobin in 100 ml Serum konstant.
III. Automatisierung
– Bichromatische Analyse für Gesamt-Bilirubin
Wie vorher erwähnt und wegen der Hämoglobin-Störung, erfordert das erfindungsgemäße Verfahren Messungen bei zwei Wellenlängen, nämlich bei 600 und 536 nm. Jedoch stehen beim Hitachi 704 nur 600 und 546 nm zur Verfügung und deshalb wurden die Proben zuerst bei 600 und dann bei 546 nm abgelesen.
Jedes Mal wurde eine zweite Wellenlänge von 700 nm verwendet, um die Störung durch Serum-Komponenten zu beseitigen.
Zur Berechnung der Konzentration wurden zwei Bilirubin-Lösungen, mit und ohne Hämoglobin, hergestellt und an der Datenanzeige wurden zwei Zahlen abgelesen, eine die Extinktion bei 600 nm wiedergebend und die andere die bei 546 nm. Aus diesen Zahlen war es möglich, zwei Gleichungen mit zwei Unbekannten aufzustellen und als die Gleichungen aufgelöst wurden, ergaben sie eine Gleichung, die sich auf die Extinktion bei zwei Wellenlängen bezieht, d. h. 4,95B1 (bei 600 nm) – 2,5B2 (bei 546). Die Gleichung wurde in den Computer eingegeben, wodurch man direkt die Konzentration an Bilirubin in mg/dl erhält.
Es wurde gefunden, dass das Verfahren bis zu mindestens 100 mg/dl linear ist, wie in 9 gezeigt. Gleichzeitig ist das Verfahren hochempfindlich und ein so geringer Wert wie ungefähr 0,05 mg/dl kann leicht berechnet werden.

– Bichromatische Analyse für direktes Bilirubin:
– Wie oben angegeben wurde eine Lösung von Ditaurobilirubin in HSA mit und ohne HB verwendet, um zwei Gleichungen mit zwei Unbekannten aufzustellen. Die resultierende Gleichung 3,97 B1 – 1,67 B2 wurde verwendet, um die Linearität und die Empfindlichkeit des Verfahrens zu überprüfen. Als ein Ergebnis wurde gezeigt, dass es mindestens bis zu 60 mg/dl linear und für bis ungefähr 0,05 mg/dl empfindlich ist.
– Bichromatische Analyse für direktes Bilirubin in menschlichen Sera:

Die Anwesenheit von unkonjugiertem Bilirubin in menschlichen Sera erhöht das direkte Bilirubin fälschlicherweise. Deshalb wurde eine andere Gleichung abgeleitet, die sowohl bei der Anwesenheit von direktem als auch von indirektem Bilirubin wie folgt gilt:

a) DTB wurde zu Mischserum bei einer Endkonzentration von 3,45 mg/dl in BR-Equivalenten gegeben;
b) zu einer anderen Probe wurden 0,5 ml Hb-Lösung mit 4,0 g/dl hinzugefügt. Beide Proben wurden (20x) mit dem Hitachi 740 im Direkt-BR-Modus untersucht und der BR-Gehalt wurde unter Anwendung der Formel für Gesamt-BR, d. h. 4,95 B1 – 2,5 B2, berechnet.

Die beiden resultierenden Gleichungen waren: 1,062 x – 0,717 y = 3,79 1,63 x – 2,43 y = 2,25wenn nach y und x aufgelöst wurde, erhielt man die folgende Gleichung: 5,38 B1 – 2,68 B2.
Eine zweite Probe von Mischserum wurde untersucht, welche die gleiche Menge Br, jedoch als Bu, enthielt und dessen Konzentration war nach der obigen Formel 2,1 mg/dl und die Störung von Bu im Direkt-Modus ist 2,1/3,79 = 0,554 und 1 – 0,554 = 0,446 ist der Beitrag von DBR.
Deshalb muss die Original-Gleichung mit 0,446 multipliziert werden, um eine andere Gleichung zu erhalten, die das direkte BR wiederspiegelt, welche lautet: (5,38 B1 – 2,68 B2) × 0,446 = 2,40 B1 – 1,2 B2
Bezüglich der Hämoglobin-Störung ist gezeigt worden, dass die Verdünnung der Serum-Probe entweder mit einer HSA-Lösung oder einer Hämoglobin-Lösung bis zu wenigstens 2285 mg Hb in 100 ml Serum keinen Effekt auf die scheinbare Gesamt-Bilirubin-Konzentration hat.
Im Fall des direkten Bilirubins wird keine Hämoglobin-Störung beobachtet, wenn BR bei über 1,0 mg/dl bis zu ungefähr 2000 mg Hb in 100 ml Serum liegt. Wenn jedoch die Konzentration des direkten Bilirubins ungefähr 0,2 mg/dl beträgt, verursacht eine Hämoglobin-Konzentration von über 800 mg/dl eine schwere Reduktion der scheinbaren Br-Konzentration.
Es wurde keine Verschleppung zwischen den Proben beobachtet, wenn von niedrigen Werten (0,8 mg/l) zu sehr hohen Werten (23,3 mg/dl) oder umgekehrt gewechselt wird.
– Richtigkeit:
Das wurde durch Hinzufügen bekannter, steigender Mengen zu Mischserum-Proben ermittelt. Jede Konzentration wurde dreimal untersucht und die Werte wurden gemittelt. Die verwendeten Konzentrationen von Bu und DTB reichten von 1,0 mg bis 25 mg/dl. Die Wiederfindungsrate wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Gefundene Menge-ursprünglich vorliegende Menge × 100/hinzugefügte Menge
Die Wiederfindungsrate schwankt in beiden Fällen von 99 bis 108%, mit einem Mittelwert von 102%.

