JPS59203954A - ビリルビンの分析法 - Google Patents
ビリルビンの分析法Info
- Publication number
- JPS59203954A JPS59203954A JP7988583A JP7988583A JPS59203954A JP S59203954 A JPS59203954 A JP S59203954A JP 7988583 A JP7988583 A JP 7988583A JP 7988583 A JP7988583 A JP 7988583A JP S59203954 A JPS59203954 A JP S59203954A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bilirubin
- mobile phase
- acetonitrile
- isomers
- dimethylformamide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/728—Bilirubin; including biliverdin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
この発明は試料中のビリルビンを８つの異性体すなわち
ビリルビン■α、■αおよび■αに分離レて定量分析す
る方法に関する。
ビリルビン■α、■αおよび■αに分離レて定量分析す
る方法に関する。
←）従来技術
ビリルピンは、ヘモグロビンの主要な構成要素であクヘ
モグロビンが肝臓で分解される際にグルクロン酸抱合体
となって主として胆汁中に放出され、またビリルビンは
脂溶性であるが、血液中にも微量存在している。しかし
ビリルビンの代謝機構には不明な点が多いといわれてい
る。従来血清、胆汁などの体液中のビリルビンの測定法
としてはジアゾ分析法が知られているが、この方法では
ビリルビンの８つの異性体をそれぞれ分離して定量分析
することはできず８つの異性体の合計量として定量分析
できるだけである。従って高ピリルビン血症の検査など
その利用範囲は限られてりる。近時、ビリルビンの代謝
機構をさらに詳しく解明するため、またビリルビン代謝
系の疾病、例えば肝疾患、代謝酵素異常などの予防や治
療にも利用するために、液体クロアトグラ７イによるピ
リルビンの３つの異性体の分離定量分析が試みられてい
る。従来この液体クロマトグラフイとしては、シリカを
担体とする化学結合型逆相カラムと移動相としてアセト
リトリルもしくはメタノールと緩衝液との混合液を用い
る方法が知られている。しかしこの方法は、ビリルビン
の分子内に存在するカルボキシル基、イミノ基などの基
とカラム担体の残存シラノール基などとの相互作用など
の影響を受けてテーリングを起こし、８つの異性体の分
離が不充分で満足すべき結果が得られていない。
モグロビンが肝臓で分解される際にグルクロン酸抱合体
となって主として胆汁中に放出され、またビリルビンは
脂溶性であるが、血液中にも微量存在している。しかし
ビリルビンの代謝機構には不明な点が多いといわれてい
る。従来血清、胆汁などの体液中のビリルビンの測定法
としてはジアゾ分析法が知られているが、この方法では
ビリルビンの８つの異性体をそれぞれ分離して定量分析
することはできず８つの異性体の合計量として定量分析
できるだけである。従って高ピリルビン血症の検査など
その利用範囲は限られてりる。近時、ビリルビンの代謝
機構をさらに詳しく解明するため、またビリルビン代謝
系の疾病、例えば肝疾患、代謝酵素異常などの予防や治
療にも利用するために、液体クロアトグラ７イによるピ
リルビンの３つの異性体の分離定量分析が試みられてい
る。従来この液体クロマトグラフイとしては、シリカを
担体とする化学結合型逆相カラムと移動相としてアセト
リトリルもしくはメタノールと緩衝液との混合液を用い
る方法が知られている。しかしこの方法は、ビリルビン
の分子内に存在するカルボキシル基、イミノ基などの基
とカラム担体の残存シラノール基などとの相互作用など
の影響を受けてテーリングを起こし、８つの異性体の分
離が不充分で満足すべき結果が得られていない。
（ハ）発明の目的
この発明は上記の問題点を改善するためになされたもの
であって、試料中のどルビリンを８つの異性体に分離し
て定量分析することを目的とするものである。
であって、試料中のどルビリンを８つの異性体に分離し
て定量分析することを目的とするものである。
（ニ）発明の構成
この発明は、ビリルビン含有の試料を、移動相によって
化学結合型逆相カラムを通過させる液体クロマトグラフ
イに付してビルビリンを分離し、分離液の吸光強度を測
定して試料中のビリルビンを定景分析する方法であって
、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと、アセトニトリルと
、酸性緩衝液との混合液からなる酸性移動相を用いて、
ビリルビンの８つの異性体に分離して定量分析すること
を特徴とするビリルビンの分析法を提供するものである
。
化学結合型逆相カラムを通過させる液体クロマトグラフ
イに付してビルビリンを分離し、分離液の吸光強度を測
定して試料中のビリルビンを定景分析する方法であって
、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと、アセトニトリルと
、酸性緩衝液との混合液からなる酸性移動相を用いて、
ビリルビンの８つの異性体に分離して定量分析すること
を特徴とするビリルビンの分析法を提供するものである
。
この発明のビリルビンの分析法は、ビリルビンの分析用
に従来用いられている液体クロマトグラフイの移動相で
あるアセトニトリルもしくはメタノールと緩衝液との混
合液の代クに、Ｈ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下Ｄ
ＭＦと呼称）とアセトニトリルと酸性緩衝液との混合液
