ES2202959T3 - Procedimiento y reactivos para la determinacion de bilirrubinas. - Google Patents
Procedimiento y reactivos para la determinacion de bilirrubinas.Info
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Abstract
Composición de reactivos para la determinación de bilirrubina en sueros biológicos, que comprende dimetilformamida, sulfato de zinc y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico.
Description
Procedimiento y reactivos para la determinación
de bilirrubinas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la determinación de bilirrubinas en sueros
biológicos, y más particularmente a un nuevo reactivo como
acelerador y a una nueva composición de reactivos, ambos para su
utilización en dicha determinación de bilirrubinas.
Diversos procedimientos son ya conocidos para la
determinación de bilirrubinas, que se basan en sus reacciones con
compuestos diazoicos. Los procedimientos con compuestos diazoicos
proporcionan un valor único para la concentración de bilirrubina
total (TBR) en una muestra y, con cierta modificación, se obtiene un
valor más pequeño adicional que representa la concentración de los
ésteres o conjugados de bilirrubina más solubles, conocidos también
como bilirrubinas directas (DBR). Uno de los procedimientos
conocidos es el de Doumas et al, (Clin. Chem. 31,
1779-1789, 1985), en el que se utiliza cafeína como
acelerador de la reacción de diazotación, necesario debido a la
lenta reacción de la bilirrubina no conjugada. Sin embargo, la
cafeína adolece de inconvenientes, a saber, reduce el poder
absorbente molar de pigmentos azoicos y reacciona con el derivado
azoico para proporcionar un cromóforo amarillo. Además, todos dichos
procedimientos adolecen de varias deficiencias, a saber, la
factibilidad de automatización, la naturaleza compleja del
acelerador y de los reactivos alcalinos, y sobre todo la
sensibilidad para la interferencia con hemoglobina, que es entre
otras cosas un contaminante normal de las muestras de suero
pediátricas.
La utilización de sulfato de zinc en la
determinación de bilirrubina se conoce a partir del documento
EP-A-0.433.977, como lo es la
utilización de dimetilformamida a partir del documento
WO-A-9.904.258
El objetivo de la presente invención consiste por
lo tanto en proporcionar nuevos reactivos para su utilización en el
procedimiento de determinación de bilirrubinas que no adolezcan de
los inconvenientes ni de las deficiencias de los procedimientos
conocidos.
Un primer objeto de la invención consiste por lo
tanto en un reactivo como acelerador para su utilización en la
determinación de bilirrubina en sueros biológicos que está
constituido por dimetilformamida.
Un segundo objeto de la invención consiste en una
composición de reactivos para su utilización en la determinación de
bilirrubina en sueros biológicos, que comprende dimetilformamida,
sulfato de zinc y ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico.
Un tercer objeto de la invención consiste en un
procedimiento para la determinación de bilirrubinas en sueros
biológicos, que comprende mezclar una muestra de suero con nitrito
de sodio y ácido sulfanílico en presencia de una composición de
reactivos que comprende dimetilformamida como acelerador de la
reacción de diazotación, sulfato de zinc como estabilizador del
cromóforo y ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico,
a continuación se añade 2-aminoetanol o una mezcla
de 2-aminoetanol y dimetilformamida, y finalmente se
mide la absorbancia de la mezcla obtenida.
La composición de reactivos de la presente
invención puede ser la siguiente, más particularmente para su
utilización en la determinación de bilirrubina total: 50 ml de
dimetilformamida, 25 mg de sulfato de zinc y 1,5 ml de una solución
0,1 M de ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico,
con adición de agua hasta 100 ml.
Para la determinación de bilirrubina total, la
composición de reactivos anteriormente mencionada (7 ml) se añade a
una mezcla de 0,075 ml de nitrito de sodio (5 g/l) (0,072 moles/l)
y 1 ml de ácido sulfanílico (que se prepara disolviendo 5 g de
ácido sulfanílico en agua, añadiendo 5 ml de HCl concentrado y
diluyendo a 1 l con agua); a continuación, se mezclan 0,7 ml de la
mezcla anterior con 0,02 ml de una muestra de suero, y se añaden
0,1 ml de 2-aminoetanol antes de proceder a la
medición de la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm frente
a agua.
La composición de reactivos de la presente
invención puede ser la siguiente, más particularmente para su
utilización en la determinación de bilirrubina directa: 12 ml de
dimetilformamida, 37,5 mg de sulfato de zinc y 1 ml de una solución
0,1 M de ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico,
con adición de agua hasta 100 ml.
