JPS63163275A - 血中ビリルビンの分画測定法 - Google Patents
血中ビリルビンの分画測定法Info
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- JPS63163275A JPS63163275A JP61310902A JP31090286A JPS63163275A JP S63163275 A JPS63163275 A JP S63163275A JP 61310902 A JP61310902 A JP 61310902A JP 31090286 A JP31090286 A JP 31090286A JP S63163275 A JPS63163275 A JP S63163275A
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、血中アルブミンの高速液体クロマトグラフィ
ーによる分画測定法に関する。
ーによる分画測定法に関する。
（従来の技術）
ビリルビンは、ヘモグロビンの正常ｉ（謝産物であり、
遊離体、モノグルクロン酸包合体あるいはジグルクロン
酸包合体として胆液中に多量に含まれる。このビリルビ
ンの血中濃度は極めて低いが。
遊離体、モノグルクロン酸包合体あるいはジグルクロン
酸包合体として胆液中に多量に含まれる。このビリルビ
ンの血中濃度は極めて低いが。
例えば肝機能が低下し、黄度が発症するとその濃度は上
昇する。そのため、血中ビリルビンの測定は肝機能検査
の代表的な項目のひとつとなっている。
昇する。そのため、血中ビリルビンの測定は肝機能検査
の代表的な項目のひとつとなっている。
血中ビリルビンは、ジアゾカップリングにより生じる色
素を検出する方法により従来から測定がなされてきた。
素を検出する方法により従来から測定がなされてきた。
このジアゾ反応法は、最も一般的なビリルビンの測定法
であり、特にアルコールをカンプリング試薬とするＭａ
ｌｌｏｙ−Ｅｖｅｌｙｎ法Ｕ、 ｌ１ｉｏｌ。
であり、特にアルコールをカンプリング試薬とするＭａ
ｌｌｏｙ−Ｅｖｅｌｙｎ法Ｕ、 ｌ１ｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、、 １１９．４８１． （１９３７） ）が
、その簡便性から臨床検査において広く用いられている
。しかし。
、その簡便性から臨床検査において広く用いられている
。しかし。
上記ジアゾ反応法は１反応時のｐＨにより発色色調が変
化する；あるいは９反応時間により発色強度が異なるた
め高精度の測定がなされ得ないという欠点がある。さら
に、遊離型あるいはグルクロン酸包含型として存在する
血中の各ビリルビン成分を個々に測定することができな
い。最近ではアルブミンと強く共有結合していると考え
られるデルタビリルビン（Ｂｓ）の存在が黄厄患者の血
清中で新たに確認されており、このデルタビリルビンが
総ビリルビンに占める割合が肝機能を反映することが知
られるようになった。そのため、デルタビリルビンをは
じめとする各ビリルビン成分の分画測定法の開発が望ま
れている。
化する；あるいは９反応時間により発色強度が異なるた
め高精度の測定がなされ得ないという欠点がある。さら
に、遊離型あるいはグルクロン酸包含型として存在する
血中の各ビリルビン成分を個々に測定することができな
い。最近ではアルブミンと強く共有結合していると考え
られるデルタビリルビン（Ｂｓ）の存在が黄厄患者の血
清中で新たに確認されており、このデルタビリルビンが
総ビリルビンに占める割合が肝機能を反映することが知
られるようになった。そのため、デルタビリルビンをは
じめとする各ビリルビン成分の分画測定法の開発が望ま
れている。
上記ビリルビンを、ジアゾ反応により間接的に測定する
のではなく直接的に測定すれば、その精度は高くなると
考えられる。このような直接分画測定法としては、各種
クロマトグラフィー法、特に逆相系の高速液体クロマト
グラフィー法（）ＨＰＬＣ法）がある。逆相系のクロマ
トグラフィーにおいては、 Ｂｓを除く各ビリルビン成
分〔ジグルクロン酸抱合型どりルピン（ＢＤＣ） 、モ
ノグルクロン酸抱合型ビリルビン（ＢＭＣ） 、遊離ビ
リルビン（ＢＩＪ） 〕は、移動相中の有機溶媒濃度が
５０容量％以上でないと溶出されない。しかし、このよ
うな有機溶媒濃度の高い条件下においては、各種血中蛋
白（アルブミンやグロブリン）およびアルブミンと結合