からなる酸性移動相を用いることを特徴とするもので、
テーリングを殆んど解消して試料中のビリルビンをその
８つの異性体朋α、■αおよび■αにシャープに分離し
て定量分析することができる。
に従来用いられている液体クロマトグラフイの移動相で
あるアセトニトリルもしくはメタノールと緩衝液との混
合液の代クに、Ｈ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下Ｄ
ＭＦと呼称）とアセトニトリルと酸性緩衝液との混合液
からなる酸性移動相を用いることを特徴とするもので、
テーリングを殆んど解消して試料中のビリルビンをその
８つの異性体朋α、■αおよび■αにシャープに分離し
て定量分析することができる。
この発明の分析法に用いられる液体クロマトグラフイの
カラムとしては例えばオクタデシルシリカなどの担体を
充填した化学結合型逆相カラムが用いられる。
カラムとしては例えばオクタデシルシリカなどの担体を
充填した化学結合型逆相カラムが用いられる。
移動相としてはＤＭＦ，アセトニトリルおよび酸性緩衝
液の混合液が用いられるが、ＤＭＦは４０〜７５容量チ
で用いられる。４０チ（以下チはすべて容量チを意味す
る）以下になるとテーリングが著しくなってシャープに
分離できなくなク、また７５チを超えるとＤＭＦは比較
的粘度が高いのでカラム内の圧力が高まりカラム性能が
劣化するなどの好ましくない現象が強くなる。従って特
に好ましい混合比率は４５，ｖＯ％である。
液の混合液が用いられるが、ＤＭＦは４０〜７５容量チ
で用いられる。４０チ（以下チはすべて容量チを意味す
る）以下になるとテーリングが著しくなってシャープに
分離できなくなク、また７５チを超えるとＤＭＦは比較
的粘度が高いのでカラム内の圧力が高まりカラム性能が
劣化するなどの好ましくない現象が強くなる。従って特
に好ましい混合比率は４５，ｖＯ％である。
移動相のｐＨは、酸性緩衝液（リン酸塩緩衝液、酢酸緩
衝液など，，＝Ｋ−．ｌｙ！５２，Ｆ＝！７ｆｐＨは低
い程３つの異性体の分離は良好であるが、ｐＨが低すぎ
ると機器腐蝕、カラム充填剤の劣化などの好甘レ〈ない
現象が起るので、この発明の分析法は一般にｐＨ２．０
〜５．０の範囲の移動相を用いて行われ好ましいのは２
．５〜４．０の範囲である。
衝液など，，＝Ｋ−．ｌｙ！５２，Ｆ＝！７ｆｐＨは低
い程３つの異性体の分離は良好であるが、ｐＨが低すぎ
ると機器腐蝕、カラム充填剤の劣化などの好甘レ〈ない
現象が起るので、この発明の分析法は一般にｐＨ２．０
〜５．０の範囲の移動相を用いて行われ好ましいのは２
．５〜４．０の範囲である。
そしてまず第一にＤＭＦの量と移動相のｐＨが選択され
る。この選択されたＤＭＦ量と移動相のｌ）Ｈの条件下
でビリルビンの８つの異性体が最短時間で良好に分離で
きるようにアセトニトリルによって保持時間が調節され
る。従ってアセトニトリルの量は、ＤＭＦの量と移動相
のｐＨに対応する酸性緩衝液の量とに関連して選択され
るが、移動相のｌθ〜８０チ程度で用いられる。
る。この選択されたＤＭＦ量と移動相のｌ）Ｈの条件下
でビリルビンの８つの異性体が最短時間で良好に分離で
きるようにアセトニトリルによって保持時間が調節され
る。従ってアセトニトリルの量は、ＤＭＦの量と移動相
のｐＨに対応する酸性緩衝液の量とに関連して選択され
るが、移動相のｌθ〜８０チ程度で用いられる。
この発明の移動相には他のテーリング防止剤例えばテト
ラプチルアンモニウｇＴＢＡ）やドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤ８）Ｚどを添加してもよい。
ラプチルアンモニウｇＴＢＡ）やドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤ８）Ｚどを添加してもよい。
上記のごとき液体クロマトグラフイによってビリルビン
の３異性体を分離して４５５ｎｍの波長光の吸光度を通
常の吸光度測定器で測定して８異性体の定量分析がなさ
れる。
の３異性体を分離して４５５ｎｍの波長光の吸光度を通
常の吸光度測定器で測定して８異性体の定量分析がなさ
れる。
（ホ）実施例と比較例
この発明を実施例と比較例によって詳しく説明する。
液体クロマトグラフイのカラムとしてはオクタデシルシ
リカを充填した内径４．６ｆｆｌｉ長さ１５ｃＩＩ１の
逆相カラム（島津デュポン社製）を、分離液の吸光度測
定器としては島津ＳＰＤ−１（４５５ｎｍ波長の吸光度
測定）を、ビリルビン試料としてはビリルビンスタンダ
ード２０〔日水商事（株）製，総ビリルビンｔ２０ｔＩ
４／ｄｌ）をそれぞれ用いた。
リカを充填した内径４．６ｆｆｌｉ長さ１５ｃＩＩ１の
逆相カラム（島津デュポン社製）を、分離液の吸光度測
定器としては島津ＳＰＤ−１（４５５ｎｍ波長の吸光度
測定）を、ビリルビン試料としてはビリルビンスタンダ
ード２０〔日水商事（株）製，総ビリルビンｔ２０ｔＩ
４／ｄｌ）をそれぞれ用いた。
実施例１，２および８
下記第１表の条件で前記試料のビリルビンを測定し、そ
の分析チャートを第１〜８図に示した。
の分析チャートを第１〜８図に示した。
第１〜８図のピークけいづれも左よりビリルビン、朋α
、■α、および■αのピークを示す。これらの図から明
らかなようにいずれもテーリングが殆んど認められず、
シャープにビリルビンの３異性体が分離定量されている
。
、■α、および■αのピークを示す。これらの図から明
らかなようにいずれもテーリングが殆んど認められず、
シャープにビリルビンの３異性体が分離定量されている
。
ｐＨが最も高い４．０の実施例ｌではアセトニトリルの
量を減少させて分離を向上させてお９、保持時間は長く
なるが良好に８異性体に分離定量されている。
量を減少させて分離を向上させてお９、保持時間は長く
なるが良好に８異性体に分離定量されている。
ｐＨが中位の３．０の実施例２ではアセトニ｝ＩＪルを
実施例１よジ増加させて保持時間を短かくしているが、
