JPH0532040B2

JPH0532040B2 -

Info

Publication number: JPH0532040B2
Application number: JP59174630A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Wada; Juzo Kosaka
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1984-08-22
Filing date: 1984-08-22
Publication date: 1993-05-14
Also published as: DE3443415A1; GB2164149B; GB8427424D0; GB2164149A; US4716110A; JPS6152300A; DE3443415C2

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は液体特に体液中の過酸化水素を測定す
るための試薬組成物に関するものである。

（従来技術）今日、過酸化水素の測定は医療分野における臨
床検査をはじめとして、化学産業、食品産業、公
衆衛生等の各分野で非常に広い範囲で実施されて
いる。特に臨床検査においては酵素を利用する体
液成分の分析法が急速に普及しており、その中で
も、過酸化水素の測定は重要な位置を占めてい
る。それというのも、成分に酸化酵素を作用させ
て過酸化水素を生成させ、この過酸化水素を測定
するというような比較的簡単な方法で分析可能な
体液中の成分が非常に多いからである。代表的な
成分／酸化酵素の組み合せとしてはグルコース／
グルコースオキシダーゼ、コレステロール／コレ
ステロールオキシダーゼ、尿酸／ウリカーゼ、ア
ミノ酸／アミノ酸オキシダーゼ、ピルビン酸／ピ
ルビン酸オキシダーゼ等があげられる。

さて、生じた過酸化水素は種々の方法で測定さ
れるが、パーオキシダーゼの存在下、色原体を酸
化させることにより色素を形成させ比色定量する
方法が最も一般的に行なわれている。このような
色原体は一般に分子中にアミノ基、水酸基を有し
ており、安定で色素形成能力の大きい色原体が選
択される。最も多用される色原体はトラインダー
（Trinder）試薬として知られる４−アミノアン
チピリンとフエノールの組み合せであるが、近
年、その変型も多数報告されている。

一方、体液中の成分を測定するための試薬組成
物を担体に固着させるいわゆるドライケミストリ
ーの分野では、色原体としてベンチジン誘導体、
殊にｏ−トリジンが好んで使用されてきた。とい
うのは、この物質を色原体として使用した場合、
非常に鋭敏な感度が得られ、可視光線領域の長波
長側に極大吸収を有する色素を生成するため、共
存する種々の着色成分の影響を受けにくいなどい
くつかの利点が存在するからである。しかしなが
らｏ−トリジンは発癌性を有しているとみなされ
ており、この物質を使用する試験用具の製造に際
しては特別の注意を払わなければならないという
問題がある。

近年、ｏ−トリジンの特性を生かしつつ、発癌
性を有していないとみなされる色原体が開発され
た。これは、ベンチジン３，3′，５，5′位がそれ
ぞれメチル基で置換された化合物である〔V.R.
ホランド（Holland）ら、テトラヘドロン
（Tetrahedron）、30巻、3299〜3302頁（1974年）
参照〕。又、西独国特許第2460903号には、３，
3′，５，5′位がメチル以外のアルキル基で置換さ
れたベンチジンも同様に色原体として使用可能で
あることが記述されている。

しかしながら、これらベンチジン誘導体は、い
ずれも水に対する溶解性が極めて悪く、このた
め、酸性PH領域において、限られた濃度範囲で使
用可能であるにすぎない。これは、酵素を利用す
る体液中成分の分析がほとんど中性付近で実施さ
れることから考えて、重大な欠点といつてよい。
これらベンチジン誘導体が主として試験片に用い
られているのも、上述の欠点を考慮してのことで
ある。但し、これらのベンチジン誘導体を使用し
た試験片においても、上述の欠点にもとづく不利
益は解消されず、過酸化水素の生成量が非常に少
ない場合にのみ使用可能であるにすぎない。

このため、測定可能な過酸化水素の濃度範囲を
拡大するための工夫が試みられており、他の色原
体と混合して用いる方法が報告されている（特公
昭57−5520号公報）。