した形態である上記Ｂｓが凝集・析出するためＢｓは溶
出されず、かつ数回の測定でカラムの目詰まりを生じる
。
のではなく直接的に測定すれば、その精度は高くなると
考えられる。このような直接分画測定法としては、各種
クロマトグラフィー法、特に逆相系の高速液体クロマト
グラフィー法（）ＨＰＬＣ法）がある。逆相系のクロマ
トグラフィーにおいては、 Ｂｓを除く各ビリルビン成
分〔ジグルクロン酸抱合型どりルピン（ＢＤＣ） 、モ
ノグルクロン酸抱合型ビリルビン（ＢＭＣ） 、遊離ビ
リルビン（ＢＩＪ） 〕は、移動相中の有機溶媒濃度が
５０容量％以上でないと溶出されない。しかし、このよ
うな有機溶媒濃度の高い条件下においては、各種血中蛋
白（アルブミンやグロブリン）およびアルブミンと結合
した形態である上記Ｂｓが凝集・析出するためＢｓは溶
出されず、かつ数回の測定でカラムの目詰まりを生じる
。
ＬａｕｆｆらはＢｓをＨＰＬＣで分離するため、アルブ
ミンを除く他の血中蛋白（グロブリンなど）を数段階の
前処理操作により除去している（ Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１
ｎｉｃａｌＣｈｅ ２８．６２９． （１９８２） ）
、このような前処理操作によりＢｓの分離・測定が可
能となるが前処理操作が繁雑であるうえ９ｓは光に不安
定であるため前処理操作中に分解して高精度の測定が行
われにくいという欠点がある。
ミンを除く他の血中蛋白（グロブリンなど）を数段階の
前処理操作により除去している（ Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１
ｎｉｃａｌＣｈｅ ２８．６２９． （１９８２） ）
、このような前処理操作によりＢｓの分離・測定が可
能となるが前処理操作が繁雑であるうえ９ｓは光に不安
定であるため前処理操作中に分解して高精度の測定が行
われにくいという欠点がある。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。
その目的とするところは、血中のデルタビリルビンを含
む各ビリルビン成分を高精度で分画測定する方法を提供
することにある。本発明の他の目的は、上記各ビリルビ
ン成分を繁雑な前処理操作を行うことなく、逆相系の高
速液体クロマトグラフィーを用いて分画測定する方法を
提供することにある。
む各ビリルビン成分を高精度で分画測定する方法を提供
することにある。本発明の他の目的は、上記各ビリルビ
ン成分を繁雑な前処理操作を行うことなく、逆相系の高
速液体クロマトグラフィーを用いて分画測定する方法を
提供することにある。
（問題点を解決するための手段）
本発明の血中ビリルビンの分画測定法は、（ａ）親水性
充填剤が固定相として充填された分離カラムに血清もし
くは血漿を含む試料を導入して蛋白成分およびビリルビ
ンを該充填剤に吸着させる工程。
充填剤が固定相として充填された分離カラムに血清もし
くは血漿を含む試料を導入して蛋白成分およびビリルビ
ンを該充填剤に吸着させる工程。
（ｂ）該分離カラムに、ｐＨ２〜５の水性溶液を主成分
とし４０容量％以下の割合で有機溶媒を含有する溶離液
を移動相として供給し、アルブミン画分、グロブリン画
分およびデルタビリルビンを溶出させる工程、および（
ｃ）該分離カラムに該（ｂ１項よりも有機溶媒濃度の高
い溶離液を移動相として供給し。
とし４０容量％以下の割合で有機溶媒を含有する溶離液
を移動相として供給し、アルブミン画分、グロブリン画
分およびデルタビリルビンを溶出させる工程、および（
ｃ）該分離カラムに該（ｂ１項よりも有機溶媒濃度の高
い溶離液を移動相として供給し。
デルタビリルビン以外の各ビリルビン画分を順次溶出さ
せる工程を包含する逆相高速液体クロマトグラフィーに
よる分画測定法であり、そのことにより上記目的が達成
される。
せる工程を包含する逆相高速液体クロマトグラフィーに
よる分画測定法であり、そのことにより上記目的が達成
される。
本発明方法は９例えば、第１図に示される測定装置によ
り具体化される。この装置は、溶離液（移動相）１を収
容する溶離液槽１１と、定流量ポンプ１２を介してこの
槽１１に連結される試料導入装置２と、該試料導入装置
２に連結される分離カラム３とを有する。溶離液１は、
後述のようにその有機溶媒含有率を変化させる必要があ
るため１本装置においては、緩衝液などの水性溶液でな