良好に８異性体が分離定量されている。
実施例１よジ増加させて保持時間を短かくしているが、
良好に８異性体が分離定量されている。
さらにｐＨが最低の２．７の実施例３ではアセトニトリ
ルを実施例２よク減少させたので保持時間は長くなって
いるがこれも良好に３異性体が分離定量されている。
ルを実施例２よク減少させたので保持時間は長くなって
いるがこれも良好に３異性体が分離定量されている。
比較例１および２
比較のために移動相にアセトニトリルと緩衝液とを主成
分として］）ＭＰを含有しないものを用い、下記第２表
の条件で分析して得たチャートを第４図と第５図に示し
た。これらのチャートから明らかなように著しくテーリ
ングレプロードなひとつのピークしか示さず８つの異性
体には分離されていない。
分として］）ＭＰを含有しないものを用い、下記第２表
の条件で分析して得たチャートを第４図と第５図に示し
た。これらのチャートから明らかなように著しくテーリ
ングレプロードなひとつのピークしか示さず８つの異性
体には分離されていない。
（ヘ）発明の効果
この発明によれば、血清、胆汁などの生体液中のビリル
ビンを３つの異性体に分離して定量分析することができ
、この発明はビリルビンの代討機購の解明やビリルビン
に関連する疾病、例えば肝疾患、代謝酵素異常などの予
防治ｇに利用できる。
ビンを３つの異性体に分離して定量分析することができ
、この発明はビリルビンの代討機購の解明やビリルビン
に関連する疾病、例えば肝疾患、代謝酵素異常などの予
防治ｇに利用できる。
なおこの発明の分析法は、ビリルビン抱合体やフォトビ
リルビンの分離定量分析にも逗用できるものと化゜じら
れる。
リルビンの分離定量分析にも逗用できるものと化゜じら
れる。
弟１〜３図はこの発明の分析法の実施例による分析テヤ
ート、第４〜５図は比戟例の分析チャートである。 代理人弁理士．０６ヵ％ａＭ］ｙ と；惟一一ｊ −２７４−’ ２７５
ート、第４〜５図は比戟例の分析チャートである。 代理人弁理士．０６ヵ％ａＭ］ｙ と；惟一一ｊ −２７４−’ ２７５
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 Ｌビリルピン含有の試料を、移動相によって化学結合型
逆相カラムを通過させる液体クロマトグラフイに付して
ビルビリンを分離し、分離液の吸光強度を測定して試料
中のビリルビンを定量分析する方法であって、 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドと、アセトニトリルと、
酸性緩衝液との混合液からなる酸性移動相を用いて、ビ
リルビンの８つの異性体に分離して定量分析することを
特徴とするビリルビンの分析法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7988583A JPS59203954A (ja) | 1983-05-06 | 1983-05-06 | ビリルビンの分析法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7988583A JPS59203954A (ja) | 1983-05-06 | 1983-05-06 | ビリルビンの分析法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59203954A true JPS59203954A (ja) | 1984-11-19 |
| JPH0423217B2 JPH0423217B2 (ja) | 1992-04-21 |
Family
ID=13702707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7988583A Granted JPS59203954A (ja) | 1983-05-06 | 1983-05-06 | ビリルビンの分析法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59203954A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63163275A (ja) * | 1986-12-26 | 1988-07-06 | Sekisui Chem Co Ltd | 血中ビリルビンの分画測定法 |
| EP1046914A1 (en) * | 1999-04-21 | 2000-10-25 | Mohammad Zouheir Dr. Habbal | Method and reagents for the determination of bilirubins |
-
1983
- 1983-05-06 JP JP7988583A patent/JPS59203954A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63163275A (ja) * | 1986-12-26 | 1988-07-06 | Sekisui Chem Co Ltd | 血中ビリルビンの分画測定法 |
| EP1046914A1 (en) * | 1999-04-21 | 2000-10-25 | Mohammad Zouheir Dr. Habbal | Method and reagents for the determination of bilirubins |
| WO2000065359A1 (en) * | 1999-04-21 | 2000-11-02 | SALWAN, Nehmé | Method and reagents for the determination of bilirubins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0423217B2 (ja) | 1992-04-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Carr et al. | Fluorescence studies of the stationary-phase chemical environment in reversed-phase liquid chromatography | |