又、３，3′，５，5′−テトラアルキルベンチジ
ンが水に対して難溶性であることの別の不利益
は、試験片の製造時にももたらされる。例えば、
体液中のグルコースを測定するための試験片を製
造する場合、一般に酵素、緩衝物質、色原体から
なる含浸水溶液が調製されるが、３，3′，５，
5′−テトラアルキルベンチジンを色原体として選
択した時、単一の含浸水溶液を得ることは非常に
難かしい。このため、酵素、緩衝物質を含浸する
工程と色原体を含浸する工程とにわけたり（特公
昭57−29160号公報）、色原体含浸水溶液に媒染剤
を加えたり（アメリカ合衆国特許第4361648号）
するなどの対策が考えられている。

本発明者は上述の欠点を考慮しつつ、鋭意研究
し、本発明を完成させた。

（発明の目的）本発明は上記従来技術における問題点を解決す
るためのものであり、その目的とするところは、
３，3′，５，5′−テトラアルキルベンチジンの特
性を生かしつつ、水に対する溶解性にすぐれ、巾
広いPH領域で使用可能であり且つ試験溶液および
試験片の両方に使用可能な色原体を提供すること
にある。

（発明の構成）すなわち本発明の過酸化水素測定用組成物は、
パーオキシダーゼ若しくは体液中の成分と反応し
て過酸化水素を生成する酵素とパーオキシダーゼ
との組み合わせより成る酵素、緩衝物質および色
原体を含んで成る過酸化水素測定用組成物におい
て、色原体として一般式：〔式中、R₁，R₂，R₃およびR₄は同一又は異な
り、各々炭素原子数１ないし６の直鎖アルキル基
を表わし、 R₅およびR₆は水素原子又は次式： −（CH₂）_oSO₃H （）（式中、ｎは１ないし６の整数を表わす。）で表
わされるスルホアルキル基を表わし、且つ少なく
ともR₅およびR₆のいずれか一方は該スルホアル
キル基を表わすものであり、更に該スルホアルキ
ル基はヒドロキシル基の少なくとも１個により置
換されていてもよい。〕で表わされる３，3′，５，5′−テトラアルキルベ
ンチジンのスルホアルキル誘導体又はその水溶性
塩を含むことを特徴とする。

本発明者らは、色原体として上記一般式（）
で表わされる化合物又はその水溶性塩を使用する
と感度が良く、且つ高濃度の過酸化水素も定量的
に測定し得ることを見い出した。

本発明において好適に使用される化合物を以下
に記載するが、もちろんこれらに限定されるもの
ではない：Ｎ−（２−スルホエチル）−３，3′，５，5′−テ
トラメチルベンチジン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，3′，５，5′−
テトラメチルベンチジン、Ｎ−（４−スルホプチル）−３，3′，５，5′−テ
トラメチルベンチジン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，3′，５，5′−
テトラエチルベンチジン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
３，3′，５，5′−テトラメチルベンチジン、Ｎ，N′−ビス（２−スルホエチル）−３，3′，
５，5′−テトラメチルベンチジン、Ｎ，N′−ビス（３−スルホプロピル）−３，3′，
５，5′−テトラメチルベンチジン、Ｎ，N′−ビス（４−スルホブチル）−３，3′，
５，5′−テトラメチルベンチジン、Ｎ，N′−ビス（３−スルホプロピル）−３，3′，
５，5′−テトラエチルベンチジン、Ｎ，N′−ビス（２−ヒドロキシ−２−スルホ
エチル）−３，3′，５，5′−テトラメチルベンチ
ジン、Ｎ，N′−ビス（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−３，3′，５，5′−テトラメチルベン
チジン。