Para la determinación de bilirrubina directa, la
composición de reactivos anterior (7 ml) se añade a una mezcla de
0,075 ml de nitrito de sodio y 1 ml de ácido sulfanílico (como para
la determinación de bilirrubina total); a continuación, se mezclan
0,35 ml de dicha mezcla con 0,02 ml de una muestra de suero, y se
añaden 0,45 ml de una mezcla de 7 ml de dimetilformamida con 2 ml
de 2-aminoetanol, antes de proceder a la medición
de la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm frente a
agua.
En el procedimiento según la presente invención,
se hace reaccionar bilirrubina (Bu, mBc, dBc y Bs) con ácido
sulfanílico diazotado en presencia del acelerador
(dimetilformamida) y del estabilizador (sulfato de zinc) en
condiciones muy suaves y durante un tiempo de reacción corto para
proporcionar pigmentos azoicos de color de rosa. Estos últimos se
transforman en derivados estables de color azul mediante la adición
del reactivo alcalino único (2-aminoetanol),
utilizándose la intensidad de dichos derivados para la
cuantificación.
\newpage
Además, la presencia del otro componente en la
composición de reactivos, es decir de ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico,
elimina totalmente una interferencia por hemoglobina,
proporcionando un efecto protector sobre la bilirrubina.
La presente invención se describirá a
continuación con mayores detalles con referencia al siguiente
Ejemplo, que se proporciona, naturalmente, en la presente memoria
únicamente como tal sin limitar el alcance de la invención, y a los
dibujos adjuntos.
La Figura 1 muestra la absorción de los derivados
de bilirrubina diazoicos formados.
La Figura 2 muestra la absorbancia en función de
la concentración según el procedimiento de la invención y el de
Doumas.
La Figura 3 representa la curva patrón del poder
absorbente molar del ensayo de bilirrubina en condiciones de
reacción del presente procedimiento.
La Figura 4 ilustra el efecto de Trolox sobre la
interferencia de hemoglobina sobre los valores de bilirrubina
aparente.
La Figura 5 muestra los valores respectivos
esperados de bilirrubina total de varias mezclas a diferentes
concentraciones.
La Figura 6 muestra la absorbancia en función de
la concentración según el procedimiento de la invención y el de
Jendrassik.
La Figura 7 ilustra el efecto de Trolox sobre la
interferencia de hemoglobina sobre la concentración de
bilirrubina.
La Figura 8 muestra los valores respectivos
esperados de bilirrubina directa de varias muestras a diferentes
concentraciones.
La Figura 9 muestra la linealidad del
procedimiento.
En este ejemplo, se han utilizado los siguientes
equipos, materiales y tipos de reactivos:
- -
- Instrumentos: espectrofotómetro de registro de luz UV-visible, Modelo UV 160 U (Shimadzu, JP) y Suprasil (QS) Beckmann Cell 900 de pared negra (Beckman Instruments, EE.UU.); para el modo automatizado, el analizador automático Hitachi 704 (Boehringer Mannheim, DE).
- -
- Materiales: bilirrubinas y ditaurobilirrubinas de Calbiochem (La Jolla, CA, EE.UU.).
- -
- Reactivos y patrones: reactivos de calidad para análisis de Fluka (Buchs, CH); sueros procedentes de personas normales (no ictéricos, no hemolizados) y procedentes de pacientes con diversos trastornos del metabolismo de la bilirrubina (separados inmediatamente después de una venipunción y almacenados a una temperatura de -45ºC).
- -
- Nitrito de sodio: 5,0 g/l preparado recientemente cada mes y mantenido a una temperatura de 4ºC.
- -
- Ácido sulfanílico: 5,0 g/l preparado disolviendo ácido sulfanílico en agua, añadiendo 5,0 ml de HCl concentrado y diluyendo a 1 l con agua; se almacena a temperatura ambiente.
- -
- Composición de la invención: 25,0 mg de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico y 1,5 ml de una solución 0,1 M de sulfato de zinc se añaden a 50,0 ml de dimetilformamida, y el volumen se lleva a 100,0 ml con agua desionizada; la composición se puede almacenar a una temperatura de +4ºC y se deberá desechar cuando se decolore.