| Walters et al. | An ultramicromethod for the determination of conjugated and total bilirubin in serum or plasma | |
| DE69016423T2 (de) | Bestimmungsmethode für glykosyliertes hämoglobin. | |
| JP4953477B2 (ja) | 改良されたビタミンｄ測定 | |
| Marra et al. | High-performance liquid chromatographic assay of asymmetric dimethylarginine, symmetric dimethylarginine, and arginine in human plasma by derivatization with naphthalene-2, 3-dicarboxaldehyde | |
| Taniguchi et al. | Quantitative determination of metanephrine and normetanephrine in urine | |
| US5004546A (en) | Process for measuring stable-type glycated hemoglobin in a sample | |
| Soldin et al. | Simultaneous liquid-chromatographic analysis for 4-hydroxy-3-methoxymandelic acid and 4-hydroxy-3-methoxyphenylacetic acid in urine. | |
| Yokoyama et al. | Separation and determination of amino acids, creatinine, bioactive amines and nucleic acid bases by dual-mode gradient ion-pair chromatography | |
| Kessler et al. | A semiautomated nonincineration technique for determining serum thyroxine | |
| Campillo et al. | Glyoxal and methylglyoxal determination in urine by surfactant-assisted dispersive liquid–liquid microextraction and LC | |
| EP1092978A1 (en) | Method and device for determining the concentration of heparin in a sample of fluid | |
| JPS59203954A (ja) | ビリルビンの分析法 | |
| Scott et al. | Advances in the application of high resolution liquid chromatography to the separation of complex biological mixtures | |
| JPH0532040B2 (ja) | ||
| Vollmer et al. | Isocratic reverse-phase liquid chromatography assay for amino acid metabolic disorders using eluates of dried blood spots | |
| Beale et al. | Rapid incremental methods for the determination of serum iron and iron-binding capacity | |
| Williams et al. | Differential ultraviolet spectrophotometric determination of serum salicylates | |
| US5460970A (en) | Separation of acetaldehyde-induced hemoglobin (Hb A1-AcH) | |
| US4789525A (en) | Analytical method and multilayer element for total ionic iron determination | |
| US5955374A (en) | Method of detection of bilirubin in urine on an automated analyzer | |
| Defreese et al. | Properties and determination of serum bilirubin | |
| EP0579246A1 (en) | Method for removing unstable type saccharified hemoglobin | |
| Akaoka et al. | Determination of hypoxanthine and xanthine in plasma separated by thin-layer chromatography | |
| JPS5938651A (ja) | カテコ−ルアミンの定量法 |