上記の化合物を色原体として用いる場合には、
一種類のみでもまた数種類を併用してもよく、
又、他の色原体と組み合せて使用することも可能
である。

これらの化合物はほとんど文献未記載のもので
あるが、公知方法により容易に製造することがで
きる。

例えば、３，3′，５，5′−テトラアルキルベン
チジンに相当するサルトンを反応させる〔小田
ら、工業化学雑誌、59巻９号、1028〜1030頁
（1956年）参照〕方法や、３，3′，５，5′−テト
ラアルキルベンチジンと分子末端にハロゲンを有
するアルキルスルホン酸又はヒドロキシアルキル
スルホン酸とを反応させる〔N.E.グツド
（Good）ら、アナリテイカルバイオケミストリ
ー（Analytical Biochemistry）、104巻、300〜
310頁（1980年）参照〕方法などがあげられる。

本発明の組成物に使用する３，3′，５，5′−テ
トラアルキルベンチジン誘導体は、従来、過酸化
水素の測定に使用されてきたすべての色原体のか
わりに使用することができる。とりわけ、分析工
程の中間に過酸化水素を生成させる方法にもとづ
く体液成分の酵素的測定に使用するのが、有利で
ある。それというのも、本発明の化合物は、特に
水に対して優れた溶解性を示すため、緩衝物質、
パーオキシダーゼ若しくは体液中の成分と反応し
て過酸化水素を生成する酵素とパーオキシダーゼ
との組み合わせからなる酵素と混合して安定な単
一の試験溶液とすることができると同時に、高濃
度の過酸化水素まで感度良く定量可能で、共存す
る着色成分の影響を受けにくい等、数々の利点を
併せ持つからである。

さらに、本発明の組成物に使用する色原体化合
物をパーオキシダーゼ若しくは体液中の成分と反
応して過酸化水素を生成する酵素とパーオキシダ
ーゼとの組み合わせからなる酵素、緩衝物質とと
もに吸収性担体に包含させ、使用の際、便利なよ
うに該担体をプラスチツク等の支持体に貼付せし
め、試験片とした場合、特に簡便で貯蔵安定性に
優れた試験用具を得ることができる。最も多用さ
れる吸収性担体は紙であるが、不織物、綿、木
片等も使用可能である。又、試験用試薬組成物を
所望により適当な接着剤例えばゼラチン、合成樹
脂等とともに上記プラスチツクシート等の支持体
に塗布、乾燥することにより固着させることも可
能であり、更に種々の変形が容易になし得ること
は明らかである。

以下の実施例において本発明を更に詳細に説明
する。なお、本発明は下記実施例に限定されるも
のではない。

色原体化合物の製造：製造例１Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，3′，５，5′−
テトラメチルベンチジンナトリウム塩の合成 24.0ｇの３，3′，５，5′−テトラメチルベンチ
ジンを１−プロパノール100mlに溶解する。１，
３−プロパンサルトン24.4ｇをメタノール100ml
に溶かして前記溶液に加え、約３時間加熱還流す
る。室温まで冷却し、1NNaOH水溶液を加えて
中和した後、溶媒を蒸発乾固する。メタノール／
アセトンで再結晶し、白色結晶20ｇを得た。（収
率35％）薄層クロマトグラフイー〔シリカゲルプレート
（メルク社製）、展開溶媒；２−プロパノール：酢
酸：水＝50：15：20〕UV吸収あり、ニンヒドリ
ン反応（＋）Rf＝0.25 赤外吸収スペクトル〓NH3400cm^-1、〓Ｃ＝C1620cm^-1、〓CN1260cm^-1、〓SO₃1200、1050cm^-1 製造例２Ｎ，N′−ビス（２−ヒドロキシ−２−スルホ
エチル）−３，3′，５，5′−テトラメチルベン
チジンナトリウム塩の合成 12.02ｇの３，3′，５，5′−テトラメチルベンチ
ジンを500mlの２−プロパノールに溶解する。52
ｇの２−クロロ−１−ヒドロキシエタンスルホン
酸ナトリウムを300mlの水に溶かして前記溶液に
加える。次いで４ｇのNaOHを加え、約16時間
加熱還流する。室温まで冷却し、溶媒を蒸発乾固
する。残渣をメタノールに溶解しシリカゲル（カ
ラムクロマト用シリカゲルNo.１；半井化学社製）
を充填したカラムを用いてクロマトグラフイーに
かけ傾斜溶離する。（溶媒；クロロホルム／メタ
ノール）。各溶離液について薄層クロマトグラフ
イー〔シリカゲルプレート（メルク社製）；展開
溶媒、２−プロパノール：酢酸：水＝50：15：
20〕を行ない、Rf＝0.07にUV吸収を有するフラ
クシヨンを集めた後溶媒を除去し、白色結晶5.3
ｇ（収率20％）を得た。