- -
- Reactivo R1: se prepara mezclando 0,075 ml de nitrito de sodio, 1,0 ml de ácido sulfanílico, seguido de la adición de 7,0 ml de la composición de la invención. El R1 se puede utilizar en el plazo de 24 h a temperatura ambiente o de 120 h a una temperatura de +4ºC.
- -
- Reactivo R2: reactivo alcalino constituido por 2-aminoetanol.
- -
- Composición de la invención: 37,5 mg de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico y 1,0 ml de una solución 0,1 M de sulfato de zinc se añaden a 12,0 ml de dimetilformamida, y el volumen se lleva a 100,0 ml con agua desionizada; la composición se puede almacenar a una temperatura de +4ºC y deberá desecharse cuando se decolore.
- -
- Reactivo R1: véase el apartado (1), pero con la composición de la invención anteriormente mencionada.
- -
- Reactivo R2: reactivo alcalino que se obtiene mezclando 7,0 ml de dimetilformamida con 2,0 ml de 2-aminoetanol.
Éstas se preparan disolviéndola en una pequeña
cantidad de sulfóxido de dimetilo y Na_{2}CO_{3} 0,1 M seguido
de una dilución en 40 g/l de albúmina en 0,1 mol/l de solución
tampón Tris, pH 7,4 o en suero humano no ictérico, no hemolizado,
transparente.
En un tubo de ensayo pequeño, se mezclan 0,020 ml
de una muestra de suero con 0,700 ml de R1. Después de dos minutos,
se añaden 0,1 ml de R2 y se mezcla. Se mide la absorbancia a 600 nm
frente a agua. Una muestra del patrón apropiado se trata de manera
similar y se utiliza para el cálculo.
En un tubo de ensayo pequeño, se mezclan 0,02 ml
de una muestra de suero con 0,350 ml de R1. Después de cinco
minutos, se añaden 0,450 ml de R2 y se mezcla. Se mide la
absorbancia a 600 nm frente a agua. Una muestra del patrón de
ditaurobilirrubina apropiado se trata de manera similar y se utiliza
para el cálculo.
- -
- Los volúmenes de la muestra y de los reactivos son los mismos que se han mencionado anteriormente, pero se utilizan las ecuaciones indicadas bajo el título de resultados para el cálculo.
Los volúmenes de la muestra, de R1 y de R2 se
reducen al 50% de sus valores mencionados en el modo manual
anteriormente mencionado.
La Figura 1 muestra la absorción de derivados de
bilirrubina diazoicos formados en las condiciones experimentales
del procedimiento según la presente invención, que presentan un
cromóforo que se absorbe al máximo a una longitud de onda de 600
nm.
Se ha confirmado que el derivado diazoico de
ácido sulfanílico produce el pigmento diazoico de color
violeta/rosa de bilirrubina, y que dicho pigmento se transforma en
un cromóforo de color azul mediante la adición del reactivo
2-aminoetanol.
La Figura 2 confirma que la relación entre la
absorbancia y la concentración es lineal. Al efectuar la
comparación con el procedimiento de Doumas, el presente
procedimiento presenta una linealidad perfecta hasta una absorbancia
de 2,5 A, mientras que el procedimiento de Doumas deja de ser lineal
a valores de absorbancia inferiores. Además, el coeficiente de
Pearson (r2) es casi 1,0.
La precisión en la operación calculada a partir
de un grupo de muestras (n = 20) utilizando Dade®
L-Sta-Bil, Lote nº
BIC-983K que contiene aproximadamente 20 mg de
bilirrubina/dl es excelente con un C.V. del 1,95% y una D.E. de 4,72
g x 10^{- 3}. Otro grupo de muestras (n = 18) que contenía
aproximadamente 5 mg/dl mostró un C.V. del 2,74% y una D.E. del
2,77 x 10^{-3}. La precisión entre días para muestras conservadas
a una temperatura de -45ºC (n = 12) mostró un C.V. Del 4,48% y una
D.E. del 1 x 10^{-2}.
El color producido como resultado de la reacción
de la invención es muy estable tanto a una D.O. muy elevada de 1,4
como a una D.O. baja de 0,1. El valor de d A/min varió de 0,0 a
0,0001 durante un periodo de tiempo de 20 minutos.
El límite inferior de detección del presente
procedimiento basado en 2 x D.E. de la lectura del testigo inferior
es de 0,2 mg/dl.