る第１溶離液１ａを収容する第１溶離液槽１１ａおよび
有機溶媒でなる第２溶離液１ｂを収容する第２溶離液槽
１１ｂが備えられている。定流量ポンプ１２には濃度勾
配装置１３が接続されており、これにより第１溶離液１
ａおよび第２溶離液１ｂが所望の度合に混合される。分
離カラム３には検出器４１が接続されており、ここで検
出された値は記録計４１に表示される。
り具体化される。この装置は、溶離液（移動相）１を収
容する溶離液槽１１と、定流量ポンプ１２を介してこの
槽１１に連結される試料導入装置２と、該試料導入装置
２に連結される分離カラム３とを有する。溶離液１は、
後述のようにその有機溶媒含有率を変化させる必要があ
るため１本装置においては、緩衝液などの水性溶液でな
る第１溶離液１ａを収容する第１溶離液槽１１ａおよび
有機溶媒でなる第２溶離液１ｂを収容する第２溶離液槽
１１ｂが備えられている。定流量ポンプ１２には濃度勾
配装置１３が接続されており、これにより第１溶離液１
ａおよび第２溶離液１ｂが所望の度合に混合される。分
離カラム３には検出器４１が接続されており、ここで検
出された値は記録計４１に表示される。
この測定装置により血中のビリルビンを測定するには、
まず、第１溶離液１ａを定流量ポンプ１２を介して分離
カラム３へ導入する。この第１溶離液１ａは水性溶液１
通常、酢！２緩衝液などの各種緩衝液が用いられ、その
ｐＨは２〜５．好ましくは３〜４の範囲である。ｐＨが
５を越える中性〜アルカリ領域ではビリルビンが不安定
となり２分解しやす（なる。さらにｐＨが１２を越える
と血中の各種蛋白が凝集・沈澱するためカラムの目づま
りを引き起こす。次に、血清、血漿などの試料が試料導
入装置２から注入され、上記第１溶離液１ａと混合して
分離カラム３へ供給される。分離カラム３には固定相と
して２通常の逆相クロマトグラフィーに用いられる充填
剤が充填されている。この充填剤は、好ましくは蛋白質
を非特異的に吸着しない、比較的親水性の高いゲルが用
いられる。例えば、水酸基、カルボキシル基、エーテル
基などの親水性の基をその表面に有する高分子系ゲルが
用いられる。その素材としてはアクリル酸エステルやメ
タクリル酸エステルを（共）重合成分とする（メタ）ア
クリル酸エステル系樹脂が挙げられる。
まず、第１溶離液１ａを定流量ポンプ１２を介して分離
カラム３へ導入する。この第１溶離液１ａは水性溶液１
通常、酢！２緩衝液などの各種緩衝液が用いられ、その
ｐＨは２〜５．好ましくは３〜４の範囲である。ｐＨが
５を越える中性〜アルカリ領域ではビリルビンが不安定
となり２分解しやす（なる。さらにｐＨが１２を越える
と血中の各種蛋白が凝集・沈澱するためカラムの目づま
りを引き起こす。次に、血清、血漿などの試料が試料導
入装置２から注入され、上記第１溶離液１ａと混合して
分離カラム３へ供給される。分離カラム３には固定相と
して２通常の逆相クロマトグラフィーに用いられる充填
剤が充填されている。この充填剤は、好ましくは蛋白質
を非特異的に吸着しない、比較的親水性の高いゲルが用
いられる。例えば、水酸基、カルボキシル基、エーテル
基などの親水性の基をその表面に有する高分子系ゲルが
用いられる。その素材としてはアクリル酸エステルやメ
タクリル酸エステルを（共）重合成分とする（メタ）ア
クリル酸エステル系樹脂が挙げられる。
シリカゲルにオクタデシルシラノール基を導入したＯＤ
Ｓ系逆相クロマトグラフィー用ゲルにアルブミンを化学
結合させて親水性を高めた充填剤も好適に用いられる。
Ｓ系逆相クロマトグラフィー用ゲルにアルブミンを化学
結合させて親水性を高めた充填剤も好適に用いられる。
試料中のどリルビンおよび血清蛋白などは、ここで固定
相に吸着する。第り溶離液１ａを適当な時間にわたり流
した後、濃度勾配装置１３により第２溶離液１ｂを系内
に導入し、第１溶離液１ａおよび第２溶離液１ｂの混合
液が移動相として分離カラム３に供給されるようにする
。
相に吸着する。第り溶離液１ａを適当な時間にわたり流
した後、濃度勾配装置１３により第２溶離液１ｂを系内
に導入し、第１溶離液１ａおよび第２溶離液１ｂの混合
液が移動相として分離カラム３に供給されるようにする
。
第２？′８離液１ｂとしては、水と相溶しうる有機溶媒
９通常アセトニトリルおよび／またはメタノールが使用
される。この有機溶媒濃度は溶離液１全体の４０容量％
以下に設定される。有機溶媒が４０容量％を越えると血
中の蛋白が凝固・沈澱するためカラムに目づまりを生じ