赤外吸収スペクトル〓OH3500cm^-1、〓NH3400cm^-1、〓Ｃ＝C1620cm^-1、〓CN1260cm^-1、〓SO₃1200、1050cm^-1 過酸化水素測定用組成物の調製：実施例１Ｎ，N′−ビス（３−スルホプロピル）−３，3′，
５，5′−テトラメチルベンチジンナトリウム塩
200mg、パーオキシダーゼ（100IU／mg）10mg、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン1.21
ｇ、クエン酸（１水和物）210ｇ、水酸化ナトリ
ウム0.85ｇを精製水に溶解し、全量100mlとし、
反応液（PH6.5）とする。

実施例２グルコースオキシダーゼ（1200IU／ｇ）0.96
ｇ、パーオキシターゼ（100IU／mg）0.15ｇ、ポ
リビニルピロリドン（MW40000）5.0ｇＮ−（３
−スルホプロピル）−３，3′，５，5′−テトラメ
チルベンチジンナトリウム塩0.8ｇ、クエン酸
（１水和物）1.98ｇ、クエン酸三ナトリウム（２
水和物）10.44ｇ、EDTA・2Na0.1ｇを精製水に
溶解し全量100mlとする。

過酸化水素測定用検量線の作製：０、10、20、30、40ｍＭ／に調製した過酸化
水素水溶液各々10μに実施例１で調製した本発
明の組成物を含む反応液3.0mlを加え、37℃恒温
槽に５分間浸漬し、発色させる。25℃まで冷却
後、波長665nｍで吸光度（又は光学密度；
optical dencity、O.D）を測定する。ブランクの
吸光度を差し引くことにより、ΔO.Dを求め、横
軸に過酸化水素濃度、縦軸にΔO.Dをとり、検量
線を作製した。第１図に示す如く、検量線は過酸
化水素濃度40ｍＭ／まで原点を通る直線となつ
た。したがつて比色分析により過酸化水素濃度を
正確に定量できることが判る。

尿中グルコース測定用試験片の製造：実施例２で調製した溶液にシユライヒア・ウン
ト・シユル（Schleicher＆Schull）社製No.2316の
紙を浸し、60℃で30分間乾燥した。得られた試
験紙を５mm×５mmに切断し、接着テープを用いて
５mm×60mmのポリスチレンシートに貼り付けて尿
中グルコース測定用試験片を製造した。

第２図に試験片を示す。図中１は試験紙、２は
ポリスチレンシートである。

比較試験片の製造：上記本発明組成物の含浸溶液からＮ−（３−ス
ルホプロピル）−３，3′，５，5′−テトラメチル
ペンチジンナトリウム塩を除いた溶液に上記と同
じ紙を浸して60℃、30分間乾燥した後、0.5％
３，3′，５，5′−テトラメチルベンチジン−アセ
トン溶液に再び浸して真空乾燥する。得られた試
験紙を上記と同様の操作で試験片とした。

グルコース濃度の測定：濃度の異なるグルコース標準液に本発明の組成
物を使用して製造した試験片及び比較試験片を
各々瞬時浸し、過剰の液を除去した後、正確に20
秒間反応させた後色差計（カラーデイフアレンス
コンピユーター日本電色 ND−504DE）を
用いて、660nｍの波長で反射率を測定した。横
軸をグルコース濃度、縦軸を反射率とすると、第
３図に示すような検量線が得られる。