La Figura 3 representa la curva patrón del poder
absorbente molar del ensayo de bilirrubina en las condiciones de
reacción del presente procedimiento, que es más sensible que el de
Doumas en aproximadamente el 20% y esto se extiende al valor
calculado del poder absorbente molar (E) de bilirrubina azoica.
Se ha encontrado adicionalmente que la relación
de suero a reactivo R1 que no causa una precipitación de proteína
era de 1:15. Incluso con una relación superior de 1:7,5, a la que
tiene lugar una precipitación, la adición del reactivo alcalino
2-aminoetanol activa la disolución.
Como ya se ha mencionado, la hemoglobina presenta
un efecto de interferencia sobre las mediciones, y los valores de
bilirrubina aparente se reducen con concentraciones de hemoglobina
crecientes. La Figura 4 muestra dicho efecto, así como el efecto
protector de Trolox CR (es decir, ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico),
que en realidad elimina totalmente el efecto negativo de la
hemoglobina.
Sin embargo, a medida que se reduce la
concentración de bilirrubina, se observa un aumento de la
bilirrubina aparente con un aumento de la hemoglobina. Esto se
explica por el hecho de que la hemoglobina presenta una absorbancia
a aproximadamente 536 nm que se extiende a la región de máxima
bilirrubina diazoica alcalina a 600 nm. Por tanto, la hemoglobina
incluso en presencia de Trolox CR puede presentar un efecto de
interferencia positivo. Dicha propiedad se puede utilizar para
calcular la concentración de bilirrubina con cualquier valor de
hemoglobina.
Cálculo de la concentración de bilirrubina
utilizando el principio espectrofotométrico de análisis de
multicomponentes:
Puesto que los espectros de hemoglobina y de
bilirrubina diazoica alcalina se solapan, se pueden utilizar las
dos ecuaciones siguientes para calcular la concentración de
bilirrubina:
A1^{600} = a1^{Hb} c^{Hb} +
a1^{BR}
c^{BR}
A2^{536} = a2^{Hb} c^{Hb} +
a2^{BR}
c^{BR}
Analizando muchas muestras de concentración
creciente de hemoglobina, la bilirrubina en las presentes
condiciones de ensayo, promediando los valores de poderes de
absorción molares de cada una, se halla la concentración de
bilirrubina total en una muestra en presencia de cualquier
concentración de hemoglobina utilizando la siguiente ecuación:
C^{TBR} = 2,43 A1 - A2 x
13,84 expresado en
mg/dl
Como se muestra en la figura 5, los valores
esperados de bilirrubina total en muchas muestras a concentraciones
muy diferentes permanecen constantes incluso en presencia de 2.500
mg/dl de hemoglobina. La precisión dentro de la operación del
presente procedimiento para muestras que contienen un valor de
bilirrubina total de hasta 5,0 mg/dl es excelente. Se obtuvieron
valores similares tanto si la Hb era de una persona adulta como de
origen fetal. Se mostró que el procedimiento era lineal hasta
aproximadamente 55 mg de bilirrubina en 100 ml de suero.
En el caso de bilirrubina directa, la reacción es
completa después de 5 minutos.
La Figura 6 muestra que el procedimiento de la
presente invención es superior al de Jendrawik adoptado para el
analizador Hitachi 911. Es perfectamente lineal y más sensible a
concentraciones elevadas en aproximadamente el 50%.
La relación de suero a la relación de R1 se puede
aumentar hasta 1:35 sin eliminar por desplazamiento salino las
proteínas.
La Figura 7 muestra que la presencia de
aproximadamente 500 mg/dl de hemoglobina en suero reduce la
concentración de bilirrubina en aproximadamente el 50%, pero que
este efecto negativo se evita completamente mediante la adición de
Trolox CR que proporciona de este modo un efecto protector
eficaz.
Se utilizaron ditaurobilirrubina y hemoglobina
preparadas recientemente a partir de hemolizados de R.B.C. para
establecer la ecuación apropiada para el cálculo de la
concentración de bilirrubina directa. El procedimiento que se siguió
fue el mismo que para la bilirrubina total anteriormente
mencionado. La ecuación resultante de dicho tratamiento fue:
C^{DBR} = 2,615 A1 - A2 x
19,0, mg/dl expresada como
DTB
C^{DBR} = 2,615 A1 - A2 x
13,0, mg/dl expresada como
BR
Esta ecuación se modifica para tener en cuenta la
interferencia de bilirrubina no conjugada que reacciona en el modo
directo, como sigue:
C^{DBR} = 2,615 A1 - A2 x
9,0, mg/dl expresada como
DBR
El procedimiento es lineal hasta 30 mg de
bilirrubina directa en 100 mg de suero, y además presenta una
excelente precisión dentro de la muestra.