る。このような有機溶媒濃度が４０容量％以下の移動相
（溶離液１）を分離カラム３に導入することにより、ア
ルブミン、グロブリンおよびデルタビリルビン（アルブ
ミン結合型ビリルビン）が溶出される。通常、有機溶媒
濃度をＯから４０容量％に徐々に高める方法が採用され
る。次に、 ｔＭ度勾配装置１３により第２溶離液１ｂ
が溶離液ｌ全体に占める割合を段階的に高める。有機溶
媒濃度を上げることによりデルタビリルビン以外のビリ
ルビン成分、つまりジグルクロン酸包合型ビリルビン、
モノグルクロン酸包合型ビリルビンおよび遊離型ビリル
ビンが順次溶出される。遊離型ビリルビンが光により異
性化した異性体が存在する場合は、この異性体も溶出さ
れる。゛ビリルビンはテトラビロール骨格を有するため
一分子あたり４個の２級アミン基を有する。このアミノ
基はプラスの電荷を有するため、カラム内の親水性の充
填剤に吸着しにくいことがある。そのためビリルビン成
分がカラム内に保持されずに溶出したり１分離が不充分
である場合も生じる。そのような場合には、移動相に微
量のアルキルスルホン酸塩を添加することが推奨される
。アルキルスルホン酸塩の添加により荷電が中和され、
かつ疎水性が高められるためカラムへの保持性が高くな
り９分離を良好にすることができる。分離カラム３で各
成分に分離されたビリルビンは該分離カラム３を出た後
、検出器４で測定され、記録計４１に表示される。検出
器としては例えば、吸光光度計が使用され、 ４５０
ｎｍにおける吸光強度が測定される。
９通常アセトニトリルおよび／またはメタノールが使用
される。この有機溶媒濃度は溶離液１全体の４０容量％
以下に設定される。有機溶媒が４０容量％を越えると血
中の蛋白が凝固・沈澱するためカラムに目づまりを生じ
る。このような有機溶媒濃度が４０容量％以下の移動相
（溶離液１）を分離カラム３に導入することにより、ア
ルブミン、グロブリンおよびデルタビリルビン（アルブ
ミン結合型ビリルビン）が溶出される。通常、有機溶媒
濃度をＯから４０容量％に徐々に高める方法が採用され
る。次に、 ｔＭ度勾配装置１３により第２溶離液１ｂ
が溶離液ｌ全体に占める割合を段階的に高める。有機溶
媒濃度を上げることによりデルタビリルビン以外のビリ
ルビン成分、つまりジグルクロン酸包合型ビリルビン、
モノグルクロン酸包合型ビリルビンおよび遊離型ビリル
ビンが順次溶出される。遊離型ビリルビンが光により異
性化した異性体が存在する場合は、この異性体も溶出さ
れる。゛ビリルビンはテトラビロール骨格を有するため
一分子あたり４個の２級アミン基を有する。このアミノ
基はプラスの電荷を有するため、カラム内の親水性の充
填剤に吸着しにくいことがある。そのためビリルビン成
分がカラム内に保持されずに溶出したり１分離が不充分
である場合も生じる。そのような場合には、移動相に微
量のアルキルスルホン酸塩を添加することが推奨される
。アルキルスルホン酸塩の添加により荷電が中和され、
かつ疎水性が高められるためカラムへの保持性が高くな
り９分離を良好にすることができる。分離カラム３で各
成分に分離されたビリルビンは該分離カラム３を出た後
、検出器４で測定され、記録計４１に表示される。検出
器としては例えば、吸光光度計が使用され、 ４５０
ｎｍにおける吸光強度が測定される。
（作用）
本発明方法においては、高速液体クロマトグラフィーに
おける移動相のｐＨを特定し、かつ該移動相中の有機溶
媒濃度を順次変化させたため、血中の蛋白成分を凝固さ
せることなく、デルタビリルビンを含む各ビリルビン成
分を分画して測定することが可能となる。特別な前処理
を必要としないため各ビリルビン成分が分解したり、損
失することがなく、高精度の測定値が得られる。
おける移動相のｐＨを特定し、かつ該移動相中の有機溶
媒濃度を順次変化させたため、血中の蛋白成分を凝固さ
せることなく、デルタビリルビンを含む各ビリルビン成
分を分画して測定することが可能となる。特別な前処理
を必要としないため各ビリルビン成分が分解したり、損
失することがなく、高精度の測定値が得られる。
（実施例）
以下に本発明を実施例につき説明する。
夫藷皿よ
（Ａ）充填剤ゲルの調製：４重世％のポリビニルアルコ
ール水溶液４００−にテトラエチレングリコールジメタ
クリレート４０ｇ、テトラメチロールメタントリアクリ
レート１０ｇ、 メタクリル酸５０ｇ。
ール水溶液４００−にテトラエチレングリコールジメタ