図からわかるように、テトラメチルベンチジン
を色原体として用いた試験片は本発明にもとずく
試験片に比べてグルコース濃度が低い領域では感
度が低く、又50mg／dl以上のグルコース濃度では
反射率の変化が小さい。そして250mg／dl以上で
はほゞ一定の反射率を示すことから、この試験片
の測定可能なグルコース濃度範囲は０〜250mg／
dlである。

これに対し、本発明にもとづく試験片は比較試
験片よりも感度が高く、又2000mg／dlのグルコー
ス濃度まで明瞭な反射率の変化が認められる。従
つてこの試験片の測定可能なグルコース濃度範囲
は０〜2000mg／dlであり、本発明の過酸化水素測
定用組成物を使用して製造した試験片は従来の過
酸化水素測定用組成物を使用して製造した比較試
験片に比べて広いグルコース濃度範囲に適用可能
であることが判る。又、グルコース以外に、適す
る酵素及び緩衝物質を用いることにより、本発明
の組成物及び該組成物を使用して製造した試験片
は体液中に含まれる種々の成分の定量に用いるこ
とができることは勿論である。

（発明の効果）上述のように、本発明の過酸化水素測定用組成
物は色原体として３，3′，５，5′−テトラアルキ
ルベンチジンのスルホアルキル誘導体又はその水
溶性塩を使用するものであるため、従来の３，
3′，５，5′−テトラアルキルベンチジンを原色体
として使用する過酸化水素測定用組成物に比べて
水に対する溶解性が著しく向上すると共に、より
幅広いPH領域で使用可能となつた。

又、水に対する溶解性が優れているため従来の
組成物を使用する場合に比べて水溶液中の成分の
より高感度でより広い濃度範囲にわたる定量分析
が可能となつた。

更に体液中の各種成分測定用の試験片の製造時
においても水溶液から過酸化水素測定用組成物を
担体に一工程で担持できるため、試験片の製造工
程を簡略化でき且つ従来の組成物を使用した試験
片に比べてより高感度でより広い濃度範囲にわた
つて使用可能な試験片を得ることができる。

このように本発明の過酸化水素測定用組成物は
水溶液の形態でも試験片の形態でも使用すること
ができ且つ種々の変形も可能であるため、体液中
の各種成分の正確で簡便迅速な定量分析に優れた
効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の過酸化水素測定用組成物を使
用して作製した検量線を示すグラフ、第２図は本
発明の組成物を使用して製造した尿中グルコース
測定用試験片の一実施例の斜視図、第３図は本発
明の組成物を使用した試験片と比較試験片を用い
て測定した、グルコース濃度と色差計から読み取
つた試験紙表面の一定波長での反射率との関係を
示すグラフである。図中、１……試験紙、２……ポリシチレンシー
ト。

Claims

【特許請求の範囲】１パーオキシダーゼ若しくは液体中の成分と反
応して過酸化水素を生成する酵素とパーオキシダ
ーゼとの組み合わせより成る酵素、緩衝物質およ
び色原体を含んで成る過酸化水素測定用組成物に
おいて、色原体として一般式：〔式中、R₁，R₂，R₃およびR₄は同一又は異な
り、各々炭素原子数１ないし６の直鎖アルキル基
を表わし、 R₅およびR₆は水素原子又は次式： −（CH₂）_oSO₃H （）（式中、ｎは１ないし６の整数を表わす。）で表
わされるスルホアルキル基を表わし、且つ少なく
ともR₅およびR₆のいずれか一方は該スルホアル
キル基を表わすものであり、更に該スルホアルキ
ル基はヒドロキシル基の少なくとも１個により置
換されていてもよい。〕で表わされる３，3′，５，5′−テトラアルキルベ
ンチジンのスルホアルキル誘導体又はその水溶性
塩を含むことを特徴とする過酸化水素測定用組成
物。