Como se muestra en la Figura 8, los valores
esperados de bilirrubina directa en muchas muestras permanecen
constantes incluso en presencia de una cantidad superior a 3.000 mg
de hemoglobina en 100 ml de suero.
Como se ha mencionado anteriormente y debido a la
interferencia de hemoglobina, el procedimiento de la invención
requiere mediciones a dos longitudes de onda, a saber a 600 y a 536
nm. Sin embargo, en el analizador Hitachi 704, únicamente están
disponibles longitudes de onda de 600 y 546 nm, y por tanto las
muestras se leyeron en primer lugar a 600 nm y a continuación a 546
nm.
Cada vez, se utilizó una longitud de onda
secundaria de 700 nm para eliminar la interferencia por los
componentes del suero.
Para el cálculo de la concentración, se
prepararon dos soluciones de bilirrubina con y sin hemoglobina y se
leyeron en un Monitor Data, dos números, uno que refleja la
absorbancia a 600 nm y el otro a 546 nm. A partir de estos números,
fue posible generar dos ecuaciones con dos incógnitas y cuando se
resolvieron las ecuaciones, esto dio como resultado una ecuación
que relaciona la absorbancia a dos longitudes de onda, es decir,
4,95 B1 (a 600 nm) - 2,5 B2 (a 546). Esta ecuación se introdujo en
el ordenador, el cual proporciona la concentración de bilirrubina
directamente expresada en mg/dl.
Se encontró que el procedimiento era lineal hasta
por lo menos 100 mg/dl, tal como se muestra en la Figura 9. Al
mismo tiempo, éste es muy sensible y se puede calcular fácilmente
un valor tan bajo como de aproximadamente
0,05 mg/dl.
0,05 mg/dl.
- -
- Como anteriormente, se utilizó una solución de ditaurobilirrubina en HSA con y sin HB para generar dos ecuaciones con dos incógnitas. La ecuación resultante 3,97 B1 - 1,67 B2 se utilizó para comprobar la linealidad y la sensibilidad del procedimiento. Como resultado de ello, se mostró que éste es lineal hasta por lo menos 60 mg/dl y sensible hasta aproximadamente 0,05 mg/dl.
La presencia de bilirrubina no conjugada en
sueros humanos aumenta falsamente la bilirrubina directa. Por
tanto, se deriva una ecuación diferente que se aplica en presencia
de bilirrubinas tanto directa como indirecta, como sigue:
- a)
- Se añadió DTB a suero agrupado a una concentración final de 3,45 mg/dl en BR equivalente;
- b)
- a otra muestra, se le añadieron 0,5 ml de solución de Hb de 4,0 g/dl.
- Las dos muestras se analizaron (x 20) en un analizador Hitachi 704 en el modo de BR directa y se calculó el contenido de BR utilizando la fórmula para BR total, es decir 4,95B1 -2,5B2.
Las dos ecuaciones que resultaron fueron:
1,062 x - 0,717 y =
3,79
1,63 x - 2,43 y =
2,25
al resolver para "y" y "x", se obtuvo
la siguiente
ecuación:
5,38 B1 - 2,68
B2.
Se analizó una segunda muestra de suero agrupado
que contenía la misma cantidad de Br, pero como Bu y su
concentración mediante la fórmula anterior fue de 2,1 mg/dl y la
interferencia de Bu en el modo directo es 2,1//3,79 = 0,554, 1 -
0,554 = 0,446 es la contribución de DBR.
Por tanto, la ecuación original deberá
multiplicarse por 0,446 para obtener otra ecuación que refleja la
BR directa, que es:
(5,38 B1 - 2,68 B2) x 0,446 =
2,40 B1 - 1,2
B2
Con respecto a la interferencia de hemoglobina,
se ha mostrado que la dilución de una muestra de suero ya sea con
una solución de HSA o con una solución de hemoglobina no presenta
ningún efecto sobre la concentración de bilirrubina total aparente
hasta por lo menos 2.285 mg de Hb en 100 ml de suero.