クリレート４０ｇ、テトラメチロールメタントリアクリ
レート１０ｇ、 メタクリル酸５０ｇ。
トルエン４０ｇおよびベンゾイルパーオキサイド１．５
ｇを加えた。４００ｒｐｍで攪拌しながら８０℃で１０
時間反応させた後、熱水およびアセトンで洗浄し９粒子
径８〜１０μｍの高分子球状多孔体を得た。
ｇを加えた。４００ｒｐｍで攪拌しながら８０℃で１０
時間反応させた後、熱水およびアセトンで洗浄し９粒子
径８〜１０μｍの高分子球状多孔体を得た。
（Ｂ）ビリルビンの測定：第１図に示す測定装置により
血清中のビリルビンの分画測定を行った。
血清中のビリルビンの分画測定を行った。
分離カラム３としては、（Ａ）項で得られた充填剤ゲル
を内径６ｍ、長さ１５０龍のステンレス製カラムに充填
したものを使用した。第１溶離液（第１移動相）ｌａと
しては、 ５ｍｍｏｌ／Ａ！のペンタスルホン酸ナト
リウムを含む酢酸緩衝液（ｐＨ３，０）を。
を内径６ｍ、長さ１５０龍のステンレス製カラムに充填
したものを使用した。第１溶離液（第１移動相）ｌａと
しては、 ５ｍｍｏｌ／Ａ！のペンタスルホン酸ナト
リウムを含む酢酸緩衝液（ｐＨ３，０）を。
そして第２溶離液（第２移動相）ｌｂとしてはアセトニ
トリルを使用した。
トリルを使用した。
まず定流量ポンプ１２により第１溶離液１ａを１．〇−
／分の割合で分離カラム３に供給しながら、試料導入装
置１３を介して試料を分離カラム３に供給した。試料と
しては黄度患者の血清１０μｌを用いた。試料添加３分
後に濃度勾配装置１３（液体クロマトグラフシステムＬ
Ｃ−４Ａ （島津製作所製）に組み込まれている）を操
作し、第１溶離液１ａと第２溶離液１ｂとの混合液が溶
離液（移動相）１として分離カラム３に供給されるよう
にした。第２溶離液１ｂの溶離液１全体に占める濃度は
４容量％／分の割合で順次上昇させた。検出器４として
は吸光光度計（ＵＶＩＤＥＣ１００−Ｖｌ 、日本分光
社製）を用い、 ４５０龍ｍの吸収強度の測定を行っ
た。記録計４１に表示されたクロマトグラムを第２図（
Ａ）に示す。比較として、健常人血清１０μｌを用いて
同様の操作を行った。得られたクロマトグラムを第２図
（Ｂ）に示す。
／分の割合で分離カラム３に供給しながら、試料導入装
置１３を介して試料を分離カラム３に供給した。試料と
しては黄度患者の血清１０μｌを用いた。試料添加３分
後に濃度勾配装置１３（液体クロマトグラフシステムＬ
Ｃ−４Ａ （島津製作所製）に組み込まれている）を操
作し、第１溶離液１ａと第２溶離液１ｂとの混合液が溶
離液（移動相）１として分離カラム３に供給されるよう
にした。第２溶離液１ｂの溶離液１全体に占める濃度は
４容量％／分の割合で順次上昇させた。検出器４として
は吸光光度計（ＵＶＩＤＥＣ１００−Ｖｌ 、日本分光
社製）を用い、 ４５０龍ｍの吸収強度の測定を行っ
た。記録計４１に表示されたクロマトグラムを第２図（
Ａ）に示す。比較として、健常人血清１０μｌを用いて
同様の操作を行った。得られたクロマトグラムを第２図
（Ｂ）に示す。
第２図（Ａ）および（Ｂ）を比較すると、黄度患者血清
には、健常人血清には含有されない物質のピークａｙｄ
が確認される。これらのピークを同定したところ、それ
ぞれ、デルタビリルビン（Ｂｇ）。
には、健常人血清には含有されない物質のピークａｙｄ
が確認される。これらのピークを同定したところ、それ
ぞれ、デルタビリルビン（Ｂｇ）。
ジグルクロン酸抱合型ビリルビン（ＢＤＣ）、モノグル
クロン酸抱合型ビリルビン（ＢＭＣ）および遊離ビリル
ビン（ＢＵ）であることが確認された。
クロン酸抱合型ビリルビン（ＢＭＣ）および遊離ビリル
ビン（ＢＵ）であることが確認された。
実施±叉
第１溶離液１ａのｐＨを４．０としたこと以外は実施例
１と同様に操作し、黄度患者血清中のビリルビンの測定
を行った。得られたクロマトグラムを第３図に示す。第
３図において、 ａ−ｄのピークは実施例１と同様で
あり＋ ａ６は、溶離液１のｐＨが高い状態において一
部溶出されたＢｓである。
１と同様に操作し、黄度患者血清中のビリルビンの測定
を行った。得られたクロマトグラムを第３図に示す。第
３図において、 ａ−ｄのピークは実施例１と同様で
あり＋ ａ６は、溶離液１のｐＨが高い状態において一
部溶出されたＢｓである。
且ＩＬ上
第１溶離液１ａのｐＨを８．０としたこと以外は実施例
１と同様に操作し、黄度患者血清中のビリルビンの測定
を行った。得られたクロマトグラムを第４図に示す。第
