JPS58223061A - 非蛋白物質の分析方法 - Google Patents

非蛋白物質の分析方法

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JPS58223061A
JPS58223061A JP10564482A JP10564482A JPS58223061A JP S58223061 A JPS58223061 A JP S58223061A JP 10564482 A JP10564482 A JP 10564482A JP 10564482 A JP10564482 A JP 10564482A JP S58223061 A JPS58223061 A JP S58223061A
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protein
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adsorbed
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Toshiyuki Doro
敏行 堂路
Fumio Kamiyama
文男 神山
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Sekisui Chemical Co Ltd
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Sekisui Chemical Co Ltd
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02Column chromatography
    • G01N30/04Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/16Injection
    • G01N30/20Injection using a sampling valve

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  • General Physics & Mathematics (AREA)
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  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蛋白質を含んでいる血清等の試料中の非蛋白物
質を液体クロマドグ27等分析カラムを用いる手法によ
シ分析する分析方法Ellする。
血清等に含まれるアルドステロン、アルドステロン、ユ
ルチソール、フレグナンジオール、エストpゲン等のス
テルイド系ホルモン、カテコールアミン、ポリアミン等
のアミン慶どや、各種薬剤等の非蛋白質成分を、病理学
的な研究や診断に利用するために液体クロマトグラフ等
により分析することが広く行われているが、血清等の生
体試料中には一般に蛋白質が含まれている。
この蛋白質の存在により、分析精度や分析カラム機能が
低下したシ、該分析カラムの寿命が短かくなったりする
ので、非蛋白質成分の分析においては、予め除蛋白操作
により蛋白質を除いた試料を用いるのが普通である。し
かしながら、従来の方法では除蛋白操作に多大の時間、
労力を要する、該操作の段階で分析成分が多量に損失し
たシ、若しくれ変性したシする等の欠点があった。
本発明は上記の如き従来法の欠点にかんがみ、簡単な操
作でかつ有効に除蛋白が行える分析方法を提供すること
を目的としてなされたもめであシ、その要旨は、非蛋白
物質を分析カラムを通過させることにより分析を行うに
際し、特定の条件下で非蛋白分析目的物質は吸着するが
蛋白質は吸着せず、他の条件下では吸着した上記非蛋白
分析目的物質を溶離する充填剤が充填された除蛋白カラ
ムに分析目的物質及び蛋白質を含む試料液を通して、充
填剤に分析目的物質を含む非蛋白物質を吸着させると共
に、吸着しなかった蛋白質を系外に除去したのち、該除
蛋白カラムに溶離液を流して、吸着されていた上記非蛋
白物質を脱着させ、これを分析カラムに直接チャージす
ることを特徴とする非蛋白物質の分析方法に存する。
以下、図面を参照しながら本発明につき説明する0 第1図は本発明の一実施□態様を示す接続図であり、接
続端A−Fを有する6方パルプ4に、除蛋白カラム5が
接続端B、Eを介して′接続され、水槽1中のイオン交
換水若しくは緩衝液がポンプ2によって試料インジェク
ター3.接続端A。
Bを経由して除蛋白カラム5に送られ、そこから接続端
E、Fを通シ系外に排出するようになされている。