En el caso de bilirrubina directa, no se observa
ninguna interferencia de hemoglobina cuando la BR se encuentra en
una concentración por encima de 1,0 mg/dl hasta aproximadamente
2.000 mg de Hb en 100 ml de suero. Sin embargo, cuando la
concentración de bilirrubina directa es de aproximadamente 0,2
mg/ml, una concentración de hemoglobina por encima de 800 mg/dl
causa una importante reducción de la concentración de Br
aparente.
No se observó ningún arrastre entre muestras
cuando se pasó de valores bajos (0,8 mg/l a valores muy elevados
(23,3 mg/dl) o viceversa.
Esto se realizó añadiendo cantidades crecientes
conocidas a muestras de suero agrupado. Cada concentración se
analizó tres veces y los valores se promediaron. La concentración
de Bu y de DTB que se utilizó varió de 1,0 mg a 25 mg/ml. La
recuperación se calculó utilizando la siguiente fórmula:
\frac{Cantidad \ encontrada
\ - \ cantidad \ originalmente \ presente}{Cantidad \ añadida} x
100
La recuperación en ambos casos varió del 99 al
108% con un promedio del 102%.
- Valores en seres humanos según el analizador
Hitachi 704 (procedimiento de la invención).
Se analizaron cien muestras obtenidas a partir de
personas adultas ostensiblemente sanas. Los resultados fueron como
sigue:
| Especie de bilirrubina | Intervalo, mg/dl | Media | S.D |
| TBR | 0,097 - 0,980 | 0,50 | 0,23 |
| DBR | 0,036 - 0,384 | 0,21 | 0,10 |
En la siguiente Tabla se han expuesto las
diversas características del procedimiento según la presente
invención, además de otras características que no se han detallado
anteriormente.
Claims (6)
1. Composición de reactivos para la determinación
de bilirrubina en sueros biológicos, que comprende
dimetilformamida, sulfato de zinc y ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico.
2. Composición de reactivos según la
reivindicación 1, para la determinación de bilirrubina total, que
comprende 50 ml de dimetilformamida, 25 mg de sulfato de zinc y 1,5
ml de una solución 0,1 M de ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico,
con adición de agua hasta 100 ml.
3. Composición de reactivos según la
reivindicación 1, para la determinación de bilirrubina directa, que
comprende 12 ml de dimetilformamida, 37,5 mg de sulfato de zinc y
1 ml de una solución 0,1 M de ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico,
con adición de agua hasta 100 ml.
4. Procedimiento para la determinación de
bilirrubinas en sueros biológicos, que comprende mezclar una
muestra de suero con nitrito de sodio y ácido sulfanílico en
presencia de una composición de reactivos que comprende
dimetilformamida como acelerador de la reacción de diazotación,
sulfato de zinc como estabilizador de cromóforo y ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-croman-2-carboxílico,
añadir a continuación 2-aminoetanol o una mezcla de
2-aminoetanol y dimetilformamida, y medir finalmente
la absorbancia de la mezcla obtenida.
5. Procedimiento según la reivindicación 4 para
la determinación de bilirrubina total, en el que se añaden 7 ml de
la composición de reactivos según la reivindicación 2 a una mezcla
de 0,075 ml de nitrito de sodio (5 g/l) (0,072 mol/l) y 1 ml de
ácido sulfanílico (que se prepara disolviendo 5 g de ácido
sulfanílico en agua, añadiendo 5 ml de HCl concentrado y diluyendo
a 1 l con agua); a continuación, se mezclan 0,7 ml de la mezcla
anterior con 0,02 ml de una muestra de suero, y se añaden 0,1 ml
de 2-aminoetanol antes de proceder a la medición de
la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm frente a agua.
6. Procedimiento según la reivindicación 4 para
la determinación de bilirrubina directa, en el que se añaden 7 ml
de la composición de reactivos según la reivindicación 3 a una
mezcla de 0,075 ml (5 g/l) (0,072 mol/l) de nitrito de sodio y 1 ml
de ácido sulfanílico (que se prepara disolviendo 5 g de ácido
sulfanílico en agua, añadiendo 5 ml de HCl concentrado y diluyendo
a 1 l con agua); a continuación, se mezclan 0,35 ml de esta mezcla
con 0,02 ml de una muestra de suero, y se añaden 0,45 ml de una
mezcla de 7 ml de dimetilformamida con 2 ml de
2-aminoetanol antes de proceder a la medición de la
absorbancia a una longitud de onda de 600 nm frente a agua.
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