４図において、ビリルビンは各成分に充分に分離されず
にひとつのピークｒとなって現れる。ｅのピークは、溶
離液１のｐＨが高い状態において溶出されたビリルビン
混合物である。
１と同様に操作し、黄度患者血清中のビリルビンの測定
を行った。得られたクロマトグラムを第４図に示す。第
４図において、ビリルビンは各成分に充分に分離されず
にひとつのピークｒとなって現れる。ｅのピークは、溶
離液１のｐＨが高い状態において溶出されたビリルビン
混合物である。
北較■叢
第１溶離液１ａとして実施例１と同様の酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ３，０）とアセトニトリルとの混合液（容量比１：１
）を用いたこと以外は実施例１と同様に操作し、黄度患
者血清中のビリルビン測定を試みた。しかし１分離カラ
ム３内で血清蛋白が凝固し、カラム内圧が上昇したため
測定が不能となった。
Ｈ３，０）とアセトニトリルとの混合液（容量比１：１
）を用いたこと以外は実施例１と同様に操作し、黄度患
者血清中のビリルビン測定を試みた。しかし１分離カラ
ム３内で血清蛋白が凝固し、カラム内圧が上昇したため
測定が不能となった。
（発明の効果）
本発明によれば、このように、繁雑な前処理を行うこと
なく高精度で血中のビリルビンの分画測定がなされる。
なく高精度で血中のビリルビンの分画測定がなされる。
血中のビリルビン、特に肝機能を示す重要な指標となる
デルタビリルビンが精度良く測定されるため２本法は例
えば肝機能検査法として極めて有用である。
デルタビリルビンが精度良く測定されるため２本法は例
えば肝機能検査法として極めて有用である。
４、 ズ の ゛な普 ■
第１図は２本発明方法に用いる測定装置の一実施例を示
すフローダイヤグラム；第２図（Ａ）および（Ｂ）は、
それぞれ本発明方法により黄痕患者血清および健常人血
清を測定して得られたクロマトグラム；第３図は本発明
の他の方法により黄痕患者血清を測定した得られたクロ
マトグラム；そして第４図は１本発明方法とは異なるｐ
Ｈの溶離液を用いて黄厄患者血清を測定して得られたク
ロマトグラムである。
すフローダイヤグラム；第２図（Ａ）および（Ｂ）は、
それぞれ本発明方法により黄痕患者血清および健常人血
清を測定して得られたクロマトグラム；第３図は本発明
の他の方法により黄痕患者血清を測定した得られたクロ
マトグラム；そして第４図は１本発明方法とは異なるｐ
Ｈの溶離液を用いて黄厄患者血清を測定して得られたク
ロマトグラムである。
１・・・溶離液、２・・・試料導入装置、３・・・分離
カラム、４・・・検出器、１３・・・濃度勾配装置。
カラム、４・・・検出器、１３・・・濃度勾配装置。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）親水性充填剤が固定相として充填された分離
カラムに血清もしくは血漿を含む試料を導入して蛋白成
分およびビリルビンを該充填剤に吸着させる工程、 （ｂ）該分離カラムに、ｐＨ２〜５の水性溶液を主成分
とし４０容量％以下の割合で有機溶媒を含有する溶離液
を移動相として供給し、アルブミン画分、グロブリン画
分およびデルタビリルビンを溶出させる工程、および （ｃ）該分離カラムに該（ｂ）項よりも有機溶媒濃度の
高い溶離液を移動相として供給し、デルタビリルビン以
外の各ビリルビン画分を順次溶出させる工程、 を包含する逆相高速液体クロマトグラフィーによる血中
ビリルビンの分画測定法。 ２、前記（ｂ）項および（ｃ）項における溶離液の有機
溶媒濃度を徐々に上昇させる特許請求の範囲第１項に記
載の測定法。 ３、前記デルタビリルビン以外のビリルビンがジグルク
ロン酸抱合型ビリルビン、モノグルクロン酸抱合型ビリ
ルビンおよび遊離ビリルビンである特許請求の範囲第１
項に記載の測定法。 ４、前記親水性充填剤が水酸基、カルボキシル基および
エーテル基のうちの少なくとも一種でなる親水性の官能
基をその表面に有する有機高分子系充填剤である特許請
求の範囲第１項に記載の測定法。 ５、前記親水性充填剤の素材が、（メタ）アクリル酸エ
ステル系樹脂である特許請求の範囲第１項に記載の測定
法。 ６、前記親水性充填剤がＯＤＳ系逆相クロマトグラフィ
ー用充填剤にアルブミンを化学結合させた充填剤である