一方、溶離液槽6中の溶離液はポンプ7により、接続端
り、Cを経由して液体クロマトグラフの分析カラム8へ
送られる様に一/にされている。
上記除蛋白カラム5には特定の条件、例えば水ないしは
特定のPHの緩衝液中では非蛋白質である分析目的物質
は吸着するが、蛋白質は吸着せず、そして他の条件例え
ば上記と異なったPHの緩衝液中では、これに吸着した
上記非蛋白分析目的物質を溶離する性質を有する充填剤
が充填されている。
本発明においては、分析目的物質に応じて上記充填剤が
選定されるのであるが、一般に充填剤として上記性質を
有する高分子物質の微粒子状のものを採用するのが好ま
しい。又、該充填剤の分析目的物質に対する吸着性に関
しては、該物質を分析するための分析カラムに充填され
る充填剤よりも吸着性が低いことが好ましく、この様な
組合せの除蛋白カラム及び分析カラムを用いることKよ
って、除蛋白カラムに吸着されていた目的物質を溶離液
によって完全に溶離させ、これをそのま\分析カラムに
流して該分析カラムで精度よく分離、分析することが出
来る。
しかして、除蛋白カラム5に充填される充填剤の好適な
例として社、例えば血清試料中の非彎白物質分析用とし
てテトラメチロールメタントリアクリレートやn−エチ
レングリコールジメタクリレート (nは2〜4)の単
独重合あるいはこれらめモノマーを含むモノマー混合物
の共重合によって得られる水との親和性を有する重合体
物質の粒状物が挙げられ、なかんずく、懸濁重合によっ
て得られる粒径10〜20z程度の微細粒子が好ましい
しかして、本発明方法では第1図に示される上述の接続
状態において、試料インジェクター3より、試料例えば
除蛋白処理を行っていない血清試料を注入すると、該血
清試料はポンプ2によりイオン交換水若しくは緩衝液と
共に移送されて除蛋白カラム5に達し、ここで血清試料
中の非蛋白分析目的物質は該カラムの充填剤に吸着され
、一方、該試料中の蛋白質は吸着されないで該カラム5
を通過し、6方パルプ4の接続端E、Fを経由して系外
に排出される。
離液が接続端り、 Eを経由して除蛋白カラム5を通過
し、かくして上記において吸着された非蛋白物質が溶離
されて溶離液と共に移送され、接続端B、Cを経由して
分析カラム8に達し、この分析カラム8の作用によって
分析目的物質が分離され、分析力之ム8以降に設けられ
た適宜な検出器により検出され、分析が行われるのであ
る。
なお、本実施例では分析カラム8におけるポンプ2によ
るイオン交換水の進行方向と、ポンプ7による溶離液の
進行方向とはそれぞれ反対方向になる様になされたが、
これに限られる必要はなく、これらの進行方向が同じ方
向となる様な接続方式が採用されてもよい。又、第2図
の接続に切換えたのち、分析目的物質が6方バルブ4の
接続端Cを通過して分析カラム8に達した頃を見開らっ
て、6方バルブ4を第1図に示される接続にさらに切換
えることも可能であり、この様に切換えることにより、
分析カラム8で分析を行いながら、次の試料を除蛋白カ
ラム5に通し次の分析のだめの除蛋白処理を平行して行
うことが出来るので能率的である。
本発明の非蛋白物質の分析方法は上述の通シの方法であ
りゝ、分析目的物質を損失したシ、変質させたりするこ
となく簡単な操作で試料中の蛋白質を除去することが出
来るので、血清等蛋白質を含む試料の非蛋白物質を分析
するために採用されて有効なるものである。
以下本発明につき実施例により説明する。
実施例1 高圧6方バルブ4に、除蛋白カラム5.液体クロマトグ
ラフ(ウォーターズ、モデル6000A)に組み込まれ
た分析カラム8等を第1図に示す通りに接続した。
なお、除蛋白カラム5としては、内径4 m 、長さ1
.5 csのステンレス製カラムに、4重量%ポリビニ
ルアルコール水溶液400ml中にテトラエチレングリ
コールジメタクリレート40g、テトラメチロールメタ
ントリアクリレート10g、メタクリル酸50g、トル
エン40g及びベンゾイルパーオキサイド1.5gを供
給し、400rPmで攪拌しながら80℃で10時間反
応させ、反応後熱水及びアセトンで洗浄して得た粒子径
5〜20μの高分子球状多孔体を充填したものを用いた
ポンプ2により水槽1中のイオン交換水を1.0∝/分
の流速で6方パルプ4の接続端A、Bを経由して除蛋白
カラム5に流しながら、試料インジェクター3から除蛋
白処理をしていない試料血清10μlを注入した。
該試料血清は正常男子血清に副腎質ホルモン、プレドニ
ゾロンが10PPm添加されたものである。
上記注入の5分後に、6方バルブ4を切換えて第2図の
如く接続し、ポンプ7により、溶離液槽6中のメタノー
ル対水が70:30の溶離液を0.5∝/分の流速で、
6方バルブ接続端D、E、除蛋白カラム5,6方バルブ
接続端B、Cを経由して液体クロマトグラフの分析カラ
ム8へと通し、除蛋白カラム5において吸着されていた
が上記溶離液の流通により溶離した非蛋白物質の分析を
行った。
なお、分析カラムとしては5HANDON社製HY P
 Eπ5IL−ODS  (商品名、カラムサイズ内径
6fi;長さLock)を用い、検出は240 nmの
吸収強度によって行った。得られたクロマトグラムは第
3図囚に示される通りでアシ、副腎質ホルモンを添加し
ない正常男子血清を試料として用いる以外は上記と同様
にして分析操作を行って得られた第1図ω)に示される
クロマトグラム七の対比によシ明らかなる様に1第1図
(4)のクロマトグラムにおいては血清中の副腎質ホル
モンがピーク11として明確に検出されている。
実施例2 実施例1で用いたのと同じステンレス製カラムに、実施
例1で使用した混合モノマー(テトラエチレングリコー
ルジメタクリレート、テトラメチロールメタントリアク
リレート及びメタクリル酸)に代えてテトラメチロール
メタントリアクリレ−)100Fを用いる以外は実施例
1と同様に重合を行って用意した粒子径5〜20声の高
分子球状多孔体を充填して除蛋白カラムを用意した。こ
の除蛋白カラムを用いる以外は実施例1と同様な分析装
置を用いた。ポンプ2によシ水槽1中の0.01 N 
Na2CO3水溶液を1.Oae/分の流速で、第1図
の如く6方パルプ4の接続端A、Bを経由して除蛋白刃
ラム5に流しながら、試料インジェクター3から除蛋白
処理をしていない試料血清10plを注入した。
該試料血清は抗テンカン剤服用患者の血清である0 試料注入の5分後に、6方バルブ4を切換えて第2図の
如く接続し、ポンプ7により溶離液槽6中のアセトニト
リル対水が35:65の溶離液を1.0 ce 7分の
流速で、6方パルプ接続端DE、除蛋白カラム5.6方
パルプ接続端B、 Cを経由して液体クロマトグラフの
分析力2ム8へと通し、除蛋白カラム5に吸着されてい
た非蛋白物質を溶離させて分析カラム8を通過させて該
物質の検出を行った。なお、分析カラムとしてL実施例
1で用いたのと同じカラムを用い、検出は220 nm
の吸収強度によって行った。
得られたクロマトグラムは第4図囚に示される通りであ
る。一方、第4口の)は上記患者血清を用いる代シに正
常人の血清を試料として用いる以外は上記と同様にして
分析操作を行って得られたクロマドグ2ムであり、第4
図囚のクロマトグラムには、同図03)では極用されて
いないピーク12.13.14が検出されていることが
認められる。
そして、該ビークiz、 ia、及び14社それぞれ抗
テンカン剤中に含まれるフェノバルビタール。
カルバマゼピン及びフェニイトンであることが同定の結
果判明した。
比較例1 実施例Iにおいて用いた除蛋白カラムを用いずして、実
施例1と同じ血清試料を同じ液体クロマトグラムの分析
力2ム8に通したが、該カラム内で血清蛋白の凝固によ
ゐ沈積が生じ、カラム内圧の上昇等が起って分析困難と
なった。
【図面の簡単な説明】
第1図及び第2図は本発明の一実施態様を示す接続図で
あシ、第3図囚、ω)社本発明実施例1で得られたクロ
マトグラム、第4図囚、ω)は本発明実施例2で仰られ
たり四マドグラムであるOl・・・水槽、2.7・・・
ポンプ、3・・・試料インジェクター、4・・・6方パ
ルプ、5・・・除蛋白刃2ム、6・・・溶離液槽、8・
・・分析カラム@特許出願人 積水化学工業株式会社 代表者 塵 沼 基 利 才2 区 才3囚

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1、 非蛋白物質を分析カラムを通過させることによシ
    分析を行うに際し、特定の条件下で非蛋白分析目的物質
    は吸着するが蛋白質は吸着せず、他の条件下では吸着し
    た上記非蛋白分析目的物質を溶離する充填剤が充填され
    た除蛋白カラムに分析目的物質及び蛋白質を含む試料液
    を通して、充填剤に分析目的物質を含む非蛋白物質を吸
    着させると共に、吸着しなかった蛋白質を系外に除去し
    たのち、該除蛋白カラムに溶離液を流して、吸着されて
    いた上記非蛋白物質を脱着させ、これを分析カラムに直
    接チャージすることを特徴とする非蛋白物質の分析方法
JP10564482A 1982-06-18 1982-06-18 非蛋白物質の分析方法 Granted JPS58223061A (ja)

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JPH0225147B2 JPH0225147B2 (ja) 1990-05-31

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