– Werte bei Menschen, gemäß Hitachi 704 (erfindungsgemäßes Verfahren). Einhundert Proben, die von augenscheinlich gesunden, adulten Personen erhalten wurden, wurden analysiert. Die Ergebnisse waren wie folgt:

Es ist über die verschiedenen Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens berichtet worden, wobei andere Merkmale, die nicht oben beschrieben wurden, zusätzlich in der folgenden Tabelle angegeben werden.
Tabelle

Claims

Reagenzienzusammensetzung für die Bestimmung von Bilirubinen in biologischen Sera, welche Dimethylformamid, Zinksulfat und 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure umfasst.
Reagenzienzusammensetzung gemäß Anspruch 1, zur Bestimmung von Gesamt-Bilirubin, welche 50 ml Dimethylformamid, 25 mg Zinksulfat und 1,5 ml einer 0,1 M Lösung von 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure, mit Wasser bis auf 100 ml aufgefüllt, umfasst.
Reagenzienzusammensetzung gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung von direktem Bilirubin, welche 12 ml Dimethylformamid, 37,5 mg Zinksulfat und 1 ml einer 0,1 M Lösung von 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure, mit Wasser bis auf 100 ml aufgefüllt, umfasst.
Verfahren zur Bestimmung von Bilirubinen in biologischen Sera, welches das Mischen einer Serum-Probe mit Natriumnitrit und Sulfanilsäure in Anwesenheit einer Reagenzienzusammensetzung, die Dimethylformamid als Beschleuniger für die Diazotierungsreaktion, Zinksulfat als Chromophor-Stabilisator und 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure umfasst und dann die Zugabe von 2-Aminoethanol oder einer Mischung von 2-Aminoethanol und Dimethylformamid und schließlich die Messung der Extinktion der erhaltenen Mischung, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 4, zur Bestimmung von Gesamt-Bilirubin, in welchem 7 ml der Reagenzienzusammensetzung von Anspruch 2 zu einer Mischung aus 0,075 ml Natriumnitrit (5 g/l) (0,072 mol/l) und 1 ml Sulfanilsäure (hergestellt durch Lösen von 5 g Sulfanilsäure in Wasser, Hinzugeben von 5 ml konzentrierter HCl und Verdünnung mit Wasser auf 1 l) hinzugegeben werden; dann werden 0,7 ml der obigen Mischung mit 0,02 ml Serum-Probe gemischt und 0,1 ml 2-Aminoethanol hinzugefügt, bevor die Messung der Extinktion bei 600 nm, gegen Wasser, durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4 zur Bestimmung von direktem Bilirubin, in welchem 7 ml der Reagenzienzusammensetzung von Anspruch 3 zu einer Mi schung aus 0,075 ml Natriumnitrit (5 g/l), (0,072 mol/l) und 1 ml Sulfanilsäure (hergestellt durch Lösen von 5 g Sulfanilsäure in Wasser, Hinzugeben von 5 ml konzentrierter HCl und Verdünnung mit Wasser auf 1 l) hinzugegeben werden; dann werden 0,35 ml dieser Mischung mit 0,02 ml Serum-Probe gemischt und 0,45 ml einer Mischung aus 7 ml Dimethylformamid und 2 ml 2-Aminoethanol hinzugegeben, bevor die Messung der Extinktion bei 600 nm, gegen Wasser, durchgeführt wird.