特許請求の範囲第１項に記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61310902A JPH0718856B2 (ja) | 1986-12-26 | 1986-12-26 | 血中ビリルビンの分画測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61310902A JPH0718856B2 (ja) | 1986-12-26 | 1986-12-26 | 血中ビリルビンの分画測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63163275A true JPS63163275A (ja) | 1988-07-06 |
| JPH0718856B2 JPH0718856B2 (ja) | 1995-03-06 |
Family
ID=18010756
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61310902A Expired - Fee Related JPH0718856B2 (ja) | 1986-12-26 | 1986-12-26 | 血中ビリルビンの分画測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0718856B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108918712A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-11-30 | 安徽科宝生物工程有限公司 | 一种胆红素含量的检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58223061A (ja) * | 1982-06-18 | 1983-12-24 | Sekisui Chem Co Ltd | 非蛋白物質の分析方法 |
| JPS58223062A (ja) * | 1982-06-21 | 1983-12-24 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | 生理活性物質及び／又は薬物の分離分析方法 |
| JPS5957160A (ja) * | 1982-09-28 | 1984-04-02 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 体液成分の分離法 |
| JPS59203954A (ja) * | 1983-05-06 | 1984-11-19 | Shimadzu Corp | ビリルビンの分析法 |
-
1986
- 1986-12-26 JP JP61310902A patent/JPH0718856B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58223061A (ja) * | 1982-06-18 | 1983-12-24 | Sekisui Chem Co Ltd | 非蛋白物質の分析方法 |
| JPS58223062A (ja) * | 1982-06-21 | 1983-12-24 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | 生理活性物質及び／又は薬物の分離分析方法 |
| JPS5957160A (ja) * | 1982-09-28 | 1984-04-02 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 体液成分の分離法 |
| JPS59203954A (ja) * | 1983-05-06 | 1984-11-19 | Shimadzu Corp | ビリルビンの分析法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108918712A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-11-30 | 安徽科宝生物工程有限公司 | 一种胆红素含量的检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0718856B2 (ja) | 1995-03-06 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |